Способ получения комплекса фосфолипидов

 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано в технологии получения исходного материала для липосомальных форм лекарственных препаратов. Технический результат изобретения, проявляющийся в упрощении способа и повышении выхода целевого продукта, достигается тем, что способ включает гомогенизацию головного мозга крупного рогатого скота охлажденным ацетоном с последующей фильтрацией, экстракцию осадка смесью хлороформа с этанолом, отделение липидной фазы и выделение из нее фосфолипидов добавлением ацетона в соотношении с супернатантом 1,5-2,0:1.

Изобретение относится к медицине, а именно лекарственным препаратам, содержащим материалы головного мозга млекопитающих животных, и может быть использовано в технологии получения исходного материала для липосомальных форм лекарственных препаратов.

Основным условием терапевтической эффективности липосомальных препаратов является сродство состава мембран липосом к клеточной структуре различных органов макроорганизма, что обеспечивается сбалансированным эквимолярным соотношением всех типов фосфолипидов с максимальным использованием их функциональной активности по отношению к различным органам макроорганизма.

Наибольший интерес в этом соотношении представляет комплекс фосфолипидов, выделенных из животной ткани. Известно, что в смеси липидов, выделенных из белого вещества мозга быков, содержится 50% холестерина, цереброзина, фосфатидилэтаноламина, остальное - фосфатидилхолин (лецитин), фосфатидилинозит, фосфатидилсерин, что обеспечивает высокую степень сродства к органам макроорганизма, а липиды растительного происхождения, например сои, содержат почти 87% фосфатидилхолина.

[В. И. Ефременко. Липосомы (получение, свойства, аспекты применения в биологии и медицине). 263 с. Деп. в ВИНИПИ, 3733 -В98, 18.12.98].

Известен способ получения комплекса фосфолипидов из отходов головоногих моллюсков, включающий экстракцию общих липидов смесью хлороформа с этанолом, промывку экстракта от нелипидных примесей раствором хлористого натрия, перерастворение общих липидов петролейным эфиром, диэтиловым эфиром, хлороформом или этиловым спиртом и осаждение фосфолипидов ацетоном при соотношении экстракта и ацетона 1:5 - 1:10.

[Авт. св. СССР 1080825, А 61 К 37/22, оп. 23.03.84, Бюл. 11].

Этот способ модифицирован с целью упрощения технологии тем, что используют лиофильно высушенное сырье, экстракцию проводят этиловым спиртом, перерастворение - гексаном и выделение фосфолипидов - отгонкой гексана. [Авт. св. СССР 1175486, А 61 К 37/22, оп. 30.08.85, Бюл. 32].

При достаточно высоком выходе целевого продукта (7,5-10%) состав липидов содержит большое количество фосфатидилхолина (60-75%) при недостаточном содержании других фосфолипидов.

Известен способ поэтапного выделения фосфолипидов из спинного и головного мозга крупного рогатого скота (КРС) и свиней.

[Авт. св. СССР 957908, А 61 К 35/50, оп.15.09.82, Бюл. 34].

Целью изобретения является повышение выхода фосфатидилхолина. Способ включает измельчение исходного сырья, его обезвоживание методом лиофильного высушивания, поэтапную многократную экстракцию ацетоном и этанолом, очистку экстрактов поэтапной кристаллизацией холестерина, сфинголипидов, фосфатидилэтаноламина с последующей хроматографией целевого продукта на колонке с окисью аммония. При такой технологии достигаются высокий выход и чистота целевого продукта, однако, способ длителен и сложен.

Известен способ получения холестерина из головного и спинного мозга млекопитающих, в частности КРС, путем 5-6-кратного экстрагирования сырья ацетоном при соотношении 1:2, отгонки растворителя после каждой экстракции при атмосферном давлении, выделение целевого продукта перекристаллизацией из этанола. При этом первую экстракцию проводят избытком ацетона, а последующие экстракции ведут смесью ацетона и воды, смесь получают при отгонке растворителя из предыдущего экстракта.

[Патент РФ 2034552, А 61 К 35/30, оп.10.05.95, Бюл. 13].

По этому способу не экстрагируются фосфолипиды, способ длителен и сложен.

Известен способ получения комплекса липидов из вилочковой железы КРС.

[Патент РФ 1836092, А 61 К 31/685, оп. 23.08.93, Бюл. 31].

Способ включает измельчение и гомогенизацию сырья в физиологическом растворе, отделение жидкой фазы, экстракцию жидкой фазы изопропанолом, отделение экстракта и осаждение комплекса липидов ацетоном в соотношении 1:2-10.

Недостатком способа является то, что в выделяемом комплексе липидов недостаточна доля фосфолипидов (2-13%), остальное - глицериды, холестерин, жирные кислоты, плазмалогены. Комплекс эффективно используется как иммунокоррегирующий препарат.

Наиболее близким к заявляемому способу является метод экстракции животных тканей Фолча.

[Препаративная биохимия липидов. Москва. - Наука. - 1981.- с. 10-15].

В основе способа предусмотрены следующие операции: гомогенизация, обезвоживание и экстракция исходного сырья смесью хлороформа и метанола с отделением экстракта фильтрованием или центрифугированием. Экстракция осадка хлороформом и отделение экстракта. Объединение экстрактов и расслоение липидной и нелипидной фаз добавлением 1% раствора хлористого калия. Отделение липидной фазы и выделение из нее липидов путем фильтрования, высушивания сульфатом натрия и упаривание в вакууме.

Недостатком метода является то, что в липидный экстракт переходят нелипидные примеси полярного характера. Это объясняется тем, что многие липиды в органических растворителях образуют мицеллы, захватывающие воду и низкомолекулярные вещества.

При экстракции смесью растворителей, содержащих полярные компоненты, в экстракт переходят аминокислоты, полипептиды, сахара и др. Удаление нелипидных примесей осуществляется отмывкой экстракта раствором соли или фильтрацией. Кроме того, разделение водной и органической фаз затруднено тем, что экстракция липидов зачастую сопровождается образованием устойчивых эмульсий, так как липиды являются типичными поверхностно-активными веществами. Разрушение эмульсий достигается при небольших количествах центрифугированием, а при больших количествах экстракта - добавлением бензола, вакуумированием разделительной колонки или ее длительным вращением. Все эти операции усложняют процесс, снижают выход целевого продукта.

Техническим результатом заявляемого способа является упрощение способа, повышение выхода целевого продукта при достижении сбалансированного эквимолярного соотношения фосфолипидов, обладающих сродством со структурой клеток макроорганизма.

Технический результат изобретения достигается тем, что способ получения комплекса фосфолипидов из животного сырья включает гомогенизацию, обезвоживание и экстракцию исходного сырья ацетоном, экстракцию осадка смесью хлороформа с метанолом или этанолом, отделение липидной фазы и выделение из нее фосфолипидов добавлением ацетона в соотношении с экстрактом 1,5 - 2,0:1.

По отношению к прототипу заявляемый способ имеет следующие отличительные признаки.

Гомогенизация, обезвоживание и экстракция исходного сырья в ацетоне обеспечивает экстрагирование нелипидных примесей, жирных кислот, а также возможность проведения однократной экстракции липидов.

Экстракция осадка смесью хлороформа с метанолом или этанолом обеспечивает полную экстракцию липидов и повышение выхода целевого продукта, упрощает процесс отделения липидной фазы.

Выделение фосфолипидов из липидного экстракта путем осаждения их ацетоном в соотношении с экстрактом 1,5 - 2,0:1 обеспечивает получение сбалансированного эквимолярного состава комплекса фосфолипидов при содержании следующих компонентов, %: Холестерин - 16,6 Цереброзиды - 16,6 Фосфатидилэтаноламин - 16,6 Фосфатидилхолин - 8,3 Сфингомиелин - 8,3 Фосфатидилсерин - 6,25 Фосфатидилинозит - 6,25 При этом ганглиозиды и другие гликолипиды остаются в надосадочной жидкости.

Способ осуществляется следующим образом.

Мозг крупного рогатого скота гомогенизируют в охлажденном ацетоне, перемешивают на шуттеле, фильтруют суспензию. Осадок опять суспендируют в ацетоне, перемешивают, вновь фильтруют. Полученный осадок экстрагируют смесью органических растворителей. Встряхивают. Собирают супернатант путем двукратной фильтрации. Добавляют к полученному экстракту 1,5 объема ацетона. Смесь фосфолипидов выпадает в осадок. После полного формирования осадка его собирают фильтрованием.

Пример 1.

В качестве источника получения фосфолипидов используют головной мозг крупного рогатого скота в количестве 1000 г. Гомогенизируют в 4000 мл охлажденного ацетона (-20^oС), затем непрерывно перемешивают в течение 12 часов при 20^oС и суспензию фильтруют на воронке Бюхнера. Осадок вновь суспендируют в 2000 мл охлажденного ацетона и перемешивают в течение 4 часов при 20^oС, повторно фильтруют на воронке Бюхнера.

Для извлечения фосфолипидов полученный осадок экстрагируют 2000 мл смеси хлороформ-этанол (1: 1) путем встряхивания на шуттеле в течение 1 часа при 20^oС. Полученный супернатант собирают и для осаждения фосфолипидов добавляют к нему 1,5 объема (3000 мл) охлажденного ацетона (-20^oС). После полного формирования осадка (через 30 мин), представляющего собой смесь различных фосфолипидов, его собирают фильтрованием.

Выход препарата фосфолипидов составил 10 г (1% от веса исходного сырья).

Пример 2.

В качестве источника получения фосфолипидов используют головной мозг крупного рогатого скота. Конкретное осуществление способа проводят, как описано в примере 1, используя для осаждения фосфолипидов вместо 1,5 объемов (3000 мл) ацетона 2 объема (4000 мл). В надосадочной жидкости, полученной после осаждения препарата ацетоном, фосфолипиды не обнаруживаются.

Выход препарата фосфолипидов составил 14 г (1,4% от веса исходного сырья).

Пример 3 по прототипу.

Мозг крупного рогатого скота гомогенизируют, экстрагируют в 10 объемах смеси хлороформа с метанолом (2:1). Суспензию фильтруют. Остаток гомогенизируют с 1200 мл хлороформа и вновь фильтруют. В объединенный фильтрат добавляют при встряхивании 1%-ный раствор хлористого калия. Верхнюю фазу и промежуточный слой сливают, а нижнюю фазу, содержащую липиды, фильтруют, после чего органическую фазу удаляют на роторном испарителе.

Выход препарата фосфолипидов составил 5,7 г (0,57% от веса исходного сырья).

Как показали экспериментальные исследования, при осаждении фосфолипидов из экстракта ацетоном с соотношением менее чем 1,5:1 снижается выход целевого продукта, увеличение же объема ацетона более чем 2,0:1 нецелесообразно, так как выход целевого продукта не изменяется.

Простота и эффективность заявляемого способа обуславливает перспективность использования изобретения в биотехнологии фосфолипидов.

Формула изобретения

Способ получения комплекса фосфолипидов из головного мозга крупного рогатого скота путем его гомогенизации, экстракции содержащем хлороформ, органическим растворителем, фильтрации с последующим выделением целевого продукта, отличающийся тем, что ткань мозга гомогенизируют в охлажденном ацетоне, после фильтрации осадок суспендируют в ацетоне, повторно фильтруют, затем осадок экстрагируют смесью хлороформа с этанолом, супернатант собирают и добавляют к нему ацетон в соотношении 1,5-2,0: 1 для осаждения фосфолипидов.