Фрагмент днк pcg 2,6, кодирующий синтез секретируемой бета- галактозидазы penicillium canescens, и штамм гриба penicillium canescens - продуцент секретируемой бета- галактозидазы

 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и к генетической инженерии и может быть использовано для получения бета-галактозидазы. Фрагмент ДНК PCG 2,6, размером 6,3 т.п.н., несет полную структурную часть гена бета-галактозидазы и функционально полную регуляторную область этого гена. На основе фрагмента конструируют штамм Penicillium canescens ВКПМ-725-продуцент бета-галактозидазы. За 96-108 часов ферментации использование штамма позволяет получить в культуральной жидкости 605-620 ед/мл бетагалактозидазы. 2 с.п. ф-лы, 1 табл.

Изобретение относится к микробиологической промышленности и к генетической инженерии и представляет собой фрагмент ДНК мицелиального гриба Penicillium canescens, кодирующий синтез секретируемого фермента бета-галактозидазы и штамм-продуцент Penicillium canescens, сконструированный методами трансформации и генетической инженерии на основе этого фрагмента ДНК.

В качестве продуцентов бета-галактозидазы известны различные виды бактерий, дрожжей и мицелиальных грибов. По оптимуму действия бета-галактозидазы делятся на кислые и нейтральные (т.е. имеющие оптимум действия при соответствующей реакции среды). Секретируемые бета-галактозидазы грибов в основном имеют оптимум действия в кислых (pH 5) средах; бета-галактозидаза Penicillium canescens имеет оптимум действия при pH=4,5. Грибные секретируемые бета-галактозидазы используются в молочной промышленности для гидролиза лактозы в молочной творожной сыворотке.

Молекулярная масса бета-галактозидазы Penicillium canescens порядка 120-126 kD, оптимум действия при pH=4,5 и температурный оптимум при 55oC (Николаев И. В. и др. 1989 Биохимия, т. 54: 1294-1299). Фермент представлен единой полипептидной цепью из 1011 аминокислотных остатков. Галактозидаза входит в группу нескольких секретируемых ферментов (амилаза, целлобиаза, целлюлаза, протеаза и др.), которые накапливаются в культуральной жидкости при глубинной ферментации. Среди секретируемых ферментов Penicillium canescens бета-галактозидаза преобладает, занимая около 30% всего секретируемого белка (Николаев И.В. и др. 1992 Биохимия, т. 57: 873-879).

Геном гриба Penicillium canescens (ВКПМ F178) содержит одну копию гена секретируемой бета-галактозидазы ( Николаев И.В. и др. Молекулярная биология 1992 т. 26: 869-875). Ген бета-галактозидазы включает в себя нуклеотидную последовательность ДНК, кодирующую бета-галактозидазу (структурная часть гена), 5'- нетранслируемую область ДНК, несущую регуляторную функцию и 3'- нетранслируемую область. Регуляция активности бета-галактозидазы осуществляется путем индукции или репрессии ее синтеза. Индуцирующим началом является наличие в среде арабинозы. Максимальная индукция наблюдается при концентрации арабинозы порядка I mM. При наличии в среде глюкозы, других сахаров, а также избытка арабинозы происходит репрессия синтеза по механизму углерод-катаболитной репрессии (Nikolaev I.V., Vinetski Yu.P., 2nh Europ. Conf. Fung. Genet., abstr. A8, 1994, Lunteren, The Netherlands).

В качестве ближайшего аналога заявляемого изобретения может быть рассмотрен фрагмент ДНК PCG 12-38, кодирующий синтез бета-галактозидазы Penicillium canescens и сконструированный на его основе штамм-продуцент бета-галактозидазы Penicillium canescens F-715 (заявка на патент РФ N 94042578, Бюллетень изобретений РФ N 23, 1996 г.).

Фрагмент ДНК PCG 12 содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую структуру бета-галактозидазы (структурная часть гена, включающая в себя 3368 н. п. ) и 5'-нетранслируемую область размером 1000 н.п. Эта область обеспечивала регуляторную функцию углерод-катаболитной репрессии, но не содержала всех элементов, необходимых для активации гена бета-галактозидазы. Штамм Penicillium canescens F-715 за 96 часов ферментации накапливал до 220 ед/мл бета-галактозидазы (субстрат ОНФГ, 30oC) на среде с свекловичным жомом и БВК.

Задачей заявляемой группы изобретений является повышение уровня накопления бета-галактозидазы Penicillium canescens в культуральной жидкости. Для решения задачи получают фрагмент ДНК PCG 2,6 размером 6,3 т.п.н., несущий полную структурную часть гена бета-галактозидазы и функционально полную регуляторную область этого гена.

Для решения задачи на основе вышеприведенного фрагмента конструируют штамм Penicillium canescens PCG 2,6-26 (регистрационный номер во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ВКПМ F-725), в геном которого включены 8-10 дополнительных копий гена бета-галактозидазы с полной регуляторной областью.

Штамм Penicillium canescens F-725 способен за 96-108 часов ферментации накапливать в культуральной жидкости 605-620 ед/мл бета-галактозидазы. Конструирование штамма включало в себя несколько этапов.

Этап 1 - выделение фрагмента ДНК PCG 2,6 гриба Penicillium canescens F178, кодирующего ген секретируемой бета-галактозидазы с полной регуляторной областью.

Этап 2 - включение выделенного фрагмента ДНК с геном в состав векторной молекулы pTZ19R.

Этап 3 - трансформация штамма-реципиента Penicillium canescens ВКПМ F-1178 niaD (РСА 10) векторной молекулой с включенным геном бета-галактозидазы.

Этап 4 - отбор наиболее продуктивного трансформанта, его генотипический фенотипический и физиолого-биохимический анализ.

Полученный штамм характеризуется следующими культурально-морфологическими, физиолого-биохимическими и генотипическими признаками, некоторые из которых отличались от таковых у природного штамма 1. Культурально-морфологические признаки на различных питательных средах после 10 суток роста при 30oC: а) Сусло-агар.

Диаметр колоний 6,5 - 7,5 см. Колонии различной степени опушенности, радиальнобороздчатые, с обильным спороношением, дымчато-зеленовато-серые с растущим краем ( 2-4 мм). Обратная сторона оранжево-темно-коричневая. Конидиеносцы 430-450 3.0-3.2 мкм, конидии 2.0-2.2 мкм, шаровидные, в молодом возрасте гладкие, в старом шероховатые, образуются в цепочках, соединяются в колонки, со временем распадающиеся.

б) Агаризованная среда Ролена-Тома с сахарозой.

Диаметр колоний 38-48 мм. Колонии войлочные или слабо пушистые в центре, слабовыпуклые, с радиальными бороздками, белого цвета, по краям окрашены в серо-голубоватый тон, края неровные, лопастные, обратная сторона серо-бежевого тона.

в) Агаризованная среда Чапека с глюкозой.

Диаметр колоний 2,8-4,0 см. Колонии серые, складчатые, с ровным краем, конидиеобразование интенсивное, цвет конидий светло-серый. Обратная сторона колоний с радиальными складками слабо кремового тона.

По культурально-морфологическим признакам, перечисленным выше, не отмечено отличий от природного штамма Penicillium canescens ВКПМ F-178, за исключением характера роста на среде Чапека с глюкозой, где у штамма Penicillium canescens ВКПМ F-725 отмечено более интенсивное спороношение и некоторое изменение формы края колонии.

2. Физиолого-биохимические признаки.

Мезофил, растет при 25-37oC, оптимальная температура роста 29oC. Оптимум роста при значениях pH среды 4,1-5,8. Желатину разжижает слабо. Отношение к источникам углерода. Хорошо усваивает моно-, ди- и полисахариды, за исключением арабинозы, которую утилизирует слабо. Хорошо усваивает аммонийный и нитратный азот, пептон, мочевину.

У заявляемого штамма Penicillum canescens ВКПМ F-725 избирательно увеличена активность секретируемой бета-галактозидазы, доля которой составляет 88% от суммарного внеклеточного белка, а другие секретируемые ферменты культуральной жидкости не изменены.

3. Генетическая стабильность.

Штамм ВКПМ F-725 стабилен по признаку продукции бета-галактозидазы после десятикратного пассажа конидиями. С исходного клона после первичного пересева было сделано десять последовательных пересевов конидиями на косяки, каждый из которых инкубировали до образования зрелых конидий и хранился при 4oC. Затем с 1-го, 2-го, 4-го, 6-го, 8-го и 10-го косяка были взяты конидии для инокулирования проб с жидкой средой (свекловичный жом и соевый шрот). При их одновременной ферментации в динамике определялась активность бета-галактозидазы в культуральной жидкости (таблица).

4. Генотипические признаки.

Основной генотипический признак заявляемого штамма заключается в увеличенном числе генов секретируемой бета-галактозидазы. Определение числа генов в сравнении с исходным штаммом было проведено методом дот-гибридизации ДНК-ДНК. На нейлоновый фильтр для ДНК-гибридизации каплями в ряд наносили ДНК штаммов Penicillium canescens ВКПМ F-178 niaD (РСА10) и заявляемого в равном количестве, соблюдая принцип двукратного разведения между соседними каплями. Четкое отсутствие сигнала гибридизации с меченой ДНК плазмиды, несущей ген бета-галактозидазы у ДНК штамма РСА-10, наблюдаемой на 3 разведения ранее, чем у штамма ВКПМ F-725 доказывало, что в геном последнего включены 8-10 дополнительных копий гена бета-галактозидазы. Штамм Penicillium canescens PCG 2,6-26 дополнительно содержит плазмиду pSTA10 с геном нитратредуктазы Aspergillus niger (Unkles et al., 1989).

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Получение фрагмента ДНК PCG 2,6, кодирующего синтез бета-галактозидазы.

Для получения банка генов ДНК используют штамм Penicillium canescens ВКПМ F-178. ДНК этого штамма обрабатывают рестриктазой Sau3A в условиях неполного расщепления, фракционируют путем центрифугирования в градиенте плотности сахарозы, выделяя фрагменты ДНК размером 20 тыс.пар оснований (п. о. ), и включают путем легирования в ДНК фагового вектора лямба EMBL4. Далее готовят упаковочную смесь (белки фаговых головок и белки хвостов фага лямбда по отдельности), проводят упаковку при оптимальных соотношениях компонентов смеси и полученные фаговые частицы с рекомбинантными ДНК рассевают на чашки Петри с питательной средой и индикаторными бактериями (Т.Маниатис, Э.Фрич, Дж. Самбру. Молекулярное клонирование. М.; Мир, 1984). Полученные негативные колонии (независимые клоны) в количестве 3 104 в совокупности представляют собой банк генов пеницилла. Далее из этого банка генов выделяют фрагмент ДНК, кодирующий ген секретируемой бета-галактозидазы с промоторным районом, несущим все сигнальные последовательности для регуляции (индукции и репрессии) ее синтеза.

Для решения этой задачи синтезируют олигонуклеотид (зонд 1) с последовательностью с учетом частоты встречаемости кодонов в мицелиальных грибах. Эта последовательность соответствует N-концевой аминокислотной последовательности бета-галактозидазы (с 4-ой по 11-ую аминокислоту). Полученный олигонуклеотид в количестве 10 нг смешивают с 10 мкг мРНК, выделенной из клеток мицелия гриба Penicillium canescens ВКПМ F-178, нагревают 3 мин при 80oC, а затем инкубируют 1 ч при 50oC и определяют нуклеотидную последовательность мРНК гена бета-галактозидазы по Сэнгеру в направлении от праймера (олигонуклеотида-зонда 1) к 5'-концу. На основе секвенированной последовательности РНК синтезируют олигонуклеотид 2 для гибридизационного скрининга фаговой библиотеки генов P. canescens: 5' GATGGTGAAGCCATCCA- ACTTATG 3'.

Этот зонд радиоактивно метят до высокой специфической активности (1 1010 имп. мин/мкг) с помощью терминальной трансферазы в буфере, содержащем 100 мМ какодилата К, pH = 7,0, 1мМ дитиотреитола, 100 мкг/мл бычьего сывороточного альбумина, 100 нг зонда, 100 мкКи [-32 * P]dATP и 20 ед. фермента в течение 1ч при 37oC и добавляют в раствор для гибридизации (5х раствор Денхардта, 6xSSC, 0,5%SDS, 0,2 мг/мл ДНК спермы лосося) до конечной концентрации 106 имп.мин/мкг. Фаговые негативные колонии переносят на нейлоновые фильтры для ДНК-ДНК гибридизации и инкубируют в указанном растворе в течение ночи, плавно снижая температуру с 65oC до комнатной, после чего отмывают фильтры от неспецифически связавшейся метки в растворе 4xSSC при 37oC. Фильтры экспонируют с рентгеновской пленкой. При анализе геномной библиотеки гриба Penicillium canescens данным методом из 3х104 рекомбинантных фагов были выделены клоны, из которых детально исследован клон PCG 2,6. Этот клон нес фрагмент ДНК PCG 2,6 с структурной кодирующей частью гена секретируемой бета-галактозидазы, 3'-нетранслируемой частью и 5'-нетранслируемой областью протяженностью 2600 нуклеотидов. Эта область содержит нуклеотидную последовательность ДНК, полностью обеспечивающую регуляторную функцию (специфическую индукцию арабинозой и углеродкатаболитную репрессию) гена секретируемой бета-галактозидазы Penicillium canescens ВКПМ F-178. Для определения нуклеотидной последовательности гена бета-галактозидазы фрагмент ДНК, кодирующий полный ген, его 5'-нетранслируемую область и 3'-нетранслируемую область расщепляют рестриктазами и полученные фрагменты в прямой и обратной ориентациях клонируют в векторный фаг М13 для секвенирования ДНК по методу Сенгера. Ниже приведены нуклеотидная последовательность ДНК, кодирующая полный ген секретируемой бета-галактозидазы Penicillium canescens, а также нуклеотидные последовательности и 5' и 3'-нетранслируемых областей этого гена.

Далее получают плазмиду pPCG 2,6, несущую фрагмент ДНК PCG 2,6, кодирующий бета-галактозидазу. 2 мкг ДНК фагового клона PCG 2,6, содержащего фрагмент ДНК с геном бета-галактозидазы, обрабатывают рестриктазой BglI в течение 1 ч при 37oC в количестве 20 ед. в условиях неполного расщепления и затем образовавшиеся фрагменты легируют с 0,1 мкг плазмиды pTZ19R (Pharmacia catalog, 1986), предварительно расщепленную той же эндонуклеазой рестрикции. Легирование проводят в течение ночи при 16oC, добавляя в пробу 2 ед. ДНК-лигазы фага Т4. Клоны, содержащие фрагмент ДНК с данным геном отбирают путем гибридизации с радиоактивно меченным зондом 2, после чего проверяют ориентацию вставки в полученной плазмиде pPCG 2,6.

Пример 2. Получение штамма Penicillum canescens ВКПМ F-725. Для решения этой задачи требуется система трансформации, позволяющая включать в геном штамма Penicillium canescens дополнительные копии гена бета-галактозидазы. Штамм Penicillium canescens F-178 niaD (РСА10) - реципиент для трансформации был получен селекцией штамма Penicillium canescens ВКПМ F-178 после мутагенеза нитрозогуанидином по признаку устойчивости к хлорату, происходящей вследствие утраты активности фермента нитратредуктазы. ( Aleksenko A.Y. et аl 1995 Curr Genet 28:474-477).

Генетический дефект в полученном штамме затрагивал признак niaD, что было доказано комплементацией этого признака при трансформации штамма РСА10 плазмидой pSTA10, несущей ген niaD Aspergillus niger (Unkles S.et al. 1989 Gene 1989 78: 157).

Штамм-реципиент Penicillium canescens F-178 niaD (PCA 10) выращивают в течение 16 ч при 30oC на полной питательной среде с NH4CI в качестве источника азота, переносят мицелий в раствор 1.2 М MgS04 и 10 мМ NaH2P04, pH = 5.8 и добавляют лизирующие ферменты Trichoderma reesei до концентрации 3 мг/мл. Протопластирование проводят в течение 1 ч при 30oC в условиях перемешивания. Протопласты собирают центрифугированием в ступенчатом градиенте плотности сорбитола, промывают 2 раза в стабилизирующем растворе, содержащем 1,2 М сорбитола, 10 мМ Трис, pH = 7,5, 10 мМ CaCl2 и суспендируют в нем же при концентрации 108 протопластов/мл. Трансформацию проводят следующим образом: к 100 мкл суспензии протопластов добавляют 1 мкг ДНК плазмиды PSTA10, несущей в качестве селективного маркера ген нитрат редуктазы Aspergillius niger, и 10-20 кратный избыток плазмиды pPCG 2,6 с геном бета-галактозидазы Penicillium canescens, инкубируют при комнатной температуре 20 мин, после чего проводят осмотический шок в течение 5 мин в 50% полиэтиленгликоле и высевают протопласты на агаризованную питательную среду с 10 мМ NaNO3. Через 4-5 суток инкубации при 30oC проводят скрининг полученных котрансформантов, анализируя уровень бета-галактозидазной активности в культуральной жидкости. Один из котрансформантов, N 26, обнаружил наивысшую способность к продукции секретируемой бета-галактозидазы. Таким образом получен заявляемый штамм Penicillium canescens F-725.

Пример 3. Ферментация штамма Penicillium canescens ВКПМ F-725 и оценка его продуктивности.

Для получения посевного материала культуру штамма PCG 2,6-26 выращивают на агаризованной среде Роулен-Тома при 30oC в течение 5-7 суток. Водной суспензией конидий (107 конидий/мл) инокулируют 100 мл среды (свекловичный жом -30 г/л: соевый шрот - 50 г/л; KH2PO4 - 25 г/л, pH=4,5) и инкубируют в качалочной колбе при 30oC в течение 120 ч на круговой качалке при 240 об/мин. По окончании ферментации культуральную жидкость отделяют от мицелия и твердых остатков среды центрифугированием (10000g, 15 мин) и в супернатанте определяют активность бета-галактозидазы. Определение активности бета-галактозидазы: Реакционную смесь, содержащую 3 мг. О-нитрофенил-галактопиранозида (ОНФГ) в 1,9 мл 50 мМ Na-ацетатно- го буфера pH - 4,5 и 100 мкл культуральной жидкости соответствующего разведения инкубируют 15 мин при 30oC, затем добавляют 1 мл 1 М Na2CO3 и измеряют оптическую плотность раствора при 420 нм. За единицу активности бета-галактозидазы принимают количество фермента, которое освобождает из субстрата ОНФГ 1 мкмоль О-нитрофенола за 1 мин при данных условиях реакции.

Через 96 ч ферментации штамм Penicillium canescens ВКПМ F-725 накапливает в культуральной жидкости 620 ед/мл бета-галактозидазы. Для бета-галактозидазы среди всех секретируемых белков в культуральной жидкости составляет согласно данным белкового электрофореза 90%.

Пример 4. Ферментация штамма Penicillium canescens F-715. Процесс ферментации и определение активности бета-галактозидазы осуществляют как в примере 3, но в качестве продуцента бета-галактозидазы используют штамм Penicillium canescens F-715. Через 96 ч ферментации штамм-прототип накапливает в культуральной жидкости 202 ед/мл бета-галактозидазы. Доля бета-галактозидазы среди других секретируемых белков в культуральной жидкости составляет по данным белкового электрофореза 55%.

Таким образом, использование заявляемого штамма позволяет значительно (более чем в 3 раза) увеличить количество накапливаемой в культуральной жидкости бета-галактозидазы, а также повысить ее долю среди других секретируемых белков (с 55% до 90%), что существенно упрощает процедуру выделения этого фермента.

Формула изобретения

1. Фрагмент ДНК PCG 2,6, кодирующий синтез секретируемой бета-галактозидазы Penicillium canescens, содержащий регуляторные элементы и структурную часть гена бета-галактозидазы (см.описание).

2. Штамм гриба Penicillium canescens ВКПМ F-725-продуцент секретируемой бета-галактозидазы.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к микробиологической промышленности и, в частности, генетической инженерии и представляет собой фрагмент ДНК мицелиального гриба Penicillium canescens, кодирующий синтез секретируемой -галактозидазы, и штамм Penicillium canescens продуцент b-галактозидазы, сконструированный методами генетической инженерии на основе этого фрагмента

Изобретение относится к химической инженерии, в частности к получению последовательности ДНК, которая кодирует активность изопенициллин-N-синтетазу Конструируют рекомЬинантную плазмидную ДНК pPS20 путем лигирования Hind III фрагмента плазмиды размером 2,5 кв и Hind III фрагмента плазмиды 335
Изобретение относится к микробиологической промышленности и, в частности, генетической инженерии и представляет собой фрагмент ДНК мицелиального гриба Penicillium canescens, кодирующий синтез секретируемой -галактозидазы, и штамм Penicillium canescens продуцент b-галактозидазы, сконструированный методами генетической инженерии на основе этого фрагмента

Изобретение относится к биотехнологии, микробиологическому получению ферментных препаратов и может найти применение в производстве ферментов, используемых в пищевой промышленности, преимущественно при производстве молочных продуктов

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения фермента альфа-амилазы

Изобретение относится к области генетической инженерии и может быть использовано с целью получения фермента эндоксиланазы в промышленном масштабе

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано при промышленном получении промежуточных продуктов для синтеза цефалоспориновых антибиотиков

Изобретение относится к биотехнологии и характеризует фитазу, фрагмент ДНК, кодирующий эту фитазу, вектор экспрессии, содержащий фрагмент ДНК

Изобретение относится к медицине и касается пептидов, которые могут быть использованы для клеточной адгезии и заживления ран

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой фермент гликозилгидролазу (варианты), продуцируемый гифомицетами, в частности Chrysosporium lucknowense, а также нуклеиновокислотный конструкт для экспрессии гликозилгидролазы

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к производству бактериальных биопрепаратов

Изобретение относится к способу выделения генетически трансформированных клеток, в которые введена заданная последовательность нуклеотидов, заключающемуся в том, что трансформированные клетки получают избирательные преимущества без разрушения нетрансформированных клеток, а также к новым соединениям, которые используются в указанном способе

Изобретение относится к генной инженерии

Изобретение относится к области генетической инженерии и может быть использовано с целью получения фермента эндоксиланазы в промышленном масштабе

Изобретение относится к области генной инженерии и биотехнологии и может быть использовано в медико-биологической и фармацевтической промышленности

Изобретение относится к микробиологической промышленности и к генетической инженерии и может быть использовано для получения бета-галактозидазы

Наверх