Оптический биосенсор необратимых ингибиторов холинэстеразы в воздухе

 

Оптический биосенсор предназначен для контроля загрязнений окружающей среды. Активный компонент биосенсора выполнен из комплекса холинэстеразы с ее обратимым ингибитором-люминогеном, иммобилизованным на нейтральной подложке, а для регистрации аналитического эффекта используется оптический детектор. Особенностью активного компонента биосенсора является его способность увеличивать интенсивность флуоресценции при воздействии необратимыми ингибиторами, например O,O-диизопропилфторфосфатом. Технический результат - упрощение конструкции и сокращение времени анализа. 2 з.п. ф-лы, 1 табл., 1 ил.

Изобретение относится к области контроля загрязнений окружающей среды и, в частности, фосфорорганическими отравляющими веществами, инсектицидами, карбаматами.

В полевых условиях целесообразно использование для определения ингибиторов холинэстеразы (далее по тексту ХЭ) наиболее простых по устройству и удобных в эксплуатации технических устройств типа биосенсор.

Биосенсор - это устройство, состоящее из биологического активного компонента и компонента, преобразующего аналитический эффект в какой-либо регистрируемый сигнал (световой, звуковой и т.п.). В случае оптического биосенсора аналитический эффект передается непосредственно с биологического активного компонента на оптический детектор (Э.Тернер, И.Карубе, Дж.Уилсон. Биосенсоры: основы и приложения. Москва, "Мир", 1992).

Известны оптические биосенсоры, основанные на использовании флуоресцентных меток в иммуноанализе [1, 2]. В этих биосенсорах луч от источника света проходит через оптическое волокно и возбуждает флуоресценцию комплекса антитело-антиген, образующегося на поверхности или около оптического волокна. Возникающая при этом флуоресценция через оптическое волокно и фильтр поступает на фотодиод или фотоумножитель. Недостатком этих биосенсоров является их несоответствие следующим требованиям к биосенсорам: малый размер, небольшой вес и простая конструкция.

Наиболее близким к предлагаемому аналитическому устройству является "Портативный автоматический прибор для анализа токсичных газов" (далее по тексту "биосенсор") [3], предназначенный для обнаружения ингибиторов холинэстеразы в водных пробах путем измерения флуоресценции продукта ферментативного превращения синтетического субстрата N-метилиндоксила. В качестве активного компонента в биосенсоре используется ацетилхолинэстераза, раствор которой поступает одновременно с анализируемой водной пробой в смеситель. Затем после определенного периода, необходимого для ингибирования фермента, раствор, содержащий холинэстеразу и анализируемую пробу, поступает во второй смеситель, в который одновременно подается раствор субстрата N-метилиндоксилацетата. Далее раствор поступает в оптический детектор, регистрирующий интенсивность флуоресценции. Свет флуоресценции, возникающий при воздействии возбуждающего света на образующийся при ферментативном гидролизе субстрата N-метилиндоксил, через оптическое волокно поступает на сферическую линзу, проходит через сплиттер, фильтр и далее через линзу на фотодиод.

В патенте [3] также указывается на возможность реализации альтернативной конструкции биосенсора, которая предусматривает использование в качестве активного компонента биосенсора ацетилхолинэстеразы, иммобилизованной на поверхности оптического волокна, расположенного в проточном реакторе, а также поступление субстрата N-метилиндоксилацетата в проточный реактор вместе с анализируемой жидкой пробой. Однако конкретная альтернативная конструкция биосенсора на основе иммобилизованной холинэстеразы в материалах патента не приводится.

Обсуждаемый биосенсор принят в качестве наиболее близкого аналога (прототипа).

Выбор в качестве наиболее близкого аналога (прототипа) данного аналитического устройства [3] предлагаемому обусловлен их пренадлежностью к одному и тому же родовому понятию "оптический биосенсор для обнаружения ингибиторов холинэстеразы", отражающему их одинаковое назначение - обнаружение ингибиторов холинэстеразы с оптической регистрацией аналитического эффекта.

Общими существенными признаками предлагаемого биосенсора с прототипом являются содержание холинэстеразы на биологическом активном компоненте и использование для регистрации аналитического эффекта оптического детектора.

Биосенсор-прототип имеет ряд недостатков: его конструкция сложна, что обусловлено необходимостью обеспечения одновременной подачи субстрата с анализируемой пробой жидкости в проточный реактор (два насоса, проточный реактор, смеситель и т.д.), поступление жидкости в оптический датчик и т.д. Использование такого биосенсора для анализа воздуха предусматривает предварительную пробоподготовку, т.е. адсорбцию содержащихся в воздухе токсичных химикатов на сорбенте с последующей их экстракцией в соответствующий растворитель.

Указанные выше недостатки ведут к усложнению конструкции и удорожанию прибора, а также к увеличению времени анализа.

Общим недостатком известных биосенсоров, в том числе и прототипа, является возможность их использования только для анализа жидких проб. Ни один из них не может быть использован для мониторинга окружающего воздуха без предварительной пробоподготовки.

Предлагаемое решение направлено на упрощение конструкции биосенсора и сокращение времени анализа.

Технический результат достигается тем, что в предлагаемом биосенсоре активный компонент выполнен из комплекса EI_f холинэстеразы с ее обратимым ингибитором-люминогеном I_f, иммобилизованным на нейтральной подложке, а оптический детектор представляет собой оптический волновод, внутри которого последовательно расположены по ходу светового луча от источника света (см. чертеж, позиция 1): фокусирующая сферическая линза (позиция 2), диафрагма (позиция 3), фильтр для выделения длины волны возбуждающего света (позиция 4), призма (позиция 5), фокусирующая линза (позиция 7), подложка с иммобилизованным комплексом холинэстеразы с ее обратимым ингибитором-люминогеном (позиция 6), а далее по ходу луча флуоресценции от комплекса EI_f последовательно расположены фокусирующая флуоресцирующий луч света сферическая линза (позиция 7), призма (позиция 8), фильтр для выделения луча флуоресцирующего света (позиция 9), фокусирующая линза (позиция 10), фотодиод с выводом сигнала на световое табло или с возможностью получения звукового сигнала (11).

Использование в предлагаемом биосенсоре активного компонента, выполненного из комплекса холинэстеразы EI_f с ее обратимым ингибитором-люминогеном I_f, иммобилизованного на нейтральной подложке, позволило отказаться от использования субстрата. К числу обратимых ингибиторов-люминогенов холинэстеразы относятся сульфат хинидина, сульфат хинина, лактат 2-этокси-6,9-диаминоакридиния (далее по тексту риванол) и др. При воздействии холинэстеразы (ацетилхолинэстеразы) обратимый ингибитор-люминоген I_f теряет способность к флуоресценции, что можно объяснить образованием не флуоресцирующего фермент-ингибиторного комплекса EI_f. В свою очередь, при воздействии необратимого ингибитора I_n, например О,О-диизопропилфторфосфата (известные необратимые ингибиторы холинэстеразы не обладают флуоресцентными свойствами), на активный компонент биосенсора наблюдается мгновенное увеличение интенсивности флуоресценции. Наблюдаемый эффект можно объяснить высокой скоростью ингибирования холинэстеразы необратимым ингибитором с образованием сначала фермент-ингибиторного комплекса EI_n, а затем - фосфорилированного фермента. В результате связывания холинэстеразы в комплекс с необратимым ингибитором имеет место диссоциация комплекса EI_f и выделение флуоресцирующего обратимого ингибитора-люминогена I_f.

Дополнительное использование призмы в оптическом детекторе позволяет возбуждать обратимый ингибитор-люминоген монохроматическим светом и отсекать луч возбуждающего света от света флуоресценции.

В таблице приведены существенные признаки биосенсора-прототипа и предлагаемого биосенсора.

Таким образом, совокупность существенных признаков предлагаемого решения, приведенных в таблице, обеспечивает достижение заявленного технического результата: упрощения конструкции биосенсора и сокращения времени анализа.

Использованные литературные источники 1. US Patent 4447546, issued May 8, 1984. С 12 Q 1/00.

2. US Patent 4558014. С 12 Q 1/00.

3. US Patent H 1344, Aug.2, 1994. С 12 Q 1/46.

Формула изобретения

1. Оптический биосенсор для определения ингибиторов холинэстеразы в воздухе, включающий активный компонент с иммобилизованной холинэстеразой и оптический детектор, отличающийся тем, что активный компонент выполнен из комплекса холинэстеразы с ее обратимым ингибитором-люминогеном, иммобилизованным на нейтральной подложке.

2. Оптический биосенсор ингибиторов холинэстеразы в воздухе по п.1, отличающийся тем, что оптический детектор представляет собой оптический волновод, внутри которого последовательно расположены по ходу светового луча от источника света: фокусирующая сферическая линза, диафрагма, фильтр для выделения длины волны возбуждающего света, призма, фокусирующая линза, подложка с иммобилизованным комплексом холинэстеразы с ее обратимым ингибитором-люминогеном, а далее по ходу луча флуоресценции последовательно расположены фокусирующая флуоресцирующий луч света сферическая линза, призма, фильтр для выделения луча флуоресцирующего света, фокусирующая линза, фотодиод с выводом сигнала на световое табло или с возможностью получения звукового сигнала.

3. Оптический биосенсор ингибиторов холинэстеразы в воздухе по п.1, отличающийся тем, что позволяет проводить мониторинг ингибиторов холинэстеразы в окружающей воздушной среде в следящем режиме.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2