Циклогексапептиды, их смеси, способ их получения

 

Описываются новые циклогексапептиды формулы цикло А-В-С-E-F- (D) - Аla (I), где А, В, Е и F, независимо друг от друга, обозначают Val или Tyr, причем, если В, F = Tyr; А, Е = Val, и, если А, Е = Tyr; В, F = Val, С = Xaa - обозначают остаток природной аминокислоты, кроме цистеина и триптофана, и соответственно этому могут представлять собой Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Tyr, Thr, Phe, His, Ser, Met, Lys, Arg, Asp, Asn, Glu, Gln, а также их физиологически приемлемые соли. Они специфически ингибируют связь интерлейкина-4 (IL) с IL-4-рецептором и подавляют действие IL-4. В связи с этим вышеуказанные соединения пригодны как для терапии и профилактики, так и для диагноза аллергий и инфекций. 7 с. и 9 з.п. ф-лы, 6 ил., 1 табл.

Изобретение относится к циклогексапептидам формулы (I): цикло (A-B-C-E-F-(D)-Ala) в которой A, B, C, E и F, независимо друг от друга, могут быть одинаковыми или разными и обозначают остаток природной аминокислоты, кроме цистеина (Cys) и триптофана (Trp), и соответственно этому могут представлять собой аланин (Ala), аргинин (Arg), аспарагин (Asn), аспарагиновую кислоту (Asp), глутамин (Gln), глутаминовую кислоту (Glu), глицин (Gly), гистидин (His), изолейцин (Ile), лейцин (Leu), лизин (Lys), метионин (Met), фенилаланин (Phe), пролин (Pro), серин (Ser), триптофан (Thr), тирозин (Tyr) или валин (Val), а также к их физиологически совместимым солям.

Предпочтительны циклогексапептиды формулы (I), в которой A и B, независимо друг от друга, могут быть одинаковыми или разными и обозначают Ile, Leu, Val, Phe и Tyr; и C, F и E, независимо друг от друга, могут быть одинаковыми или разными и обозначают остаток природной аминокислоты, кроме цистеина и триптофана.

Далее, предпочтительны соединения формулы (I), которые имеют следующую пептидную последовательность: цикло (Val-Val-Xaa-Val-Val-(D)-Ala), цикло (Val-Tyr-Xaa-Tyr-(D)-Ala) или цикло (Tyr-Val-Xaa-Tyr-Val-(D)-Ala), причем Xaa представляет собой остаток природной аминокислоты, кроме Cys и Trp.

Под природными аминокислотами нужно понимать все в естественном состоянии свободные или являющиеся в качестве составных элементов протеинов α-аминокислоты, которые, например, описываются в Bell (FEBS - Letters, 64 (1976), 29-35).

В случае естественно находящихся в протеинах аминокислот под природными аминокислотами нужно понимать L-аминокислоты (за исключением глицина). (D)-Ala соответствует остатку аминокислоты-аланина- в D-конфигурации.

Под пептидами нужно понимать последовательность аминокислот, которые связаны друг с другом за счет пептидных связей, причем пептиды имеют N-конец и C-конец.

Заключенные в скобки аминокислотные последовательности описывают циклопептиды, где N-конец (аминогруппа) первой аминокислоты связана с C-концом (COOH-группа) последней аминокислоты.

Под физиологически совместимыми солями соединений формулы (I) понимают как неорганические, так и также органические соли, которые описываются в Remington's Pharmaceutical Sciences (17-е издание, с 1418/1985/). В качестве солей принимают во внимание в частности соли щелочных и щелочно-земельных металлов, соли с физиологически приемлемыми аминами и соли с неорганическими или органическими кислотами, как например HCl, HBr, H₂SO₄, малеиновая кислота, фумаровая кислота.

В случае вышеописанных соединений формулы (I) речь идет о циклогексапептидах, которых можно синтезировать общеизвестными, обычными в химии пептидов способами. Синтез циклогексапептидов осуществляют, например, путем а) сочетания пригодным образом защищенных производных аминокислот с твердым носителем, б) отщепления линейного пептида при получении защитных групп боковых цепей, в) циклизации пептида в растворе,
г) отщепления защитных групп боковых цепей.

В качестве защитных групп аминокислот пригодны защитные группы, которые обычно применяют в синтезе пептидов и описываются, например, в Kontakte Merck 3/79, с. 14-22, и 1/80, с. 23-35.

Уретановыми защитными группами аминофункций являются, например, Pyoc, Fmoc, Fcboc, Z, Boc, Ddz, Bpoc, Z-(NO₂), Dobz, Moc, Mboc, Iboc, Adoc, Adpoc, Msc или Pioc. Удаление этих защитных для аминокислот групп осуществляют с помощью кислот, оснований или путем восстановления.

Защитными группами гуанидиновой группы являются, например, NO₂, тозил, Boc, Z, мезитилен-2-сульфонил (Mts) и другие. Отщепление можно осуществлять гидролитически или гидрогенолитически.

Боковые COOH-функции блокируют в виде сложных алкиловых эфиров, предпочтительно в виде метилового, этилового или трет.бутилового сложного эфира, или в виде сложных бензиловых эфиров или модифицированных сложных бензиловых эфиров (n-NO₂, n-Cl, n-Br и другие). Деблокирование осуществляют путем щелочного или кислотного омыления или путем гидрирования. Защитными для гидроксильной функции являются, например, трут-бутил или бензил.

Настоящее изобретение, кроме того, относится к смесям циклогексапептидов общей формулы (I).

Синтез вышеуказанных циклогексапептидов в форме смесей возможен за счет применения так называемых "комбинаторных способов синтеза". Комбинаторные способы синтеза, с помощью которых простым путем можно синтезировать "пептидные библиотеки", известные PCT-азявки WO 92/000091.

Получение смесей соединений формулы (I) можно осуществлять согласно вышеуказанных стадиям а) - г). Разумеется, при применении комбинаторных способов синтеза нет необходимости стремиться синтезировать все возможные циклогексапептиды формулы (I) (в случае описанных здесь циклогексапептидов имеются все же почти 1,9 миллионов (18⁵) различных соединений, соответственно синтезов). Напротив, путем одновременной добавки всех 18 различных аминокислот на цикл синтеза можно получать смесь циклогексапептидов формулы (I). Преимущество этого технического приема по сравнению с обычными способами синтеза очевидно. Так, например, после только 5-кратного прохождения цикла синтеза, причем, смотря по обстоятельствам, одновременно используются все желательные аминокислоты, и последующей циклизации путем только одного синтеза получают пептидные смеси, которые содержат фактически все 1,9 миллионов возможных циклогексапептидов.

Альтернативно к только что описанному способу, однако, не нужно добавлять во все циклы синтеза смеси аминокислот. Так, после одного цикла синтеза носитель, на котором синтезируются пептидные смеси, можно фракционировать и в последующих отдельных реакциях синтеза вводить желаемую аминокислоту в определенное положение.

После получения пептидных смесей по вышеописанному способу необходимо распознавать возможные биологически активные пептиды и идентифицировать их последовательность. Это становится возможным за счет применения итеративного способа повторного ресинтеза, который поясняется ниже на примере смеси, содержащей циклопептиды формулы (A):
цикло (O₁-O₂-X-X-X-(D)-Ala) (A).

Эта смесь содержит циклогексапептиды с тремя переменными положениями (X), которые заняты любыми природными аминокислотами, кроме Cys или Trp. Остальные положения заняты определенными аминокислотами (O) (это также природные аминокислоты, кроме Cys и Trp). Одно положение всегда занято D-Ala.

Смесь циклопептидов формулы (A) получают, как описано выше, тем, что после 3-х циклов синтеза при применении смеси всех (вышеуказанных) 18 аминокислот носитель со связанными с ним пептидными смесями фракционируют и затем в 324-х (18х18) отдельных синтезах получают смеси циклопептидов формулы (A). Каждая из этих 324-х смесей содержит примерно 5800 (18³) различных пептидов.

Каждую из 324-х смесей в биологическом анализе (см. ниже) отбирают в качестве активно распознаваемой смеси и путем итеративного ресинтеза при новом введении дальнейшего определенного положения ограничивают в ее комплектности. Каждая фаза итеративного ресинтеза требует 18 новых стадий синтеза. Действие полученного в конце циклогексапептида с определенной структурой подтверждается путем испытания в биологическом анализе. Таким образом описанный образ действий поясняется следующей схемой.

Пептид с тремя определенными положениями:
цикло (O₁-O₂-X-X-X(D)-Ala):
1) специфический биологический анализ (324 теста),
2) идентификация активной смеси,
3) синтез (18) пептидов с 4-мя определенными положениями.

Пептид с четырьмя определенными положениями:
цикло (O₁-O₂-O₃-X-X-(D)-Ala):
1) специфический биологический анализ (18 тестов),
2) идентификация активной смеси,
3) синтезы (18) пептидов с 5-ю определенными положениями.

Пептид с пятью определенными положениями:
цикло (O₁-O₂-O₃-O₄-X-(D)-Ala):
1) специфический биологический анализ (18 тестов),
2) идентификация активной смеси,
3) синтезы (18) пептидов с 6-ю определенными положениями.

Пептид с шестью определенными положениями:
цикло (O₁-O₂-O₃-O₄-O₅-(D)-Ala):
1) специфический биологический анализ (18 тестов),
2) идентификация активного пептида.

В принципе, смеси циклопептидов можно также разделять, соответственно очищать, с помощью обычных методов анализа, таких как препаративная ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография) или другие хроматографические способы.

В настоящее время найдено, что циклогексапептиды общей формулы (I), соответственно их смеси, специфически ингибируют связь интерлейкина-4 (IL) с IL-4-рецептором и подавляют действие IL-4. Предлагаемые согласно изобретению вещества таким образом эффективны в качестве ингибиторов действия IL-4.

Ингибирующее IL-4 действие предлагаемых согласно изобретению соединений, соответственно их смесей, можно определять в анализе на связывание без клеток, так и в клеточном биологическим анализе.

Из патента ФРГ 4322330 A1 известно, что путем подавления действия IL-4 можно ставить диагноз, лечить и/или бороться с заболеваниями, которые характеризуются повышенным появлением Т-клеток-помощников типа ТН2.

Терапия и профилактика многих аллергических, вирусных, паразитарных и бактериальных заболеваний по-прежнему представляет собой большую проблему. В случае некоторых паразитарных, вирусных и бактериальных заболеваний известно, что при их протекании появляются изменения в субпопуляциях лимфоцитарных и моноцитарных клеток. Это касается, например, повышенного появления так называемых Т-клеток-помощников типа 2 (в дальнейшем называются ТН2-клетки). Т-Клетки вообще в субпопуляциях разделяются на основании поверхностных маркеров и на основании их функции. Так, например, Т-лимфоциты-помощники содержит CD4-поверхностные молекулы и после их активирования выделяют цитокины.

Анализы образца цитокина клонированных Т-клеток-помощников из здоровых мышей или стимулированных с помощью аллогенных клеток мышей показывают, что эти клетки продуцируют интерлейкин-2, интерлейкин-4, гамма-интерферон, интерлейкин-5, интерлейкин-6, интерлейкин-10 и лимфотоксин (Т-клетки-помощники так называемого ТН0-типа).

После инфекции мышей, например, с помощью бактериального антигена Brucella abortus или с помощью Mycobacterium tuberkulosis после клонирования Т-клеток-помощников находят прежде всего клоны, которые выделяют лимфотоксин, гамма-интерферон и интерлейкин-2, однако мало выделяют или вообще не выделяют никакого интерлейкина-4, интерлейкина-5, интерлейкина-6 и интерлейкина-10 (Т-клетки-помощники так называемого типа TH1).

После инфекции, например, сусцептильных мышей с помощью паразитарных возбудителей, как Leishmania major при клонированиях Т-клеток-помощников появляются прежде всего клоны, которые в повышенной степени продуцируют интерлейкин-4, интерлейкин-5 и интерлейкин-10, однако в уменьшенных или в неопределенных количествах продуцируют интерлейкин-2 и гамма-интерферон (Т-клетки-помощники ТН2-типа) [Mosmann и др. , Immunological Review 1991, N 123, 209-229, S.Romagnani, Immunology Today 256-257, т. 12, N 8, 1991].

Это повышенное появление ТН-2-лимфоцитов уже наблюдалось в случае некоторых инфекционных заболеваний у животных и у человека (Else and Grenic, Parasitology Today, т. 7, N 11, 1991, c.313-316, Parasitology Today, т. 7, N 10, 1991, с.261) и оно отражается также во вторичных параметрах. Так, инфицированные с помощью Leishmania major мыши в общем показывают пониженное продуцирование гамма-интерферона, сильно повышенное содержание в сыворотке IgE и эозинофилию.

В случае человека, например, при лепроматозной проказе, лейшмании и шистомиазе и инфекциях с помощью Mycobacterium tuberculosis, в общем, найдена сильно повышенная IgE-концентрация в сыворотке этих пациентов по сравнению с сыворотками здоровых людей. При паразитарных инфекциях часто наблюдают эозинофилию в процесс заболевания.

Также аллергические реакции, в которых принимают участие IgE, немедленного типа, как атопический дерматит и астма, характеризуются таким нарушением регуляции. Например, имеются антигенспецифические клоны Т-клеток из главных биопсий пациентов с атопическим дерматитом прежде всего ТН2-типа (Kapsenberg и др. Immunology Today, т. 12, N 11, 1991, 392-395).

Предлагаемые согласно изобретению соединения и смеси пригодны как для терапии и профилактики, так и также для диагноза аллергий и инфекций, в особенности вирусных, бактериальных и паразитарных инфекций, а также грибковых инфекций, предпочтительно инфекций за счет вируса иммунного дефицита человека (ВИЧ), микобактерий, прежде всего Mycobakterium Leprae, листерий, простейших, прежде всего семейств Leishmania и Plasmodium; грибков, прежде всего рода Schistosoma, Nipponstronglys и Heligmosomoides; за счет Trichurida, Trichinella, Taenia (Cystice), Candida и Aspergillus. Однако также можно ставить диагноз, лечить или профилактически предупреждать аллергические реакции немедленного типа, в особенности реакции, в которых принимает участие IgE. К ним прежде всего причисляют атопический дерматит и астму.

Формы введения в общем различны при различных заболеваниях. Так, например, может быть предпочтительным топическое применение при некоторых заболеваниях. Например, при астме предпочтительно применение в виде ингаляции, при конъюнктивите - в виде глазных капель, при атопическом дерматите предпочтительно кожное и внутрикожное введение, так как патологические ТН2-клетки можно обнаружить прежде всего топически.

Прелагаемые согласно изобретению пептиды, соответственно их смеси, также вообще можно использовать в качестве исследовательских инструментов (Tools), чтобы ингибировать связывание интерлейкина-4 (IL-4) с IL-4-рецепторами.

Изобретение относится, далее, к фармацевтическим композициям, которые содержат соединения формулы (I) или их смеси.

Лекарственные средства можно применять, например, в форме фармакологических препаратов, которые можно вводить орально, например в виде таблеток, драже, твердых или мягких желатиновых капсул с лекарством, растворов, эмульсий или суспензий. Также пригодной формой применения является включение лекарственных средств в липосомы, которые в случае необходимости содержат другие компоненты, такие как протеины. Их можно также вводить ректально (кишечно), например в форме свечей, или парентерально, например в форме растворов для инъекций. Для приготовления фармацевтических препаратов эти соединения можно вводить в терапевтически инертные органические или неорганические носители. Примерами таких носителей для таблеток, драже и твердых желатиновых капсул с лекарством являются лактоза, кукурузный крахмал или его производные, сало и стеариновая кислота или ее соли. Пригодными носителями для приготовления растворов являются вода, многоатомные спирты, сахароза, инертный сахар и глюкоза. Пригодными носителями для растворов для инъекций являются вода, спирты, многоатомные спирты, глицерин и растительные масла. Пригодными носителями для свечей являются растительные и отвержденные масла, воски, жиры и полужидкие многоатомные спирты. Фармацевтические препараты также могут содержать консерванты, растворители, стабилизаторы, смачиватели, эмульгаторы, подслащивающие вещества, красители, улучшающие неприятный вкус лекарства вещества, соли для изменения осмотического давления, буферы, средства для покрытия, антиоксиданты, а также в случае необходимости другие терапевтические биологически активные вещества.

Изобретение относится также к способу получения предлагаемого согласно изобретению лекарственного средства, который отличается тем, что по меньшей мере одно соединение формулы (I) вместе с фармацевтически пригодным и физиологически приемлемым носителем и в случае необходимости другими пригодными биологически активными веществами, добавками или вспомогательными веществами доводят до пригодной дозировочной формы.

Предпочтительными формами введения являются оральное и топическое использование, локальные формы, как например с помощью катетера, или, однако, также с помощью инъекций.

Экспериментальная часть
Следующие примеры (получения) должны служить для более подробного пояснения изобретения, никоим образом не ограничивая объема охраны изобретения. Применяют следующие сокращения:
AS = аминокислота, BSA = альбумин сыворотки крупного рогатого скота, TCX = тонкослойная хроматография, ДМХ = дихлорметан, ДИК = диизопропилкарбодиимид, DIPEA = диизопропилэтиламин, ДМФ = диметилформамид, ДМСО = диметилсульфоксид, ELISA = ферментный иммуносорбентный анализ, Fmoc = 9-флуоренилметилоксикарбонил, HOBt = 1-гидроксибензотриазол, ВЭЖХ = высокоэффективная жидкостная хроматография, huIL = человеческий интерлейкин, IL = интерлейкин, muIL = мышиный интерлейкин, PBS = фосфатно-буферный рассол, PBSA = альбумин сыворотки крупного рогатого скота в PBS, TBTU = бензотриазолил-тетраметилуроний-тетрафторборат, ТФК = трифторуксусная кислота.

Надписи на чертежах
Фиг. 1. Конкурентный тест на связывание huIL-4: ▪ K0022; .

Фиг. 2. Конкурентный тест на связывание muIL-4: ▪ K0022; .

Фиг. 3. Конкурентный тест на связывание huIL-Ira: ▪ K0022; .

Фиг. 4. Испытание пептидов в huIL-4-зависимом биологическом анализе:
а) стандартная кривая huIL-4 (по титру): ▪ huIL-4,
б) добавка пептидов (по титру) к 1 нг/мл huIL-4 (постоянно):
K K5993, .

Фиг. 5. Испытание пептидов в muIL-4-зависимом биологическим анализе:
а) стандартная кривая muIL-4 (по титру): ▪ muIL-4,
б) добавка пептидов (по титру) к 1 нг/мл muIL-4 (постоянно):
X K5993, .

Фиг. 6. Испытание пептидов в huIL-1-бета-зависимом биологическим анализе:
а) стандартная кривая huIL-1-бета (по титру) ▪ huIL-I-бета;
б) добавка пептидов (по титру) к 0,5 ед/мл huIL-1-бета (постоянно):
X K5993, .

Синтез циклогексапептидов
Описанные циклопептиды получают в виде индивидуальных пептидов или в виде смеси. Синтез осуществляют путем:
а) сочетания пригодным образом защищенных производных аминокислот с твердым носителем,
б) отщепления линейного пептида при получении защитных групп боковых цепей,
в) циклизации пептида в растворе,
г) отщепления защитных групп боковых цепей.

а) Синтез линейных пептидов или смесей пептидов
13,1 г Fmoc-D-Ala-тритильной смолы суспендируют в 131 мл дихлорметана (ДХМ/ДМФ = 2:1) и, смотря по обстоятельствам, в предварительно подготовленный реакционный сосуд пипеткой вносят 0,4 мл (40 мг, 0,032 ммоль) суспензии смолы. В качестве реакционных сосудов набивают стекловатой острый конец сосуда Эппендорфа и помещают в синтез-блоки множественного автомата для синтеза пептидов. Готовят 0,7 М растворы необходимых аминокислот, сочетание осуществляют с 5-кратным избытком Fmoc-аминокислоты после in situ активации с помощью диизопропилкарбодиимида (ДИК), который добавляют в виде 1,5 М раствора в смеси ДМФ/ДХМ (1:2) в пятикратном избытке. Время сочетания составляет 50 минут.

Определенные пептидные смеси получают путем смешивания носителей (полимерные шарики), которые содержат индивидуальные пептиды.

Протокол (методика) цикла синтеза в синтез-автоматах SYRO (см. в таблицу).

б) Отщепление линейных пептидов или смесей пептидов от смолы
Отщепление пептидов, соответственно смесей пептидов, от смолы (по 1 г) осуществляют в так называемом Falcons® с помощью 30 мл смеси уксусной кислоты с метаном и ДХМ (2:2:6) в течение 3-х часов при встряхивании и при комнатной температуре. Смолы отфильтровывают от раствора после отщепления, и растворитель удаляют в вакуумном концентрате при 300 мбар и 40^oC (ДХМ/метанол), соответственно при 1 мбар и 40^oC (уксусная кислота). Остатки растворяют в смеси трет-бутилового спирта с водой (4:1), смешивают с 2-мя эквивалентами 0,2 н. HCl (в расчете на аминогруппы) и снова концентрируют в вакуумном концентрате (испарителе).

в) Циклизация линейных пептидов или смесей пептидов
0,4 ммоль пептида или смеси пептидов растворяют в 250 мл ДМФ (0,0016 моль) в полипропиленовых склянках и смешивают с 4-мя эквивалентами диизопропиламина (DIPEA). При встряхивании медленно прикапывают по 3 мл 0,4 М раствора HOBt/TBTU в ДМФ (3 эквивалента, 1,2 ммоль). За течением реакции следят с помощью ТСХ, и реакция заканчивается спустя 5 часов. Растворители удаляют в течение ночи (15 часов) при давлении 1 мбар при 40^oC и в вакуумном концентрате, сухие остатки обрабатывают с помощью ДМХ и встряхивают с 5%-ным раствором KHSO₄, 5%-ным раствором NaHCO₃ и водой (по 3 раза). Органические фазы сушат над сульфатом натрия, отфильтровывают и концентрируют в вакууме. Остатки растворяют в смеси трет-бутилового спирта с водой (4:1) и лиофилизируют.

г) Отщепление защитных групп боковых цепей
По 100-200 мг циклопептида или смеси циклопептидов в течение 4-х часов при комнатной температуре обрабатывают с помощью 5 мл, соответственно 10 мл раствора для отщепления (ТФК/тиоанизол/тиокрезол=0,95 : 0,25 : 0,25), чтобы отщепить защитные группы боковых цепей. Затем циклопептиды осаждают в смеси диэтилового эфира с н-гептаном (1:1), центрифугируют, еще дважды промывают смесью диэтилового эфира с гептаном, растворяют в смеси трет-бутилового спирта с водой (4:1) и подвергают сушке вымораживанием.

Пример 1. Синтез цикло (Val-Tyr-Xaa-Val-Tyr-(D)-Ala) (K0021)
а) Синтез смеси линейных пептидов цикло (Val-Tyr-Xaa-Val-Tyr-(D)-Ala)
Для синтеза смеси линейных пептидов (Val-Tyr-Xaa-Val-Tyr-(D)-Ala), состоящей из 18 компонентов (см. последовательность 1 в конце описания), их получают в виде индивидуальных пептидов на полимерных носителях с помощью автоматического устройства ("робота") для множественного синтеза пептидов. В качестве реакционных сосудов фильтровальные колонки из полипропилена заполняют в количестве по 40 мг (= 0,032 ммоль) Fmoc-D-Ala-2-хлортритильной смолой. Распределение количеств смолы осуществляют либо за счет навески сухой смолы, либо путем внесения пипеткой суспензии смолы в смеси дихлорметана с диметилформамидом (2:1). Готовят 0,7М растворы необходимых Fmoc-аминокислот с эквивалентными количествами N-гидроксибензотриазола (HOBt) в диметилформамиде (ДМФ), сочетание осуществляют с 5-кратным избытком Fmoc-аминокислот путем активирования in situ с помощью ДИК, который добавляют в виде 1,5 М раствора в смеси дихлорметана с диметилформамидом (2:1) в 5-кратном избытке. Время сочетания составляет 50 минут.

б) Отщепление смеси линейных пептидов от смолы
18 отдельных гексапептидных смол перед отщеплением пептидов от смолы объединяют в смесь пептидов (Val-Tyr-Xaa-Val-Tyr-(D)-Ala) (18 х 40 мг = 0,72 г пептидной смолы). Отщепление смеси пептидов от в целом 0,72 г пептидной смолы осуществляют с помощью 20 мл смеси уксусной кислоты с метанолом и дихлорметаном (2: 2:6) в течение 3-х часов при встряхивании и при комнатной температуре. Смолу отфильтровывают от раствора после отщепления и растворитель удаляют в роторном вакуумном испарителе (Beta-RVC, Chrisr, Osterode) при давлении 200 мбар и температуре 40^oC (ДХМ/метанол), соответственно 1 мбар и 40^oC (уксусная кислота). Остаток растворяют в смеси трет-бутилового спирта с водой (4:1), смешивают с 2-мя эквивалентами и 0,2 н. HCl (в расчете на аминогруппу) и концентрируют досуха на роторном вакуумном испарителе (концентраторе).

в) Циклизация
Смесь пептидов (Val-Tyr-Xaa-Val-Tyr-(D)-Ala) (0,4 ммоль) растворяют в 250 мл ДМФ (0,0016 М) в склянке из полипропилена, смешивают с 4-мя эквивалентами диизопропилэтиламина (DIPEA) и охлаждают в течение 1 часа в холодильнике. При встряхивании медленно прикапывают 3 мл 0,4 М раствора HOBt/TBTU/ДМФ (= 3 эквивалента, 1,2 ммоль). За протеканием реакции следят с помощью тонкослойной хроматографии (элюирующее средство: хлороформ/метанол/ледяная уксусная кислота = 85:15:2, R_F продукта = 0,59). Реакция заканчивается спустя 3 часа. Растворитель удаляют в роторном вакуумном испарителе (концентраторе) при давлении 1 мбар и температуре 40^oC, сухой остаток растворяют в дихлорметане и встряхивают с 5%-ным раствором KHSO₄ и водой. Органическую фазу сушат над Na₂SO₄. Растворитель выпаривают в вакууме и остаток растворяют в смеси трет-бутилового спирта с водой (4:1) и лиофилизируют.

г) Отщепление защитных групп боковых цепей
Смесь циклопептидов (Val-Tyr-Xaa-Val-Tyr-(D)-Ala) (100-200 мг) обрабатывают в течение 4-х часов при комнатной температуре с помощью раствора для отщепления (ТФК/тиоанизол/тиокрезол = 0,95 : 0,025 : 0,025), чтобы отщепить защитные группы боковых цепей. Раствор после отщепления при перемешивании медленно добавляют к смеси диэтилового эфира с н-гептаном (1:1), осадок (преципитат) отделяют путем центрифугирования и седимент промывают трижды смесью диэтилового эфира с н-гептаном при обработке ультразвуком, растворяют в смеси трет-бутилового спирта с водой (4:1) и подвергают сушке вымораживанием.

д) Анализ смеси циклопептидов
Анализ смеси циклопептидов осуществляют с помощью ВЭЖХ и масс-спектроскопии с ионным распылением (Ionen spray). Масс-спектр (FAB):
cyclo(Val-Tyr-Xaa-Val-Tyr(D)-Ala); Xaa=Gly: 653,8 (M+H); Xaa=Ala: 667,8 (M+H); Xaa= Ser: 683,8 (M+H); Xaa=Pro: 693,9 (M+H); Xaa=Val: 695,9 (M+H); Xaa: 697,9 (M+H); Xaa=Leu: 709,9 (M+H); Xaa=Ile: 709,9 (M+H); Xaa=Asn: 710,9 (M+H); Xaa= Asp: 711,8 (M+H); Xaa=Lys: 724,9 (M+H); Xaa=Gln: 724,9 (M+H); Xaa= Glu: 725,9 (M+H); Xaa=Met: 728 (M+H); Xaa=His: 733,9 (M+H); Xaa=Phe: 743,9 (M+H); Xaa=Arg: 752,9 (M+H); Xaa=Tyr: 759,9 (M+H).

Пример 2. Синтез цикло (Val-Val-Xaa-Val-Val-(D)-Ala) (K5993)
Синтез смеси циклопептидов цикло (Val-Val-Xaa-Val-Val-(D)-Ala) осуществляют аналогично примеру 1 при применении соответствующих аминокислот. Масс-спектр (FAB):
cyclo(Val-Val-Xaa-Val-Val-(D)-Ala); Xaa=Gly: 525,7 (M+H); Xaa-Ala: 539,7 (M+H); Xaa= Ser: 555,7 (M+H); Xaa=Pro: 565,8 (M+H); Xaa=Val: 567,8 (M+H); Xaa= Thr: 569,8 (M+H); Xaa=Leu: 581,8 (M+H); Xaa=Ile: 581,8 (M+H); Xaa=Asn: 582,8 (M+H); Xaa= Asp: 583,7 (M+H); Xaa=Lys: 596,8 (M+H); Xaa=Gln: 596,8 (M+H); Xaa= Glu: 597,8 (M+H); Xaa=Met: 599,9 (M+H); Xaa=His: 605,8 (M+H); Xaa=Phe: 615,8 (M+H); Xaa=Arg: 624,8 (M+H); Xaa=Tyr: 631,8 (M+H).

Пример 3. Синтез цикло (Tyr-Val-Xaa-Tyr-Val-(D)-Ala) (K 0022)
Синтез смеси циклопептидов цикло (Tyr-Val-Xaa-Tyr-Val-(D)-Ala) осуществляют аналогично примеру 1 при применении соответствующих аминокислот. Масс-спектр (FAB):
cyclo(Tyr-Val-Xaa-Tyr-Val-(D)-Ala; Xaa=Gly: 653,8 (M+H); Xaa=Ala: 667,8 (M+H); Xaa= Ser: 683,8 (M+H); Xaa=Pro: 693,9 (M+H); Xaa=Val: 695,9 (M+H); Xaa= Thr: 697,9 (M+H); Xaa=Leu: 709,9 (M+H); Xaa=Ile: 709,9 (M+H); Xaa=Asn: 710,9 (M+H); Xaa= Asp: 711,8 (M+H); Xaa=Lys: 724,9 (M+H); Xaa=Gln: 724,9 (M+H); Xaa=Glu: 725,9 (M+H); Xaa=Met: 728 (M+H); Xaa=His: 733,9 (M+H); Xaa= Phe: 743,9 (M+H); Xaa=Arg: 752,9 (M+H); Xaa=Tyr: 759,9 (M+H).

Пример 4.

Аналогичным образом получают следующие циклопептиды, соответственно смеси циклопептидов (см. последовательность 2 в конце описания, где cyclo = цикло, Hyp = гидроксипролин).

Определение (изменение) биологической активности в биологическом анализе
Пример 5. Специфическое ингибирование IL-4-связи в опыте по связыванию в отсутствие клеток
Из европейского патента EP 48170 A1 известны тесты по связыванию в отсутствие клеток. Для их осуществления используют рекомбинантные химерные протеины, которые состоят из экстрацеллюлярной области обычно постоянных мембранных рецепторов, с карбоксильным концом которых соединена Fc-область тяжелой иммуноглобулиновой цепи, состоящей из Hinge-, CH2- и CH3- доменов. Эти так называемые рецептор/Fc-слитые белки (протеины) могут связываться при получении специфической активности связывания с твердыми фазами, которые, например, предварительно покрыты направленными против Fc-части моноклональными антителами. В качестве твердой фазы для этого примера применяют ®Nunc Typ B ELISA-пластины. Рецептор/Fc - слитые белки (протеины), растворенные в PBS, содержащем 10 мг/мл BSA (PBSA), связываются с этими предварительно обработанными пластинами (HuIL - 4R/Fc: 500 нг/мл, muIL-4R/Fc: 250 нг/мл, huIL-1R/Fc: 125 нг/мл, 1 час при комнатной температуре). После промывки пептиды или соответствующие специфические немаркированные лиганды (huIL-4R/Fc: huIL-4; muIL-4R/Fc: muIL-4; huIL-1R/Fc: huIL-Ira) добавляют в изменяющихся концентрациях и после этого добавляют специфические лиганды в биотинилированной форме в постоянной концентрации (100 нг/мл). Инкубацию осуществляют в течение 1 часа при комнатной температуре в PBSA, содержащем 5% ДМСО. После промывки осуществляют инкубацию со стрептавидин/пероксидазой (Amersham, 1: 2000 в PBSA) в течение 20 минут при комнатной температуре. Обнаружение связанной пероксидазы проводят после повторной промывки в тетраметилбензидин-субстратном растворе (Behringwerke). После инкубации в течение 30 минут измеряют экстинкцию при 450 нм, которая прямо отражает количество связанных с рецептором биотинтилированных лигандов. На фиг. 1-3 представлен измеренный сигнал экстинкции в зависимости от концентрации конкурирующего агента, причем в качестве 100%-ного значения принимают экстинкцию, измеренную в отсутствие конкурирующего агента.

На фиг. 1 показано, что в тесте на huIL-4-связывание немаркированный huIL-4 конкурирует с биотинилированным huIL-4 в отношении связывания с человеческим IL-4-рецептором. Соответствующее имеет значение для muIL-4 и мышиного IL-4-рецептора (фиг. 2), а также для huIL-Ira и человеческого IL-1-рецептора (фиг. 3). Смеси пептидов K5993, K0021 и K0022, напротив, ингибируют связывание биотинилированного huIL-4 и muIL-4 с их соответствующими рецепторами (фиг. 1 и 2), в то время как в опыте на IL-Ira-связывание они не вызывают никакого значительного эффекта (фиг. 3). Определяют следующие IC₅₀-значения (мкг/мл):
cyclo(Val-Val-Xaa-Val-Val-(D)-Ala) (K5993) - 37;
cyclo(Val-Tyr-Xaa-Val-Tyr-(D)-Ala) (K0021) - 68;
cyclo(Tyr-Val-Xaa-Tyr-Val-(D)-Ala) (K 0022) - 220;
cyclo(Val-Tyr-Ala-Val-Tyr-(D)-Ala) - 16,7;
cyclo(Tyr-Val-Ala-Tyr-Val-(D)-Ala) - 8,3;
cyclo(Tyr-Val-Hyp-Tyr-Val-(D)-Ala) - 17,4;
cyclo(Tyr-Val-Ile-Tyr-Val-(D)-Ala) - 62,5;
cyclo(Tyr-Val-Leu-Tyr-Val-(D)-Ala) - 41,3;
cyclo(Tyr-Val-Arg-Tyr-Val-(D)-Ala) - 96,6;
cyclo(Tyr-Val-Thr-Tyr-Val-(D)-Ala) - 92,0,
(где cyclo = цикло; Xaa = остаток природной аминокислоты без Cys и Trp).

Пример 6. Влияние на индуцированую IL-4 пролиферацию
В биологическом анализе определяют биологическую активность циклогексапептидов формулы (I), соответственно их смесей. IL-4 связывается специфически с IL-4-рецептором. По этой причине применяют линию клеток, которая имеет мышиное происхождение и несет мембранный мышиный IL-4-рецептор. Эту линию клеток трансфицируют полным геном человеческого интерлейкин-4-рецептора. Мышиный и человеческий мембранные рецепторы одновременно функционально экспримируются этой линией клеток и линия клеток пролиферируется как в зависимости от мышиного, так и также в зависимости от человеческого IL-4 (Mosley и др. , Cell, т. 59, 335-348, октябрь, 20, 1989). Для лучшей растворимости пептидов добавляют во все культуральные среды 1% ДМСО.

а) Влияние на индуцированную человеческим IL-4 пролиферацию
Линия клеток, пролиферированная в зависимости от человеческого IL-4 (huIL-4), представлена на фиг. 4 (стандартная кривая). При применении постоянной концентрации huIL-4 приходят к зависящему от концентрации ингибированию пролиферации благодаря, смотря по обстоятельствам, указанным, по отдельности добавляемым смесям пептидов (фиг. 4).

б) Влияние на индуцированную мышиным IL-4 пролиферацию
Линия клеток, пролиферированная в зависимости от мышиного IL-4 (muIL-4), представлена на фиг. 5 (стандартная кривая). При применении постоянной концентрации muIL-4 приходят к зависящему от концентрации ингибированию пролиферации благодаря, смотря по обстоятельствам, указанным, по отдельности добавляемым смесям пептидов (фиг. 5).

Пример 7. Влияние на индуцированную IL-4 пролиферацию
Применяют IL-4-зависимый клон T-клеток (D10 (N4) M, Hopkins и др., J. of Jmm. Methods, 120, 271-276, 1989). Для лучшей растворимости пептидов к культуральной среде добавляют 1% ДМСО. Клетки пролиферируются в зависимости от человеческого IL-4-бета (hu IL-1-бета) (фиг. 6, стандартная кривая). При применении постоянной концентрации IL-4-бета не приходят ни к какому ингибированию пролиферации линии клеток благодаря, смотря по обстоятельствам, указанным, по отдельности добавляемым смесям пептидов в указанной концентрационной области (фиг. 6).

Формула изобретения

1. Циклогексапептиды формулы I
цикло(A-B-C-E-F-(D)-Ala,
где A, B, E и F, независимо друг от друга, обозначают Val или Tyr, причем, если B, F = Tyr; A, E = Val, и, если A, E = Tyr; B, F = Val,
C = Xaa - обозначают остаток природной аминокислоты, кроме цистеина и триптофана, и соответственно этому могут представлять собой Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Tyr, Thr, Phe, His, Ser, Met, Lys, Arg, Asp, Asn, Glu, Gln, а также их физиологически приемлемые соли.

2. Циклогексапептиды формулы I по п.1, представляющие собой
цикло(Val-Val-Xaa-Val-Val-(D)-Ala),
цикло(Val-Tyr-Xaa-Val-Tyr-(D)-Ala) или
цикло(Tyr-Val-Xaa-Tyr-Val-(D)-Ala),
причем Xaa - обозначают остаток природной аминокислоты, кроме Gys и Trp, а также их физиологически приемлемые соли.

3. Циклогексапептиды формулы I по п.1, представляющие собой
цикло(Val-Tyr-Ala-Val-Tyr-(D)-Ala);
цикло(Val-Tyr-Arg-Val-Tyr-(D)-Ala);
цикло(Val-Tyr-Asn-Val-Tyr-(D)-Ala);
цикло(Val-Tyr-Asp-Val-Tyr-(D)-Ala);
цикло(Val-Tyr-Gln-Val-Tyr-(D)-Ala);
цикло(Val-Tyr-Glu-Val-Tyr-(D)-Ala);
цикло(Val-Tyr-Gly-Val-Tyr-(D)-Ala);
цикло(Val-Tyr-His-Val-Tyr-(D)-Ala);
цикло(Val-Tyr-Ile-Val-Tyr-(D)-Ala);
цикло(Val-Tyr-Leu-Val-Tyr-(D)-Ala);
цикло(Val-Tyr-Lys-Val-Tyr-(D)-Ala);
цикло(Val-Tyr-Met-Val-Tyr-(D)-Ala);
цикло(Val-Tyr-Phe-Val-Tyr-(D)-Ala);
цикло(Val-Tyr-Pro-Val-Tyr-(D)-Ala);
цикло(Val-Tyr-Ser-Val-Tyr-(D)-Ala);
цикло(Val-Tyr-Thr-Val-Tyr-(D)-Ala);
цикло(Val-Tyr-Tyr-Val-Tyr-(D)-Ala) или
цикло(Val-Tyr-Val-Val-Tyr-(D)-Ala),
а также их физиологически приемлемые соли.

4. Циклогексапептиды формулы I по п.1, представляющие собой
цикло(Val-Tyr-Ala-Val-Tyr-(D)-Ala);
цикло(Tyr-Val-Ala-Tyr-Val-(D)-Ala);
цикло(Tyr-Val-Hyp-Tyr-Val-(D)-Ala);
цикло(Tyr-Val-Gln-Tyr-Val-(D)-Ala);
цикло(Tyr-Val-Lys-Tyr-Val-(D)-Ala);
цикло(Tyr-Val-Glu-Tyr-Val-(D)-Ala);
цикло(Tyr-Val-Asp-Tyr-Val-(D)-Ala);
цикло(Tyr-Val-Phe-Tyr-Val-(D)-Ala);
цикло(Tyr-Val-Gly-Tyr-Val-(D)-Ala);
цикло(Tyr-Val-His-Tyr-Val-(D)-Ala);
цикло(Tyr-Val-Ile-Tyr-Val-(D)-Ala);
цикло(Tyr-Val-Leu-Tyr-Val-(D)-Ala);
цикло(Tyr-Val-Asn-Tyr-Val-(D)-Ala);
цикло(Tyr-Val-Pro-Tyr-Val-(D)-Ala);
цикло(Tyr-Val-Arg-Tyr-Val-(D)-Ala);
цикло(Tyr-Val-Ser-Tyr-Val-(D)-Ala);
цикло(Tyr-Val-Thr-Tyr-Val-(D)-Ala);
цикло(Tyr-Val-Val-Tyr-Val-(D)-Ala);
цикло(Tyr-Val-Tyr-Tyr-Val-(D)-Ala) или
цикло(Tyr-Val-Met-Tyr-Val-(D)-Ala),
а также их физиологически приемлемые соли.

5. Циклогексапептиды следующих формул:
цикло(Tyr-Val-Ala-Gly-Xaa-(D)-Ala);
цикло(Tyr-Val-Ala-Gln-Xaa-(D)-Ala);
цикло(Tyr-Val-Ala-Lys-Xaa-(D)-Ala);
цикло(Tyr-Val-Ala-Asn-Xaa-(D)-Ala);
цикло(Tyr-Val-Ala-Ile-Xaa-(D)-Ala);
цикло(Tyr-Val-Ala-Leu-Xaa-(D)-Ala);
цикло(Tyr-Val-Ala-Pro-Xaa-(D)-Ala);
цикло(Tyr-Val-Ala-Phe-Xaa-(D)-Ala);
цикло(Tyr-Val-Ala-His-Xaa-(D)-Ala);
цикло(Tyr-Val-Ala-Ala-Xaa-(D)-Ala) или
цикло(Tyr-Val-Ala-Tyr-Xaa-(D)-Ala),
причем Xaa - остаток природной кислоты, кроме цистеина и триптофана,
а также их физиологически приемлемые соли.

6. Циклогексапептиды формулы I по одному из пп.1 - 5, обладающие способностью ингибировать связывание интерлейкина-4 (IL-4) с IL-4-рецептором.

7. Циклогексапептиды формулы I по одному из пп.1 - 5 для получения диагностического средства.

8. Циклогексапептиды формулы I по одному из пп.1 - 5 для получения "научного инструмента" для ингибирования связи интерлейкина-4 (IL-4) с IL-4-рецептором.

9. Способ получения циклогексапептидов общей формулы I по одному из пп.1 - 5, отличающийся тем, что а) исходную N-замещенную F-moc-D-Ala-2-хлортритильную смолу сочетают с соответствующим образом защищенными производными аминокислот, процесс ведут с помощью автоматического устройства для множественного синтеза пептидов, б) образовавшийся линейный пептид отщепляют от носителя при сохранении защитных групп боковых цепей, в) линейный пептид циклизуют в растворе, г) отщепляют защитные группы боковых цепей и, в случае необходимости, переводят в физиологически приемлемую соль.

10. Лекарственное или диагностическое средство, обладающее способностью предупреждать и диагностировать аллергические реакции немедленного типа на основе активнодействующего вещества и обычных добавок, отличающееся тем, что в качества активнодействующего вещества используют циклогексапептиды по пп.1 - 5 в эффективном количестве.

11. Способ получения лекарственного или диагностического средства, отличающийся тем, что, по меньшей мере, один циклогексапептид по пп.1 - 5, взятый в эффективном количестве, смешивают с физиологически приемлемым носителем, а также, в случае необходимости, с пригодными добавками и/или вспомогательными веществами.

12. Смесь, содержащая циклогексапептиды по одному из пп.1 - 5, обладающая способностью ингибировать связывание интерлейкина-4 (IL-4) с IL-4-рецептором.

13. Смесь по п.12 для получения лекарственного средства при лечении или профилактике аллергий и инфекций.

14. Смесь по п.12 для получения диагностического средства.

15. Смесь по п.12 для получения "научного инструмента" для ингибирования связывания интерлейкина-4 (IL-4) с IL-4-рецептором.

16. Способ получения смеси по п.12, отличающийся тем, что а) пригодным образом защищенные производные аминокислот сочетают на твердом носителе, причем для введения переменных положений либо добавляют смесь всех жевательных аминокислот, либо носитель с соединенными с ним олигопептидами разделяют на фракции и каждую фракцию по отдельности сочетают со специфической аминокислотой и затем фракции снова объединяют, б) образовавшуюся смесь линейных пептидов отщепляют от носителя при получении защитных боковых групп, в) смесь линейных пептидов циклизуют в растворе, г) боковые защитные группы отщепляют и, в случае необходимости, д) переводят в физиологически приемлемые соли.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9

PD4A - Изменение наименования обладателя патента Российской Федерации на изобретение

(73) Новое наименование патентообладателя:
Санофи-Авентис Дойчланд ГмбХ (DE)

Извещение опубликовано: 27.12.2005        БИ: 36/2005

---