Циклопептиды, способ их получения

 

Описываются новые циклопептиды общей формулы I цикло-(Arg-А-Аsp-R¹-R²), где А=Gly, R¹ - остаток 2-карбокси-8-амино-4-тиапиперолидин-9-она, 0-амино-метил-0¹-карбоксибифенила, 2-аминометил-5-карбоксиметилтиофена или остаток 2-(3-амино-1-пирролид-2-онил)-4-метилпентановой кислоты (s)Gly(ANC-2)-Leu или (R)Gly(ANC-2)-Leu, причем остатки соответственно соединены через пептидные связи, R² отсутствует, а также их физиологически приемлемые соли. Эти соединения действуют как ингибиторы интегрина и могут быть применены, в частности, для профилактики и лечения заболеваний кровообращения, костей и противоопухолевой терапии, а также как антивирусные активные вещества. 3 с. и 2 з.п. ф-лы, 1 табл.

Изобретение касается новых циклопептидов формулы I цикло-(Arg-A-Asp-R¹-R²), I где A=Glu; R¹ обозначает остаток 2-карбокси-8-амино-4- тиапиперолидин-9-она (Btd), о-амино-метил-о'-карбоксибифенила (Biph), 2-амино-метил-5-карбокси-метилтиофена (Act) или остаток 2-(3-амино-1-пирролид-2-онил)-4-метилпентановой кислоты (S) Gly[ANC-2]-Leu или (R) Gly[ANC-2]-Leu, причем остатки соответственно соединены через пептидные связи, R² отсутствует, а также их физиологически приемлемых солей.

Подобные соединения известны из Pharmazie, 40(8), 532-5(1985).

Задачей изобретения является получение соединений с ценными свойствами, в частности таких, которые могут быть использованы для изготовления лекарственных средств.

Показано, что соединения формулы I и их соли обладают весьма ценными свойствами. Прежде всего они действуют как ингибиторы интегрина, причем они ингибируют взаимодействие рецепторов интегрина β₃ или β₅ с лигандами. Особую активность проявляют соединения в случае интегринов α_vβ₁, α_vβ₃, α_vβ₅, α_vβ₆ и α_11bβ₃. Это действие может быть доказано, например, методом, который описывают Дж. Дабл. -Ю. Смит и др. в J.Biol. Chem. 265, 12267-12271 (1990). Дополнительно проявляются противовоспалительные эффекты.

Соединения могут применяться в качестве активных начал лекарственных средств в медицине и ветеринарии, в частности для профилактики и лечения заболеваний кровообращения, тромбоза, инфаркта миокарда, артериосклероза, воспалений, апоплексии, ангины пекторис, опухолевых заболеваний, остеолитических заболеваний, в частности остеопороза, при развитии кровеносных сосудов и рестенозе после пластической операции на сосудах, а также для улучшения заживления ран.

Соединения пригодны в качестве антимикробных или антивирусных активных веществ, препятствующих инфекциям, вызываемым бактериями, грибками, дрожжами или вирусами, а также в качестве антисептиков.

Согласно изобретению наиболее предпочтительными циклопептидами формулы I являются: а) цикло-(Arg-Gly-Asp-(S)Gly[ANC-2]-Leu); б) цикло-(Arg-Gly-Asp-(R)Gly[ANC-2]-Leu); в) цикло-(Arg-Gly-Asp-Act); г) цикло-(Arg-Gly-Asp-Btd).

Поскольку вышеназванные аминокислоты могут существовать в нескольких энантиомерных формах, все эти формы, а также их смеси (например, DL-формы) охватываются настоящим изобретением. Аминокислоты могут включать соответствующие известные защитные группы.

Предметом изобретения, далее, является способ получения соединения формулы I или одной из его солей, отличающийся тем, что их выделяют в свободном виде из одного из их функциональных производных путем обработки сольволизирующим или гидрогенолизирующим средством. Предметом изобретения является также способ, согласно которому обрабатывают пептид формулы II H-Z-OH, II где Z обозначает -Arg-A-Asp-R¹-R²-; -A-Asp-R¹-R²-Arg-; -Asp-R¹-R²-Arg-A-; -R¹-R²-Arg-A-Asp-; -R²-Arg-A-Asp-R¹, R¹ остаток 2-карбокси-8-амино-4-тиапиперолидин-9-она (Btd), О-амино-метил-, O¹ - карбоксибифенила (Biph), 2- аминометил-о-карбоксиметилтиофена (Act) или остаток 2-(3-амино- 1-пирролид-2-онил)-4-метилпентановой кислоты (S)Gly[ANC-2]-Leu или (R) Gly[ANC-2]-Leu,
R² отсутствует,
A-Gly,
или реакционноспособное производное такого пептида обрабатывают циклизующим средством и/или переводят основное или кислое соединение формулы I путем обработки кислотой или основанием в одну из его солей.

Приведенные в тексте сокращения аминокислотных остатков обозначают остатки следующих аминокислот:
Act 2-аминометилтиофен-5-уксусная кислота
Asp Аспарагиновая кислота
Arg Аргинин
Biph о-Аминометил-бифенил-о'-карбоновая кислота
Btd 8-Амино-4-тиапиперолидин-9-он-2-карбоновая кислота
Gly Глицин
Gly[ANC-2]-Leu 2-(3-Амино-1-пирролид-2-онил)-4-метил- пентановая кислота
Leu Лейцин
Кроме того, ниже обозначают:
BOC трет.-Бутоксикарбонил
CBZ Бензилоксикарбонил
DCCI Дициклогексилкарбодиимид
DMF Диметилформамид
EDCl N-Этил-N'-(3-диметиламинопропил)-карбодиимидгидрохлорид
Et Этил
FMOC 9-Флуоренилметоксикарбонил
HOBt 1-Гидроксибензотриазид
Me Метил
Mtz 4-Метокси-2,3,6-триметилфенил-сульфонил
OBut трет-Бутокси
OMe Метокси
OEt Этокси
POA Феноксиацетил
TBTU 2-(1H-Бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3 тетраметилуронийтетрафторборат
TFA трифторуксусная кислота
Выше и ниже по тексту остатки A, R¹, R² и Z имеют значения, указанные в формулах I и II, если не оговорено иное.

Остаток (S)Gly[ANC-2[-Leu или (R)Gly[ANC-2] -Leu обозначает остаток 3(S)-или 3(R)-(3-амино-1-пирролид-2-онил)-4-метил- пентановой кислоты

Biph обозначает остаток о-аминометилбифенил-о'-карбоновой кислоты, причем Biph1 и Biph2 обозначают возможные атропоизомеры.

Соединения формулы I, а также исходные вещества для их получения можно получать по известным методам, описанным в литературе (например, Губен-Вайль. Методы органической химии, Издательство ГеоргТиме, Штуттгарт). При этом можно также воспользоваться известными вариантами, не упоминаемыми здесь более подробно.

Пептидный структурный элемент Gly[ANC-2]-Leu в (R)- или (S)-форме получается по методу P. M. Фрайдингера и др., описанному в J.Org. Chem. 47, 104(1982), а синтез Btd возможен по У.Нагаи и др. Tetrahedron, 49, 3577-3592 (1993).

Исходные вещества, если желательно, также могут быть образованы in situ, так что их не выделяют из реакционной смеси, а сразу же превращают дальше в соединения формулы I.

Соединения формулы I могут быть получены выделением их в свободном виде из их функциональных производных путем сольволиза, в частности гидролиза или гидрогенолиза.

Предпочтительные исходные вещества для сольволиза или соответственно для гидрогенолиза включают такие, которые содержат вместо одной или нескольких свободных амино- и/или гидроксигрупп соответствующие защищенные амино- и/или гидроксигруппы, предпочтительно такие, которые вместо H-атома, соединенного о N-атомом, несут одну аминозащитную группу, например такие, которые соответствуют формуле I, но вместо NH₂ - группы содержат NHR' - группу (где R' обозначает аминозащитную группу, например BOC или CBZ.

Далее предпочтительны исходные вещества, которые вместо H-атома гидроксигруппы несут гидроксизащитную группу, например такие, которые соответствуют формуле I, но вместо гидроксифенилгруппы содержат R'' O-фенилгруппу (где R'' обозначает гидроксизащитную группу).

В молекуле исходного вещества могут также присутствовать несколько - одинаковых или разных - защищенных амино- и/или гидроксигрупп. В случае, если имеющиеся защитные группы отличаются друг от друга, они могут быть во многих случаях отщеплены избирательно.

Выражение "Аминозащитная группа" общеизвестно и относится к группам, которые годятся для того, чтобы защитить (блокировать) аминогруппу от химических превращений, но которые легко удаляются после того, как желаемая химическая реакция проведена в других местах молекулы. Типичны для таких групп, в частности, незамещенные или замещенные ацил-, арил-, аралкоксиметил- или аралкилгруппы. Так как аминозащитные группы после желаемой реакции (или серии реакций) удаляются, их вид и величина в остальном не имеют критически важного значения; предпочтительны, однако, такие группы с 1-20, в особенности с 1-8 C-атомами. Выражение "Ацильная группа" следует понимать в связи с настоящим способом в самом широком смысле. Оно охватывает ацильные группы, производные от алифатических, аралифатических, ароматических или гетероциклических карбоновых или сульфоновых кислот, а также, в частности, алкоксикарбонильные, арилоксикарбонильные и прежде всего аралкоксикарбонильные группы. Примеры таких ацильных групп включают алканоил, как-то: ацетил, пропионил, бутирил. аралканоил, как-то: фенилацетил, ароил, как-то: бензоил или толуил; арилоксиалканоил, как-то: POA; алкоксикарбонил, как-то: метоксикарбонил, этоксикарбонил, 2,2,2-трихлорэтоксикарбонил, BOC, 2-иодэтоксикарбонил, аралкоксикарбонил, как-то: CBZ ("карбобензокси"), 4-метоксибензилоксикарбонил, FMOC; арилсульфонил, как-то: Mtr. Предпочтительные аминозащитные группы - BOC и Mtr., далее CBZ, FMOC, бензил и ацетил.

Выражение "Гидроксизащитная группа" также общеизвестно и относится к группам, пригодным для защиты гидроксигруппы от химических превращений, но которые легко удаляются после того, как желаемая реакция проведена в других местах молекулы. Типичны для таких групп вышеназванные незамещенные или замещенные арил-, аралкил или ацилгруппы, далее также алкилгруппы. Природа и величина гидроксизащитных групп не имеют критически важного значения, так как они после желаемой химической реакции или серии реакций удаляются снова; предпочтительны группы с 1-20, в особенности с 1-10 C-атомами. Примерами гидроксизащитных групп, между прочим, являются бензил, п-нитробeнзoил, п-толуолсульфонил, тpет.-бутил и ацетил, причем особенно предпочтительны бензил и трет.- бутил. COOH-группы в аспарагиновой и глутаминовой кислотах предпочтительно защищаются в форме их трет. -бутиловых эфиров (например, Asp (OBut)).

Применяемые в качестве исходных веществ функциональные производные соединений формулы I могут быть подучены обычными методами аминокислотного и пептидного синтеза, как они, например, описаны в названных стандартных трудах и патентных заявках, например, также твердофазным методом по Меррифилду (Б. Ф. Гизин и P.B.Meppифилд, J.Am. Chem. Soc., 94,310 и cлед(1972)). Особенно благоприятен синтез по стратегии FMOC в проточном реакторе, описанный А.Иончиком и Дж.Меррифилдом в Peptides, Труды 8-го Американского симпозиума по пептидам, 73-77 (1983) (редакторы: В.Дж.Хруби и Д.Х.Рич), Пиерс Ко, Рокфорд.

Высвобождение соединений формулы I из их функциональных производных удается - в зависимости от используемой защитной группы - например, c сильными кислотами, целесообразно с или хлорной кислотой, но также и с другими сильными кислотами, как-то: соляная кислота или серная кислота, сильными органическими кислотами; как-то: трихлоруксусная кислота или сульфоновые кислоты, как-то: бензол- или п-толуолсульфокислота. Присутствие дополнительного инертного растворителя возможно, но не всегда необходимо. В качестве инертных растворителей особенно пригодны органические, например карбоновые кислоты, как-то: уксусная кислота, эфир, как-то: тетрагидрофуран или диоксан, амиды, как-то: диметилформамид, галогенированные углеводороды, как-то: дихлорметан, затем также спирты, как-то: метанол, этанол или изопропанол, а также вода. Далее могут рассматриваться смеси вышеназванных растворителей. TFA применяется преимущественно в избытке без добавления другого растворителя, хлорная кислота в форме смеси уксусной кислоты и 70%-ной хлорной кислоты в соотношении 9: 1. Температуры реакции для расщепления целесообразно находятся между 0 и прибл. 50^oC, предпочтительно между 15 и 30^oC (комнатная температура).

Группы BOC, oBut и Mtr могут быть отщеплены, например, трифторуксусной кислотой в дихлорметане или прибл. 3-5-нормальной HCl в диоксане при 15-30^oC, FMOC-группа приблизительно 5-50%-ным раствором вторичных аминов, как-то: диметиламин, диэтиламин или пиперидин в диметилформамиде при 15-30^oC.

Защитные группы (например, CBZ или бензил), удаляемые гидрогенолитически, могут быть отщеплены, например, обработкой водородом в присутствии катализатора (например катализатора из благородного металла, как-то платина, целесообразно на носителе, как-то: уголь). В качестве растворителя пригодны вышеуказанные, в особенности, например, спирты, как-то: метанол или этанол, или амиды, как-то: диметилформамид. Гидрогенолиз проводится, как правило, при температурах от 0 до 100^oC и давлениях от прибл. 1 до 200 бар, предпочтительно при 20-30^oC и 1-10 бар. Гидрогенолиз CBZ-группы удается, например, хорошо на 5-10%-ном Pd-C в метаноле или с формиатом аммония (вместо H₂) на Pd-C в метанол/диметилформамиде при 20-30^oC.

Соединения формулы I могут быть также получены циклизацией соединений формулы II в условиях пептидного синтеза. При этом целесообразно работают по обычным методам пептидного синтеза, как они описаны, например, у Губен-Вайля, 1-я глава, том 15/11, стр. 1-806 (1974).

Реакция удается преимущественно в присутствии дегидратизирующего средства, например карбодиимида, как-то: DCCI или EDCl, далее ангидрида пропанфосфоновой кислоты (ср. Angew. Chem.,), 92, 129 (1980), дифенилфосфорилазида или 2-этокси-N- этоксикарбонил-1,2-дигидрохинолина, в инертном растворителе, например галогенированном углеводороде, как-то: дихлорметан, эфире, как-то: тетрагидрофуран или диоксан, амиде, как-то: диметилформамид или диметилацетиламид, нитриле, как-то: ацетонитрил, или в смесях этих растворителей, при температурах от прибл. -10 до 40^oC, предпочтительно от 0 до 30^oC. Чтобы способствовать внутримолекулярной циклизации перед межмолекулярным связыванием пептида, целесообразно работать в разбавленных растворах (принцип разведения).

Вместо II можно также вводить в реакцию подходящие реакционноспособные производные этих веществ, например такие, в которых реакционноспособные группы промежуточно блокированы защитными группами. Производные аминокислот II могут применяться, например, в форме их активированных эфиров, которые целесообразно образуются in situ, например, благодаря добавлению HOBt или N-гидроксисукцинимида.

Исходные вещества формулы II, как правило, новые. Они могут быть приготовлены по известным методам, например вышеуказанным методам пептидного синтеза и отщепления защитных групп.

Как правило, сначала синтезируют защищенные пентапептидные сложные эфиры формулы R'-Z-OR'', например BOC-Z-OMe или BOC-Z- OEt, которые затем омыляются в кислоты формулы R'-Z-OH, например BOC-Z-OH; от этих кислот отщепляются защитная группа R', благодаря чему получают свободные пептиды формулы H-Z- OH(II).

Основание формулы I может быть переведено кислотой в соответствующую кислотноаддитивную соль. Для этого превращения особенно годятся кислоты, которые дают физиологически безупречные соли. Так, могут применяться неорганические кислоты, например серная кислота, азотная кислота, галогенводородные кислоты, как-то: хлористоводородная или бромистоводородная кислоты, фосфорные кислоты, как-то: ортофосфорная кислота, сульфаминовая кислота, далее органические кислоты, в частности алифатические, алициклические, аралифатические, ароматические или гетероциклические одно- или многоосновные карбоновые, сульфоновые или серные кислоты, например муравьиная, уксусная, пропионовая, триметилуксусная, диэтилуксусная, малоновая, янтарная, пимелиновая, фумаровая, малеиновая, молочная, винная, яблочная, бензойная, салициловая, 2- или 3-фенилпропионовая, лимонная, глюконовая, аскорбиновая, никотиновая, изоникотиновая, метан- или этансульфоновая, этандисульфоновая, 2-гидроксиэтансульфоновая, бензосульфоновая, п-толуолсульфоновая, нафталинмоно- и дисульфоновая, лаурилсерная кислоты. Соли с физиологически не безупречными кислотами, например пикраты, могут применяться для выделения и/или очистки соединений формулы I.

С другой стороны, кислота формулы I реакцией с основанием может быть переведена в одну из ее физиологически безупречных солей металла или аммония. В качестве солей могут рассматриваться при этом, в частности, соли натрия, калия, магния, кальция и аммония, далее замещенные соли аммония, например диметил-, диэтил- или диизопропиламмониевые соли, моноэтанол-, диэтанол- или триэтаноламмониевые соли, циклогексил-, дициклогексиламмониевые соли, дибензилэтилендиаммониевые соли, далее, например, соли с N-метил-D-глюкамином, или аргинином, или лизином.

Новые соединения формулы I и их физиологически приемлемые соли могут применяться для получения фармацевтических препаратов путем перевода их совместно с по меньшей мере одним веществом носителя или вспомогательным веществом и, если желательно, совместно с одним или несколькими другими активными веществами в подходящую лекарственную форму. Полученные таким образом препараты могут применяться как лекарственные средства в медицине или ветеринарии. В качестве вещества носителя могут рассматриваться органические или неорганические вещества, которые годятся для энтерального (например, орального или ректального), парентерального (например, внутривенной инъекции) или локального (например, местного, дермального, в глаза или в нос) применения или для применения в форме ингаляционных аэрозолей и не реагируют с новыми соединениями, например вода или водный изотонический раствор поваренной соли, низшие спирты, растительные масла, бензиловые спирты, полиэтиленгликоли, глицеринтриацетат и другие глицериды жирных кислот, желатины, соевый лецитин, углеводы, как-то: лактоза или крахмал, стеарат магния, тальк, целлюлоза, вазелины. Для орального применения служат, в частности, таблетки, драже, капсулы, сиропы, соки или капли; интересны специальные лаковые таблетки и капсулы со стойким к желудочному соку покрытием или соответственно оболочками капсул. Для ректального применения служат суппозитории, для парентерального применения - растворы, преимущественно масляные или водные растворы, затем суспензии, эмульсии или имплантаты. Для местного применения пригодны, например, растворы, которые могут быть применены в форме глазных капель, далее, например, суспензии, эмульсии, кремы, мази или компримаматы. Для применения в качестве ингаляционного аэрозоля годятся аэрозоли, содержащие активное вещество, либо растворенное, либо суспендированное в газе-вытеснителе или в смеси таких газов (например, CO₂ или фторхлоруглеводородах). Целесообразно применять активное вещество при этом в микронизированной форме, причем могут присутствовать дополнительные физиологически совместимые растворители, например этанол. Ингаляционные растворы могут вводиться с помощью обычных ингаляторов. Новые соединения могут также быть лиофилизированы и полученные лиофилизаты, например, применяться для изготовления инъекционных препаратов. При этом инъекции могут выполняться как ударной дозой, так и как непрерывное вливание (например, внутривенно, внутрибрюшинно, подкожно или подоболочечно). Указанные препараты могут быть стерилизованы и/или содержать вспомогательные вещества, как-то: консервирующие, стабилизирующие и/или смачивающие средства, эмульгаторы, соли для оказания влияния на осмотическое давление, буферные вещества, красящие и/или ароматизирующие вещества. Они могут, если нужно, содержать одно или несколько активных веществ, например один или несколько витаминов.

Вещества согласно изобретению могут вводиться пациенту, как правило, аналогично другим известным имеющимся в продаже пептидам, в частности по аналогии с соединениями, описанными в US-A 4472305, преимущественно в дозировках от прибл. 0,05 до 500 мг, в особенности от 0,5 до 100 мг на единицу дозы. Ежедневная доза составляет, как правило, от 0,01 до 2 мг/кг веса тела. Специальная доза для каждого определенного пациента зависит, однако, от различных факторов, например от активности соединения, возраста, веса тела, общего состояния здоровья, пола, от пищи, от момента и пути введения лекарства, от скорости выделения, комбинации лекарственных средств и тяжести заболевания. Предпочтительно парентеральное введение.

Далее, новые соединения формулы I могут применяться как лиганды интегрина для колонок аффинной хроматографии с целью получения интегринов в чистом виде.

Лиганд, т. е. производное пептида формула 1, при этом присоединяется ковалентно через анкерные функции к полимерному носителю.

В качестве полимерных носителей пригодны известные в химии пептидов полимерные твердые фазы с преимущественно гидрофильными свойствами, например, поперечно сшитые полисахара, как целлюлоза, сефароза или сефадеко^TM, акриламиды, полимеры на полиэтиленгликолевой основе или тентакельполимеры^TM.

В качестве анкерных функций, которые соединяют с полимерными носителями, пригодны преимущественно линейные алкиленовые цепи с 2-12 C-атомами, присоединенные одним концом непосредственно к полимеру, а на другом конце имеющие функциональную группу, например такую, как гидрокси, амино, меркапто, малеинимидо или -COOH и пригодные для связывания с функциональной боковой цепью соответствующего пептида.

При этом возможно, что пептид непосредственно или через вторую анкерную функцию будет соединен с анкером пептида.

Кроме того, аминокислоты, являющиеся составной частью пептидов формулы I, могут быть так модифицированы в их боковых цепях, что они будут способны присоединяться через, например, группы NH₂, CH-, OH-, NH₂ или COOH к анкеру полимера.

Аминокислотными остатками, боковая цепь которых может служить непосредственно анкерной функцией, являются, например, Arg или Asp.

Примерами анкера, которые могут быть связаны через свободные NH₂-группы, являются остатки, такие как, например, - CO-C_nH_2n-NH₂, -CO-C_nH_2n-OH, -CO-C_nH_2n-SH или -CO-C_nH_2n-COOH с n=2-12, причем длина алкиленовой цепи не имеет критически важного значения, и она при необходимости может быть замещена, например, соответствующими арильными иди алкарильными остатками.

С-концевые анкеры, которые могут быть присоединены к свободным кислотным группировкам, представляют собой, например, группы -O-C_nH_2n-SH, -O-C_nH_2n-OH, -O-C_nH_2n-NH₂, -O-C_nH_2n-COOH, -NH-C_nH_2n-SH, -NH-C_nH_2n-OH, -NH-C_nH_2n-NH₂,
-NH-C_nH_2n-COOH, причем n, а также алкиленовая цепь имеют вышеуказанное значение.

Получение материалов для афинной хроматографии для очистки интегринов происходит в условиях, обычных для конденсации аминокислот.

В случае тиолсодержащих анкеров можно использовать реакции присоединения, как: реакцию Михаэля на производных малеинимида или образование дисульфида с полимерсвязанным тиолом.

Значения температур указаны в ^oC. В нижеследующих примерах "обычная переработка" означает: добавляют, в случае необходимости, воду, нейтрализуют, экстрагируют эфиром или дихлорметаном, отделяют, сушат органическую фазу над сульфатом натрия, фильтруют, упаривают и очищают хроматографически на кизельгеде и/или путем кристаллизации. RT = время удерживания (минуты) в высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на системе A: Lichrosorb® RP Select В (250х4; 5 мкм) или системе Lichrosorb® RP18 (250х4; 5 мкм); подвижная фаза (система A): 0,3% TFA в воде; изопропаноловый градиент 0-80 объемн. %; 50 мин. при 1 мл/мин, протекания и детектирование при 215 нм. Подвижная фаза (система B): элюент A: 0,1% TFA в воде, элюент В: 0,1% TFA в ацетонитрил/воде (9: 1); градиент 20-90% В; 50 мин при 1 мл/мин. М⁺ = молекулярный пик в масс-спектре, полученном по методу быстрой атомной бомбартировки, причем указанный молекулярный вес повышен на одну единицу массы в сравнении с рассчитанной величиной.

Пример 1
Раствор 0,4 г H-Arg(Mtr)-Gly-Asp-Btd-ONa (например, может быть подучен из FMOC-Arg(Mtr)-Gly-Asp-Btd-O-Wang), причем -O-Wang обозначает используемый в модифицированном методе Меррифилда остаток 4-оксиметилфеноксиметил-полистирольной смолы, путем отщепления группы FMOC с помощью пиперидин/диметилформамида и отщепления смолы с помощью TFA/CH₂Cl₂ (1:1) в 15 мл DMF разбавляют в 85 мл дихлорметана и смешивают с 50 мг NaHCO₃. После охлаждения в смеси сухой лед/ацетон добавляют 40 мкл дифенилфосфорилазида. После 16 часов выдерживания при комнатной температуре раствор концентрируют. Концентрат фильтруют (колонна с сефадексом G10 в смеси изопропанол/вода 8:2) и затем очищают посредством ВЭЖХ. Получают цикло-Arg(Mtr)-Gly-Asp-Btd.

Аналогично получают циклизацией соответствующих линейных пептидов: цикло-(Arg(Mtr)-Gly-Asp- (S) Gly[ANC-2]-Leu; цикло-(Arg(Mtr)-Gly-Asp-(R)Gly[ANC-2] - Leu; цикло-(Arg(Mtr)-Gly-Asp-Biph1); цикло-(Arg(Mtr)-Gly- Asp-Biph2); цикло-(Arg(Mtr)-Gly-Asp-Act).

Пример 2
Раствор 0,28 г цикло-Arg(Mtr)-Gly-Asp-Btd (может быть получен путем циклизации в соответствии с примером 1) в 8,4 мл TFA, 1,7 мл дихлорметана и 0,9 мл тиофенола оставляют стоять на 4 часа при комнатной температуре, затем концентрируют и по разбавлении водой сушат вымораживанием. Гельфильтрация на сефадексе G10 (уксусная кислота/вода 1:1) и последующая очистка путем препаративной ВЭЖХ при указанных условиях приводят к выделению цикло-(Arg-Gly-Asp-Btd); RT=13,2; М⁺ 527.

Аналогично получают: из цикло-(Arg(Mtr)-Gly-Asp-(S) Gly[ANC-2]-Leu: цикло-(Arg-Gly-Asp-(S) Gly[ANC-2] -Leu, RT= 4,8; M⁺ 525; из цикло-(Arg(Mtr)-Gly-Asp-(R) Gly[ANC-2] -Leu: цикло-(Arg-Gly-Asp-(R) Gly[ANC-2]-Leu, RT=6,3; M⁺ 525; из цикло-(Arg(Mtr)-Gly-Asp-Biph1): цикло-(Arg-Gly-Asр-Biph1); RT-20,7; M⁺ 538; из цикло-(Arg(Mtr)-Gly-Asp-Biph2): цикло-(Arg-Gly-Asp-Biph2); RT= 20,8; М⁺ 538; из цикло-(Arg(Mtr)-Gly-Asp-Act): цикло-(Arg-Gly-Asp-Act); RT=14,3; M⁺ 547.

Пример 3
80 мг цикло-(Arg-Gly-Asp-Btd) растворяют пять или шесть раз в 0,01 М HCl и после каждого процесса растворения очищают вымораживанием. Последующая очистка с помощью HPLC дает цикло-(Arg-Gly-Asp-Btd) х HCl.

Аналогично получают: из цикло- (Arg-Gly-Asp-Aha): цикло-(Arg-Gly-Asp-Aha) х HCl; цикло-(Arg-Gly-Asp-Aha) х HNO₃;
Пример 4
Для получения аффинных фаз суспендируют 0,9 г (Cl- (CH₂)₃-CO-NH-(CH₂)₃-полимера (может быть получен конденсацией (Cl-(CH₂)₃-COOH с H₂N-(CH₂)₃-полимером) в 10 мл 0,1 М натрийфосфатного буфера при pH 7 и добавляют при 4^oC 1 эквивалент цикло-(Arg(Mtr)-Gly-Asp(ONa)-Btd). Перемешивают в течение 4 часов при одновременном нагревании реакционной смеси до комнатной температуры, твердый остаток отфильтровывают и дважды промывают каждый раз 10 мл буферного раствора (pH 7) и затем трижды водой каждый раз до 10 мл. Получают цикло цикло-(Arg(Mtr)-Gly-Asp-(O(CH₂)₃)-CONH- (CH₂)₃-полимер-Btd).

Пример 5
Аналогично примеру 2 получают, исходя из цикло- (Arg(Mtr)-Gly-Asp-(O(CH₂)₃)-CONH-(CH₂)₃ -полимер-Btd), отщеплением группы Mtr цикло-(Arg-Gly-Asp-(O(CH₂)₃)-CONH-(CH₂)₃- полимер-Btd).

Пример 6
Аналогично примеру 4 получают конденсацией полимер -(O(CH₂)₃)-NH₂ (имеется в продаже) и цикло-(Arg-Gly- Asp-Biph1) следующую полимерную фазу: цикло-(Arg-Gly-Asp-(NH-(CH₂)₃)-O-полимер)-Biph1).

Нижеследующие примеры касаются фармацевтических препаратов.

Пример A: Склянки для инъекций
Раствор 100 г циклопептида формулы I и 5 г вторичного фосфата натрия в 3 л дважды дистиллированной воды устанавливают на pH 6,5 с помощью 2н. соляной кислоты, стерильно фильтруют, разливают в склянки для инъекций, лиофилизируют в стерильных условиях и стерильно закрывают. Каждая склянка содержит 5 мг активного вещества.

Пример B: Суппозитории
Расплавляют смесь 20 г активного вещества формулы I со 100 г соевого лецитина в 1400 г какао-масла, выливают в формы и дают остыть. Каждый суппозиторий содержит 20 мг активного вещества.

Пример C: Раствор
Готовят раствор на 1 г активного вещества формулы I, 9,38 г NaH₂PO₄·2H₂O, 28,48 г Na₂HPO₄·12H₂O и 0,1 г бензалконийхлорида в 940 мл дважды дистиллированной воды. Устанавливают pH 6,8, доливают до 1 л и стерилизуют облучением. Этот раствор может применяться в форме глазных капель.

Пример D: Мазь
Смешивают 500 мг активного вещества формулы I с 99,5 г вазелина при асептических условиях.

Пример E: Таблетки
Смесь 100 г пиклопептида формулы I, 1 кг лактозы, 600 г микрокристаллической целлюлозы, 600 г кукурузного крахмала, 100 г поливинилпирролидона, 80 г талька и 10 г стеарата магния спрессовывают обычным способом в таблетки, так что каждая таблетка содержит 10 мг активного вещества.

Пример F: Драже
Прессуют таблетки, как указано в примере E, и покрывают их затем обычным способом покрытием из сахарозы, кукурузного крахмала, талька, траганта и красителя.

Пример G: Капсулы
Капсулы из твердого желатина заполняют обычным способом активным веществом формулы I, так что каждая капсула содержит 5 мг активного вещества.

Пример H: Ингаляционные аэрозоли
Растворяют 14 г активного вещества формулы I в 10 л изотонического раствора поваренной соли и закачивают раствор в имеющиеся в торговле распылительные сосуды с помощью насосного механизма. Раствор может быть распылен в рот или нос. Распыляемое количество (прибл. 0,1 мл) соответствует дозе прибл. 0,14 мг.

Фармакологические данные, подтверждающие биологическую активность соединений по изобретению (см. таблицу).

Связывание витронектина (VN) с рецептором определяли согласно методу, описанному Смитом и сотр. в J.Biol. Chem., 265,1267-71 (1990).

IC₅₀-значение (концентрация нмоль/л, соответствующая 50%-ному ингибированию связывания витронектина с рецептором) характеризует активность соединений формулы I.

По мнению заявителя соединения по изобретению характеризуются средней степенью активности.

Формула изобретения

1. Циклопептиды формулы I
цикло-(Arg-A-Asp-R¹-R²) (I),
где А = GLy;
R¹ - остаток 2-карбокси-8-амино-4-тиапиперолидин-9-она (Btd) О-амино-метил-O'-карбоксибифенила (Biph), 2-аминометил-5-карбоксиметилтиофена (Act) или остаток 2-(3-амино-1-пирролид-2-онил)-4-метилпентановой кислоты (s) Gly (ANC-2)-Leu или (R) Gly(ANC-2)-Leu, причем остатки соответственно соединены через пептидные связи;
R² отсутствует,
а также их физиологически приемлемые соли.

2. Циклопептиды формулы I по п.1, представляющие собой: а) цикло-(Arg-Gly-Asp-(S)Gly/ANC-2/-Leu); б) цикло-(Arg-Gly-Asp-(R)Gly/ANC-2/-Leu); в) цикло-(Arg-Gly-Asp-Act); г) цикло-(Arg-Gly-Asp-Btd).

3. Энантиомер или диастереаомер соединения формулы I согласно п.1.

4. Способ получения соединений формулы I по п.1 или одной из его солей, отличающийся тем, что их выделяют в свободном виде из одного из их функциональных производных путем обработки сольвализирующим или гидрогенизирующим средством.

5. Способ получения соединения формулы I согласно п.1 или одной из его солей, отличающийся тем, что пептид формулы II:
H-Z-OH,
где Z = -Arg-A-Asp-R¹-R²-; -A-Asp-R¹-R²-Arg-; -Asp-R¹-R²-Arg-A-; -R¹-R²-Arg-A-Asp-; -R²-Arg-A-Asp-R¹-, где R¹ - остаток 2-карбокси-8-амино-4-тиапиперолидин-9-она(Btd), О-амино-метил-О'-карбоксибифенила (Biph), 2-аминометил-5-карбоксиметилтиофена (Act), или остаток 2-(3-амино-1-пирролид-2-онил)-4-метилпентановой кислоты (S)Gly((ANC-2)-Leu, или (R)Gly[ANC-2] -Leu;
R² - отсутствует;
A = Gly
или реакционноспособное производное такого пептида обрабатывают циклизующим средством и/или переводят основное или кислое соединение формулы I путем обработки кислотой или основанием в одну из его солей.

РИСУНКИ

Рисунок 1