Способ оценки нейротоксичности сыворотки крови больных с заболеваниями печени

 

Изобретение относится к медицине, точнее к способам оценки нейротоксичности сыворотки крови больных с заболеваниями печени. Технический результат: прогнозирование развития и выяснения причин расстройств функций периферической нервной системы при коррекции проводимой лечебной терапии. В качестве тестируемого объекта используется переживающий седалищный нерв лягушки, в среду переживания которого добавляется сыворотка больных, разведенная в соотношении 1: 5 раствором Рингера для холоднокровных. Наблюдение ведется в течение 2,5 ч, оценивают изменения перехватов Ранвье и перикариона леммоцитов в сравнении с их изменениями при переживании в течение всего времени в растворе Рингера для холоднокровных. Появление признаков нарушения проведения по волокну свидетельствует о возможности развития периферической нейропатии и необходимости ее предупреждения или коррекции. 3 ил., 1 табл.

Изобретение относится к области медицины, а именно способам оценки нейротоксичности сыворотки крови больных диффузными заболеваниями печени, позволяющим оценить риск развития периферических нейропатий при недостаточности функций печени и уточнить лечебную тактику.

Известно, что у больных заболеваниями печени в ряде случаев могут развиваться нарушения функций периферической нервной системы. Такие поражения в значительной части случаев клинически мало выражены. У большинства больных нейропатии могут проявляться в виде локомоторных расстройств и расстройств чувствительности [1] , а также сопровождаться вегетативными дисфункциями, обусловливающими нарушения регуляции секреции и ритмической активности внутренних органов [2-5]. Отсутствие доступных методов оценки степени этих неврологических расстройств и их связи с недостаточностью функции печени приводит к тому, что в клинической практике им не уделяется должного внимания. Степень поражения периферической нервной системы не коррелирует с показателями, характеризующими белоксинтезирующую и желчевыводительную функции печени, а также сохранность структуры гепатоцитов [6]. Периферические неврологические расстройства могут развиться и прогрессировать у больных с удовлетворительными данными рутинных исследований функций печени, свидетельствующими о компенсированности основного заболевания, и при отсутствии других значимых нервно-психических нарушений. Эти обстоятельства определяют необходимость в оценке степени нейротоксичности сыворотки крови больных с патологией печени для уточнения прогноза и коррекции проводимой терапии.

Снижение детоксицирующей функции печени при диффузных заболеваниях органа приводит к развитию эндотоксемии. В свою очередь эндотоксемия при циррозе печени (как и при септических состояниях) может выступать как медиатор гемодинамических, неврологических и гематологических расстройств [7, 8]. Проявлениями системной эндотоксемии могут быть пирогенная реакция, ДВС-синдром, нарушение функции почек, эндотоксический шок и другие [9]. Повышение уровня эндотоксинов в крови усугубляет поражение печеночных клеток. Появление эндотоксемии, вероятно, связано с нарушением функций клеток Купфера [10].

Поражение нервной системы может появляться задолго до наступления декомпенсации процесса и вносить свой вклад в прогрессирование заболевания и ухудшение качества жизни больных. Выявление поражения нервной системы возможно при проведении клинических тестов оценки состояния автономной нервной системы (проба Вальсальвы, тест оценки функции потовых желез [11]). Однако для оценки прогноза, выявления тяжести поражения и коррекции проводимой терапии необходимо проведение оценки степени нейротоксичности сыворотки крови больных.

Таким образом, оценка нейротоксичности сыворотки крови при заболеваниях печени остается важной и до конца не решенной задачей. Во многом это связано с тем, что до конца не выяснена природа субстрата нейротоксичности при печеночной патологии, а прямые корреляции между выраженностью этого осложнения и степенью нарушения доступных рутинной оценке функций печени не выявлены. Имеются данные о способах оценки содержания эндотоксинов в организме посредством выявления пирогенной реакции у кроликов и оценки жизнеспособности куриных эмбрионов, а также посредством выявления генерализованного тромбообразования в сосудах Limulus polyphemus после взаимодействия тестовых объектов со средами, содержащими эндотоксин [12]. Для выявления эндотоксинов в крови применяют тетрахилиновый тест по методу Ирлиной Н.С. в модификации [13] , основанный на оценке жизнеспособности микроорганизмов при воздействии тестируемой сыворотки.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению по технической сущности и значению получаемого результата является способ выявления эндотоксинов с помощью Люмулюс-теста [14], позволяющий косвенно судить о степени нейротоксичности сыворотки крови больных с заболеваниями печени по содержанию в ней липополисахаридного эндотоксина, взятый в качестве прототипа [15].

Способ-прототип основан на том, что под действием эндотоксина у Limulus polyphemus происходит ферментативное превращение тромбообразующего протеина, которое ведет к фатальной внутрисосудистой коагуляции. Тестируемая сыворотка крови предварительно обрабатывается хлорной кислотой (НСlO₄) [16]. Набор для проведения анализа включает лиэат из клеток крови Limulus polyphemus и хромогенный субстрат (синтетический субстрат для тромбообразующего протеина с присоединенным к нему хромофором - паранитроанилином, который отщепляется под действием активированного эндотоксином тромбообразующего протеина).

При проведении анализа смешивают обработанную сыворотку крови, лизат и хромогенный субстрат, смесь инкубируют, последовательно обрабатывают нитритом натрия, сульфитом аммония, 1-нафтилендиамина гидрохлоридом и измеряют оптическую плотность раствора, содержащего продукты реакции диазосочетания. По величине оптической плотности определяют концентрацию эндотоксина в тестируемой сыворотке крови [17].

Показано, что частота выявления эндотоксина с помощью Люмулюс-теста и его количество увеличиваются при прогрессировании заболеваний печени и при появлении различных осложнений (кровотечение из расширенных вен пищевода, асцит, энцефалопатия). Стадии энцефалопатии связываются с конкретными цифрами эндотоксемии, определяемыми хромогенным Люмулюс-тестом [18]. Однако Люмулюс-тест позволяет оценить вклад только одного фактора в развитие поражения нервной системы при дисфункции печени, в то время как в патогенезе таких поражений доказана роль гипераммонийемии, аутоиммунных нарушений и других факторов. Выявление эндотоксина с помощью Люмулюс-теста напрямую не позволяет оценить степень нейротоксичности сыворотки крови.

Кроме того, несмотря на высокую чувствительность (до 10 пг/мл эндотоксина) и реактогенность, Люмулюс-тест обладает целым рядом недостатков [12, 15, 19]: - дозозависимое ингибирование реакции при применении антикоагулянтов; - изменение результатов реакции при употреблении жирной пищи; - возможность получения ложноположительного результата при взаимодействии компонентов реакции с фибриногеном и в результате формирования комплексов с липопротеинами плазмы, а также при появлении в крови β-глюкана; - возможность получения ложноотрицательного результата в результате неспецифической амидолитической активности плазмы; - необходимость предварительной обработки сыворотки крови (нагревание, разведение, обработка НСlO₄) для уменьшения вероятности ложных результатов; - отсутствие отечественной сырьевой базы и высокая стоимость набора тест-системы Люмулюс-теста, составляющая около 70 долларов США.

Целью изобретения является создание способа оценки нейротоксичности сыворотки крови больных с диффузным поражением печени для прогнозирования развития и выяснения причин расстройств функций периферической нервной системы при коррекции проводимой лечебной терапии.

Оценку нейротоксичности сыворотки крови больных производили на переживающем препарате седалищного нерва декапитированных лягушек, помещенном в модифицированный раствор Рингера (модификация для холоднокровных [20]).

Выделение седалищного нерва и подготовку препарата для исследований выполняли по стандартному алгоритму [21, 22], включающему последовательное выполнение декапитации лягушки, иссечение пояса верхних конечностей кожи с последующим удалением брюшного органокомплекса и продольным рассечением позвоночника пополам. Из подготовленного костномышечного препарата выделяли седалищный нерв на бедре. После препаровки седалищный нерв пересекали острой бритвой ниже разветвления на мало- и большеберцовый нервы. Органокомплекс позвоночника и седалищного нерва помещали на предметное стекло в раствор Рингера, после чего нерв при помощи острых препаровальных игл расщепляли поволоконно под визуальным контролем с помощью бинокулярной лупы при увеличении х40-80. Разволокненный нерв размещали на предметном стекле, поперечно направлению нерва помещали 3-4 волокна стекловаты, нерв накрывали сверху покровным стеклом размером 18•18 мм, отсекали части нерва, выступающие за покровное стекло. Таким образом, между предметным и покровным стеклами создавали микрокамеру, содержащую раствор Рингера, глубина которой определялась толщиной волокон стекловаты. Для смены содержимого камеры на противоположные края покровного стекла помещали прямоугольные кусочки сухой и смоченной раствором Рингера фильтровальной бумаги размером 1 см², создавая на покровном стекле проточную систему для переживания нервного волокна. Качество приготовленного препарата седалищного нерва оценивали под микроскопом при помощи фазовоконтрастного устройства, а также контролировали отсутствие реакции волокон нерва на смену раствора Рингера.

Тестируемую сыворотку крови больных разводили раствором Рингера в соотношении 1:5 для нивелирования возможного осмотического эффекта на нервные волокна лягушки.

Разведенную сыворотку вводили в проточную систему через 30 мин после адаптации нервов в растворе Рингера, посредством накапывания ее на фильтровальную бумагу с одной стороны покровного стекла. Быстрая смена среды достигалась быстрой сменой фильтровальной бумаги с другой стороны покровного стекла.

Определение нейротоксичности сыворотки крови проводили путем сравнительного изучения микроскопических изменений волокон седалищного нерва с использованием следующих контрольных образцов: 1. седалищных нервов лягушки, которые переживали в течение всего времени в растворе Рингера, препараты которых готовили из контралатеральной конечности при каждом исследовании; 2. седалищных нервов, которые переживали в растворе Рингера с добавлением сыворотки крови людей без клинических и лабораторных признаков патологии печени. Контрольные образцы допустимо тестировать не реже одного раза в неделю и при приготовлении нового раствора Рингера.

Изменения нервов оценивали по результатам непосредственного визуального наблюдения и по данным серийной фотосъемки, которую проводили в течение 2,5 ч переживания при помощи микроскопа, оборудованного фазовоконтрастным устройством. Изменения нервов оценивали через каждые 30 мин эксперимента. Выполняли трехкратное испытание одного образца сыворотки на седалищных нервах разных лягушек.

Критериями оценки служили выраженность и динамика изменений структурных элементов нервного волокна, приведенные в таблице.

Появление признаков нарушения проведения по волокну (нарушение непрерывности осевого цилиндра, значительное набухание перикариона леммоцита со сдавлением осевого цилиндра, расширение щели перехвата, появление "вторичного" конуса перехвата, значительное набухание и расслоение миелиновых ламелл) свидетельствовало о возможности развития периферической нейропатии и необходимости ее предупреждения или коррекции.

Возможность постижения цели изобретения доказывается следующими примерами.

Пример 1.

Взята сыворотка крови обследованного здорового человека, у которого не обнаружено признаков периферической нейропатии и который никогда не страдал заболеваниями печени.

При наблюдении за перехватами Ранвье (фиг.1а) выявлено незначительное набухание миелиновых ламелл луковиц перехвата к окончанию времени переживания. В более поздние сроки наблюдения отмечено усиление четкости краевой линии волокна в области щели перехвата без увеличения ее размеров.

При наблюдении за перикарионом леммоцита и прилежащей к нему части волокна (фиг.1б) установлено незначительное набухание ламелл миелина на стороне перикариона, которое появлялось через 1.4 часа после введения сыворотки крови. Изменения соотношения размеров перикариона, миелиновой оболочки и осевого цилиндра не отмечено. Непрерывность осевого цилиндра не нарушалась во все сроки наблюдения.

Пример 2.

Для оценки нейротоксичности взята сыворотка крови больной Б. Диагноз заболевания - хронический вирусный гепатит. Приблизительная продолжительность клинически выраженного заболевания - 1.5 года. Симптомы энцефалопатии (нарушения сна, нарушения памяти, спутанность сознания, расстройства личности, расстройства речи, нарушения зрения) не выражены. По результатам лабораторного исследования цитолитические процессы в печени незначительно выражены (активности аланинаминотрансферазы (АЛТ) 82 ЕД/л, γ-глутанилтрансферазы (ГГТП) 54 ЕД/л, лактатдегидрогеназы (ЛДГ) 521 ME, щелочной фосфатазы (ЩФ) 233 Ед, содержание общего билирубина 17,22 мкммоль/л), отмечается диспротеинемия. Больная отмечает покалывание в дистальных отделах нижних конечностей, зябкость нижних конечностей, при неврологическом исследовании выявлены нарушения чувствительности в виде гипо- и парастезий в дистальных отделах нижних конечностей и снижение чувствительности на верхних конечностях на участках, расположенных в виде пятен.

При сравнении изменений перехватов Ранвье, которые переживали в растворе Рингера, и перехватов, которые переживали в растворе Рингера с добавлением сыворотки крови больной Б. (фиг.2а), было отмечено, что в то время как в первом случае перехваты за 2,5 часа менялись незначительно (слабое набухание миелиновых ламелл), то во втором случае отмечалось значительное набухание и расслоение ламелл луковиц перехватов, появление вторичных миелиновых конусов и заметное расширение щели перехвата и усиление ее размытости соответственно примерно через 0,5 часа и 1,5 часа после введения сыворотки крови.

Изменений перикариона леммоцитов в первом случае практически не наблюдалось. Несколько набухший перикарион сохранялся в течение всего времени наблюдения. Во втором случае (фиг.2б) в течение всего времени наблюдения общий диаметр волокна и перикариона практически не менялся. Размеры перикариона не изменились, в то время как значительно уменьшился диаметр осевого цилиндра. Увеличилась толщина миелиновой оболочки с противоположной перикариону стороны волокна. Произошло расслоение миелиновых ламелл волокна на стороне, прилежащей к перикариону.

Изменения перехватов и леммоцитов были неодинаково выражены по ходу нервного волокна.

В данном примере видно, что отсутствие признаков энцефалопатии и приведенные клинические данные о состоянии периферической нервной системы не могут свидетельствовать об отсутствии периферической нейропатии. С применением заявляемого способа выявлена возможность поражения периферической нервной системы, которое заслуживает внимания. Лечебная коррекция состояния прежде всего должна быть связана с нормализацией функции печени.

Пример 3.

Для оценки нейротоксичности взята сыворотка крови больного С. Клинический диагноз заболевания - цирроз печени, портальная гипертензия (варикозно расширенные вены пищевода III степени), рецидивирующее кровотечение, постгеморрагическая анемия, состояние после эмболизации селезеночной вены. Продолжительность заболевания - примерно 4 года. У больного найдены признаки энцефалопатии, в том числе прогрессирующее в последнее время нарушение зрения, неустойчивость в позе Ромберга. Отмечена заторможенность больного. У пациента найдены клинические признаки периферической нейропатии (парастезии в виде "мурашек", "ватность" ног, особенно по утрам). При неврологическом исследовании были найдены расстройства чувствительности по типу гипостезии на кончиках пальцев нижних конечностей, отмечено появление патологических рефлексов. По результатам лабораторного исследования крови больного установлено, что цитолитические процессы в печени незначительно выражены (АЛТ 82 ЕД/л, содержание общего билирубина 18,45 мкммоль/л), наруен белково-азотистый обмен (снижено количество альбумина, отмечена диспротеинемия).

При сравнении изменений перехватов Ранвье, которые переживали в растворе Рингера, и перехватов, которые переживали в растворе Рингера с добавлением сыворотки крови больного С. (фиг.3а), было отмечено, что в то время как в первом случае перехваты за 2,5 часа менялись незначительно (слабое набухание миелиновых ламелл), во втором случае произошло набухание волокна в области луковиц перехвата, в конечные сроки наблюдения началось формирование вторичного конуса одной из луковиц. Через 1 час 15 минут после введения сыворотки крови больного отмечено расслоение миелиновых ламелл конуса перехвата.

Изменений перикариона леммоцитов в первом случае практически не наблюдалось (несколько набухший перикарион сохранялся в течение всего времени наблюдения). Во втором случае в течение всего времени наблюдения, начиная с 30 минут после введения сыворотки крови больного С. (фиг.3б), происходило набухание перикариона леммоцита и насечки Шмидта-Лантермана, которая располагалась на противоположной перикариону стороне волокна. Параллельно происходило уменьшение диаметра осевого цилиндра на участке между перикарионом и насечкой. Через 2 часа после введения сыворотки крови нарушалась непрерывность осевого цилиндра.

В представленном примере показано, что сыворотка крови больного С. обладает выраженным токсическим действием на периферические нервы, что проявляется не только в нарушении проведения по волокну, но и в полном перерыве осевого цилиндра. Косвенно о токсическом поражении нервной системы свидетельствуют клинические признаки поражения периферических нервов и выраженная энцефалопатия. Таким образом, приведенные примеры показывают, что, несмотря на разведение сыворотки, сохраняются ее токсические свойства в отношении периферических нервов, что может свидетельствовать о неосмотическом механизме поражения. Поскольку изменения в седалищном нерве лягушки появляются в течение 2,5 часов переживания в сыворотке крови больных, то можно предположить, что постоянное пребывание в подобной среде обусловит появление у больных еще более выраженных изменений.

Выполнение описанного алгоритма действий приводит к определению нейротоксичности сыворотки крови больных с диффузными хроническими заболеваниями печени, причем критерием изменений периферических нервов является морфологическая оценка сохранности или нарушения структуры нервного волокна.

Заявляемое изобретение удовлетворяет критерию "новизна", так как впервые предложен способ комплексного определения нейротоксичности сыворотки крови больных с заболеваниями печени, который предполагает не оценку косвенных данных, а изучение непосредственной реакции живого нервного волокна.

Заявляемое изобретение удовлетворяет критерию "изобретательский уровень", так как в нем не используются известные технические решения. По сравнению с известным способом-прототипом для оценки возможности сыворотки крови вызывать токсические изменения нервной системы используется прямое наблюдение за реакцией нервного волокна, в отличие от определения токсических свойств по косвенному показателю в способе-прототипе (определение концентрации эндотоксина в сыворотке крови). В отличие от способа-прототипа, оценивается влияние на периферические нервы не одного, а всех токсичных факторов сыворотки крови больного.

Соответствие критерию "пригодность для промышленного применения" доказывается результатами приведенных исследований, из которых видно, что изобретение может широко применяться в лабораторной практике, поскольку метод определения очень прост и может быть реализован в любой морфологической лаборатории специалистами, имеющими представление о ведении морфологических исследований.

Источники информации 1. Коновалов Н.В. Гепато-церебральная дистрофия. - М.: Медгиз, 1960. - 136 с.

2. Гайворонский И.В., Чепур С.В. Портальная гипертензия: морфофункциональное исследование. - СПб.: Сезар, 1997. - 130 с.

3. Gentle S. , Perretti A., Persico М. et al. Clinical and electrophysiological stydu on peripheral neuropathy in liver cirrhosis // J. Hepatol. - 1995. - Vol. 23, N 3. - P. 248-252.

4. Knill-Jones R., Goodwill С., Dayan A. et al. Peripheral neuropathy in сhronical liver disease: clinical, electrodiagnostic and nerve biopsy findings // Neurol. Neurosurg. Psychiat. -1972. - Vol. 35, N 1. - P. 22-30.

5. Мiralles R., Espadalir J. Autonomic neuropathy in chronic alcoholism: evaluation of cardiovascular, pupillary and symptoms skin responses // J. Eur. Neurol. - 1995. - Vol. 35, N 5 - P. 287-292.

6. Подымова С.Д. Болезни печени: Руководство для врачей. -3-е изд., перераб. и доп. - М.: Медицина, 1998. - 704 с.

7. Fulenwider J. Т., Sibley С., Stein S. F. et al. Endotoxaemia of cirrhosis: an observation not substantiated // Gastroenterology. - 1980. - Vol. 78, N 5. - P. 1001-1004.

8. McCabe W. R. Endotoxin: niorobiological, chemical, pathophysiologic and clinical correlation // Semin. Infect. Dis. -1980. - Vol. 3, N 1. - P. 38-88.

9. Schussler P., Eisenburg J., Kruis W. et al. New aspects of the value of endotoxins in various gastrointestinal diseases // Fortschr. Mod. - 1978. - Vol. 98, N 41(2). - P. 2059-2083.

10. Shiratori Y., Takikawa H., Кawase Т. et al. Superoxide anion generating capacity and lysosomal enzyme activities of Kupffer cells in galactosamine induced hepatitis // Gastroente-rol. Jpn. - 1986. - Vol. 21, N 2. - P. 135-144.

11. Menforte R. , Estruch R., Valls-Sol S. et al. Autonomic and peripheral neuropathies in patient with chronic alcoholism. A doserelated tonic effect of alcohol // Arch. Neurol. - 1995. -Vol. 52, N 1. - P. 45-51.

12. Sveen К. , Hofstad Т. , Milner К.С. Lethality for mice and chick embryos, pyrogenicity in rabbits and ability to gelate lysate from amoebocytes of Limulus polyphemus by lypopolysaccharides from Bacteroides, Fusobacterium and Veillonella // Acta Pathol. Microbiol. Scand. Sect. - 1997. - Vol. 85, N 4. - P. 388-396.

13. Полозова Е.В. Обоснование применения эмульсии перфторуглеродов для лечения эндотоксикоза при острых отравлениях карбофосом и психотропными лекарственными препаратами: Автореф. дисс. канд. мед. наук. - СПб, 2000. - 22 с.

14. Cooper J.F., Pearson S.M. Detection of endotoxin in biological products by the limulus test // Dev. Biol. Stand. 1977. - Vol. 34. N 1. - P. 7-13.

15. Hurley J. C. Endotoxemia: methods of detection and clinical correlates//clin. Microbiol. Rev.-1995.-Vol.8, 2. - P 268-292.

16. Tamura H., Obayashi T., Takagi K. et al. Perchloric acid treatment of human blood for quantitative endotoxin assay using synthetic сhromogenic substrate for horseshoe crab clotting enzyme // Thromb. Res. - Vol. 27, N1. - P. 51-57.

17. Yajima Y., Fukuda I., Otsuki M. et al. Endotoxemia in liver diseases: detection by a quantitative assay using chromogenic substrate with perchloric acid pretreatment // J. Exp. Med. - 1985. - Vol. 147, N. 4. - P. 411-419.

18. Bigatello L.M., Broitman S. A., Fattori L. et al. Endotoxemia, encephalopathy and mortality in cirrhotic patients // Am. J. Gastroenterol. - 1987. - Vol. 82, N 1. - P. 11-15.

19. Nakao A., Yasui M., Kawagoe Т. et al. False-positive endotoxemia derives from gauze glucan after hepatectomy for he-patocellular carcinoma with cirrhosis // Hepatogastroenterology. - 1997. - Vol. 44, N 5. - P. 1413-1418.

20. Блаттнер Р. , Классен X., Денерт X. и др. Эксперименты на изолированных препаратах гладких мышц. - M.: Мир, 1983. - 206 с.

21. Сотников О. С. Функциональная морфология живого мякотного нервного волокна. - Л.: Наука, 1978. - 99 с.

22. Сотников О.С. Динамика структуры живого нейрона. - Л.: Наука, 1985. - 159 с.

Формула изобретения

Способ оценки нейротоксичности сыворотки крови больных с заболеваниями печени, отличающийся тем, что проводят выявление изменений структуры нервного волокна переживающего препарата седалищного нерва лягушки под действием исследуемой сыворотки крови, разведенной раствором Рингера в соотношении 1: 5, для чего готовят два препарата нерва и помещают их на 2,5 ч в проточные системы, одну из которых заполняют исследуемой сывороткой крови, другую - разведенной сывороткой крови здорового человека или раствором Рингера, а изменения нервных волокон оценивают каждые 30 мин при помощи микроскопа и по нарушению структуры миелинизированных нервных проводников относительно контрольного волокна устанавливают нейротоксическое воздействие сыворотки крови больного и возможность развития у него периферической нейропатии.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4