Штамм актиномицета streptomyces avermitilis ссм 4697 - продуцент авермектинов

 

Изобретение относится к микробиологии и касается нового штамма актиномицета для производства антипаразитарных препаратов на основе авермектинов. Штамм Streptomyces avermitilis ССМ 4697 получен путем направленной селекции штамма Streptomyces avermitilis ВНИИСХМ-54 через ряд промежуточных вариантов. Отбор активных вариантов проводили по способности биосинтеза авермектинового комплекса с содержанием авермектина группы В1 не менее 36%. Содержание авермектинов в мицелии штамма ССМ 4697 составляет 2300 мкг/мл. Состав авермектинов, %: группа А11a + А) - 7,4; группа А2 + A) -22,4; группа В11a + В) - 49,6, группа B22a + В) - 20,6. Мицелиальные экстракты из штамма вызывают гибель нематод, клещей, вшей, мух, блох, тараканов, двукрылых и прямокрылых вредителей, платяной моли, ковровых и обойных жучков. 2 табл.

Область техники Изобретение относится к области микробиологии, в частности к микроорганизмам, продуцирующим авермектины, используемые для производства антипаразитарных препаратов.

Предшествующий уровень техники Известно, что актиномицет Streptomyces avermitilis при культивировании в присутствии источников углерода, азота и фосфора при постоянной аэрации продуцирует восемь близких по строению веществ, названных авермектинами, которые обладают резко выраженным антипаразитарным действием (патент GB 1573955, 1980 г.). Все авермектины по химическому строению являются 16-членными макролидами и отличаются между собой заместителями у 5 и 26 атомов углеродного кольца. Индивидуальные авермектины, получившие обозначения A1a, A1b, A2a, A2b, B1a, B1b, B2a и B2b, имеют различную биологическую активность. Наиболее активными являются авермектины B1, особенно B1a.

Развитие технологии получения авермектинов происходит по нескольким направлениям, к числу которых относятся получение штаммов, продуцирующих повышенные количества всего комплекса авермектинов или продуцирующих авермектины с преобладающим содержанием группы B1.

Известен штамм Streptomyces avermitilis АТСС 31272, продуцирующий в среднем 500 мкг/мл авермектинов (патент US 4310519, 1982 г.). Продуктивность штамма Streptomyces avermitilis ВНИИСХМ-51 (патент RU 2048250, 1995 г.) составляет 700 мкг/мл. Штамм Streptomyces avermitilis ВНИИСХМ-54 продуцирует уже 1500 мкг/мл авермектинов (патент RU 2054483, 1996 г.), причем содержание авермектина B1a достигает 35% и более. Во всех приведенных случаях авермектины выделяют из мицелия экстракцией индивидуальным органическим растворителем, смешивающимся с водой, с последующим разделением, например хроматографическим.

Сущность изобретения Авторами получен штамм, продуцирующий еще более высокие уровни авермектинов с повышенным содержанием в комплексе авермектинов группы B1 (B1a, B1b) - наиболее активных в биологическом отношении.

Штамм Streptomyces avermitilis CCM 4697, продуцирует в среднем 2300 мкг/мл авермектинов при размахе изменчивости 2000-3000 мкг/мл. Штамм депонирован в Чешской коллекции микроорганизмов в Брно.

Предлагаемый штамм был получен путем направленной селекции из исходного штамма Streptomyces avermitilis ВНИИСХМ-54 через ряд промежуточных вариантов. Отбор активных вариантов проводили по способности к биосинтезу авермектинового комплекса с содержанием B1 не менее 36%. Промежуточные варианты характеризовались высокой изменчивостью по авермектинообразованию, что позволяло использовать каждый из них в последующих этапах селекции, но не давало возможности применять в качестве промышленных штаммов. У промежуточных вариантов изменчивость последовательно составляла 50-140%, 49-130% и 78-143%, что соответствовало продуцированию 900-2500 мкг/мл; 950-2500 мкг/мл и 1650-3000 мкг/мл авермектинов.

Полученный штамм характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиологическими признаками.

Культура имеет спороносцы в виде правильных спиралей.

На 2%-ном глюкозокартофельном агаре на 14-21 день роста при 28oC, pH 6,8-7,2 образуются колонии 7-10 мм с серым воздушным мицелием и темно-каштановой обратной стороной колоний. В популяции, как правило, имеется около 5% серо-белых колоний с бежевой обратной стороной. Край колоний неровный с белым ободком. Поверхность колонии складчатая. К десятому дню роста на поверхности колонии могут образовываться белые бархатистые включения.

В табл. 1 представлены данные о цвете воздушного и субстратного мицелия, интенсивности спороношения, а также о наличии или отсутствии растворимых пигментов на различных органических и синтетических агаризованных средах.

Максимальное накопление авермектинов происходит на 7-8 сутки при скорости растворения кислорода 1,0-1,3 мМоль O2мин и температуре 28oC.

Сведения о физиолого-биохимических признаках штамма Streptomyces avermitilis CCM 4697 суммированы в табл.2.

Противопаразитарные свойства Мицелиальные экстракты вызывают гибель нематод, относящихся к родам: Haemonchus, Trichostrongylus, Ostrertagia, Nematodirus, Cooperia, Ascaris, Bunostomum, Oesophagostomum, Chabertia, Trichuris, Strongylus, Thichonema, Dictyocaulus, Capillaria, Heterakis, Toxocara, Oxyuris, Ancylostoma, Uncinaria, Toxascaris, Ascaridia.

Также их действие губительно для клещей, афидов, вшей, мух, блох, тараканов, двукрылых и прямокрылых вредителей, платяной моли, ковровых и обойных жучков.

Среднее содержание авермектинов в мицелии S. avermitilis ССМ 4697 составляет 2300 мкг/мл при размахе изменчивости 2000-3000 мкг/мл. Компонентный состав авермектинов следующий, %: группа A1(A1a+A1b) 5,0 - 7,2; группа A2(A2a+A2b) 21,6 - 24,5; группа B1(B1a+B1b) 48,5 - 50,0; группа B2(B2a+B2b) 18,4 - 23,0 Таким образом новый штамм-продуцент S. avermitilis ССМ 4697 позволяет получать на 50% больше авермектинов, чем известный штамм S. avermitilis ВНИИСХМ-54.

Для выделения авермектинов используют сухую биомассу, полученную при выращивании продуцента в глубинных условиях на известных питательных средах.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения
Пример 1
Споры штамма S. avermitilis ССМ 4697 выращивали на овсяном агаре в течение 10 суток при 27-29 oC. Кусочки агаровой среды со спорами внесли в качалочные колбы емкостью 750 мл, содержащие 75 мл среды следующего состава, %: глюкоза - 4,0; соевая мука - 0,6; белково-витаминный концентрат - 0,8; кукурузный экстракт - 0,4; CaCO3 - 0,1; K2HPO4 - 0,05; вода водопроводная. Глюкозу стерилизовали отдельно при 0,6 ати 30 минут и вносили в колбы непосредственно перед засевом. Остальные компоненты стерилизовали при 1,0 ати 40 минут. Значение pH до стерилизации 6,2-6,4.

Колбы установили на качалку с числом оборотов 220 в минуту и выращивали инокулят при 27-29oC в течение 36 часов. Затем инокулят в количестве 5% перенесли в колбы с ферментационной средой следующего состава, %: глюкоза - 7,0; соевая мука - 0,6; белково-витаминный концентрат - 0,8; кукурузный экстракт - 0,4; CaCO3 - 0,1; K2HPO4 - 0,05; вода водопроводная. Значение pH до стерилизации 6,2 - 6,4. Глюкозу стерилизовали отдельно при 0,6 ати 30 мин, а остальные компоненты при 1,0 ати 40 мин. Глюкозу внесли в колбы непосредственно перед засевом среды инокулятом.

Ферментацию проводили в течение 192 часов при 28oC на качалках с числом оборотов 220 в минуту.

Определение уровня авермектинообразования проводили следующим образом. По 1 мл образца культуральной жидкости перенесли в пробирки, содержащие по 9 мл этилового спирта, тщательно перемешали и оставили на 30 мин для экстракции авермектинового комплекса, после чего содержимое пробирки профильтровали через бумажный фильтр. Содержание в фильтратах всех компонентов авермектинового комплекса определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, основанным на хроматографическом разделении авермектиновых компонентов на аналитической колонке с обращенной фазой Диасорб С-16 4х250 мм с размером частиц 6 мкм в изократическом режиме. Элюирующей системой служила смесь этилового спирта и ацетонитрила с водой в соотношении 6,5:2,0:1,5.

Детектирование компонентов вели при длине волны 243 нм. Хроматографирование исследуемых образцов проводили в сравнении со стандартным образцом авермектина.

Содержание авермектинов в мицелии S. avermitilis ССМ 4697 составило 2300 мкг/мл. Компонентный состав авермектинов, %:
группа A1(A1a + A1b) 7,4;
группа A2(A2a + A2b) 22,4;
группа B1(B1a + B1b) 49,6;
группа В22a + B2b) 20,6.


Формула изобретения

Штамм актиномицета Streptomyces avermitilis ССМ 4697 - продуцент авермектинов.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области микробиологической и медицинской промышленности и может быть использовано для создания лекарств, в частности для создания рекомбинантных форм стафилокиназы
Изобретение относится к биотехнологии и медицине

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой новый бактериальный штамм, способный разлагать полихлорированные бифенилы (ПХБ) в аэробных условиях in situ в объектах окружающей среды

Изобретение относится к биотехнологии, экологии, охране окружающей среды, касается биологической очистки объектов окружающей среды от полихлорированных бифенилов (ПХБ) и представляет собой новый штамм дрожжей, способный разлагать ПХБ в аэробных условиях in situ в объектах окружающей среды
Изобретение относится к области микробиологии, в частности к лабораторной диагностике холеры и к штаммам-продуцентам диагностических сывороток, может быть использовано в иммунологических, генетических исследованиях и для получения холерной агглютинирующей Огава сыворотки

Изобретение относится к новым безопасным ослабленным штаммам Pseudomonas aeruginosa, полученным выделением Pseudomonas aeruginosa в чистом виде согласно иммунотипу Fisher-Devlin и затем неоднократной очисткой выделенного штамма, в особенности штаммов CFCAPA 10142 (КССМ 10029), CFCPA 20215 (КССМ 10030), CFCPA 30720 (KCCM 10031), CFCPA 40057 (КССМ 10032), CFCPA 50243 (КССМ 10033), CFCPA 60534 (КССМ 10034) и CFCPA 70018 (КССМ 10035)

Изобретение относится к средствам специфической профилактики чумы, инфекционного гепатита и парвовирусного энтерита собак
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно, к получению берберина в иммобилизованной клеточной культуре василистника малого (Thalictrum minus L.)

Изобретение относится к производству биологически активных веществ, получаемых путем микробиологического синтеза, и может быть использовано для производства пуринсодержащих продуктов (инозина, гуанозина, гипоксантина)

Изобретение относится к способам получения 2-оксиметшшенемов, используемых в синтезе пенемов, обладающих антибактериальным действием
Изобретение относится к биотехнологии

Изобретение относится к микробиологии и касается нового штамма актиномицета для производства антипаразитарных препаратов на основе авермектинов

Наверх