Средство, нормализующее функциональную активность спинного мозга, и способ его получения

 

Изобретение относится к производству лекарственных средств, применяемых в медицинской практике, и касается получения препаратов из животного сырья. Сущность заявляемого способа: свежий или дефростированный спинной мозг убойного скота измельчают, гидролизуют нейтральной протеазой, отделяют экстракт от жмыха, а доочистку целевого продукта осуществляют методом ультрафильтрации на мембранах с селективностью 10-15 кДа с последующим выпариванием под вакуумом. Фармакологическое средство в качестве активного начала содержит в эффективном количестве целевой продукт, полученный заявляемым способом, и представляет собой низкомолекулярную фракцию гидролизата спинно-мозговой ткани животного происхождения, содержащую комплекс аминокислот в концентрации 2 - 4 мг/мл и пептидов в концентрации 6 - 8 мг/мл. Фармакологическое средство используют в дозе 0,1-0,25 мл/мг массы тела. Технический результат: фармакологическое средство обеспечивает нормализующее действие на функции спинного мозга. 3 с.п. ф-лы, 1 ил., 3 табл.

Изобретение относится к производству лекарственных средств, применяемых в медицинской практике, и касается получения препаратов из животного сырья.

Нейродегенеративные соматические заболевания спинного мозга (CM), a также его травматическая болезнь, возникающая вследствие повреждения позвоночника, относятся к важнейшим нерешенным проблемам современной медицины. Эти заболевания расцениваются, как одни из самых прогностически неблагоприятных, ввиду тяжести последствий, недостаточной эффективности существующих методов лечения и отсутствия этиотропных лекарственных средств.

Для лечения как дегенеративных, так и травматической болезни СМ различными авторами было исследовано действие ряда препаратов самых различных фармакологических групп: блокаторов альфа-адренергических рецепторов, стимуляторов и блокаторов бета-адренорецепторов, барбитуратов, антифибринолитических средств, антикоагулянтов, низкомолекулярных декстранов, опиатных антагонистов, тиреотропного гормона, иммунодепрессантов, липидных антиоксидантов, эуфиллина, диметилсульфоксида, нестероидных противовоспалительных препаратов, мышечных релаксантов. Результаты экспериментов, не всегда обнадеживающие, все же позволяют говорить о том, что терапевтический нигилизм в отношении заболеваний СМ не оправдан [1, 2].

Неоднозначные результаты при лечении неполной травмы СМ в экспериментальных модельных опытах на животных были получены при использовании высоких доз кортикостероида - метилпреднизолона, который увеличивал сохранность нервной ткани и снижал неврологический дефицит [3, 4]. Однако в ряде случаев, особенно при назначении позднее чем через 8 часов после травмы, высокие дозы метилпреднизолона не только оказывались неэффективными, но и вызывали нежелательное влияние на спинно-мозговую ткань, препятствуя нормальному регенераторному процессу [5, 6].

Таким образом, вопрос о клиническом применении вышеперечисленных групп препаратов остается открытым. На практике же терапевтическое лечение нейродегенеративных соматических заболеваний и травматической болезни СМ, как правило, ограничивается назначением общеукрепляющих и поддерживающих лекарственных средств: витаминов группы В, Е, АТФ, метионина, глутаминовой кислоты и пр. [7].

Задача настоящего изобретения состоит в создании нового фармакологического средства, оказывающего нормализующее действие на функции СМ при его дегенеративных изменениях и травматической болезни.

Технический результат изобретения заключается в создании нового фармакологического средства из спинно-мозговой ткани убойных сельскохозяйственных животных, нормализующего функциональную активность спинного мозга и способа его получения.

Указанный технический результат достигается тем, что впервые разработан препарат для лечения вышеуказанных заболеваний с использованием в качестве сырья спинно-мозговой ткани убойных сельскохозяйственных животных, поэтому прототипа к данному изобретению нет.

На чертеже изображены двигательные нейроны вентролатерального ядра передних рогов спинного мозга крысы (окраска толуидиновым синим по Нисслю; ок. 10, об. 20): а) явления хроматолиза после длительной гипокинезии; б) восстановление хроматофильного вещества Ниссля после применения препарата ПСМ; в) нейроны интактной крысы.

Сущность заявляемого способа получения фармакологического средства состоит в том, что свежий или дефростированный спинной мозг убойного скота измельчают, смешивают с водой в соотношении 1:1 и подвергают гидролизу нейтральной протеазой, взятой из расчета 1,2-1,6 ПЕ/г сырья, в условиях рН-статирования при 7,6±0,2 и температуре 39±1^oС в течение 3-4 ч. По окончании процесса гидролиза высокомолекулярные компоненты отделяют кислотным или спиртовым осаждением, а доочистку целевого продукта осуществляют методом ультрафильтрации на мембранах с селективностью 10-15 кДа с последующим выпариванием под вакуумом на 50% (по объему) и обработкой активированным углем, взятым из расчета 30-40 г/л. Полученный продукт стерилизуют и разливают в ампулы.

Целевой продукт (препарат из спинного мозга - ПСМ) представляет собой прозрачную желтоватую жидкость и содержит комплекс биологически активных полипептидов и аминокислот.

Для более полной характеристики препарата проведено изучение его состава, основных свойств, токсикологической безвредности и специфической биологической активности.

Присутствие в препарате аминокислот подтверждается его окрашиванием в сине-фиолетовый цвет при добавлении спиртового раствора нингидрина.

Для определения в препарате пептидных связей в него добавляют биуретовый реактив. Окрашивание раствора в фиолетовый цвет свидетельствует о наличии пептидных связей.

Отсутствие в препарате высокомолекулярных белковых компонентов подтверждается тем, что при добавлении к 1 мл препарата 0,25 мл 20%-ного раствора трихлоруксусной кислоты раствор остается прозрачным.

Интенсивность окраски препарата не превышает эталон 2 б (ГФ XI, вып. 1, с. 194).

Препарат имеет плотность 1,020 - 1,040 г/см³ (ГФ XI, вып. 1, с. 24), содержит 6 - 8 мг/мл азота пептидов (ГФ XI, вып. 2, с. 30), 2 - 4 мг/мл аминного азота (определяется потенциометрически) и 4 - 8 мг/мл общего азота (ГФ XI, вып. 1, с. 180). Сухой остаток составляет 5 - 9% (ГФ XI, вып. 1, с. 176).

Содержание свободных аминокислот (ГФ XI, вып. 1, с. 110) колеблется в следующих пределах, мг/мл: L-Аспарагиновая кислота - 2,6±0,3 L-Треонин - 1,4±0,2 L-Серин - 2,4±0,3 L-Глутаминовая кислота - 4,2±0,4 L-Пролин - 2,8±0,3 Глицин - 1,2±0,2 L-Аланин - 2,0±0,2 L-Валин - 1,6±0,3 L-Метионин - 0,6±0,2
L-Изолейцин - 1,2±0,2
L-Лейцин - 2,9±0,3
L-Тирозин - 0,5±0,1
L-Фенилаланин - 1,4±0,2
L-Гистидин - 1,5±0,2
L-Лизин - 2,3±0,3
L-Аргинин - 2,5±0,3
Величина молекулярной массы целевого продукта определяется селективностью ультрафильтрационных мембран, используемых при его получении, и составляет 10-15 кДа.

Согласно изобретению фармакологическое средство, нормализующее функциональную активность спинного мозга, содержит в качестве активного начала эффективное количество целевого продукта, полученного указанным способом и представляющего собой низкомолекулярную фракцию гидролизата спинно-мозговой ткани, содержащую комплекс аминокислот и биологически активных пептидов.

Во время проведения исследований заявляемого фармакологического средства на экспериментальных моделях in vivo были обнаружены новые терапевтические эффекты, такие как способность нормализовывать метаболизм в двигательных нейронах спинного мозга при дегенеративных изменениях, вызванных длительной гипокинезией, восстанавливать функции СМ, нарушенные в результате гемисекции, а также купировать судорожный синдром.

Согласно изобретению способ нормализации функциональной активности спинного мозга достигается посредством введения терапевтически эффективного количества фармакологического средства, представляющего собой целевой продукт, полученный указанным способом. Фармакологическое средство целесообразно применять в суточной дозе от 0,1 до 0,25 мл на 1 кг массы тела в течение 10 дней.

Изобретение иллюстрируется примерами конкретного выполнения способа получения фармакологического средства из животного сырья (примеры 1, 2) и испытания биологической активности продукта, получаемого заявляемым способом (примеры 3, 4, 5).

Пример 1. 30 кг свежего спинного мозга крупного рогатого скота измельчают электромясорубкой, заливают 30 л дистиллированной воды и гомогенизируют с помощью роторно-пульсационного аппарата. Гомогенат помещают в реактор, нагревают до 39±1^oС, устанавливают рН 7,6±0,1 раствором NaOH и при постоянном перемешивании электромешалкой добавляют фермент террилитин (ФС 42-3270-96) из расчета 1,2-1,4 ПЕ/г сырья. Гидролиз проводят в течение 3-4 ч при перемешивании.

По окончании процесса гидролиза субстрат подкисляют соляной кислотой до рН 5,0±0,1, прогревают при 98,0±0,5^oС в течение 30-40 мин и фильтруют горячим через миткаль.

Осветленный гидролизат охлаждают до комнатной температуры и подвергают баромембранному разделению в тангенциальном потоке на ультрафильтрационных мембранах с селективностью 10-15 кДа. Полученный пермеат (около 30 л) выпаривают под вакуумом до объема, составляющего 50% от исходного (15 л), обрабатывают в течение 10 мин активированным углем, взятым из расчета 40-60 г/л, фильтруют через полотняный фильтр, стерилизуют и готовят лекарственную форму. Выход целевого продукта составляет 0,5 л/кг сырья.

Пример 2. 30 кг дефростированного спинного мозга свиней измельчают и подвергают гидролизу бактилином (ТУ 9381-001-04863057-97) по примеру 1.

По окончании процесса гидролиза субстрат прогревают при 98,0±0,5^oС в течение 30-40 мин, охлаждают до комнатной температуры и добавляют к нему 150 л этилового спирта. Смесь инкубируют в течение 2 ч и удаляют выпавший осадок. Надосадочную жидкость выпаривают под вакуумом до конечного объема 15 л, обрабатывают активированным углем по примеру 1, фильтруют, стерилизуют и готовят лекарственную форму. Выход целевого продукта составляет 0,5 л/кг сырья.

Исследование токсикологической безвредности препарата проводили в соответствии с "Методическими рекомендациями по изучению общетоксического действия фармакологических средств", утвержденными МЗ РФ 29.12.97 [8]. При определении параметров острой токсичности объектами исследования служили лекарственная форма ПСМ, полученная заявляемым способом, а также субстанция препарата, получаемая путем его лиофильного высушивания. Субстанцию ПСМ растворяли ex tempore в воде для инъекций в необходимой концентрации.

Установлено, что при однократном подкожном, внутримышечном и внутрибрюшинном введении лекарственной формы ПСМ белым беспородным крысам массой тела 180-200 г в максимально допустимых объемах, составляющих 10, 5 и 5 мл соответственно, гибели и симптомов отравления животных не наблюдалось, а их физиологические показатели и коэффициенты внутренних органов не отличались от контрольных.

LD₅₀ субстанции ПСМ по методу Литчфилда-Уилкоксона [9] при однократном внутримышечном введении белым аутбредным мышам массой 18-20 г составила 1240 (1401-1097) мг/кг (в перерасчете на жидкий препарат - 177 мл/кг), что в 700-1700 раз превышает предполагаемую суточную терапевтическую дозу.

Хроническую токсичность ПСМ изучали на белых аутбредных крысах обоего пола в течение 4 недель. Препарат вводили внутримышечно в 2 дозах - терапевтической и 1/10 DL₅₀. Контрольная группа крыс получала адекватно внутримышечно воду для инъекций.

Перед началом опыта и в конце оценивали общее состояние животных, определяли массу тела, состав и свойства периферической крови, функции сердечно-сосудистой и центральной нервной систем, печени, почек, надпочечников. На 28-й день опыта животных умерщвляли одномоментной декапитацией и определяли весовые коэффициенты внутренних органов. Для гистологического изучения от всех опытных и контрольных животных брали головной и спинной мозг, сердце, легкие, печень, почки, селезенку, тимус, поджелудочную железу, надпочечники, лимфоузлы различной локализации и области инокуляции препарата.

Проведенными исследованиями установлено, что ПСМ в обеих дозах (терапевтической и 1/10 DL₅₀) не оказывает влияния на общее состояние животных, их массу тела, поведенческие реакции, а также функции изучаемых органов и систем. Гистологическое изучение внутренних органов животных также не выявило существенных изменений. Дополнительно выявлено отсутствие у исследуемого препарата кумулятивных и аллергизирующих свойств, а также кожно-резорбтивного, эмбриотоксического и тератогенного действия.

Таким образом, заявляемое средство при длительном введении животным не обладает токсическим действием, препятствующим его применению в качестве лекарственного средства.

Для изучения биологической активности препарата использовали экспериментальные модели, позволяющие оценить способность ПСМ нормализовывать метаболизм в двигательных нейронах спинного мозга при дегенеративных изменениях, вызванных длительной гипокинезией (пример 3), восстанавливать функции спинного мозга, нарушенные в результате спинно-мозговой травмы, моделируемой гемисекцией спинного мозга (пример 4), а также оказывать противосудорожное действие путем модуляции медиаторных систем нервных клеток (пример 5).

Пример 3. В первой модели опытов in vivo изучена возможность коррекции препаратом ПСМ дегенеративных метаболических нарушений в нейронах спинного мозга при длительной гипокинезии. Эксперимент проводили на белых беспородных крысах массой тела 180-200 г. Условия вынужденной гипокинезии создавали в камерах малого объема в течение 60 дней [10]. ПСМ вводили ежедневно внутримышечно в дозе 0,25 мл/кг. По окончании эксперимента животных умерщвляли одномоментной декапитацией. Кусочки спинного мозга на уровне L₂-L₄ извлекали и фиксировали в жидком азоте, а часть материала после фиксации в формалине заливали в парафин и окрашивали по Нисслю. Уровни активности основных окислительно-восстановительных ферментов - сукцинатдегидрогеназы (СДГ), НАД-диафоразы (НАД-Д) и лактатдегидрогеназы (ЛДГ), являющихся наиболее информативными показателями функционального состояния ткани [11], выявляли на криостатных срезах толщиной 10 мкм. Количественную оценку результатов гистохимических реакций проводили цитоспектрофотометрическим методом [12]. Оптическую плотность измеряли в 40 случайно выбранных нейронах вентролатерального ядра передних рогов спинного мозга.

При длительной гипокинезии в двигательных нейронах спинного мозга зарегистрировано статистически значимое снижение активности СДГ и НАД-Ф, а также увеличение активности ЛДГ (табл. 1), свидетельствующее о нарушении энергетического обмена. На препаратах, окрашенных по Нисслю, в двигательных нейронах отмечался выраженный хроматолиз базофильного вещества, характеризующий снижение функциональной активности нервных клеток (чертеж а). Перечисленные показатели свидетельствуют о дегенеративных изменениях в исследуемой ткани.

Введение животным, переживающим длительную гипокинезию, препарата ПСМ существенно нормализовало энергетический обмен в двигательных нейронах, достоверно (Р<0,01; Р<0,01) повышая активность СДГ и НАД-Ф, а также снижая активность ЛДГ по сравнению с показателями нелеченых крыс. Морфологические исследования свидетельствовали о нормализации функционального состояния двигательных нейронов: базофилия хроматофильного вещества Ниссля возрастала и явления хроматолиза определялись в слабой степени выраженности и в меньшем числе нейронов (чертеж б).

Таким образом, результаты проведенных исследований позволяют заключить, что ПСМ способен поддерживать энергетический метаболизм в двигательных нейронах спинного мозга, а также стимулировать синтетические процессы на гранулярной эндоплазматической сети и, тем самым, восстанавливать функциональную активность спинного мозга при дегенеративных изменениях.

Пример 4. В работе использовали белых аутбредных крыс с массой тела 180-200 г одного (любого) пола. Животных наркотизировали внутрибрюшинно нембуталом и после наступления сна дорсальным доступом производили подоболочечную гемисекцию спинного мозга на уровне L₂-L₄ в стерильных условиях. Рану зашивали стерильным шовным материалом и обрабатывали раствором йода.

На следующий день, после появления симптомов нарушения двигательных функций, формировали две равноценные по развившемуся симптомокомплексу группы животных. Контрольную группу формировали из интактных крыс.

Контрольной и первой опытной группам ежедневно внутримышечно в течение 5 дней вводили адекватный объем раствора натрия хлорида 0,9% для инъекций.

Второй опытной группе в течение 5 дней после операции ежедневно внутримышечно вводили ПСМ в дозе 0,2 мл/кг.

На 6-й день проводили оценку показателей двигательных функций животных всех групп по их способности удерживаться на вращающемся (30 об/мин) стержне и наклонной (под углом 70^o) платформе из металлических ячеек, а также по скорости плавания (определяли время "вынужденного заплыва" на 1,5 м) [13].

Установлено, что после травматического повреждения спинного мозга изучаемые показатели двигательных функций животных резко снижались в сравнении с контролем (Р<0,02; Р<0,001; Р<0,05; таблица 2). Введение крысам в течение 5 дней после травмы ПСМ способствовало существенной нормализации двигательных функций, которые хоть и не достигали контрольных значений, но тем не менее статистически значимо (Р<0,001; Р<0,001; Р<0,02) превышали соответствующие показатели группы нелеченых животных (группа 2).

Таким образом, введение ПСМ в раннем периоде после тяжелой спинно-мозговой травмы способствует восстановлению двигательных функций животных. Следовательно, препарат может применяться у пострадавших с целью снижения ранней посттравматической смертности, числа возможных осложнений, а также для сокращения сроков лечения.

Пример 5. Оценку противосудорожной активности ПСМ проводили с использованием теста коразоловых судорог, который служит классической моделью для проверки активности противосудорожных средств [14]. Механизм действия коразола связан с его влиянием на межуточный, средний и спинной мозг. Коразол усиливает процессы иррадиации, повышает суммационную способность ЦНС, облегчает передачу импульсов в межнейронных связях и укорачивает моторную хронаксию. По современным представлениям клонико-тонический компонент судорог, индуцированных коразолом, соответствует малому эпилептиформному приступу "petit mal", наблюдаемому в клинике.

В работе использовали белых аутбредных мышей обоего пола массой 20-22 г. За 30 мин до введения судорожного агента первой (контрольной) группе животных вводили раствор натрия хлорида 0,9% для инъекций, а второй (опытной) группе - ПСМ в дозе 0,1 мл/кг массы внутримышечно. Коразол вводили также внутримышечно в дозе 100 мг/кг [15], после чего животных помещали в прозрачные плексигласовые камеры и наблюдали в течение 60 мин, регистрируя продолжительность судорог и количество павших животных.

Полученные данные (табл. 3) свидетельствуют о том, что ПСМ обладает выраженным противосудорожным действием, вызывает достоверное укорочение клонической фазы судорожного припадка (Р<0,05) и защищает животных от гибели.

Источники информации
1. Гришенкова Л.Н. и др.//Вопр.нейрохирургии. - 1997. - 2. - С.37-44.

2. Privat A.//"Rev.Prat." - 1995. - Vol. 45. - 16. - P.2051-2056.

3. Ducker T.B., Zeidman S.M.//Spine.-1994.-Vol. 19.- 20.-P.2281-2287.

4. Efficasy and Mechanism of Action of Methylprednisolone in Acute Spinal Cord Trauma//Innovation in Trauma Management. The Upjohn Company. - 1991. - Vol. 1. - P.11.

5. Brachen M. B. , Holdford T.R.//"Ibid." - 1993. - Vol. 79. - 4. - P. 500-507.

6. Hall E.D.//"J.Neurosurg."- 1992. - Vol. 76. - 1. - P.13-22.

7. Подачин В. Н., Мусалов Г.Г., Незлина Н.И. Структурно-функциональные основы компенсации функций при травме спинного мозга. - М. - 1983.

8. Методические рекомендации по изучению общетоксического действия фармакологических средств. Утверждены МЗ РФ 29.12.97.

9. Беленький М. Л. Элементы количественной оценки фармакологического эффекта. Л.: - Медгиз. - 1963. - С. 152.

10. Коваленко Е.А., Гуровский Н.Н. Гипокинезия. М. - 1980. - 318 с.

11. Берстон М. Гистохимия ферментов. М. - 1965. - 810 с.

12. Нарциссов Р.П., Дюкова И.И., Петерсон И.С. "Арх.анат." - 1969. - Т. 57. - 12. - С.112-116.

13. Буреш Я., Бурешова О., Хьюстон П. Методики и основные эксперименты по изучению мозга и поведения. М. -1991. - 399 с.

14. Раевский К. С. Фармакология нейролептиков. М.: Медицина. - 1976. - 271 с.

15. РД 42-28-8-89. - С.15-17.

Формула изобретения

1. Способ получения фармакологического средства, нормализующего функциональную активность спинного мозга, включающий измельчение ткани спинного мозга убойных сельскохозяйственных животных, ее гидролиз нейтральной протеазой, отделение экстракта от жмыха, выделение низкомолекулярной фракции гидролизата методом ультрафильтрации на мембранах с селективностью 10-15 кДа с последующим выпариванием под вакуумом.

2. Фармакологическое средство для нормализации функциональной активности спинного мозга, содержащее в качестве активного начала в эффективном количестве целевой продукт, полученный способом по п.1, и представляющее собой низкомолекулярную фракцию гидролизата спинно-мозговой ткани убойных сельскохозяйственных животных, содержащую комплекс аминокислот в концентрации 2-4 мг/мл и пептидов в концентрации 6-8 мг/мл.

3. Способ нормализации функциональной активности спинного мозга, заключающийся в восстановлении метаболизма в двигательных нейронах при дегенеративных изменениях, купировании судорожного синдрома путем применения терапевтически эффективного количества фармакологического средства по п.2 в дозе 0,1-0,25 мл/кг массы тела в течение 10 дней.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3

HE4A - Изменение адреса для переписки с обладателем патента Российской Федерации на изобретение

Новый адрес для переписки с патентообладателем:
119021, Москва, Зубовский б-р, 4, ФГУП "НПО "Микроген", патентно-лицензионный отдел

Извещение опубликовано: 10.08.2006        БИ: 22/2006

---