Новый белок эндотелиальных клеток головного мозга и композиция

 

Изобретение относится к новому выделенному и очищенному белку, который продуцируется эндотелиальными клетками головного мозга, имеет молекулярную массу приблизительно 67 кД по SDS-РАGЕ, причем упомянутый белок способен стимулировать пролиферацию клеток гладких мышц церебральных артериол. Также описана композиция, включающая новый белок. Изобретение обеспечивает получение нового средства предупреждения или лечения широкого разнообразия заболеваний сосудов головного мозга. 2 с. п.ф-лы, 7 ил.

Изобретение вообще относится к области неврологии и химии белков. Конкретнее настоящее изобретение относится к новому мембранному белку в 67 кД, секретируемому эндотелиальными клетками головного мозга.

Фактор роста нервной ткани (NGF) играет важную роль в развитии и выживании сенсорных, симпатических и некоторых холинергических нейронов. Пртоонкоген trk кодирует белок gp 14^trk, входящий в мембрану белок тирозинкиназу, экспрессия которого ограничивается только нервной тканью. Нейротрофические рецепторы trk A, B и C являются тирозинкиназами и экспрессируются в периферической и центральной нервных системах, причем каждый демонстрирует характерную временную и клеточно-специфическую картину экспрессии. Известно, что количество NGF в области поврежденных или воспаленных тканей возрастает в несколько раз, и это явление наблюдается в пределах времени инициации повреждения. NGF вовлекается в иммуномодуляцию через активацию тучных клеток, и также в процесс восстановления ткани. Эндотелиальные клетки капилляров головного мозга вместе с астроцитами играют важную роль в сохранении гематоэнцефалического барьера (ВВВ). Роль NGF в восстановлении капиллярного эндотелия после поражения ткани требует присутствия функциональных рецепторов NGF (trk-A) на эндотелиальных клетках для инициации ангиогенеза, необходимого для замены пораженных тканей.

В регуляторные механизмы роста вовлечены два протоонкогена, которые кодируют ядерные белки (c-fos, c-myc), так как они быстро индуцируются после обработки клеток полипептидными факторами роста и другими агентами. Индукция c-fos ассоциируется с разнообразием биологических событий, включая митоз, дифференциацию и деполяризацию нервных клеток. Эти наблюдения привели к предложению, что fos играет главную роль в системе сигнальной трансдукции как ядерный посредник.

Атеросклеротические изменения или атеросклеротические бляшки были в центре исследований в течение многих лет, и гистологические особенности хорошо описаны в показе четырех главных характеристик. Этими особенностями являются (1) клеточная пролиферация, особенно клеток гладких мышц; (2) возрастание отложения холестерина, особенно сложных эфиров холестерина; (3) выступы макрофагов, особенно тех, которые нагружены липидом, так называемых пенистых клеток, поскольку они выглядят наполненными жиром, плюс ассоциированные цитокины, продуцируемые макрофагами среди других клеточных элементов, включая клеточные элементы в крови; и (4) усиленный синтез элементов соединительной ткани, таких как эластин и глюкозаминогликаны. Каждая из этих четырех сфер гистологической выпуклости является средоточием интенсивных исследований, и хотя окончательная последовательность атерогенеза еще обсуждается и не определена, ясно, что он является многофакторным и включает сочетание ослабленного холестеринового обмена с возросшей пролиферацией клеток гладких мышц и с повышенной активностью цитокинов. Известно, что некоторые цитокины являются важными при регулировании слипания лейкоцитов, клеточного роста, вазомоторных функций, реконструкции сосудистой матрицы и при регулировании совместимости крови, чтобы свести к минимуму или исключить влияние тромбоза на артериальный эндотелий.

Неединственный элемент в отдельности вызывает атеросклероз, но, вероятно, регулирование одного из этих взаимодействующих элементов должно способствовать существенному снижению процесса атерогенеза. Например, снижение холестерина уже привело к уменьшению частотности ишемической болезни сердца у людей "с повышенным риском" такого заболевания, у которых уровень холестерина в сыворотке был уменьшен ниже 170 мг/дл. Повреждения сосудов, которые происходят при гипертензии, курении, применении пероральных противозачаточных средств, и другие повреждения, не связанные с уровнем холестерина в плазме, вызывают слипание тромбоцитов в месте повреждения. Такое слипание вызывает "реакцию выделения" в тромбоцитах с секрецией различных соединений, но в особенности тромбоксана А2 и аденозиндифосфата, и мобилизуют тромбоциты для увеличения агрегации. Кроме того, тромбоциты выделяют тромбоцитарный фактор роста (PDGF), который вызывает пролиферацию клеток гладких мышц и их миграцию к эндотелию, где клетки гладких мышц образуют начальные элементы атеросклеротической бляшки.

Процесс бляшкообразования ограничивается, в первую очередь, крупными сосудами, такими как аорта и артерии эластичного типа, такие как сонная, почечная, коронарная или средняя церебральная артерия. Однако более мелкие артериолы могут быть повреждены пролиферативным процессом, как при лакунарных ударах, при этом нагруженные жиром клетки и пролиферацию называют "липогиалинозом" ("lipohyalinosis"). Более того, при болезни Бинсвангера или при субкортикальной артериопатической энцефалопатии мелкие проникающие артериолы из белого вещества являются "концевыми сосудами" в процессинге неизвестной природы. Пролиферативный процесс этих более мелких сосудов может представлять собой нерегулируемую пролиферацию при нормальном присутствии фактора роста. Нормальное продуцирование фактора роста нервной ткани (NGF) клетками гладких мышц артерий и реакция NGF белка - trk-он- когена - предполагают паракринную функцию. Искажение или полная потеря регуляции этого паракринного контроля может привести к усиленной пролиферации клеток артериолярных гладких мышц и к сужению просвета и впоследствии к уменьшению кровотока к ишемии. Таким образом, нормальная пролиферация клеток гладких мышц, вероятно, соучаствует в атеросклерозе, и такой же неконтролируемый процесс в церебральных артериолах может привести к сужению просвета, ишемии головного мозга проводящих волокон и симптомам, подобным симптомам при ударе, и дименции.

При известном уровне техники не хватает эффективных средств предупреждения или лечения широкого разнообразия заболеваний сосудов головного мозга. Настоящее изобретение удовлетворяет эту давнишнюю потребность и требуется для техники.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения дается композиция вещества, содержащая выделенный и очищенный белок, который секретируется эндотелиальными клетками головного мозга, имеющий молекулярную массу приблизительно 67 кД по SDS-PAGE, причем упомянутый белок способен стимулировать пролиферацию клеток гладких мышц церебральных артериол.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения дается фармацевтическая композиция, содержащая выделенный и очищенный белок, который секретируется эндотелиальными клетками головного мозга, имеющий молекулярную массу приблизительно 67 кД по SDS-PAGE, причем упомянутый белок способен стимулировать пролиферацию клеток гладких мышц церебральных артериол, и фармацевтически приемлемый носитель.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения дается способ получения белка по настоящему изобретению, включающий стадии выращивания эндотелиальных клеток в питательной среде при температуре порядка 37^oC; сбора клеток и выделения и очистки белка по настоящему изобретению из упомянутых клеток.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения дается способ лечения заболевания сосудов головного мозга у человека, включающий стадию введения человеку фармакологически эффективной дозы олигонуклеотида, созданного для ингибирования продуцирования белка по настоящему изобретению.

Еще в одном варианте осуществления настоящего изобретения дается способ улучшения коллатерального церебрального кровообращения, включающий стадию введения человеку фармакологически эффективной дозы фармацевтической композиции по настоящему изобретению.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения дается способ определения тяжести сосудистомозгового заболевания у человека, включающий стадию измерения в сыворотке концентрации белка по настоящему изобретению.

Другие и дополнительные аспекты, особенности и преимущества настоящего изобретения станут явными из следующего далее описания представленных предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения, приведенных только с пояснительной целью.

Для более обстоятельного восприятия и понимания вышеперечисленных особенностей, преимуществ и целей настоящего изобретения, как и других, которые станут ясными, можно получить более конкретное описание изобретения, сущность которого кратко изложена выше, обратившись к некоторым вариантам его осуществления, которые иллюстрируются фигурами. Необходимо отметить, однако, что прилагаемые фигуры иллюстрируют предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения и, следовательно, не должны рассматриваться как ограничивающие его объем.

Фиг. 1 показывает уровни синтеза ДНК в эндотелиальных клетках головного мозга крысы (RBE) и в легочных эндотелиальных клетках (PEC). Включение тимидина измеряют в присутствии либо фактора роста нервной ткани (NGF), либо основного фактора роста фибробластов (bFGF), либо тромбоцитарного фактора роста (PDGF), либо среды с 4% сыворотки, либо контрольной среды.

На фиг. 2 показывается экспрессия TrkA в эндотелиальных клетках головного мозга крысы. Клеточные лизаты получают из эндотелиальных клеток головного мозга и их клеток PC-12, полипептиды расщепляют при электрофорезе в полиакриламидном геле в присутствии 7,5% додецилсульфата натрия (SDS-PAGE) и переносят на нитроцеллюлозную мембрану. Мембраны инкубируют в течение ночи с аффинно очищенным поликлональным анти-trkA, зондируют в течение одного часа со вторым антителом, конъюгированным с пероксидазой хрена, и обнаруживают, используя систему ECL-иммунологического анализа.

Фиг. 3 относится к продукту полимеразной (обратной транскриптазы) цепной реакции (RT-PCR) эндотелиальных клеток головного мозга крысы и контрольных клеток PC-12. Обратно транскрибируют пять мкг полной РНК и клеток PC-12, и затем амплифицируют PCR, используя trkA-специфические праймеры. Дорожки: 1) РНК PC-12; 2) РНК PC-12 + ДМСО; 3) и 4) ферменты и матричный контроль; 5) РНК эндотелиальных клеток головного мозга крысы с ДМСО; 6) РНК эндотелиальных клеток головного мозга крысы; и 7) маркер ДНК. Продукт в двести (200) пар оснований (указывается стрелкой), полученный с мРНК эндотелиальных клеток головного мозга крысы, идентичен продукту клеток PC-12.

Фиг. 4 иллюстрирует активацию комплекса АР-1 в эндотелиальных клетках головного мозга крысы с помощью NGF. Ядерные экстракты получают из эндотелиальных клеток головного мозга крысы, необработанных (контрольных) или обработанных в течение 15 мин 4% сывороткой, 300 мМ ТРА, 10 нг/мл bFGF или 100 нг/мл NGF. Ядерные экстракты (2 мкг белка) инкубируют с 2 мкг поли(d1-dс) и с ³²Р-меченным API зондом (0,5 нг) в течение 30 мин при комнатной температуре. Реакционную смесь загружают на 5% полиакриламидный гель и проводят электрофорез. Гель сушат и анализируют с помощью авторадиографии.

Фиг. 5 показывает индукцию c-fos с помощью NGF на эндотелиальных клетках головного мозга крысы. Ядерные экстракты (2 мкг) из эндотелиальных клеток головного мозга крысы предварительно инкубируют с добавлением и без добавления (контроль) антител к c- fos в течение 16 ч. Затем добавляют меченный ³²Р AP1 (0,5 нг), и анализируют комплексы на 5% неденатурированном геле.

Фиг. 6 показывает секрецию белка в 67 кД в эндотелиальных клетках головного мозга крысы с помощью NGF.

Фиг. 7 показывает секрецию белка в 67 кД в эндотелиальных клетках головного мозга крысы с помощью bFGF.

Настоящее изобретение описывает иммунологическое и основанное на PCR количественное определение экспрессии trk А в эндотелиальных клетках головного мозга крысы. Эндотелиальные клетки головного мозга крысы реагируют на фактор роста нервной ткани, и эти реакции видны по изменению возросшего включения тимидина, индукции генов, включая факторы транскрипции (AP1), и экспрессии мРНК для trk А, вероятно, через активацию fos-гена. Кондиционированные среды обработанных фактором роста нервной ткани эндотелиальных клеток головного мозга крысы содержат белок порядка 67 кД, который вызывает увеличенное включение (³Н) тимидина в клетки гладких мышц сосудов. Известно, что среди клеток, не являющихся нервными клетками, только В-клетки активируются NGF, и в результате возрастает продуцирование иммуноглобулина и пролиферация В-клеток. Таким образом, настоящее изобретение раскрывает механизм, при помощи которого NGF участвует в ангиогенезе эндотелиальных клеток головного мозга как при развитии коллатерального кровообращения, так и при пролиферации клеток гладких мышц.

Настоящее изобретение показывает, что в ответ на воздействие NGF на эндотелиальные клетки головного мозга усиливается синтез ДНК и trkA-рецепторного белка, а также ассоциированное выделение уникального белка, имеющего молекулярную массу 67 кД. Кроме того, происходит индукция ранних генов (комплекс АР-1). Анализ сдвига в геле с использованием анти-fos показывает быструю индукцию fos-гена. Индукция комплекса АР-1 в эндотелиальных клетках головного мозга крысы после стимуляции NGF приводит к предположению, что fos может функционировать в системе сигнальной трансдукции, что связывает короткое время событий, индуцированных внеклеточным сигналом, с длительным временем изменений в генной экспрессии. Настоящее изобретение показывает, что NGF является главным медиатором секреции нового белка в 67 кД, так как шестичасовая выдержка эндотелиальных клеток головного мозга крысы с фактором роста нервной ткани, выращенного на матрасе в 25 см², дает в результате достаточное количество белка, который может окрашиваться кумассии голубым, в то время как контрольные клетки не окрашиваются. Такие заметно высокие показатели секретируемого белка не изменялись более ранними пассажами. Ранняя культура, пассажи 3-14, показывает похожее количество секретируемого белка, хотя с 15 пассажа картина изменяется.

Уникальная реакция эндотелиальных клеток головного мозга крысы на фактор роста нервной ткани, которая не обнаруживается с периферическими эндотелиальными клетками, такими как легочные эндотелиальные клетки, участвует как в нормальных физиологических процессах, таких как коллатеральное кровообращение, так и при паталогических состояниях, таких как субкортикальная энцефалопатия или болезнь Бинсвангера, при которых нерегулируемая пролиферация клеток гладких мышц, в ответ на стимулированное NGF выделение фактора роста из эндотелиальных клеток головного мозга крысы может привести к пролиферации концевых артериол и сужению просвета.

Настоящее изобретение относится к способам регулирования пролиферации клетки гладких мышц церебральных артериол с помощью эндотелиальной клетки головного мозга крысы. С помощью положений настоящего изобретения специалист в этой области техники может манипулировать генами, контролирующими факторы роста, а также использовать антисмысловую технологию. Таким образом, настоящее изобретение может быть полезным при создании защитного коллатерального кровообращения и минимизации артериольного сужения и в конечном счете для предупреждения ударов.

Новый белок по настоящему изобретению может посредством изменения роста клеток гладких мышц влиять на стабильность, эластичность, растяжимость сосудов головного мозга и на целостность пульсирующего кровотока при нормальных условиях, изменять развитие и поддержание коллатериального кровообращения.

Такие ожидаемые нормальные физиологические функции, когда происходит искажение или реакция на внешние раздражители с усилением или с понижением экспрессии белка по настоящему изобретению, могут иметь значение при сосудисто-мозговых осложнениях, обнаруживаемых при различных заболеваниях и стресс-факторах. Аномальные реакции эндогенно могут находиться под отвечаемостью на появление этого белка, и стать причиной большей хрупкости сосудов головного мозга, что наблюдается при некоторых сосудистомозговых заболеваниях, таких как внутримозговое кровоизлияние, субарахноидальное кровоизлияние вследствие аневризм, и мигрень.

Кроме того, возросшая реактивность при избыточной пролиферации клеток гладких мышц может способствовать внутримозговому атеросклерозу, липогиалинозу, болезни Бинсвангера дли подкорковой артериопатической энцефалопатии, болезни Moya-moya и снижению гематоэнцефалического барьера с образованием отека мозга.

Когда белок в 67 кД по настоящему изобретению секретируется эндотелиальными клетками мозга, уровни циркуляции этого белка можно установить с помощью радиоиммуноанализа. При болезненных состояниях содержание этого белка в сыворотке будет соответствовать состояниям, таким как болезнь Бинсвангера, как аномальная реактивность на белок. С другой стороны, при нормальных физиологических ситуациях, таких как образование коллатерального кровообращения, связанные с кровотоком изменения при сосудистой коррекции могут инициировать эту роль белка в росте, а не в пролиферации.

В условиях нормальной физиологии и при паталогических состояниях контроль и регуляция белка по настоящему изобретению на клеточном и молекулярном уровне могут быть использованы специалистами в этой области техники в качестве средств оптимизации нормальной деятельности сосудов и минимизации заболевания. Способы, доступные в настоящее время, которые можно применить для модификации белка по настоящему изобретению, включают методы антисмысловых олигонуклеотидов и методы образования олигонуклеотидами трехцепочечных структур (triplex).Ожидается, что в будущем подобную роль могут играть лекарственные средства, модифицирующие специфический промотор или энхансерные области генов.

Предполагается конкретно, что можно получить фармацевтические композиции, используя новый белок по настоящему изобретению. В таком случае фармацевтическая композиция содержит новый белок по настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый носитель. Специалист в этой области техники легко сможет определить, без чрезмерного экспериментирования, соответствующие дозировки и способы введения нового белка по настоящему изобретению.

Средний уровень специалиста в области молекулярной биологии в последнее время значительно вырос. Специалист в этой области техники легко сможет без излишних экспериментов секвенировать новый белок эндотелиальных клеток по настоящему изобретению. Имея сведения о белке, специалист может легко клонировать ген, кодирующий белок. Знания о генной последовательности позволят специалисту в этой области техники создать образующие тройную цепочку олигонуклеотиды для ингибирования транскрипции гена, кодирующего новый белок эндотелия мозга по настоящему изобретению. Знания о белковой последовательности белка эндотелия головного мозга по настоящему изобретению позволят специалисту легко, без излишнего экспериментирования получить антисмысловые олигонуклетиды для ингибирования трансляции белка.

Таким образом, настоящее изобретение относится к композиции вещества, содержащей выделенный и очищенный белок, который секретируется эндотелиальными клетками головного мозга, имеющий молекулярную массу приблизительно 67 кД по SDS-PAGE, причем упомянутый белок способен стимулировать пролиферацию клеток гладких мышц церебральных артериол.

Также предлагается фармацевтическая композиция, содержащая белок по настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтические композиции настоящего изобретения пригодны для применения в различных системах доставки лекарственных средств. Краткий обзор существующих способов доставки лекарственных средств см. в Langer, Science, 249:1527-1533 (1990). Способы получения соединений, которые можно вводить, известны или очевидны для специалистов в этой области техники и описаны подробнее, например, в Remington, Pharmaceutical Science, 17th ed. Маск Publishing Company, Easton, PA (1988).

Настоящее изобретение также относится к способу получения белка по п. 1, который включает стадии выращивания эндотелиальных клеток в питательных средах при температуре порядка 37^oC; сбор клеток; и выделение и очистку белка по п. 1 из упомянутых клеток. Вообще, как описывается в настоящем изобретении, продуцирование белка по настоящему изобретению может стимулироваться фактором роста, таким как фактор роста нервной ткани.

Настоящее изобретение также относится к лечению заболевания сосудов головного мозга у человека, включающему стадию введения человеку фармакологически эффективной дозы олигонуклеотида, созданного для ингибирования продуцирования белка по настоящему изобретению.

Примерами представителей болезней сосудов головного мозга, которые можно лечить способами по настоящему изобретению, являются внутримозговое кровоизлияние, субарахноидальное кровоизлияние вследствие аневризм, мигрень, внутримозговой атеросклероз, липогиалиноз, болезнь Бинсвангера или субкортикальная артериопатическая энцефаолопатия, болезнь Moyamoya и снижение гематоэнцефалического барьера с образованием отека мозга.

Специалист в этой области техники может легко получить олигонуклеотиды, такие как образующие трехцепочечную структуру и антисмысловые олигонуклеотиды, которые могут быть полезными при ингибировании или регуляции продуцирования белка по настоящему изобретению.

Настоящее изобретение также относится к способу улучшения мозгового кровообращения, включающему стадию введения человеку фармакологически эффективной дозы композиции по п. 2. Настоящее изобретение также относится к способу определения тяжести заболевания сосудов головного мозга у человека, включающему стадию измерения содержания в сыворотке белка по п. 1.

Далее приводятся примеры с целью иллюстрации различных вариантов осуществления настоящего изобретения, и эти примеры не предназначены для какого-либо ограничения настоящего изобретения.

Пример 1. Выделение эндотелиальных клеток головного мозга крысы Эндотелиальные клетки головного мозга крысы выделяют из головного мозга новорожденных крыс, и клетки пассируют на желатинизированных чашках Петри в культуральной среде, содержащей 2% обедненной тромбоцитами человеческой плазмы, 2% фетальной бычьей сыворотки и 100 мкг/мл фактора роста эндотелиальных клеток. Колонии, которые обнаруживают эндотелиальную морфологию, субклонируют, и затем клонируют, и хранят замороженные клеточные штаммы. Определяют эндотелиальные свойства клеток, включая морфологию, нетромбогенную клеточную поверхность и экспрессию антигена фактора VIII.

Для иллюстрации действия NGF и других промотирующих рост веществ на пролиферативную реакцию эндотелиальных клеток головного мозга и легких клетки пассируют на 24-луночных чашках Петри и выращивают до 80% слияния. Задерживают рост культур 48-часовой инкубацией в DMEM (модифицированная по способу Дульбекко среда Игла), содержащей 0,1% бычьего сывороточного альбумина (BSA) и 0,1% глюкозы. Эксперименты начинают последовательной инкубацией клеток в DMEM без сыворотки в присутствии или в отсутствии факторов роста. Добавляют [³H]-тимидин, и после 24-часовой выдержки клеточные слои промывают и анализируют на включение трития в ДНК. Фиг. 1 показывает, что степень включения тимидина усиливается фактором роста нервной ткани в эндотелиальных клетках головного мозга крысы, но не в легочных эндотелиальных клетках.

Пример 2. Экспрессия trkA в эндотелиальных клетках головного мозга крысы.

Чтобы определить присутствие NGF-рецептора (gpl40trk) в эндотелиальных клетках головного мозга крысы, осуществляют вестерн-блоттинг, используя поликлональные trk-A, trk В и trk С. Эндотелиальные клетки головного мозга крысы и клетки PC-12 праймируют NGF в течение 7 суток. Клетки лизируют на качалке в буфере для лизиса NP-40 (20 мМ трис, pH 8,0, 137 мМ NaCI, 10% глицерина, 1% NP-40), содержащем 1 мМ PMSF (фенилметилсульфонилфторид), 0,15 мкг/мл апротинина и 1 мМ ортованадата натрия, при 4^oC в течение 20 мин. Получают клеточные лизаты, полипептиды расщепляют 7,5% SDS-PAGE и переносят на нитроцеллюлозные мембраны. Мембраны блокируют в течение 1 ч и затем инкубируют в течение ночи с аффинно очищенным поликлональным анти-trkA. Мембраны промывают и зондируют в течение 1 часа со вторым антителом, конъюгированным с пероксидазой хрена, и проявляют, используя систему иммунологического анализа ECL (AMERSHAM), в соответствии с рекомендациями изготовителя. Иммуноблот специфически положительный для trk А, идентифицированного как белок в 140 кД (фиг. 2).

Пример 3. Экспрессия trk-рецепторного гена Экспрессия trk-рецепторного гена в эндотелиальных клетках головного мозга крысы подтверждается присутствием мРНК. Полную РНК обратно транскрибируют, используя случайные гек-самерные праймеры. Смесь продуцированных кДНК затем используют в качестве источника матрицы для растягивания части trk-А-гена. Использованные праймер из кДНК, кодирующей внеклеточную область белка, представляет собой 5'- GGTCCAGGTGCCCAATGCC-TCGGH 5'-AGCTGCTCTAGATCATCCTTCTTCTCCACCGG. Фиг. 3 показывает, что продукт в 200 пар оснований, генерированный PCR, идентичен продукту, генерированному trk-A положительными клетками PC-12.

Пример 4. Активация комплекса АР-1 Действие NGF и других промотирующих рост веществ на экспрессию АР-1 в эндотелиальных клетках головного мозга крысы измеряют анализом подвижности сдвига в геле (фиг. 4).

Экстракты ядер получают из эндотелиальных клеток головного мозга крысы, из необработанных (контрольных) или из обработанных в течение 15 мин 4% сыворотки, 300 нМ ТРА, 10 нг/мл bFGF или 100 нг/мл NGF. В соответствии с описанием у Dignam et al, Nucl. Acids Res., 11:1475-1489 (1983), субконфлюентные эндотелиальные клетки головного мозга крысы промывают охлажденным льдом ЗФР и соскабливают в 5 мл ЗФР. Клетки осаждают центрифугированием (500·g в течение 5 мин), затем ресуспендируют в 5 мл гипотонического раствора (10 мМ трис-HCl [pH 7,9], 12,5 мМ MgCl₂ 10 мМ KCl, 0,5 мМ DTT (дитиотреитол)) и дают возможность набухать на льду в течение 10 мин. Затем клетки гомогенизируют 20 встряхиваниями в стеклянном гомогенизаторе Даунса, и осаждают ядра центрифугированием при 1000·g в течение 5 мин. Затем ядра ресуспендируют в ресуспензионном буфере (20 мМ трис-HCI [pH 7,9], 1,5 мМ MgCl₂, 20% глицерина, 0,5 мМ DTT), после чего добавляют 4 М KCl до конечной концентрации 0,3 М KCl. Суспензию осторожно качают на качалке при 4^oC в течение 30 мин, затем центрифугируют при 13000·g при 4^oC в течение 15 мин. Супернатант, содержащий ядерный экстракт, хранят до проведения анализов при -70^oC.

Сайт связывания АР-1 получают из двух олигонуклеотидов, обобщающие типичные последовательности представляют собой 5'- GATCTGTGACTCAGGGGA-3' и 5'-GATCTCGCGCTGACTCACA-3'. Синтетические олигомеры метят по концам по MAniatis et al. Добавляют конкурентные ДНК, и в это же время добавляют меченный фрагмент. Ядерные экстракты (2-5 мкг белка) инкубируют с 20 мкг поли(d1- dc) и dCT-³²Р-меченным AP1 зондом (0,5 нг) в течение 30 мин при комнатной температуре. Реакционную смесь загружают в 5% полиакриламидный гель (30: 0,8/акриламид: бисакриламид/30:0,8 гель в 0,25 ТВЕ Trisma, 25 мМ борной кислоты и 1 мМ ЭДТК) и подвергают электрофорезу. Гель высушивают и анализируют авторадиографией. Плотность полос АР-1 определяют количественно денситометром для биорадиоизображений (модель GS-650). Чтобы определить идентичность белков, вносящих вклад в комплекс АР-1, проверяют действие на эти комплексы антител, направленных против c-fos и c-jun.

Известно, что специфические антитела могут либо разрывать, либо замедлять комплексы белок-ДНК в невосстанавливающих гелях. Антитела добавляют к ядерным экстрактам эндотелиальных клеток головного мозга крысы, и перед добавлением меченного зонда инкубируют в течение 16 ч при 4^oC. Полосы (фиг. 5), показанные стрелками, представляют специфическое связывание последовательностей. Добавление холодного зонда показывает специфичность связывания, и c-fos-антитело предупреждает образованием нормального комплекса ДНК-белок и генерирует в форме, мигрирующей медленнее.

Пример 5. Стимуляция NGF белка в 67 кД Гликопротеины клеточной поверхности подвергают экстенсивной модуляции in vivo, и некоторые из этих гликопротеинов могут играть главную роль во многих клеточных процессах. Чтобы показать, что реакции эндотелиальных клеток головного мозга крысы на фактор роста нервной ткани ассоциируются с таким явлением, кондиционные среды из эндотелиальных клеток головного мозга крысы собирают после воздействия на них фактора роста нервной ткани. В основном клетки выращивают до слияния, обильно промывают и выдерживают с NGF в течение 6 ч (фиг. 6).

Среды собирают и концентрируют, используя центрикон (centricon) 30. Концентрированные образцы подвергают 7,5% SDS-PAGE по Laemmii, и идентифицируют полосы белка по окрашиванию кумассии голубым, и обесцвечивают в 30% метаноле с 10% уксусной кислотой (по объему). В средах эндотелиальных клеток головного мозга крысы, обработанных NGF, появляется полоса одного определенного белка (67 кД), и представляет приблизительно 80% от всего белка. Пятна окрашенного кумассии белка затем вырезают, подвергают перевариванию с протеазой V8, подвергают электрофорезу в 15% акриламидном геле и электроблоттируют. С помощью автоматического секвенирования определяют промежуточную аминокислотную последовательность из белков, разделенных электрофорезом. Последовательность одного из пептидов имеет вид Pro-Glu-Pro-Asp-Asp-Glu-Ala-Leu-Glu-Ala-Asn-Val-Ala-GIn.

Оказывается, что у этого белка имеется N-концевая блокада ацильной частицей. По амино-концам блокируются 50% всех эукариотических белков. Информация о последовательности усеченных пептидов не совмещается с последовательностью какого-либо известного белка в банке данных (банк GEN).

Пример 6. Стимуляция bFGF белка в 67 кД Настоящее изобретение также описывает выделение секреторного белка из кондиционных сред эндотелиальных клеток головного мозга крысы посредством обработки клеток небольшим количеством - 10 нг/мл - основных факторов роста фибробастов (фиг. 7). Электрофоретическая подвижность этого белка при SDS-PAGE почти такая же, как у белка, полученного при обработке эндотелиальных клеток головного мозга крысы фактором роста нервной ткани. Известно, что основной фактор роста фибробластов обладает ангиогенным действием на эндотелиальные клетки головного мозга крысы. Так, белок, стимулированный бычьим фактором роста фибробластов, подобным образом включается в ангиогенный процесс сосудистого эндотелия.

Белок, стимулированный основным фактором роста фибробластов, секретируется сразу же после обработки b-FGF, и секреция продолжается в течение по крайней мере 48 ч. Такой белок имеет молекулярную массу порядка 65 -70 кД, и обладает свойствами гликопротеина.

Все патенты и публикации, упомянутые в этом описании, указывают на уровень техники, к которой относится настоящее изобретение. Все упомянутые патенты и публикации включены здесь в качестве ссылок в той степени, как если бы указывалось, что каждая отдельная публикация включается в настоящее в качестве ссылки.

Специалист в этой области техники без труда поймет, что настоящее изобретение хорошо адаптируется для осуществления целей и получения конечных результатов и преимуществ, которые ему присущи. Приведенные примеры вместе с описанными в них способами, процедурами, обработками, молекулами и конкретными соединениями являются характерными представителями предпочтительных вариантов осуществления изобретения, являются примерами и не предназначаются для ограничения объема изобретения. Специалисты в этой области техники могут осуществлять изменения в них и использовать иначе, не выходя за пределы сущности настоящего изобретения, определенной объемом формулы изобретения.

Формула изобретения

1. Выделенный и очищенный белок, который секретируется эндотелиальными клетками головного мозга крысы, причем указанный белок отличается тем, что имеет молекулярную массу примерно 67 кДа, определяемую методом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS - PAGE), индуцируется фактором роста нервов, обладает активностью, стимулирующей пролиферацию клеток гладких мышц церебральных артериол и заключает в себе аминокислотную последовательность Pro - Glu - Pro - Asp - Asp - Glu - Ala - Leu - Glu - Ala - Asn - Val - Ala - Gln (SEQID No:5).

2. Композиция, включающая в себя белок по п.1 и фармацевтически приемлемый носитель.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10, Рисунок 11