Способ определения функциональной активности компонента c3 комплемента человека

 

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и касается способа определения функциональной активности компонентов комплемента в сыворотке крови человека при диагностике ряда заболеваний и в биологических препаратах. Сущностью способа является определение функциональной активности компонента С3 системы комплемента человека на основе иммуноферментного метода, основанного на способности функционально активного компонента С3 образовывать С5-конвертазу классического пути при взаимодействии с С3-конвертазой. Функциональную активность компонента С3 комплемента определяют по количеству образовавшегося продукта ферментативной реакции. Техническим результатом является простота определения и хорошая воспроизводимость результатов. 1 табл.

Изобретение относится к медицинской иммунологии, а именно к способам определения функциональной активности компонентов комплемента в сыворотке крови человека при диагностике ряда заболеваний и в биологических препаратах.

Наиболее перспективным из современных методов определения белков сыворотки крови является метод иммуноферментного анализа благодаря своей чувствительности, избирательности и возможности автоматизации аналитического процесса. Однако имеющиеся на сегодня методы иммуноферментного анализа белков комплемента позволяют определять лишь их содержание как антигена. Тем не менее наиболее информативным является оценка функциональной активности этих белков, которая и характеризует развитие патологического процесса. Что касается определения функциональной активности компонентов комплемента, то практически единственным является гемолитический метод [1], не отличающийся высокой степенью воспроизводимости и неохотно используемый клиницистами из-за трудностей, связанных с приготовлением гемолитической системы на основе эритроцитов барана.

Нами разработан способ, позволяющий определять функциональную активность компонента С3 системы комплемента человека на основе иммуноферментного метода. Преимуществами предложенного метода являются простота определения, хорошая воспроизводимость результатов и отсутствие необходимости использования таких плохо сохраняемых и плохо стандартизуемых компонентов, какими являются эритроциты.

Способ осуществляется следующим образом: проводят сорбцию в лунках микропанели иммуноглобулина G, затем в лунки вносят сыворотку морской свинки и буферный раствор, содержащий ионы Са²⁺ и Ni²⁺, и проводят инкубацию для формирования на поверхности лунок стабильной С3-конвертазы классического пути комплемента, после чего, вылив содержимое в лунки, вносят растворы, в которых определяют активность компонента С3, и проводят инкубацию, во время которой происходит ковалентное связывание С3 с С3-конвертазой с превращением последней в С5-конвертазу. Количество ковалентно связавшегося в результате активации компонента С3 определяют по продукту ферментативной реакции с помощью антител к С3-фракции иммуноглобулинов G, ковалентно связанных с ферментом. Способ основан на способности функционально активного компонента С3 образовывать С5-конвертазу классического пути при взаимодействии с С3-конвертазой.

Пример. Определение функциональной активности препарата С3. Растворяют иммунохимически чистый IgG в 0,05 М натрий-карбонатном буфере, рН 9,5, в концентрациях белка 10-100 мкг/мл и вносят по 100 мкл раствора в каждую лунку плоскодонного полистиролового 96-луночного планшета. Закрывают крышкой и оставляют на ночь при 4^oС. Два раза отмывают планшет вероналовым буферным раствором, рН 7,4, содержащим 0,15 М NaCl, 0,15 мМ Са²⁺ (VBS-Ca²⁺), по 150 мкл в каждую лунку, затем планшет осушают путем вытряхивания остатка жидкости. В лунки планшета ряда вносят 75 мкл VBS-Ca²⁺, 15 мкл 0,1М нитрата никеля (II) и 10 мкл сыворотки морской свинки. После инкубации в термостате в течение 30 мин при 37^oС, двукратной отмывки VBS, содержащим 5 мМ ЭДТА, (VBS-E) и осушения планшета в лунки планшета каждого ряда вносят по 100 мкл раствора, содержащего С3 в растворе VBS-E в виде прогрессивных двукратных разведений.

После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37^oС, двукратной отмывки фосфатным буфером, рН 7,4, содержащим 0,15 М NCl и 0,05% твин-20, и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл конъюгата пероксидазы с антителами против компонента С3 человека в том же буфере в подобранном разведении. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37^oС, двукратной отмывки с детергентом и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл субстратного буфера (10 мг ортофенилендиамина в 25 мл цитратно-фосфатного буфера, рН 5,0, и 50 мкл 3% перекиси водорода). После 30 мин инкубации в темноте реакцию останавливают внесением в каждую лунку 50 мкл 14% серной кислоты. Результаты реакции учитывают с помощью спектрофотометра с вертикальным лучом измерением светопоглощения при 492 нм. Функциональную активность препарата С3 рассчитывают по стандартной кривой. Этим методом проведено определение активности С3 в 5 образцах сыворотки крови человека и стандартным гемолитическим методом [1] . Полученные результаты (в мг/мл активного компонента С3) представлены в таблице.

ЛИТЕРАТУРА 1. Козлов Л.В., Крылова Ю.И., Чих В.П., Молчанова Н.Н. Модифицированные методы определения функциональной активности факторов комплемента С2, С3, С4 и С5. Биоорганическая химия. 1982. Т. 8. 5. С. 652-659.

Формула изобретения

Способ определения функциональной активности компонента С3 комплемента человека, отличающийся тем, что сорбируют в лунках микропанели иммунохимически чистый иммуноглобулин G, в лунки микропанелей вносят раствор, содержащий сыворотку морской свинки, проводят инкубацию, выливают содержимое лунок, вносят раствор, содержащий компонет С3 комплемента человека, проводят инкубацию и выливают содержимое лунок, а затем вносят конъюгат фермента с антителами против компонента С3 человека и субстрат этого фермента, после чего проводят расчет активности С3 по количеству образовавшегося продукта ферментативной реакции.

РИСУНКИ

Рисунок 1