Способ оценки степени тяжести синдрома склерокистозных яичников у девочек- подростков

 

Способ может быть использован в области медицины, в частности в гинекологии, и может применяться в условиях клиники для подбора адекватной терапии, соответствующей степени тяжести заболевания. В реакции иммунофлюоресценции определяют уровень половые гормоны связывающего глобулина в плазме крови у девочек-подростков и рассчитывают показатель андрогенной активности (ПАА) по формуле где Х = Т/ПГСГ, при этом Т - уровень тестостерона, ПГСГ - концентрация половые гормоны связывающего глобулина, n = 3 - число исследований, и при значимости ПАА > 0,72 диагностируют тяжелую степень синдрома склерокистозных яичников (ССКЯ), при 0,38 < ПАА ≅ 0,72 - среднюю, при 0,23 ≅ ПАА ≅ 0,38 - легкую степень, 0,14 ≅ ПАА < 0,23 - риск развития ССКЯ, при ПАА < 0,14 - отсутствие патологии. Способ обеспечивает количественную оценку степени тяжести ССКЯ и приводит к повышению точности оценки. 1 табл.

Способ оценки степени тяжести синдрома склерокистозных яичников (ССКЯ) у девочек-подростков относится к медицине, а именно к акушерству и гинекологии, и может быть использован в условиях клиники для подбора адекватной терапии и прогнозирвоания риска развития заболевания, а также оценки эффективности проводимой терапии.

Известен способ оценки степени тяжести ССКЯ [Крупко-Большова Ю.А. Гинекологическая эндокринология девочек и девушек. - К., 1986. - С. 81-91] в зависимости от выраженной триады клинических симптомов: нарушения менструальной функции, увеличения яичников, ановуляции (бесплодия). К причинам, препятствующим достижению указанного ниже технического результата при использовании известного способа, относится то, что в известном способе клинические симптомы не всегда отражают глубину гормональных нарушений в организме девочек подростков с ССКЯ. Часто встречается атипичное, моносимптомное течение синдрома. Нередко наличие сопутствующих фоновых заболеваний не позволяет своевременно и достоверно дифференцировать степень тяжести ССКЯ, основываясь только на клинических симптомах. В связи с этим дать оценку степени тяжести ССКЯ у девочек-подростков невозможно. Все это препятствует получению технического результата.

Известен также способ оценки тяжести ССКЯ [Патология полового развития девочек и девушек / Под ред. Ю.А.Крупко-Большовой, А.И.Корниловой. - К., 1990] по отношению уровня лютеинизирующего гормона к уровню фоликулостимулирующего гормона. Недостатком известного способа является его неинформативность по той причине, что особенности течения заболевания у девочек-подростков на ранних стадиях в пубертатном периоде характеризуется сложными и многочисленными нейрогуморальными взаимоотношениями, регулирующими процесс полового созревания, их стремительная перестройка в период пубертата предрасполагает к тому, что ввиду ряда причин гипоталямогипофизарная система, управляющая циклической секрецией гонадотропинов, не приобретает способности к ритмической секреции гонадотропных гормонов. Организм девочек-подростков отличается незрелостью механизмов гипоталамо-гипофизарно-яичниковой системы.

Наиболее близким способом того же назначения к заявляемому изобретению по совокупности признаков является способ диагностики синдрома склерокистозных яичников, в котором путем определения уровня половые гормоны связывающего глобулина в реакции иммунофлюоресценции [Пермяков Н.К., Алиева Э.А. // Архив патологии. - 1989. - Т. 51, N 8. - С. 26-38]. Осуществляют способ следующим образом. У обследуемой пациентки производят натощак забор 2 мл крови путем венопункции, затем дают крови свернуться и отделяют плазму путем центрифугирования и определяют содержание тестостерона иммунофлюоресцентным методом. Определение уровня тестостерона базируется на реакциях конкурентного связывания между меченным европием, тестостероном и тестостероном исследуемого образца сыворотки крови с поликлональными антитестостероновыми антителами, полученными от кроликов. Стандарт, контроль и образец сыворотки пациентки, содержащие тестостерон, препятствуют связыванию меченного европием тестостерона с антителами молекул. Блокирование агента в тестостерон-испытательном буфере содействует освобождению тестостерона от связывания протеинами в исследуемом образце. Вторые антитела, направленные против кроличьего иммуноглобулина (Ig G) наслаивают к основной фазе и связывают Ig G-тестостероновый комплекс, дающий удобное разделение антител - связанных и свободных антигенов. Испытательный раствор способствует диссоциации ионов европия от меченого тестостерона в раствор, где они формируют высокофлюоресцентные комплексы с компонентами испытательного раствора. Флюорисценция каждого образца - обратно пропорциональна концентрации тестостерона в образце. Определение уровня тестостерона не может быть строго специфичным тестом, так как повышение уровня тестостерона в крови может быть не только при ССКЯ, но и при ряде другой патологии (врожденной гиперплазии коры надпочечников, идиопатическом гирсутизме и т.д.), сопровождающейся гиперандрогенией. Кроме того, выявлено повышение уровня тестостерона является важным, но не единственным признаком, отражающим глубину и степень выраженности патологического процесса при синдроме склерокистозных яичников.

Таким образом, известный способ не дает возможности для количественной оценки ССКЯ вследствие недостаточной объективности при оценке степени тяжести синдрома, а в связи с этим невозможно сравнительно точно определить степень тяжести синдрома, так как он не обеспечивает количественную оценку степени тяжести ССКЯ в зависимости от уровня тестостерона.

В основу предлагаемого способа поставлена задача оценки степени тяжести ССКЯ у девочек-подростков путем определения уровня половые гормоны связывающего глобулина в реакции иммунофлюоресценции и показателя андрогенной активности, что дает возможность количественной и точной оценки степени тяжести ССКЯ.

Указанный технический результат достигается тем, что в плазме крови определяют уровень половые гормоны связывающего глобулина в реакции иммунофлюоресценции, степень гормонального дисбаланса по уровню половые гормоны связывающего глобулина и рассчитывают показатель андрогенной активности (ПАА) по формуле где X = Т/ПГСГ; Т - уровень тестостерона; ПГСГ - концентрация половые гормоны связывающего глобулина; n=3 - число исследований, и при значимости ПАА>0,72 диагностируют тяжелую степень ССКЯ, при 0,38<ПАА≅0,72 - среднюю, при 0,23≅ПАА≅0,38 - легкую степень, 0,14≅ПАА≅0,23 - риск развития синдрома склерокистозных яичников, при ПАА<0,14 - отсутствие патологии.

Новым в способе является то, что дополнительно определяют степень гормонального дисбаланса по уровню половые гормоны связывающего глобулина и рассчитывают показатель андрогенной активности по формуле
где X = Т/ПГСГ;
Т - уровень тестостерона;
ПГСГ - концентрация половые гормоны связывающего глобулина;
n=3 - число исследований,
и при значимости ПАА>0,72 диагностируют тяжелую степень ССКЯ, при 0,38<ПАА≅0,72 - среднюю, при 0,23≅ПАА≅0,38 - легкую степень, 0,14≅ПАА<0,23 - риск развития синдрома склерокистозных яичников, при ПАА<0,14 - отсутствие патологии.

Концентрация половые гормоны связывающего глобулина, в плазме крови, является важным фактором для определения пропорций биологически активных циркулирующих в крови половых стероидных гормонов. В крови половые гормоны связывающим глобулином обратимо связано от 97 до 99% циркулирующих тестостерона и эстрадиола, и только небольшая часть свободных стероидов является физиологически активной. Изменение концентрации половые гормоны связывающего глобулина (ПГСГ) перераспределяет тестостерон и эстрадиол между стероидсвязывающими протеинами и свободными фракциями в крови. Определение уровня половые гормоны связывающего глобулина и подсчет показателя андрогенной активности, предложенные в заявленном способе, предусматривает поэтому важную информацию для клинической оценки дисфункции репродуктивной системы и указывает на повышение активности андрогенов: повышение продукции тестостерона приводит к возрастанию концентрации его в плазме, в результате чего снижается уровень половые гормоны связывающего глобулина и возрастает концентрация свободного тестостерона, который стимулирует волосяные фолликулы и способствует развитию гирсутизма, характерного для ССКЯ; компенсаторное возрастание метаболического клиренса тестостерона может приводить к нормализации плазменного уровня тестостерона, но концентрация свободного тестостерона продолжает оставаться повышенной из-за снижения уровня половые гормоны связывающего глобулина и взаимовлияния сниженных концентраций половые гормоны связывающего глобулина и повышенных - свободного тестостерона.

Таким образом, новым в заявляемом способе является использование новых информативных параметров, а именно: отношение уровня тестостерона в плазме крови к уровню половые гормоны связывающего глобулина, что отражает глубину гормональных сдвигов в организме, и расчет показателя андрогенной активности. Это позволяет оценивать точно степень тяжести ССКЯ у девочек подростков за счет возможности количественной оценки, следовательно совокупность существенных признаков формулы дает возможность по глубине гормональных сдвигов количественно оценить степень тяжести заболевания с достаточной точностью, чтобы подобрать адекватную терапию и, кроме того, определение показателя комплексного гормонального дисбаланса у девочек-подростков с ССКЯ с помощью определения в плазме крови уровня тестостерона, половые гормоны связывающего глобулина, подсчет показателя андрогенной активности позволяют достоверно и точно оценить степень тяжести ССКЯ, а также может быть использовано для оценки эффективности проводимой терапии и прогноза течения заболевания. Заявляемый способ позволяет оценить глубину поражения яичников, что может служить для назначения адекватной терапии в пубертатном и постпубертатном периодах; прогнозировать риск развития нарушений менструальной функции и бесплодия при дальнейшем прогрессировании заболевания.

Заявленный способ осуществляют следующим образом.

Путем венопункции производится забор крови натощак из локтевой вены в количестве 4 мл. После центрифугирования методом иммунофлюоресценции определяют в плазме крови содержание тестостерона и половые гормоны связывающего глобулина. Сущность проведения реакций определения уровня половые гормоны связывающего глобулина заключается в повышении иммунофлюоресценции данного глобулина путем его диссоциации, причем два момента флюороиммунометрического испытания базируются на прямом техническом приеме с использованием анти-ПГСГ антител (продуцируемых кроликами) и моноклональных антител (полученных от мышей). При проведении процедуры разведения и определения содержания половые гормоны связывающего глобулина в стандарте, контроле и образце сыворотки крови пациентки молекулы ПГСГ реагировали одновременно с поликлональными анти-ПГСГ антителами, иммобилизированными на внутренней поверхности стенки микротитрационных пипеток и меченными европием моноклональными антителами в растворе. После отмывания подготовленные растворы были прибавлены к диссоциированным от меченых антител в раствор катионам европия (Еи³⁺), где они образуют флюоресцирующие комплексы с компонентами перечня растворов.

Флюоресценция в микротитрационных пипетках измеряется флюоросчетчиком, так как световое излучение от каждого образца прямо пропорционально концентрации половые гормоны связывающего глобулина в образце. Концентрацию половые гормоны связывающего глобулина в образцах сыворотки пациентов сравнивают и рассчитывают по стандартной кривой интенсивности флюоресценции половые гормоны связывающего глобулина.

Перечень растворов, готовых к употреблению, для проведения реакций определения ПГСГ в образцах сыворотки.

1. ПГСГ-стандарт.

Добавить 0,5 мл дистиллированной воды в каждый ПГСГ-стандарт и растворить содержимое мягким встряхиванием. Дать отстояться перед употреблением не менее 10 минут. Стабильность стандарта сохраняется 3 недели при t = 2 - 8^oC.

2. Анти-ПГСГ-Еи.

Этот раствор должен быть разбавлен в желаемую концентрацию не менее чем за час до использования.

3. Проба буферных концентратов.

Налить 50 мл пробы буферного концентрата и разбавить до 3-х кратного увеличения, добавив 100 мл высококачественной дистиллированной воды, чтобы получить буферную пробу (pH 7,75). Хранить этот буфер от 2 до 8^oC.

4. Очистительный концентрат.

Налить 20 мл очистительного концентрата в чистый сосуд и разбавить в 25-кратном увеличении, добавив 480 мл высококачественной дистиллированной воды, чтобы получить буферный очистительный раствор (pH 7,75). Этот очистительный концентрат может храниться в течение двух недель при температуре от 2 до 30^oC.

Количественная испытательная процедура (процедура количественного определения уровня ПГСГ).

1. Дать реагентам достичь комнатной температуры 20-25^oC.

2. Расставить и разметить колбы для смешения стандартов и образцов (1: 100). Это производится аккуратным смешиванием 10 мл сыворотки с 1 мл испытательного буфера. Взболтнуть растворы.

3. Переведите и закрепите требуемое количество микротитроционных пипеток, обеспеченных набором реактивов, в пипеточной рамке. Пипетки могут быть закрыты вместе, чтобы убедиться в безопасности закрепления. Пронумеровать пипетки. Оставшиеся пипетки запечатать в пластиковую сумку.

4. Приготовить раствор, меченный европием, в течение одного часа (за час до использования). Важно, что бы этот испытательный буфер не входил в контакт с баховым раствором, не готовым к немедленному использованию. Рекомендуется, чтобы объем базовой смеси, требуемый для растворения, удалялся из анти-ПГСГ-Еи чистой дезинфицируемой пипеткой (не выливать из этой чистой пипетки базовую смесь), освободить в свободный пластмассовый тюбик или стеклянный пузырек, включающий объем испытательного буфера, смещать до конца. Рекомендуем использовать пустую бутылочку из-под испытательного буфера (50 мл) для приготовления меченого раствора, как это было с пипеткой, рекомендуемой для приготовления метки.

5. Тщательно наполнить двойные пипетки 25 мл разведенного стандарта ПГСГ и разведенного образца сыворотки пациента.

6. Прибавить 200 мл разбавленного анти-ПГСГ-Еи меченого раствора к каждому источнику.

7. В течение двух минут встряхивать рамку при помощи автоматического приспособления, затем - инкубация рамки 2 часа при комнатной температуре.

8. После инкубации - аспирация и мытье каждой полосы источника.

9. Прибавить 200 мл из перечня растворов прямо из бутылки реагентов к каждому источнику использования пипеткой. Этот объем должен пипетироваться точно, потому что ионы европия, являющиеся меткой, диссоциируют в этот раствор и от концентрации его зависит результат флюоресценции.

10. Встряхивать рамку автоматическим приспособлением в течение 5 минут. После встряхивания ждать 50-15 минут для измерения флюоресценции.

11. Измерение флюоресценции проводится на флуориметре "Аси" 1230 с использованием избирательной программы для автоматического измерения и подсчета результатов.

В таблице приведены результаты сопоставления заявленного способа и способа-прототипа, а также данные клинических проявлений и гормональных сдвигов в организме девочек-подростков с синдромом склерокистозных яичников.

Полученные результаты указывают на отсутствие достоверных различий в оценке степени тяжести гормонального дисбаланса при применении комплексной оценки с использованием ряда клинико-лабораторных, функциональных и ультразвуковых методов диагностики степени тяжести ССКЯ и применении заявленного способа.

На ранних стадиях у девочек-подростков заболевания отношение уровня лютеинизирующего гормона к уровню фолликулостимулирующего гормона не информативно. Имеет место монотонно низкий уровень лютеинизирующего гормона в крови на фоне нормального или несколько повышенного уровня фолликулостимулирующего гормона. В пубертатном периоде подсчет яичникового маточного индекса (ЯМИ) также не является достаточно информативным критерием диагностики ССКЯ, особенно на ранних стадиях развития заболевания, так как отсутствует выраженное увеличение яичников в связи с относительно малой длительностью течения заболевания.

Наиболее информативным критерием диагностики степени тяжести синдрома является определение концентрации ПГСГ и подсчет ПАА, так как концентрация половые гормоны связывающего глобулина связана с уровнями эстрадиола и тестостерона в плазме крови, а последние взаимодействуют по механизмам прямой и обратной связи с уровнями лютеинизирующего и фолликулостимулирующего гормонов. Таким образом, ПАА позволяет с большой информативностью и точностью судить о состоянии гипоталамо-гипофизарно-яичниковой системы и о гормональном дисбалансе в организме у девочек-подростков с ССКЯ.

Пример 1. К подростковому гинекологу обратилась больная С., 14 лет, мед. карта N 25 с жалобами на нерегулярные редкие менструации. Объективно: Ma₂Aх₃Pв₃Me₁₁, склонность к ожирению. Гирсутного синдрома нет. Данные гормонального обследования: ЛГ=1,84 ЕД/л; ФСГ=2,58 Ед/л; ЛГ/ФСГ=0,72; Е=0,2 нмоль/л; П=0,1 нмоль/л; Т=5,0 нмоль/л; К=342 нмоль/л; ТЭСГ= 16,66 нмоль/л. УЗИ: матка размерами 41х24х33 мм, правый яичник 37х30х24 мм, левый яичник 34х23х29 мм, оба яичника мелкокистозно изменены. Комплексная оценка степени тяжести ССКЯ совпадает с оценкой по показателю андрогенной активности (ПАА= 0,3) и соответствует легкой степени течения заболевания.

Пример 2. К подростковому гинекологу обратилась больная Т., 15 лет, мед. карта N 3 с жалобами на редкие менструации, гирсутный синдром. Объективно Ma_2-3Ax₃Pв₄Me₁₄, тенденция к избытку массы тела, умеренно выраженный гирсутный синдром. Данные обследования: ЛГ=9,447 ЕД/л; ФСГ=2,8 ЕД/л; ЛД/ФСГ=3,37; Е= 0,3 нмоль/л; П=6,6 нмоль/л; К=669,1 нмоль/л. УЗИ: матка 44х14х24 мм, гипопластична, правый яичник 38х24 мм, левый яичник 37х23 мм. При подсчете показателя андрогенной активности его значение составило 0,56, что соответствует средней степени течения заболевания и согласуется с комплексной оценкой состояния гормонального дисбаланса, в том числе и при изучении цирфорального ритма секреции гонадотропинов у данной больной.

Пример 3. В стационар поступила больная Г., 16,5 лет, мед. карта N 61 с жалобами на нарушение ритма менструаций в сторону полименореи, повышенное оволосение тела. Объективно: Ma₃Ax₃Pв₄Me₁₃, несколько повышенного питания, выраженный гирсутный синдром. Данные обследования: ЛГ=0,166 ЕД/л; ФСГ=3,152 ЕД/л; ЛГ/ФСГ= 0,053 (не информативно), Е₂=0,8 нмоль/л; П=0,1 нмоль/л; К=214 нмоль/л; Т= 11,2 нмоль/л; ТЭСГ=16,1 нмоль/л; ПАА =0,695. УЗИ: матка гипопластична 40х32, ОД= 41х21 мм, ОС=42х22 мм, мелкокистозно изменены. Оценка степени тяжести соответствует средней тяжести течения ССКЯ (Б), что согласуется с данными патологического исследования N 732-33 после оперативного лечения: клиновидной резекции обоих яичников.

Пример 4. В стационар поступила больная У., 15 лет с жалобами на отсутствие менструации в течение 1 года 3 месяцев, мед. карта N 133. Объективно: Ma_2-3Ax₃Pв₄Me₁₂, тенденция к избыточной массе тела, умеренно выраженный гирсутный синдром. Данные гормонального обследования: ЛГ=8,78 ЕД/л; ФСГ=4,76 ЕЛ/л; ЛГ/ФСГ= 1,845; Е₂=0,4 нмоль/л; П=9,8 нмоль/л; Т=12,9 нмоль/л; ТЭСГ== 14,5 нмоль/л; ПАА =0,95. Данные клинических, лабораторных и патогистологических (N 949-950) методов исследования соответствуют тяжелой степени течения ССКЯ, что согласуется с подсчетом степени тяжести по ПАА.

Формула изобретения

Способ оценки степени тяжести синдрома склерокистозных яичников (ССКЯ) у девочек-подростков, включающий определение уровня половые гормоны связывающего глобулина в реакции иммунофлюоресценции, отличающийся тем, что дополнительно определяют степень гормонального дисбаланса по уровню половые гормоны связывающего глобулина и рассчитывают показатель андрогенной активности (ППА) по формуле

где X = Т / ПГСГ,
Т - уровень тестостерона;
ПГСГ - концентрация половые гормоны связывающего глобулина;
n - число исследований
и при значимости ППА > 0,72 диагностируют тяжелую степень ССКЯ, при 0,38 < ППА ≅ 0,72 - среднюю, при 0,23 ≅ ПАА ≅ 0,38 - легкую степень, 0,14 ≅ ПАА < 0,23 - риск развития синдрома склерокистозных яичников, при ПАА < 0,14 - отсутствие патологии.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2