Способ диагностики пилорического хеликобактериоза

 

Изобретение может быть использовано в медицине, а именно в медицинской микробиологии и гастроэнтерологии для выявления Helicobacter pylori (HP). У больного производят сочетанный забор желудочного содержимого и сыворотки крови, проводят определение уровня аммиака фотометрическим способом с использованием метода H. Keller и мочевины стандартным диацетил-монооксимным способом, рассчитывают индексы соотношения мочевины сыворотки крови к аммиаку желудочного содержимого (А) и аммиака сыворотки крови к аммиаку желудочного содержимого и при их значении ниже 11 и выше 1 соответственно устанавливают диагноз пилорического хеликобактериоза. Способ надежен, прост в использовании.

Изобретение относится к области медицины, а именно к медицинской микробиологии, и может быть использовано в гастроэнтерологии для выявления Helicobacter pylori.

Известен способ диагностики Helicobacter pylori [1], который выполняется следующим образом: во время эндоскопического исследования осуществляют забор биоптата слизистой оболочки желудка и погружают его в стандартную индикаторную среду Christensen при комнатной температуре на 24 часа. Под воздействием фермента - микробной уреазы H.pylori происходит расщепление мочевины в растворе до аммиака, который, вызывая сдвиг рН в щелочную сторону, обусловливает изменение желтой окраски раствора на красную (розовую, фиолетовую) благодаря изменению окраски индикатора.

Способ имеет ряд следующих недостатков: - способ травматичен для больного; - способ длителен (продолжительность анализа 24 часа); - вследствие очагового расселения H.pylori на слизистой оболочке желудка биоптат может не содержать искомый микроорганизм и дать исследователю ложную информацию об отсутствии H. pylori у данного больного (ложноотрицательный результат); - поскольку используется не чистая культура, а биоптат, который может содержать разнообразную контаминантную микрофлору, тест может дать ложноположительный результат и повлечь необоснованное применение антибиотиков у исследуемого пациента; - специфичность и чувствительность теста достаточно низкие (вследствие вышеперечисленных условий) и составляют соответственно 88 и 74%.

Известен способ диагностики Helicobacter pylori [2], который выполняется следующим образом: голодный пациент с пробным завтраком принимает раствор, приготовленный на дистиллированной воде и содержащий 250 мг мочевины, помеченной изотопом ¹³С. Затем через 20, 30, 40, 50 минут у исследуемого пациента берутся пробы выдыхаемого воздуха и исследуются при помощи автоматизированного масс-спектрометра с калькуляцией содержания изотопа, а затем и общей продукции CO₂ к общей поверхности тела. Уреазная активность выражается как количество микромоль мочевины, гидролизованной за 1 минуту.

Несмотря на высокую точность способа стоимость оборудования для его осуществления чрезвычайно высока и составляет несколько сотен тысяч долларов и даже в США такая лаборатория доступна только единичным крупным научным центрам. Кроме того, указанный способ чрезвычайно трудоемкий и требует участия большого количества персонала. Все вышеупомянутые условия крайне ограничивают возможности широкомасштабного применения данного способа в клинической практике и в научных исследованиях.

Наиболее близким к предлагаемому способу является уреазный тест, основанный на определении уровня аммиака в желудочном содержимом [3]. Указанный способ диагностики пилорического хеликобактериоза осуществляется следующим образом: желудочное содержимое пациента подвергают анализу в колбе Erlenmeyer, закрытой резиновой пробкой с вентилем после подщелачивания едким натром (индикатор феноловый красный) с помощью газораспылительных трубок Dräger-Lübeck.. Через 10 минут после начала реакции газ откачивается с помощью специального насоса через трубочку 5/а. Образующийся аммиак определяется полуколичественно по зоне изменения цвета индикатора бромфенолблау.

Недостатком прототипа является низкая точность способа: чувствительность равна 83%, а специфичность - 80%. Из полученных данных следует вывод, что у 17% больных правильный диагноз с помощью данного способа установить невозможно, а 20 больным из 100 согласно указанному способу будет необоснованно рекомендовано употребление антибиотиков. Кроме того, способ технологически достаточно сложен и трудоемок. Следует также отметить, что при повышении уровня как мочевины, так и аммиака в сыворотке крови (по различным причинам) концентрация аммиака в желудочном содержимом может значительно повыситься за счет прямой диффузии и привести исследователя к ложным результатам [4, 5, 6] . Таким образом, вышеупомянутый последний способ недостаточно информативен и может сопровождаться ложноположительными и ложноотрицательными результатами вследствие недостаточной чувствительности реактива и возможных колебаний уровней исходных азотистых метаболитов крови.

Технический результат - повышение точности и упрощение способа.

Предлагаемый способ диагностики осуществляется следующим образом: у больного производят сочетанный забор желудочного содержимого и сыворотки крови, проводят определение уровня аммиака фотометрическим способом с использованием метода Н. Keller и мочевины стандартным диацетил-монооксимным методом и устанавливают диагноз пилорического хеликобактериоза по расчету следующих индексов соотношения: A) X/Y, где Х - мочевина сыворотки крови (ммоль/л), Y - аммиак желудочного содержимого (ммоль/л) B) Y/Z,
где Y - аммиак желудочного содержимого (ммоль/л),
Z - аммиак сыворотки крови (ммоль/л).

Диагноз пилорического хеликобактериоза устанавливают при величине индекса А не выше 11, а индекса В - более 1.

Общими для предлагаемого объекта изобретения и прототипа существенными признаками являются: забор желудочного содержимого, определение в оном концентрации аммиака и установление диагноза исходя из данных анализа, указывающих на неадекватное увеличение уровня ионов аммония в желудочном содержимом пациента.

Отличительными признаками предлагаемого способа являются определение наряду с аммиаком желудочного содержимого уровней мочевины и аммиака в сыворотке крови пациента, использование индексов соотношения, позволяющих исключить ложноположительный результат анализа.

Существенным моментом, позволяющим преодолеть низкую чувствительность способа-прототипа является использование для детекции аммиака другого метода, основанного на цветной реакции, предложенной М. Berthelot [7], и позволяющего определить аммиак в среде без предварительного выделения. Обязательная предшествующая реакция депротеинизации позволяет исключить ложнопозитивный результат за счет удаления из реакционной среды потенциальных источников аммиака, не связанных с присутствием H.pylori. Определение уровня аммиака проводится при помощи прямого колориметрирования, а не с использованием полуколичественной шкалы оценки, как в прототипе. Использование метода, предложенного Н. Keller et al. [7], позволяет практически свести к нулю ложноотрицательные результаты и продемонстрировать значительно более высокую чувствительность предлагаемого способа в сравнении с способом прототипа. По своей точности данную группу методов можно считать методом выбора [8] . Метод, предложенный Н. Keller et al. [7], прост в исполнении и не требует привлечения дополнительной аппаратуры и специальных реактивов, не имеющихся в распоряжении стандартно оснащенной биохимической лаборатории. Определение уровня мочевины сыворотки крови также является рутинной процедурой, проводящейся всегда наряду с определением уровня белка, билирубина и аминотрансфераз. Сочетанный забор желудочного содержимого (для рН-метрии) и сыворотки крови является обязательнoй рутинной процедурой для любого гастроэнтерологического стационара и не потребует дополнительной нагрузки персонала.

Предлагаемый способ вследствие своей технологической простоты и доступности лабораторного оборудования может быть использован в любой биохимической лаборатории, где имеется фотоэлектроколориметр. Способ удобен еще и тем, что он является малоинвазивным и атравматичным, т.е. не требует эндоскопии с биопсией и может быть использован у пациентов с катетеризацией желудка (в т.ч. и тех, кто находится в отделении ургентного профиля), а также у пациентов, у которых взятие биопсии может привести к серьезной угрозе для здоровья (гемофилия и т.д.). Приведенная совокупность существенных признаков в литературе не описана.

Проведенный анализ позволяет сделать вывод о соответствии предлагаемого способа критерию "новизна".

Пробы желудочного содержимого и сыворотки крови, взятые от 90 пациентов, исследовали на присутствие пилорического хеликобактериоза. Полученные данные верифицировали цитологически, серологически (наборы "Anti-H.pylori EIA", Roche, Швейцария) и при помощи полимеразной цепной реакции на обнаружение фрагмента ДНК H.pylori, кодирующего синтез субъединицы А уреазы микроорганизма. Величина индекса А у H.pylori-позитивных пациентов (n=70) составила 4,84±2,92 (0,23-10,64), а у H.pylori-негативных пациентов (n=20) - 105,9±49,5 (28,94-334,16). Величина индекса В у H.pylori-позитивных пациентов (n=70) составила 16,4±9,8 (3,74-106,8), а у H.pylori-негативных пациентов (n= 20) - 0,65±0,17 (0,16-0,94). Согласно данным статистического анализа (стандартный параметрический тест Стьюдента) различие было достоверно (р<0,01). Чувствительность и специфичность индекса А были равны соответственно 100% при произвольном значении, равном 11 и исчисленном из величины mean+2SD для H.pylori-позитивных пациентов. Чувствительность и специфичность индекса В были равны соответственно 100% при произвольном значении верхней границы нормативного показателя 1,0, исчисленного из величины mean+2SD для H. pylori-негативных пациентов. Таким образом, расхождения результатов индексов А и В при внутригрупповом сравнении предлагаемым способом отмечено не было.

Способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Больной Марат X., 10 лет, обратился в клинику с жалобами на боли в области пупка, возникающие сразу после приема пищи, тошноту и рвоту. При фиброгастроскопии выявлена плоская эрозия, диаметром 4 мм в области привратника, а также язва, 4 мм диаметром, в луковице двенадцатиперстной кишки. После проведения анализов по описанному способу величина индекса А была равна 0,23, что соответствует инфицированию H.pylori. Величина индекса В была равна 8,89, что окончательно подтвердило факт инфицирования пациента H. pylori. При цитологическом, серологическом и молекулярно-биологическом исследовании диагноз H.pylori инфекции был подтвержден.

Пример 2. Больной Артем П., 14 лет, обратился в клинику с жалобами на боли в околопупочной области, не связанные с приемом пищи. При проведении фиброгастроскопии у больного обнаружен гипертрофический дуоденит и слабая эритема слизистой оболочки тела желудка. В процессе тестирования по описанному способу величина индекса А была равна 38,3, что не соответствует инфицированию H. pylori. Величина индекса В была равна 0,76, исходя из чего был сделан вывод об отсутствии инфекции H.pylori. При цитологическом, серологическом и молекулярно-биологическом исследовании у пациента было подтверждено отсутствие пилорического хеликобактериоза.

Проведенное исследование свидетельствует о том, что предложенный способ диагностики пилорического хеликобактериоза является эффективным и надежным и может быть рекомендован для широкого клинического применения.

Источники информации
1. Das S.S., Bain L.A., Karim Q.N. et al. // Rapid diagnosis of Campylobacter pyloridis infection //J. Clin. Pathol. 1987, Vol. 40, 6, р. 701-702.

2. Klein P. D. , Graham D.Y. // Detection Campylobacer pylori by the ¹³C-urea breath test. In: Campylobacter pylori and gastroduodenal disease. Ed. by B. J. Rathbone, R.V. Heatley. Blackwell Scientific publ., Oxford, 1990, p. 94-105.

3. Bornschein W., Bauernfeind A., Heilmann K..L. // Urease schnelltestes bei Campylobacter pylori besiedlung der magenschleimhaut // Gastroenterol. J. 1989, Bd. 49, 2, s. 54-58.

4. Kim H., Park С., Jang W.I. et al. // The gastric juice urea and ammonia levels in patients with Campylobacter pylori // Amer. J. Clin. Pathol. 1990, vol. 94, 2, р. 187-191.

5. Fitzgerald O. , Murphy P. // Studies on physiological chemistry and clinical significance of urease with special reference to the stomach // Irish. J. Med. Sci. 1950, vol. 292, 2, p. 97-159.

6. Chittajallu R.S., Neithercut W.D., Mac Donald A.M.I., Mc Coll K.E.L. // Effect of increasing Helicobacter pylori ammonia production by urea infusion on plasma gastrin concentrations // Gut 1991, vol. 32, 1, p. 21-24.

7. Keller H., Müller-Beissenhirtz W., Neumann E. // Eine methode zur ammoniakbestimmung im capillarblut // Klin. Wschr. 1967, Bd. 45, 6, S. 314-316.

8. Братанов И.И. // Клинические и лабораторные исследования в педиатрии // София. Медицина и физкультура, 1968, с.737.

Формула изобретения

Способ диагностики пилорического хеликобактериоза, включающий взятие желудочного содержимого, определение в нем уровня аммиака, отличающийся тем, что дополнительно в сыворотке крови фотометрически определяют уровни аммиака по H. Keller и мочевины диацетил-монооксимным способом, рассчитывают индексы соотношения мочевины сыворотки крови к аммиаку желудочного содержимого (А) и аммиака сыворотки крови к аммиаку желудочного содержимого (В), и при их значении ниже 11 и выше 1 соответственно, устанавливают диагноз пилорического хеликобактериоза.