Способ получения антиротавирусного иммуноглобулина

 

Изобретение относится к медицине и касается способа получения антиротавирусного иммуноглобулина, который может использоваться для иммунопрофилактики и иммунотерапии ротавирусной инфекции. Сущность изобретения заключается в разработке способа получения антиротавирусного иммуноглобулина, включающего выделение иммуноглобулина нормального фракционированием обычной донорской сыворотки этанолом при минусовых температурах по методу Кона, исследованием его на наличие антител к ротавирусу в реакции торможения непрямой гемагглютинации и объединением препаратов с титрами антител к ротавирусу не менее 1: 160. Технический результат заключается в разработке способа, позволяющего получать препарат масштабированно в больших количествах при сохранении высокой специфической активности. 1 ил., 1 табл.

Изобретение относится к области медицины, в частности, к иммунологии и может быть использовано для иммунопрофилактики и иммунотерапии ротавирусной инфекции.

Исследования последних лет показали (1), что важную роль в этилогии кишечных инфекций, наряду с бактериальной флорой, играют и вирусы, в основном, ротавирусы. Среди детей первых лет жизни ротавирус как единственный этиологический агент или в ассоциации с другими возбудителями кишечных инфекций обуславливает высокий процент заболеваемости ротавирусной диареей, иногда с летательным исходом.

В литературе описаны вспышки ротавирусных гастроэнтеритов с тяжелым течением не только у детей, но и взрослых. Тяжелое течение таких заболеваний, нередко с летальным исходом, особенно часто встречается в старших возрастных группах, с сопутствующей патологией (диабет, сосудистые заболевания и др.). Особенно опасна ротавирусная диарея для иммунокомпрометированных лиц (Х-связанная агаммаглобулинемия, IgA-дефицит, ятрогенный вторичный иммунодефицит, возникающий после облучения, иммуносупрессивной терапии и т.д.), у которых она может переходить в хроническую форму со всеми вытекающими отсюда последствиями. Если Х-связанная агаммаглобулинемия встречается очень редко, то IgA-дефицит может быть практически у каждого 10 000 жителя России. Поэтому разработка средств этиотропной терапии представляется актуальной как у детей, так и у взрослых.

Проводятся интенсивные исследования по разработке живой аттенуированной пероральной вакцины против ротавирусной диареи с использованием штаммов ротавируса человека и животных, однако до проведения массовой вакцинопрофилактики среди детей еще далеко, существующие химиотерапевтические препараты в основном мало эффективны.

Одним из перспективных аспектов иммунотерапии является применение иммуноглобулинов как молочных, так и сывороточных для лечения ротавирусной инфекции.

Серия работ посвящена применению концентрированных иммуноглобулинов молока от иммунизированных животных для профилактики и лечения заболеваний, вызываемых ротавирусами (J. Infection and Immunity, 1977, 268-270; Med. Microbiol. Immynol, 1985 174, 177-185). Молочные иммуноглобулиновые концентраты со специфической антительной активностью против ротавируса были получены путем иммунизации коров человеческим ротавирусом. Однако гетерологичные иммуноглобулины обладают рядом недостатков (возможность возникновения аллергических реакций, плохая усвояемость и т.д.).

Известен способ получения препарата, который выбран нами в качестве прототипа, содержащего в основном IgG-иммуноглобулин, для лечения ротавирусной инфекции. Препарат получен по методу Кона из сывороток крови людей с высоким титром естественно встречающихся антител к ротавирусу (2). По данным Losonsky G.A. et al. ротавирусная инфекция излечивается после орального применения иммуноглобулина, причем в фекалиях обнаруживаются иммунные комплексы ротавирус + иммуноглобулин, составляющие до 50% вводимого препарата. Количество ротавируса, не связанного в комплексах, уменьшалось, т.е. имела место элиминация вируса из кишечника. В моче больных обнаруживались фрагменты иммуноглобулинов, что может свидетельствовать о поступлении их в циркуляцию крови.

Однако недостатком способа является то, что препарат получают из сыворотки крови доноров с высокими титрами антител к ротавирусу в реакции торможения непрямой гемагглютинации (РТНГА)-1:640, что встречается крайне редко, и возможности отбора сырья (донорских сывороток) для последующего получения специфического иммуноглобулинового препарата ввиду равномерного распределения низких титров противовирусных антител ограничены. Сбор закладки для получения препарата требует длительного времени, а объем ее обычно незначителен, соответственно и выход препарата небольшой, что при наличии такой широко распространенной инфекции как ротавирусная, создает определенный дефицит в препарате и увеличивает его себестоимость.

Задачей настоящего исследования являлась разработка способа получения антиротавирусного иммуноглобулина, позволяющего получать препарат масштабированно в больших количествах, удовлетворяющих спрос на него, с относительно низкой себестоимостью при сохранении высокой специфической активности. Нашими исследованиями показано, что несмотря на то, что исходные сыворотки доноров имеют низкий титр антител к ротавирусу 1:4, при получении из них иммуноглобулина, титры антител к ротавирусу возрастают и достигают величин, которые можно считать защитными при данной инфекции. Нами установлено, что имммуноглобулин человека нормальный может быть использован в качестве исходного сырья для выделения антиротавирусного иммуноглобулина. Титрование препаратов иммуноглобулинов на наличие антител к ротавирусу дает основание утверждать, что около 50% серий нормального иммуноглобулина человека могут использоваться как антиротавирусный иммуноглобулин. При исследовании 80 серий препаратов иммуноглобулина человека, нормального на наличие антител к ротавирусам, было обнаружено, что низкие титры (1:80) встречались в 22 образцах, средние титры (1:160 и 1:320) в 52 образцах и высокие (1:640) в 6 образцах. В 60 донорских сыворотках титры были низкие (1:4) (см. таблицу).

Важно, что иммуноглобулин человека нормальный получают из обычного сырья (донорской сыворотки), которое можно получать в больших количествах.

Сущность способа Способ осуществляется следующим образом Исходное сырье для получения антиротавирусного иммуноглобулина - иммуноглобулин человека нормальный - получают по традиционному методу Кона, т.е. фракционированием обычной донорской сыворотки этанолом при минусовых температурах (см. схему 1) (3).

Далее образцы полученных препаратов титруют на наличие антител к ротавирусам в реакции торможения непрямой гемагглютинации (РТНГА). Определение проводят с эритроцитарными ротавирусными диагностикумами иимуноглобулиновыми жидкими для РНГА и РТНГА (например, диагностикум фирмы "Ротатест", или другими аналогичными) по прилагаемым к ним инструкциям. Препараты с титрами антител к ротавирусу не ниже чем 1:160 объединяют.

Пример получения Полученные по методу Кона препараты иммуноглобулина человека нормального (10 серий) титровали в РТНГА на наличие антител к ротавирусу.

Постановка РТНГА Для постановки РТНГА требуются следующие ингредиенты: 1. Дистиллированная вода.

2. Полистироловые планшеты.

3. Асцитная жидкость иммунизированных ротавирусом крыс (ИАЖ).

4. Диагностикум эритроцитарный ротавирусный иммуноглобулиновый (ЭД) - формалинизированные эритроциты барана, покрытые иммуноглобулином крыс, и иммунизированных ротавирусом обезьян.

5. Антиген ротавируса сухой (АГ).

Антиген растворяют 0,9%-ным раствором хлорида натрия в объеме, указанном на этикетке, получая разведение 1:32. Для проведения РТНГА используют АГ в рабочем разведении, содержащем 4 агглютинирующих единицы (АЕ) в 25 мкл. Для определения рабочего разведения антиген титруют в РНГА.

Титрование антигена. Готовят в планшетах 2 ряда двукратных разведений антигена ротавируса от 1:32 до 1:8192. Для этого во вторые-шестые лунки двух рядов вносят по 25 мкл 0,9%-ного раствора хлорида натрия, в каждую лунку второго ряда 25 мкл ИАЖ (контроль специфичности реакции). Планшет встряхивают для перемешивания реагентов и оставляют при температуре 15-25^oC на 20 мин. Затем во все лунки вносят по 25 мкл ЭД. Планшет встряхивают и оставляют при температуре 15-25^oC для оседания эритроцитов.

Контроль РТНГА 1. Положительный контроль с ИАЖ. Выполняют по методике РТНГА.

2. Контроль рабочей дозы антигена. Рабочую дозу антигена разводят 2, 4, 8, 16 раз и выполняют по методике РНГА.

3. Контроль ЭД на неспецифическую агглютинацию. В 2-3 лунки вносят по 50 мкл 0,9%-го раствора хлорида натрия и 2 мкл ЭД.

4. Контроль исследуемого иммуноглобулина. Смешивают по 25 мкл иммуноглобулина в разведении 1:4 0,9%-ного раствора хлорида натрия и ЭД.

Учет результатов РТНГА Проводят после полного оседания эритроцитов следующим образом: 0 - 1 + - положительная реакция; 2 + - сомнительная реакция;
3 - 4 + - отрицательная реакция.

В контроле 1 должна быть положительная реакция в первых лунках. Результат контроля 2 должен соответствовать титру АГ при определении рабочей дозы. В контроле 3 и 4 агглютинация должна отсутствовать.

Определение антител к ротавирусам. Наибольшее разведение АГ, которое вызывает агглютинацию 3+, соответствует 1 АЕ. Готовят рабочее разведение, содержащее 4 АЕ. Например, при титре АГ 1:1024 его рабочее разведение будет равно 1:256.

Исследуемые серии иммуноглобулина разводят 9,0%-ным раствором хлорида натрия 1:4 и прогревают 30 мин в водяной бане при температуре (56±1)^oC.

РТНГА проводят в объеме 75 мкл. Готовят двукратные разведения иммуноглобулина от 1:4 до 1:1024 в объеме 25 мкл на 0,9%-ном растворе хлорида натрия. Во все лунки с разведением иммуноглобулина добавляют по 25 мкл антигена (4 АЕ). Планшет встряхивают и оставляют на 20 мин при 15-25^oC, затем вносят во все лунки по 25 мкл ЭД. Планшет встряхивают и оставляют на 1,5 - 2 ч при температуре 15 - 25^oC.

Титром иммуноглобулина считают его наибольшее разведение, которое дает положительную реакцию (0 - 1+) с 4 АЕ антигена.

Из 10 серий пять содержали титр 1:160 - 1:320 т.е. считались антиротавирусным препаратом.

Иммуноглобулиновый препарат с титрами 1:160 - 1:320 в РТНГА был применен в клиниках на детях, больных острыми кишечными инфекциями (ОКИ) ротавирусной этиологии (253 ребенка в возрасте от 3-х месяцев до 5 лет), без назначения каких-либо антибактириальных средств. 102 ребенка составили контрольную группу, получавшую общепринятую терапию (антибактериальные препараты, препараты для оральной регидратации, ферменты и т.д.). Группы больных были рандомизированы по возрасту и тяжести заболевания (тяжелые и среднетяжелые формы). Достоверность результатов проведенных исследований констатировалась оценкой клинической эффективности на основании использования двойного слепого метода.

Препараты назначили перорально за 20-30 мин до еды по 1 ампуле три раза в день в течение 4-5 дней. Контрольная группа получала обычный курс антивирусной терапии. Результаты испытаний позволили сделать следующие выводы:
1. При введении детям, больным ротавирусной инфекцией (лабораторное подтверждение), антиротавирусного иммуноглобулина побочные реакции отсутствовали (т. е. препарат не вызывает аллергических реакций, нетоксичен, нереактогенен).

2. Клиническая эффективность у больных, получавших антиротавирусный иммуноглобулин, составила 93,1%.

3. Стул нормализовался быстрее при лечении антиротавирусным иммуноглобулином - 2,9 дня (в контроле 6,5 дня).

4. Антиротавирусный иммуноглобулин способствовал элиминации (удалению) ротавируса. Санация отмечена у 63% больных, получавших иммуноглобулин (в контроле - 42%).

5. При приеме антиротавирусного иммуноглобулина установлено нарастание числа лакто- и бифидобактерий, а также кишечной палочки с нормальной ферментацией, в динамике заболевания, что не наблюдалось в контроле.

6. Получены положительные результаты лечения ротавирусной диареи антиротавирусным иммуноглобулином у взрослых (60 больных).

Предложенный нами препарат антиротавирусного иммуноглобулина человека для энтерального применения способствовал улучшению исхода лечения больных тяжелой и среднетяжелой формой ротавирусной инфекции и рекомендован для внедрения в практику здравоохраннения.

Литература
1. А.Г. Букринская, Н.М. Грачева, В.И. Васильева. Ротавирусная инфекция. - М.: "Медицина", 1989.

2. G.A. Losonsky, J.P. Johnson, J.A. Winkelstein, R.J. Jolken. J. Clin. Invest., 1995, 76, 6, 2362-2367.

3. Н. В. Холчев, Я.И. Колесникова. О методах получения и стандартизации гамма-глобулина. - Материалы 13-го съезда гигиенистов, эпидемиологов, микробиологов, инфекционистов. М., 1959 г. 2, с. 729-731.

Формула изобретения

Способ получения антиротавирусного иммуноглобулина для энтерального введения, отличающийся тем, что иммуноглобулин человека нормальный выделяют по методу Кона фракционированием обычной донорской сыворотки этанолом при минусовых температурах, исследуют его на наличие антител к ротавирусу в реакции торможения непрямой гемагглютинации и препараты с титрами антител к ротавирусу не менее 1 : 160 объединяют.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2

NF4A Восстановление действия патента Российской Федерации на изобретение

Извещение опубликовано: 20.07.2005        БИ: 20/2005