Способ постановки реакции агглютинационного иммунологического анализа

 

Изобретение относится к медицине, в частности иммунологии. Способ включает сорбцию биоспецифических лигандов на поверхность гидрозолей, последующее соединение гидрозоля с подлежащей тестированию биологической жидкостью и оценку результатов. Соединение гидрозоля с подлежащей тестированию биологической жидкостью осуществляют в среде дисперсных препаратов, нерастворимых в воде. Способ обеспечивает увеличение чувствительности анализа, снижение времени постановки анализа. 6 табл.

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины, может быть использовано в диагностике различных инфекционных и соматических патологий. При этих заболеваниях в организме больного возникают антитела, комплементарные антигенам, лежащим в основе патогенеза заболевания.

Эти антитела и антигены могут обнаруживаться в периферической крови, однако до настоящего времени не созданы диагностические препараты, отличающиеся стабильностью иммунохимических свойств и позволяющие осуществлять данную реакцию бесприборно. Отсутствуют надежные и простые методы для скрининговых исследований больных и населения, относящихся к группам риска, что важно для коррекции терапии и определения прогноза заболевания.

Цель изобретения - разработка бесприборного экспресс-метода для определения наличия и вида антител и антигенов - маркеров различных нозологий, увеличение чувствительности анализа, снижение времени постановки анализа.

Аналогом данного метода является способ определения различных антигенов либо антител путем мечения одного из компонентов: антигенов либо комплементарных им антител, именуемых в дальнейшем биолигандами, различными метками - радиологоческими, ферментными, флуоресцентными, эритроцитарными [1], латексными [2].

Аналогом данного метода является способ определения антител против вируса клещевого энцефалита в сыворотке крови с помощью реакции непрямой гемагглютинации [3].

Аналогом данного метода является также способ определения антирезусных антител при аутоиммунной гемолитической анемии [4] с помощью прямой реакции гемаагглютинации.

Аналогом данного метода является способ постановки агглютинационного иммунологического анализа при помощи гидрозолей [5], ультрадисперсных частиц неорганической природы например, оксида железа (III), Fe₂О₃, на поверхности которых адсорбированы антигены, либо антитела.

Аналогом данного метода является способ постановки агглютинационного иммунологического анализа при помощи гидрозолей, поверхность которых модифицирована для проведения хемосорбции биолигандов, либо ароматическими хинонами и нитрозосоединениями [6], либо соединениями элементов, имеющих d-слой валентных электронов [7].

Аналогом данного метода является способ постановки агглютинационного анализа при помощи гидрозолей - ультрадисперсных нерастворимых в воде частиц неорганической природы, на основе элементов или амфотерных, или имеющих d-слой валентных электронов [8].

Аналогом данного метода является способ постановки агглютинационного гидрозольного иммунохимического анализа с использованием различных поверхностно-активных веществ (ПАВ), вводимых пен, как в буферный раствор для раститровки биоматериалов, так и в собственно гидрозоль.

Прототипом данного технического решения является способ постановки агглютинационного иммунологического анализа, описанный в [10].

Согласно способа, описанного в прототипе, нерастворимый в воде гидрозольный препарат на основе неорганических катионов вводят во взаимодействие с подлежащей тестированию биологической жидкостью в емкостях, обработанных антифрикционными материалами. Гидрозоли синтезируют либо при помощи хемосорбции биоспецифических лигандов на их поверхность [6, 8], либо при помощи ионной сорбции [11]. По завершении сорбции осуществляют отмывку гидрозольного препарата от несвязавшихся биолигандов - антигенов (антител) путем многократных промывок буферными растворами [5 - 11] с последующим центрифугированием, удалением надосадка и с расуспензированием в разводящем буферном растворе, например, фосфатно-солевом буфере с рН 7,35 ± 0,05. Полученный препарат именуют гидрозолем, предназначенным для выявления антигенов, антител, комплементарных биолигандам, адсорбированным на его поверхности. Далее, подлежащую тестированию биологическую жидкость разводят путем двухкратного титрования в буферном растворе, например, фосфатно-солевом буфере с рН 7,25 ± 0,05 [11].

Недостатками прототипа можно считать: 1. Длительное время учета результатов анализа.

2. Недостаточную чувствительность аггллютинационного иммунологического анализа.

Указанные недостатки преодолеваются, если используемые для иммунологического анализа дисперсные препараты - гидрозоли и подлежащие тестированию биологические жидкости соединяют в среде дисперсных препаратов, нерастворимых в воде.

Дисперсные препараты, нерастворимые в воде, относятся к различным классам химических соединений. Это порошки оксида алюминия [12], гидроксида алюминия [13], карбоната кальция [14], сульфата бария [15].

Порошок оксида алюминия применяется как материал в тонкослойной хроматографии; гидроксид алюминия и карбонат кальция находят применение как наполнители при производстве таблеточных форм в фармации, сульфат бария используется в медицине как рентгено-контрастный препарат, в качестве среды для проведения реакций гидрозольной агглютинации эти препараты ранее описаны не были.

Изобретение используется следующими примерами конкретного выполнения.

Пример 1.

Осуществляют сорбцию биолигандов на гидролизном препарате гексанферрате железа (III), Fе₂[Fе(СN)₆]₃, поверхность которого предварительно модифицирована катионом двухвалентной ртути, согласно [7, 8]. В качестве биолиганда используют фракцию 1 чумного микроба. Адсорбцию осуществляют согласно ранее известного способа [7]. Реакции гидрозольной агглютинации осуществляют в варианте толстой капли на стекле, образованном графитовой смазкой (прототип) и в среде Al₂O₃ (заявляемое решение). Во вспомогательном планшете осуществляют разведение "положительной" и "отрицательной" сывороток на фосфатно-солевом буфере в титрах от 1: 2 до 1: 1280. Затем каждое из разведений переносят на стеклю, обработанное графитовой смазкой (прототип), либо в среду Аl₂О₃ (заявляемое решение), после чего вносят равные аликвоты гидрозольного препарата. Далее осуществляется визуальная оценка реакции, либо микроскопирования осадка. Результаты данного эксперимента представлены в таблице 1.

Пример 2 Осуществляют сорбцию биолигандов на дисперсном препарате гидроксида железа (III), Fе(ОН)₃, как в примере 1. В качестве агентов для хемооорбции используют производные нитрозоаминов [6]. В качестве биолиганда используют аффинно-очищенный дифтерийный анатоксин, в качестве дисперсного препарата - осажденный CaCO₃ (осажденный мел). В остальном методики и последующие постановки анализа не отличаются от таковых, как в примере 1. В качестве прототипа используют лунки планшетов, обработанные фторированным графитом. Результаты данного эксперимента представлены в таблице 2.

Пример 3.

Осуществляют сорбцию биолигандов на гексацианферрате меди (II), Сu₂Fе(СN)₆ в качестве основы гидрозоля [8], аналогично примера 1. В качестве агентов для хемосорбции используют производные нитрозоаминов [6], в качестве биолиганда используют антиген туберкулезный ППДД - в стандартном разведении. В качестве прототипа используют лунки полистирольного планшета, обработанные дисульфидом молибдена [10] - антифрикционным материалом. В заявляемом решении в качестве дисперсного препарата для постановки иммунологической реакции используют осажденный сульфат бария BaSO₄. В остальном методики постановки не отличаются от таковых, как в примерах 1 и 2.

Пример 4.

Осуществляют сорбцию биолиганда - антител к вирусу основакцины на гидрозольном препарате, где в качестве основы используют гексацианферрат железа (III) [8] в качестве модификатора для адсорбции - катионы d-элемента меди [7] . В качестве прототипа используют поверхность предметного стекла, обработанную перфторированной смазкой. В качестве заявляемого решения используют дисперсные препараты Al₂O₃ Аl(ОН)₃, BaSO₄, СaСO₃. В виде положительного контроля используют инактивированный формалином препарат вируса основакцины; в качестве отрицательного контроля - интактивированный формалином препарат вируса Ласса. В остальном методики постановки реакции не отличаются от таковых, как в примерах 1-3. Результаты данного эксперимента представлены в таблице 4.

Пример 5.

Осуществляют сорбцию биолиганда - антител к хорионическому гонадотропину человека (ХГЧ). В качестве основы используют гидрозоль на основе оксида железа (III) [8] , сорбцию биолиганда производят по механизму ионной сорбции [11] . В качестве положительного контроля используют образцы мочи беременных женщин, содержащие ХГЧ; в качестве отрицательного контроля - образцы мочи, не содержащие XГЧ. В качестве прототипа используют поверхность предметного стекла, обработанного силиконовым маслом; в заявляемом техническом решении используют дисперсные препараты Al₂O₃, Аl(ОН)₃, BaSO₄, СaCО₃. В остальном методики постановки реакций не отличается от таковых, как в примерах 1-4. Результаты данного эксперимента представлены в таблице 5.

Пример 6.

Осуществляют сорбцию биолиганда - антител к HBsAg. В качестве гидрозольной основы используют гексацианферрат меди (II) [8], модифицированной для усиления хемосорбции нитрозоаминами. В качестве прототипа используют поверхность предметного стекла, обработанного силиконовым маслом. В остальном, заявляемые объекты предлагаемого изобретения и методики постановки реакций не отличаются от таковых, как в примерах 1-5. Результаты данного эксперимента представлены в таблице 6.

Таким образом, из представленных примеров ясно видны преимущества технического решения по сравнению с прототипом в плане обеспечения большей чувствительности агглютинационного иммунологического анализа и снижение времени на его постановку.

Представленные результаты указывают на возможность использования предложенного способа в диагностике наличия титра и динамических изменений уровня специфических антигенов и антител, связанных с той или иной конкретной нозологической единицей. Полученные данные могут иметь важное значение в скрининговой диагностике, определении прогноза заболевания и коррекции лечения. Это может дать определенный экономический эффект в плане снижения затрат за счет экономии койко-дней и улучшения профилактических воздействий.

Источники информации 1. Роит А. Основы иммунологии. -М.: Мир, 1991. - С. 91-93.

2. Ред. Покровскии В. И. Иммунология инфекционного процесса. М., Медицина, 1994. - С.230.

3. Никитин В.М. Справочник методов иммунологии. - Кишинев, 1982, 304 с.

4. Никитин В.М. Справочник методов иммунологии. Кишинев, 1982, 304 с.

5. Мешандин А.Г. Физико-химические аспекты сорбиционых процессов при синтезе твердофоазных биолигандов. М., 1994, с. 31-34.

6. RU 2154826, 20.08.2000 г.

7. RU 2169924, 27.06.2001 г.

8. RU 2170434, 10.07.2001 г.

9. RU 2130613, 20.05.1999 г.

10. RU 2154827, 20.08.2000 г.

11. RU 2044320, C1, 20.09.1995 г.

12. Ред. Закусоев В.В. Клиническая фармакология, М.: 1978 г.

13. Слесарев В.И Основы химии живого. С.-Петербург, 2000 г.

14. Беликов В.Г. Фармацевтическая химия. - М.: Высшая школа, 1985 г., с. 147.

15. Машковский М.Д. Лекарственные препараты, т. 2, М.: Медицина, 1988 г. , с. 585.

Формула изобретения

Способ постановки реакции агглютинационного иммунологического анализа при помощи не растворимых в воде гидрозольных дисперсных препаратов, имеющих в своем составе неорганические катионы, включающий сорбцию биоспецифических лигандов на их поверхность, последующее соединение гидрозоля с подлежащей тестированию биологической жидкостью и оценку результатов анализа, отличающийся тем, что соединение гидрозоля и подлежащей тестированию биологической жидкости осуществляют в среде дисперсных препаратов, не растворимых в воде.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2