Способ получения метилового эфира феофорбида (а)

 

Изобретение относится к химии природных соединений, а именно к получению метилового эфира (МЭ) феофорбида (а), променяемого в отраслях медицины, парфюмерии, косметики и др. Способ включает извлечение производных хлорофиллов (а) и (б) из сырья растительного происхождения, их метилирование кипячением в 5%-ном растворе концентрированной серной кислоты в метаноле, хроматографическое разделение МЭ феофорбидов (а) и (б). При этом в качестве сырья используют липофильную фракцию экстрактивных веществ серпухи венценосной (Serratula coronata L.). Извлечение производных хлорофиллов (а) и (б) проводят путем обработки фракции хлороформом с последующим переосаждением производных хлорофиллов (а) и (б) из хлороформенного раствора в гептан. После метилирования осуществляют выделение МЭ феофорбидов (а) и (б) кристаллизацией их из смешанного растворителя: хлороформ - метанол (1 : 1, по объему), а после хроматографического разделения МЭ феофорбидов (а) и (б) проводят очистку МЭ феофорбида (а) кристаллизацией из смешанного растворителя: хлороформ - метанол (1 : 1,5, по объему). Способ позволяет выделить МЭ феофорбида (а) с чистотой 95-97% из липофильной фракции экстрактивных веществ серпухи венценосной (Serratula coronata L.) - отходов производства концентрата экдистероидов. 2 табл.

Изобретение относится к химии природных соединений, а именно к получению метилового эфира феофорбида (а) из растительного сырья для медицины, парфюмерии, косметики и др.

Производные хлорофилла, в частности феофорбид (а) и его метиловый эфир (М. Э. ), используются во всем мире в составе лекарственных препаратов, пищевых и косметических композициях, в качестве биодобавок, пищевых красителей и др. Интерес к получению индивидуальных хлорофиллов и их производных был поначалу связан с важной ролью этих пигментов в природе. Для изучения процесса фотосинтеза было важно установить структуру этих пигментов. Кроме того, производные хлорофилла используются для получения модельных соединений, при помощи которых изучают протекание фотосинтеза. До относительно недавнего времени других применений производные хлорофилла как индивидуальные соединения не находили. Однако оказалось, что производные хлорофилла в силу своих спектральных свойств перспективны как фотосенсибилизаторы (ФС) для фотодинамической терапии (ФДТ), в частности терапии злокачественных новообразований. Эти же вещества могут использоваться и как диагностические препараты в онкологии. Так, натриевая соль феофорбида (а) показала хорошую фотосенсибилизирующую активность. Аргинил-хлорин e₆ и лизил-хлорин р₆ запатентованы как ФС для ФДТ рака [Pat. 5,378, 835 (01/1995) USA / Nakazato M. Method of Producing Water-soluble Sodium Pheophorbide a. // C.A. - 1993. - V. 117. - 178303y; R. K. Pandey, F. Y. Shiau, A.B. Sumlin, T.J. Dougherty and K.M. Smith, Structure/activity relationship among photosensitizers related topheophorbides and bacteriopheophorbides. // Bioorg. and Med. Chem. Lett. - 1992. - V.2/5. - p.491-496].

Несмотря на то, что все эти вещества находятся еще на различных стадиях испытания, считается весьма вероятным, что препараты, полученные на основе производных феофорбида (а) и хлоринов e₆ и р₆, найдут применение в клинической практике наряду с такими препаратами как "Фотофрин" и другие.

Таким образом, поиск новых доступных источников природного сырья и получение из них индивидуальных производных хлорофилла в больших количествах является актуальной задачей.

Известен способ получения смеси метиловых эфиров (МЭ) феофорбидов (а) и (б) из крапивы [Порфирины: структура, свойства, синтез. / Н.С. Ениколопян ред. // М. : Наука, 1985, с. 191; Координационные соединения порфиринов и фталлоцианина. /Березин Б.Д. // М.: Наука, 1978, c.l7; Scheer H., Gross E., Nitsche В., et al. // Photochem. Photobiol, 1986, vol. 43, N 5, pp. 559-571] , включающий экстракцию измельченных листьев крапивы 96%-ным этанолом, получение из экстракта смеси производных хлорофилла - феофитинов (а) и (б) путем обработки экстракта НСl, отделения образовавшихся феофитинов (а) и (б) фильтрованием, промывания их этанолом и высушивания в темноте, последующее метилирование смеси феофитинов (а) и (б) 5%-ным раствором концентрированной серной кислоты в метаноле при перемешивании в течение 15 ч, получение смеси метиловых эфиров (а)+(б) путем разбавления смеси, полученной после метилирования, хлороформом с последующей промывкой и упариванием, растворение полученной после упаривания смеси в метиленхлориде, переосаждение из метиленхлорида в метанол и отделение фильтрованием выпавшего осадка.

Известен также способ получения метилового эфира феофорбида (a) [Scheer Н. , Gross E., Nitsche В., et. al. // Photochem. Photobiol., 1986, vol. 43, 5, pp. 559-571], выбранный нами за прототип, включающий экстракцию измельченных листьев крапивы 96%-ным этанолом, извлечение из экстракта смеси производных хлорофилла - феофитинов (а) и (б) путем обработки экстракта НСl, отделения образовавшихся феофитинов (а) и (б) фильтрованием, промывания их этанолом и высушивания в темноте, последующее метилирование смеси феофитинов кипячением с обратным холодильником в течение 30 мин в 5%-ном растворе концентрированной серной кислоты в метаноле, выделение м. э. феофорбида (а) из смеси М. Э. феофорбидов (а) и (б), путем ее двухстадийного разделения: колоночной хроматографией на силикагеле (элюент - ССl₄:ацетон 96:4) и тонкослойной хроматографией (ТСХ) на силикагеле (элюент - ССl₄: ацетон 9:1).

Недостатком этого способа является необходимость предварительного получения производных хлорофиллов - феофитинов с минимальным количеством примесей непосредственно из растительного сырья.

Задачей настоящего изобретения является разработка способа выделения М. Э. феофорбида (а) из липофильной фракции - отхода переработки растения серпухи венценосной (Serratula coronata L.) после извлечения экдистероидов.

При переработке серпухи венценосной (Serratula coronata L.), которая используется для получения препаратов на основе экдистероидов [Особенности технологии получения экдистероидов растения Serratula coronata L /Пунегов В. В. , Мишуров В.П., Никитина Л.П. и др.// Новые и нетрадиционные растения и перспективы их практического использования: Тез. Докл. II Междун. Симпозиума. Пущино, 16-20 июня 1999 г. - Том II. - С.79-81], отходом производства является липофильная фракция, содержащая помимо других веществ производные хлорофилла и которая может быть использована в качестве сырья для получения метилового эфира феофорбида (а).

Способ получения концентрата экдистероидов из серпухи венценосной (Serratula coronata L.) состоит в следующем: наземная часть растения экстрагируется 70%-ным водным этанолом, полученный экстракт упаривается на роторном испарителе при температуре 40-55^oС до 20% от исходного объема.

Технический результат заключается в том, что предлагаемое изобретение позволяет выделить М. Э. феофорбида (а) с чистотой 95-97% из липофильной фракции экстрактивных веществ серпухи венценосной (Serratula coronata L.) - отхода производства концентрата экдистероидов.

Общим с выбранным прототипом является то, что способ получения метилового эфира феофорбида (а) включает извлечение производных хлорофиллов (а) и (б) из сырья растительного происхождения, их метилирование кипячением в 5%-ном растворе концентрированной серной кислоты в метаноле, хроматографическое разделение М.Э. феофорбидов (а) и (б).

Отличительным является то, что в качестве сырья используют липофильную фракцию экстрактивных веществ серпухи венценосной (Serratula coronata L.), извлечение производных хлорофиллов (а) и (б) проводят путем обработки фракции хлороформом с последующим переосаждением производных хлорофиллов (а) и (б) из хлороформенного раствора в гептан, после метилирования осуществляют выделение М.Э. феофорбидов (а) и (б) кристаллизацией их из смешанного растворителя: хлороформ - метанол (1:1, по объему), а после хроматографического разделения М. Э. феофорбидов (а) и (б) проводят очистку М.Э. феофорбида (а) кристаллизацией из смешанного растворителя: хлороформ - метанол (1:1.5, по объему).

Получение концентрата экдистероидов серпухи венценосной состоит в следующем. 6 кг наземной части сухого растения экстрагируют 75 л 70% этанола. Полученный экстракт упаривают до 15% от исходного объема. При этом в растворе содержатся экдистероиды, а в осадок выпадает липофильная фракция, содержащая производные хлорофиллов (а) и (б), липиды и бесцветные примеси. Эта неиспользуемая ранее липофильная фракция экстрактивных веществ серпухи венценосной (Serratula coronata L.) после отделения экдистероидов и служит сырьем для получения производных хлорофиллов.

Способ получения М.Э. феофорбида (а) осуществляют следующим образом.

Из липофильной фракции экстрактивных веществ серпухи венценосной (Serratula coronata L.), содержащей производные хлорофилла и примеси, извлекают производные хлорофилла, очищая от примесей. Для этого липофильную фракцию смешивают с хлороформом при расходе хлороформа 800-1000 мл на 100 г фракции, нерастворимые в хлороформе примеси отделяют фильтрованием, а полученный хлороформенный раствор упаривают до объема 50-80 мл, затем приливают гептан (200-300 мл). При этом в осадок выпадают производные хлорофиллов, а в растворе остаются липиды. Выпавший осадок отфильтровывают и промывают на фильтре гептаном (50-70 мл).

Полученный осадок, содержащий производные хлорофиллов: феофорбиды (а) и (б) и их этиловые эфиры метилируют 5%-ным раствором концентрированной H₂SO₄ в метаноле кипячением с обратным холодильником в течение 0,5-1 ч.

Затем выделяют смесь метиловых эфиров. Для этого реакционную смесь охлаждают, разбавляют хлороформом и промывают водой до рН 5-7. Хлороформенный раствор смешивают с метанолом при объемном соотношении 1:1 соответственно, затем смесь упаривают и получают кристаллический порошок, представляющий собой по данным ТСХ и ВЭЖХ смесь М.Э. феофорбидов (а) и (б).

Полученную смесь М.Э. феофорбидов (а) и (б) разделяют колоночной хроматографией на оксиде алюминия L40/250 (элюент бензол-хлороформ 100:5). Выделяют хроматографическую фракцию, состоящую по данным высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) из двух компонентов - М.Э. феофорбида (а) и М.Э. феофорбида (а') в соотношении 4:1.

Выделение М. Э. феофорбида (а) из хроматографической фракции, состоящей из двух компонентов - М.Э. феофорбидов (а) и (а'), осуществляют кристаллизацией из смешанного растворителя хлороформ-метанол при объемном соотношении 1: 1.5. Для этого полученные соединения растворяют в хлороформе, к раствору прибавляют метанол, при этом в осадок выпадает М.Э. феофорбида (а) с чистотой 95-97% (данные ВЭЖХ).

Пример 1 450 г липофильной фракции смешивают с 4,5 л хлороформа, нерастворимые в хлороформе примеси отделяют фильтрованием, полученный хлороформенный раствор упаривают до объема 80 мл, затем приливают 250 мл гептана. Выпавший осадок отфильтровывают и промывают на фильтре 60 мл гептана.

Полученный осадок (около 15 г), содержащий производные хлорофиллов: феофорбиды (а) и (б) и их этиловые эфиры, метилируют следующим образом: осадок растворяют в смеси 50 мл метанола и 2,5 мл концентрированной H₂SO₄, раствор кипятят с обратным холодильником в течение 1 ч.

Реакционную смесь охлаждают, разбавляют 100 мл хлороформа и промывают водой до рН 6. 100 мл хлороформенного раствора смешивают со 100 мл метанола, затем смесь упаривают до 40 мл, получают 3,5 г кристаллического порошка, представляющего собой по данным ТСХ и ВЭЖХ смесь М.Э. феофорбидов (а) и (б).

Полученную смесь М. Э. феофорбидов (а) и (б) разделяют колоночной хроматографией на оксиде алюминия L40/250 (элюент бензол-хлороформ 100:5). Выделяют хроматографическую фракцию (около 850 мг), состоящую по данным ВЭЖХ из двух компонентов - М.Э. феофорбида (а) и М.Э. феофорбида (а') в соотношении 4:1.

Хроматографическую фракцию растворяют в 20 мл хлороформа, к раствору прибавляют 30 мл метанола, при этом в осадок выпадает около 500 мг М.Э. феофорбида (а) с чистотой 95-97% (данные ВЭЖХ).

Пример 2 Выделение М.Э. феофорбида (а) проводят так же, как в примере 1, за исключением хроматографического разделения. Полученную смесь М.Э. феофорбидов (а) и (б) разделяют колоночной хроматографией на силикагеле L40/100 (элюент CCL4 - ацетон 10:1). Выход около 500 мг М.Э. феофорбида (а) с чистотой 95-97% (данные ВЭЖХ).

R₁=СООСН₃, R₂=H метиловый эфир феофорбида (а') R₁=H, R₂=COOCH₃ метиловый эфир феофорбида (а') Структурная формула метиловых эфиров феофорбида Анализ метилового эфира феофорбида (а).

ВЭЖХ: Милихром Al, Silosorb 600; бензол-пропанол 100:7; λ=360 нм.

ЯМР ¹H и ¹³С:
Bruker AM 300, 300 МГц, CDCl₃. Величины химических сдвигов в спектрах ЯМР ¹Н и ¹³С полученного М.Э. феофорбида (а) соответствуют литературным данным:
- Electrophylic reactions of chlorin derivatives and a comprehensive collection of ¹³С data of these products and closely related compounds./ Wray V., Jurgens U., Brocmann Jr.// Tetragedron. (1979), vol. 35, pp.2275-2283;
- Clorophyllonic acid (a) methyl ester, a new chlorophyll (a) related compound, isolated as an antioxidant from short-necked clam Ruditapes philippinarum. / Yamamoto K. , Sakata K., Watanabe N., Brinen L.S. et. al. // Tetragedron. Lett. (1992) vol. 33, pp. 2587-2588.

Химические сдвиги атомов С₇ и С₁₀ М. Э. феофорбидов (а) и (а+а') в спектрах ЯМР ¹³С приведены в табл. 1. Спектр ПМР М.Э. феофорбида (а) представлен в табл. 2.

Формула изобретения

Способ получения метилового эфира (МЭ) феофорбида (а), включающий извлечение производных хлорофиллов (а) и (б) из сырья растительного происхождения, их метилирование кипячением в 5%-ном растворе концентрированной серной кислоты в метаноле, хроматографическое разделение МЭ феофорбидов (а) и (б), отличающийся тем, что в качестве сырья используют липофильную фракцию экстрактивных веществ серпухи венценосной (Serratula coronata L. ), извлечение производных хлорофиллов (а) и (б) проводят путем обработки фракции хлороформом с последующим переосаждением производных хлорофиллов (а) и (б) из хлороформенного раствора в гептан, после метилирования осуществляют выделение МЭ феофорбидов (а) и (б) кристаллизацией из смешанного растворителя: хлороформ-метанол (1: 1, по объему), а после хроматографического разделения МЭ феофорбидов (а) и (б) проводят очистку МЭ феофорбида (а) кристаллизацией из смешанного растворителя: хлороформ-метанол (1: 1,5 по объему).

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2