Способ идентификации клеток-предшественниц эпителиоидных клеток

 

Изобретение относится к медицине, в частности к гематологии. Адгезированные в течение 1 ч на стекле мононуклеарные клетки, выделенные из крови или других биологических жидкостей в виде клеточных суспензий, культивируют в лунках в среде для культивирования, содержащей 50 мкг/мл L-гидроксипролина, при 37^oC в течение 1 ч во влажной атмосфере, содержащей 5% СO₂, затем вносят в культуру микросферы полистиролового латекса, культивируют еще 1 ч, клетки последовательно фиксируют раствором глютарового альдегида и метанолом, при использовании фазово-контрастной микроскопии подсчитывают количество (%) распластанных моноцитов плазмоцитоидного типа, имеющих большое овальное или округлое "просветленное" ядро (преобладает эухроматин), содержащее одно небольшое ядрышко неправильной формы, не фагоцитирующих частицы латекса, приобретающих при распластывании форму равнобедренного треугольника со сглаженными углами или трапеции, не формирующих цитоплазматические отростки, и обладающих выраженной полярностью; все клетки, удовлетворяющие одновременно всем перечисленным требованиям, являются коммитированными клетками-предшественницами эпителиоидных клеток. Способ позволяет количественно оценивать величину пула коммитированных клеток-предшественниц эпителиоидных клеток (ЭК) в организме при всех патологических ЭК-гранулематозных процессах, что необходимо для разработки новых методов дифференциальной диагностики гранулематозных болезней.

Изобретение относится к медицине, а именно к гематологии и клинической иммунологии, и может быть использовано для количественной оценки пула ранних коммутированных клеток-предшественниц эпителиоидных клеток (пре-ЭК) в крови и других биологических жидкостях (эксудатах) человека и лабораторных животных в норме и патологии, в частности при патологических процессах, при которых в организме развиваются ЭК-гранулемы, главным образом, при различных гранулематозных болезнях. Необходимость данного изобретения продиктована потребностями медицины в разработке новых методов дифференциальной диагностики гранулематозных болезней, а также новых методов оценки эффективности их лечения.

Известно, что эпителиоидные клетки (ЭК) образуются в очагах гранулематозного воспаления при патологических процессах различной этиологии. Эпителиоидно-клеточные гранулемы или отдельные скопления ЭК (ЭК-кластеры) формируются при многих инфекционных заболеваниях, при некоторых ревматических и аутоиммунных заболеваниях, при лимфопролиферативных заболеваниях и гистиоцитозах, при развитии опухолей различного гистогенеза, при заболеваниях неизвестной или недостаточно изученной этиологии, при попадании в организм солей некоторых металлов, инородных тел, полимеров, аллергенов различного происхождения, а также при ряде патологических состояний организма.

В настоящее время считается общепризнанной следующая концепция происхождения и дифференцировки ЭК. Утверждается, что ЭК трансформируются из макрофагов (Мф), находящихся в очаге, где протекает патологический процесс (воспаление и т.п.), и при некоторых условиях - непосредственно из моноцитов (Мн) крови. В тех случаях, когда говорится о дифференцировке Мн в ЭК, предполагается, что Мн сохраняют практически равные потенции к дифференцировке в Мф и ЭК, но в силу какого-то особенного сочетания факторов, формирующих микроокружение в очаге воспаления или опухолевой ткани, включается определенная генетическая программа и происходит детерминация Мн, направляющая дифференцировку Мн в ЭК.

Еще в относительно "старых" работах по гематологии указывалось на то, что определенная гетерогенность в популяции Мн может быть связана с их различным происхождением. Н. Д. Стражеско и Д.Н. Яновский (вместе с Крюковым, Паппенгеймом, Феррата и др.) полагали, что "моноцит это понятие не однородной клеточной формы, а собирательное понятие для различных, близких по внешним морфологическим признакам, но неоднородных по происхождению клеток" (1963). На существование нескольких разновидностей Мн и Мф впоследствии указывали и другие авторы (Архипов С.А., 1995; Шубникова Е.А., 1981; Суслов А.П., 1984; Epstein W., Fukuyama K., 1989; Ryu J. et al., 1992; Williams G,. T., Williams W.J., 1983).

Вопрос о возможности идентификации ранних клеток-предшественниц ЭК в крови или других биологических жидкостях (перитонеальный эксудат и т.п.) никем до настоящего времени серьезно не рассматривался, поскольку предполагалось, что детерминация Мн в направлении ЭК-дифференцировки может происходить только в "ткани-мишени", "пораженной" патологическим процессом. Предположение, высказанное G. Williams и W. Williams (1983), о том, что ЭК дифференцируются из каких-то особых специализированных в определенном направлении Мн, не было подкреплено в свое время конкретными факторами.

В результате проведенных исследований впервые автором показано, что детерминация мононуклеарных пре-ЭК происходит еще в костном мозге, т.е. до поступления их в "ткани-мишени". Таким образом, показано, что определенная субпопуляция Мн крови уже является коммитированной в ЭК-направлении дифференцировки. На основании полученных данных разработан метод идентификации Мн с фенотипом клеток-предшественниц ЭК (пре-ЭК) по некоторым морфофункциональным характеристикам, отличающих пре-ЭК от Мн - предшественников Мф. Таким образом, появляется возможность регистрировать величину пула Мн-предшественников ЭК в организме при самых различных заболеваниях, при которых развиваются ЭК-гранулемы. Оценка пула пре-ЭК в крови и других биологических жидкостях в динамике гранулематозных болезней позволит разрабатывать новые методы их диагностики, а также новые методы оценки эффективности лечения гранулематозных болезней.

Задача изобретения - разработать способ идентификации коммитированных клеток-предшественниц ЭК в крови и других биологических жидкостях (эксудатах) человека и лабораторных животных.

Цель изобретения - разработать способ идентификации коммитированных клеток-предшественниц ЭК в крови и других биологических жидкостях человека и лабораторных животных, позволяющий количественно оценивать величину пула коммитированных клеток-предшественниц ЭК в организме человека и лабораторных животных при всех патологических ЭК-гранулематозных процессах, что необходимо для разработки новых методов дифференциальной диагностики гранулематозных болезней, а также новых методов оценки эффективности их лечения.

Прототип изобретения отсутствует.

Способ (процедура) идентификации состоит в кратковременном культивировании тестируемых суспензий мононуклеарных клеток крови, выделенных при помощи метода разделения в градиенте плотности или клеток различных эксудатов организма (перитонеальный эксудат и т.п.), последующем последовательном внесении в однослойную культуру мононуклеарных клеток среды, содержащей повышенную концентрацию L-гидроксипролина, и микросфер полистиролового латекса и осуществляется следующим образом.

В лунки из "Parafilm" (SIGMA, США) с диаметром 6,0 мм, прикрепленные на обезжиренном покровном стекле, вносят микропипеткой по 0.05 мл клеточной суспензии, содержащей 4·10⁶/мл мононуклеарных клеток крови или клеток различных эксудатов организма в среде для культивирования (199 или RPMI). Клетки инкубируют при 37^oC во влажной атмосфере, содержащей CO₂, в течение 1 часа для прикрепления к стеклу, неадгезированные мононуклеары (большая часть из которых представлена лимфоцитами) осторожно удаляют из лунки. Адгезированные клетки инкубируют для увеличения степени их распластывания в среде, содержащей 50 кг/мл L-гидроксипролина, при 37^oC во влажной атмосфере, содержащей 5% CO₂. Через 1 час после начала культивирования клеток в среде с повышенной концентрацией L-гидроксипролина стекла промывают в свежей порции среды и вносят в культуру клеток среду, содержащую частицы полистиролового латекса с диаметром 1 мкм. Через 1 час монослой Мн осторожной отмывают от частиц латекса в свежей среде, клетки фиксируют на стекле последовательной обработкой 2% раствором глютарового альдегида, приготовленном на растворе Хенкса, и метанолом соответственно 1 и 7 минут, заключают в глицерин клетками вниз на предметных стеклах и при использовании фазово-контрастного микроскопа подсчитывают количество (%) распластанных Мн плазмоцитоидного типа, не фагоцитирующих микросферы латекса, обладающих определенным, характерным для пре-ЭК типом распластывания. Плазмоцитоидные Мн, имеющие большое овальное или округлое "просветленное" ядро (в ядре преобладает эухроматин), содержащее одно небольшое ядрышко неправильной формы, не фагоцитирующие частицы латекса, приобретающие при распластывании форму равнобедренного треугольника со сглаженными углами или трапеции, не формирующие цитоплазматические отростки, и обладающие выраженной полярностью, являются пре-ЭК. Для предварительной оценки количества пре-ЭК (%) необходимо провести цитологический анализ не менее 1000 Мн. Для точной оценки количества пре-ЭК (%) необходимо проанализировать 5000 Мн. По предварительным данным возможные пределы вариации содержания пре-ЭК в норме у человека 3-30 клеток на 10000 лейкоцитов крови.

Пример 1. Из перитонеальной полости мыши линии BALB/c (путем "вымывания" стерильной средой 199) получен перитонеальный транссудат, содержащий Мф, лимфоциты и небольшое количество (0,9%) гранулоцитов и тучных клеток. Клетки осаждены центрифугированием, надосадочная жидкость удалена, к осадку добавлена свежая порция стерильной среды 199, концентрация клеток в суспензии доведена до 4·10⁶/мл. Проведена процедура идентификации клеток-предшественниц ЭК (пре-ЭК) в культуре по морфофункциональным критериям, включающим морфологические особенности ядра, тип распластывания и способность к фагоцитозу, подсчитано количество (%) мононуклеарных клеток, обладающих морфофункциональными характеристиками пре-ЭК. Установлено, что на 1000 клеток моноцитарно-макрофагального типа приходятся 3 клетки-предшественницы ЭК, т. е. только 0,3% клеток моноцитарно-макрофагального типа являются пре-ЭК.

Пример 2. Из крови практически здорового человека методом фракционирования в градиенте плотности (на разделяющей смеси фиколла и верографина) получена суспензия мононуклеарных клеток, содержащая моноциты, лимфоциты и небольшое количество (0,5%) гранулоцитов. Клетки дважды отмыты центрифугированием (при 150 g) средой RPMI от примеси разделяющей смеси. После осаждения клеток к ним добавлена свежая порция стерильной среды RPMI, концентрация клеток в суспензии доведена до 4·10⁶/мл. Проведена процедура идентификации клеток-предшественниц ЭК (пре-ЭК) в культуре мононуклеарных клеток по морфо-функциональным критериям, включающим морфологические особенности ядра, тип распластывания и способность к фагоцитозу, подсчитано количество (%) Мн, обладающих морфофункциональными характеристиками пре-ЭК. Установлено, что на 1000 клеток моноцитарного типа приходится 1 пре-ЭК, т.е. только 0,1% Мн крови являются пре-ЭКЭ. В результате цитологического анализа 5000 Мн на 2-х препаратах клеточных культур установлено, что 0,08% Мн являются пре-ЭК. С учетом того, что количество Мн в крови составляло 5%, расчетное количество пре-ЭК на 100000 лейкоцитов составило величину 4.

Формула изобретения

Способ идентификации клеток-предшественниц эпителиоидных клеток, отличающийся тем, что адгезированные в течение 1 ч на стекле мононуклеарные клетки, выделенные из крови или других биологических жидкостей в виде клеточных суспензий, культивируют в лунках в среде для культивирования, содержащей 50 мкг/мл L-гидроксипролина, при 37^oC в течение 1 ч во влажной атмосфере, содержащей 5% СО₂, затем вносят в культуру микросферы полистиролового латекса, культивируют еще 1 ч, клетки последовательно фиксируют раствором глютарового альдегида и метанолом, при использовании фазово-контрастной микроскопии подсчитывают количество (%) распластанных моноцитов плазмоцитоидного типа, имеющих большое овальное или округлое "просветленное" ядро (преобладает эухроматин), содержащее одно небольшое ядрышко неправильной формы, не фагоцитирующих частицы латекса, приобретающих при распластывании форму равнобедренного треугольника со сглаженными углами или трапеции, не формирующих цитоплазматические отростки, и обладающих выраженной полярностью; все клетки, удовлетворяющие одновременно всем перечисленным требованиям, являются коммитированными клетками-предшественницами эпителиоидных клеток.