Способ диагностики возбудителей инфекционных и паразитарных болезней и установка для его осуществления

 

Изобретение относится к области медицины и может применяться. в клинической практике. Способ диагностики возбудителей инфекционных и паразитарных болезней в исследуемом препарате состоит в приготовлении окрашенного видеоспецифичным флоуресцентным красителем стандартного препарата, размещении его на предметном стекле предметного столика люминесцентного микроскопа, освещении препарата источником, пригодным для возбуждения люминесценции красителя. Поиск возбудителей инфекционных и паразитарных болезней ведут при сканировании препарата в поле зрения микроскопа предметным столиком с последующей телевизионной разверткой микроизображений по двум координатам. Распознавание и индентификацию возбудителей инфекционных и паразитарных болезней ведут с помощью телевизионной камеры и компьютера. Камера сопряжена с микроскопом через видеоадаптер. Компьютер снабжен программой, обеспечивающей запись и анализ видеоизображения возбудителей инфекционных и паразитарных болезней в его память. Установка для реализации способа диагностики возбудителей инфекционных и паразитарных болезней содержит люминесцентный микроскоп с осветительной системой в отраженном свете и осветительную систему подсветки препарата в проходящем свете, сканирующий предметный столик, два шаговых электродвигателя, систему перемещения, систему вывода изображения на дисплей персонального компьютера. Телевизионная камера системы вывода изображения установлена на микроскопе. Выход телевизионной камеры через блок сопряжения соединен с интерфейсной платой управления телекамерой. Выход блока управления электродвигателями системы перемещения соединен с шаговыми двигателями. Способ и установка обеспечивают автоматическую идентификацию возбудителей инфекционных и паразитарных болезней, повышение скорости и эффективности поиска и интенсивности возбуждения препарата в поле зрения микроскопа. 2 с. и 3 з.п.ф-лы, 2 ил.

Изобретение относится к области медицины и может применяться в клинической практике для автоматизированного обнаружения и идентификации возбудителей инфекционных и паразитарных болезней при люминесцентном исследовании биологических препаратов всех видов (мокрота, кровь, моча и т.п.).

Известен способ измерения фотолюминесценции биологических тканей (СССР, авт. св. N 1800897, кл.G 01 N 33/48, Бюл. N 14, 1996), который состоит в том, что измерение фотолюминесценции биологических тканей производят при освещении белым светом, не содержащим в своем спектральном составе длин волн, соответствующих полосе люминесценции, а измерение люминесценции и наблюдение в белом свете осуществляют одновременно с помощью спектрального устройства.

Этот способ измерения не обеспечивает автоматической идентификации возбудителей инфекционных и паразитарных болезней (ВИПБ).

Известен способ определения степени инфицированности крови (Россия, патент N 2008677, кл.G 01 N 33/48, Бюл. N 4, 1994), который состоит в следующем. У больного кровь берут из вены в стерильный шприц с гепарином. На обезжиренные стекла наносят каплю крови, делают тонкий мазок. Мазки делают в количестве 3 - 6 на каждого больного. Мазки сушат, обрабатывают 96^o-ным спиртом, высушивают на воздухе. Мазки обрабатывают кроличьей диагностической сывороткой, помещают на 1 ч во влажную камеру, чтобы не высохла сыворотка (в чашку Петри кладется фильтровальная бумага с каплей буфера). Через 1 ч буфером смывают с мазка оставшуюся сыворотку, дважды по 10 мин в буфере. Мазки сушат 20 - 30 мин. Красят ослиным глобулином. После окраски во влажной камере в чашке Петри мазки промывают дважды по 10 мин в забуферном физиологическом растворе. После всех окрашиваний мазки промывают еще проточной холодной водой, высушивают. Используют различные специфические диагностические сыворотки, позволяющие типировать различные микробные клетки. Просматривают мазки на люминесцентном микроскопе типа МБИ - 15 без покровных стекол. Каплю иммерсионного масла наносят на мазок. Объектив 90^x, апертура 1,25, окуляр 10^x, сила тока 4,5 А.

Обнаружение микробных клеток производят при проведении люминесцентного исследования мазка крови со специфическими иммунофлуоресцирующими сыворотками и определяют количества фагоцитирующих клеток и количество микробных клеток и одновременно количество лейкоцитов и процентное содержание сегментоядерных нейтрофилов и моноцитов в 1 мл периферической крови.

Степень инфицированности крови (С) рассчитывают по формуле С = Л·Ф·М/К·100, где Л - количество лейкоцитов в 1 мл периферической крови; Ф - процентное содержание сегментоядерных нейтрофилов и моноцитов (фагоцитирующие клетки) в 1 мл периферической крови; М - количество микробных клеток в мазке крови при люминесцентном исследовании; К - количество фагоцитирующих клеток в мазке крови при люминесцентном исследовании; 100 - коэффициент перевода относительных чисел в абсолютные.

При 0 < C ≅ 7 устанавливают низкую, при 7 < C < 30 - среднюю, при C ≥ 30 - высокую степень инфицированности крови.

Этот способ реализуется с помощью люминесцентного микроскопа и не обеспечивает автоматической идентификации ВИПБ.

Известен проточный анализатор микрочастиц, предназначенный для поиска клеток, подозрительных на наличие патологии (США, патент N 5428441, кл. G 01 N 33/487, 356/73, 1995). Анализатор содержит два источника света, две коллиматорные линзы, селективный светофильтр, дихроичное зеркало, фокусирующую линзу, камеру для частиц, линзу объектива, запирающий светофильтр, полупрозрачное зеркало, телевизионную камеру, электронный затвор, диафрагму, фотоприемник, блок управления электронным затвором. Первый источник выполнен непрерывного, а второй - импульсного белого света, их оптические оси пересекаются в пространстве под углом 90^o.

На пути света первого источника последовательно установлены коллиматорная линза, селективный светофильтр и дихроичное зеркало под углом 45^o в точке пересечения оптических осей источников света.

На пути света второго источника света установлены вторая коллиматорная линза, фокусирующая линза и под углом 45^o дихроичное зеркало так, что отраженный от этого зеркала свет первого источника и прошедший через него свет второго источника совпадают по направлению распространения.

За дихроичным зеркалом по ходу лучей расположены вторая фокусирующая линза, камера для частиц, линза объектива, запирающий светофильтр и под углом 45^o полупрозрачное зеркало. Отраженные от этого зеркала лучи проходят электронный затвор, диафрагму и регистрируются фотодетектором, выход которого соединен со входом блока управления вторым источником света и электронным затвором, которые соединены с выходом этого блока. Лучи, прошедшие через полупрозрачное зеркало, попадают в видеокамеру.

Анализатор работает следующим образом. При включенном источнике непрерывного освещения через камеру пропускают биологический раствор с анализируемыми микрочастицами. При попадании микрочастицы в луч света срабатывает блок управления электронным затвором, который включает второй источник света и закрывает затвор. Микрочастица регистрируется телевизионной камерой.

Анализатор микрочастиц реализует автоматический поиск клеток, подозрительных на наличие патологии, но не обеспечивает автоматическую идентификацию ВИПБ.

За прототип изобретения принято устройство для диагностики паразитов в пробах крови - двухканальный микрофлюориметр и способ его работы (Карнаухов В. Н., Карнаухова Н.А. и Яшин В.А. Методы и техника люминесцентной цитодиагностики, Препринт, Пущино, 1993, сс. 15 - 19), который содержит люминесцентный микроскоп, в состав которого входят источник света, конденсор, светофильтр возбуждения (селективный светофильтр), полевая диафрагма, дихроичное зеркало системы возбуждения люминесценции, микрообъектив, запирающий светофильтр, сферические зеркало с отверстием-зондом, плоское зеркало, окуляр, дихроичное зеркало-анализатор, два светофильтра, призму, два фотоумножителя, два операционных усилителя, дискриминатор уровня, сканирующий столик микроскопа, блок управления электродвигателем и выработкой звукового сигнала, электродвигатель сканирующего столика, три цифровых вольтметра, анализатор амплитуды импульсов и цитологический препарат с анализируемыми клетками.

Осветительная система в отраженном свете (по ходу его распространения) содержит последовательно установленные источник возбуждения - дуговую лампу, конденсор, селективный светофильтр, полевую диафрагму и дихроичное зеркало, установленное под углом 45^o к оптической оси осветительной системы, микрообъектив, запирающий светофильтр, сферическое зеркало с отверстием-зондом и окуляр микроскопа.

Оптическая система наблюдения содержит (по ходу распространения света) дихроичное зеркало, микрообъектив, цитологчиеский препарат с анализируемыми клетками. На пути отраженного от препарата света установлено дихроичное зеркало, запирающий светофильтр, сферическое зеркало с отверстием-зондом, сменное дихроичное зеркало-анализатор, на пути отраженного от него света установлен коротковолновый светофильтр, а прошедшего - другой длинноволновый светофильтр и призма. На выходах первого светофильтра и призмы установлены фотоумножители, выходы которых соединены со входами операционных усилителей. Выходы операционных усилителей соединены со входами двух цифровых вольтметров и входами делительного устройства, выход которого соединен со входом анализатора амплитуды импульсов и входом дискриминатора уровня. Выход последнего соединен со входом блока управления электродвигателем. Выход этого блока соединен со входом электродвигателя, который кинематически связан с предметным столиком микроскопа.

Микрофлюориметр, реализующий автоматический поиск клеток, подозрительных на наличие патологии, работает следующим образом. Цитологический препарат, нанесенный на предметное стекло и окрашенный, например, акридиновым оранжевым красителем, помещается на сканирующий предметный столик и исследователь нажимает кнопку "Пуск" на пульте блока управления электродвигателем. Включается электродвигатель и начинается движение сканирующего столика. В результате этого увеличенное изображение содержащихся в препарате клеток поочередно попадает в отверстие-зонд в сферическом зеркале и на выходе блока деления возникает сигнал, пропорциональный отношению величин интенсивности длинноволновой и коротковолновой компонент люминесцентного излучения каждой из клеток. Движение сканирующего столика продолжается до тех пор, пока в поле зрения зонда не появится клетка, величина отношения интенсивности длинноволновой и коротковолновой компонент люминесцентного излучения выходит за пределы установленного оператором порога срабатывания дискриминатора уровня. В этом случае на выходе дискриминатора уровня возникает сигнал, останавливающий движение электродвигателя, и сканирование препарата прекращается. Одновременно блок управления подает оператору звуковой сигнал о том, что обнаружена клетка, подозрительная на патологию, и он может приступить к ее морфологическому или аппаратурному исследованию через окуляр микроскопа.

Микрофлюориметр реализует автоматический поиск клеток, подозрительных на наличие патологии, и их последующий визуальный или аппаратурный анализ, но не обеспечивает автоматическую идентификацию ВИПБ.

Техническим результатом изобретения являются автоматизация идентификации возбудителей инфекционных и паразитарных болезней (ВИПБ), повышение скорости и эффективности поиска и интенсивности возбуждения препарата в поле зрения микроскопа за счет большого контраста между исследуемыми люминесцирующими объектами - ВИПБ и остальными компонентами пробы.

Способ диагностики возбудителей инфекционных и паразитарных болезней в исследуемом препарате состоит в приготовлении окрашенного видеоспецифичным флуоресцентным красителем стандартного препарата, размещении его на предметном стекле предметного столика люминесцентного микроскопа, освещении препарата источником, пригодным для возбуждения люминесценции красителя, поиске возбудителей инфекционных и паразитарных болезней при санировании препарата в поле зрения микроскопа, диагностике - распознавании и идентификации по характерной картине люминесценции.

Сканирование осуществляют предметным столиком с последующей телевизионной разверткой микроизображений по двум координатам, а распознавание и идентификацию возбудителей инфекционных и паразитарных болезней ведут с помощью телекамеры, сопряженной с микроскопом через видеоадаптер, и компьютера, снабженного программой, обеспечивающей запись и анализ видеоизображения возбудителей инфекционных и паразитарных болезней в его память.

Сканирование ведут программно по заданной траектории просмотра полей зрения с предварительным выбором шага сканирования, включая возможность возврата на поле зрения с зафиксированными в памяти компьютера изображениями возбудителей инфекционных и паразитарных болезней с помощью предметного столика, управляемого от компьютера, по каждой из двух координат.

Основные операции диагностики, выбор последовательности и режима их осуществления задает оператор через меню пользователя и выполняются автоматически под управлением программы-оболочки, включающей подпрограммы, каждая из которых обеспечивает циклическое выполнение операций сканирования, захвата и переноса видеоизображения каждого поля зрения в память компьютера, анализ, включающий поиск, распознавание и идентификацию возбудителей инфекционных и паразитарных болезней по заданному алгоритму, накопление видеоизображений с обнаруженными возбудителями инфекционных и паразитарных болезней в памяти компьютера с фиксацией координат поля зрения, выдачу информации о текущих результатах анализа на экран дисплея и принятия решения о порядке и режиме осуществления следующего цикла диагностики препарата.

Компьютерный поиск, распознавание и идентификацию возбудителей инфекционных и паразитарных болезней осуществляют по программе на базе алгоритма, основанного на построчном сканировании видеоизображения каждого поля зрения окном, характерный размер которого превышает максимальный размер возбудителей инфекционных и паразитарных болезней с шагом, составляющим не более 0,5 от характерного размера окна, и сопоставлении пространственного распределения яркости выделенных окном объектов с типовыми распределениями, полученными по результатам предварительного анализа изображений возбудителей инфекционных и паразитарных болезней на различных стадиях развития, идентифицированных специалистами-микробиологами, и занесенными в память компьютера при настройке.

Отличительными признаками способа являются - поиск паразитов при сканировании препарата в поле зрения микроскопа по двум координатам, их распознавание и идентификация по характерной картине люминесценции с помощью телевизионной камеры, установленной на микроскопе через видеоадаптер, и компьютера, снабженного программой, обеспечивающей - запись видеоизображения паразитов в его память; - сканирование препарата программно по заданной траектории просмотра полей зрения с предварительным выбором шага сканирования;
- выбор последовательности и режима осуществления основных операций диагностики оператором через меню пользователя, которые выполняются автоматически.

Принцип действия установки автоматической диагностики (УАД) ВИПБ в пробах биологических препаратов основан на использовании явления индивидуальной люминесценции микробиологических объектов, наблюдаемой при избирательном взаимодействии и образовании комплексов с молекулами красителя-хромофора. В случае диагностики проб крови на содержание, например, малярийных паразитов использована способность НК-содержащих структур паразитов образовывать подобные комплексы с характерной дифференциальной люминесценцией для ДНК-содержащих ядер и РНК-содержащей цитоплазмы.

УАД содержит люминесцентный микроскоп с осветительной системой в отраженном свете, осветительную систему для люминесцентной темнопольной подсветки препарата в проходящем свете, видеоадаптер, телекамеру, компьютер с программным обеспечением, дисплей, интерфейсную плату управления телекамерой, блок сопряжения телекамеры с интерфейсной платой, сканирующий по двум ортогональным координатам предметный столик со сквозным окном и предметным стеклом, два шаговых электродвигателя, блок управления электродвигателями.

Осветительная система в отраженном свете (по ходу распространения света) содержит последовательно установленные источник света, коллектор, полевую диафрагму, сменный селективный светофильтр и дихроичное зеркало, установленное под углом 45^o к оптической оси системы, микрообъектив, установленный под углом 90^o к оптической оси системы, соосно ему установлен запирающий светофильтр, видеоадаптер и объектив.

Телекамера установлена на микроскопе после видеоадаптера. Выход телекамеры через блок сопряжения с интерфейсной платой управления телекамерой, которая установлена в свободном слоте компьютера.

Выход компьютера соединен со входом дисплея.

Осветительная система в проходящем свете включает (по ходу распространения света) дуговой источник света сине-фиолетовой области длин волн, отражатель, светоделительную пластину с теплопропускающим (ТПП) дихроичным покрытием, установленную под углом 45^o к оптической оси источника света, отрицательную линзу, установленную под углом 90^o к оптической оси источника света, соосно ей селективный светофильтр из цветного стекла, тороидальную линзу, вторую светоделительную пластину с дихроичным покрытием, установленную под углом 45^o к оптической оси тороидальной линзы, вторую тороидальную линзу, установленную под углом 90^o к оптической оси первой тороидальной линзы, и соосно второй тороидальной линзе размещен конденсор темного и светлого поля с входным и выходным зрачками, установленный под окном в предметном столике.

Блок управления электродвигателями выполнен в виде интерфейсной платы, установленной в свободном слоте компьютера, и электрически соединен с шаговыми двигателями, которые кинематически связаны с предметным столиком.

Отличительными признаками изобретения являются: осветительная система в проходящем свете, второй электродвигатель, телевизионная камера, компьютер с программным обеспечением, дисплей, блок сопряжения, интерфейсная плата управления телекамерой, осветительная система для люминесцентной подсветки препарата в проходящем свете, кроме того, выполнение электродвигателей шаговыми, а блока управления электродвигателями в виде интерфейсной платы компьютера. Размещение телевизионной камеры на микроскопе. Выполнение сканирующего столика со сквозным окном. Соединение выхода телекамеры через блок сопряжения с интерфейсной платой управления телекамерой. Соединение выхода блока управления электродвигателями, с шаговыми двигателями и соединение выхода компьютера с дисплеем.

Конструкция установки автоматической диагностики (УАД) ВИПБ в биологических препаратах и ее работа поясняются чертежами.

На фиг. 1 представлена структурная электрическая, кинематическая и оптическая схемы установки автоматной диагностики ВИПБ.

На фиг. 2 представлена распечатка с экрана дисплея.

На фигурах введены следующие обозначения:
1 - люминесцентный микроскоп (ЛМ);
2 - осветительная система в отраженном свете;
3 - осветительная система в проходящем свете;
4 - предлагаемый столик с предметным стеклом;
5 - шаговый двигатель перемещения предметного столика по другой ортогональной координате;
7 - телевизионная камера (телекамера - ТВК);
8 - блок сопряжения (БС);
9 - компьютер (К);
10 - интерфейсная плата питания шаговых двигателей и управления столиком;
11 - интерфейсная плата для управления телекамерой и ввода видеоизображения в компьютер;
12 - дисплей (Д);
13 - источник света (ИС);
14 - подвижная шторка;
15 - коллектор;
16 - теплопоглощающий светофильтр;
17 - полевая диафрагма;
18 - сменный селекторный светофильтр;
19 - отрицательная линза;
20 - дихроичное зеркало системы возбуждения люминесценции;
21 - микрообъектив;
22 - эллиптический отражатель;
23 - светоотделительная пластинка с теплопропускающим (ТПП) дихроичным покрытием;
24 - селективный светофильтр;
25 - первая тороидальная линза;
26 - вторая тороидальная линза;
27 - входной зрачок конденсатора осветительной системы в проходящем свете;
28 - выходной зрачок конденсатора осветительной системы в проходящем свете;
29 - запирающий светофильтр;
30 - подвижное плоское зеркало;
31 - окуляр;
32 - объектив;
33 - видеоадаптер;
34 - исследуемый объект.

В качестве микроскопа 1 может быть применен, например, микроскоп люминесцентный дорожный МЛД-2 с осветительной системой 2 в отраженном свете.

Система 2 содержит дуговой источник света 13 сине-фиолетовой области длин волн (400 - 440 нм), подвижную шторку 14, коллектор 15, два теплопоглощающих светофильтра 16, полевую диафрагму 17, сменный селективный светофильтр 16, отрицательную линзу 19 и дихроичное зеркало 20.

Осветительная система 3 в проходящем свете содержит дуговой источник света 13 сине-фиолетовой области длин волн (400 - 440 нм), отражатель 22, две светоотделительные пластинки 23 и дихроичным покрытием, отрицательную линзу 19, теплопоглощающий светофильтр 16, две тороидальные линзы 25 и 26 и конденсатор темного и светлого поля осветительной системы в проходящем свете с входным и выходным зрачками 27 и 28. Оптическая схема системы 3 обеспечивает работу конденсатора темного и светлого поля типа ОИ-10.

Предметный столик 4 выполнен с возможностью сканирования в горизонтальной плоскости по двум ортогональным координатам и со сквозным окном по середине.

Шаговые электродвигатели 5 и 6, например ШД-711 с редуктором, кинематически связаны с предметным столиком 4, обеспечивают его автоматическое перемещение по двум ортогональным осям в горизонтальной плоскости. Питание и управление электродвигатели получают от интерфейсной платы 10, размещенной в свободном слоте компьютера. Размер сканируемой зоны и порядок ее сканирования задают программно.

Телекамера 7 выполняется монохромной, например, PCV-2. Система ввода изображений в компьютер IBM PC PC Vision-2 обеспечивает получение, ввод в память компьютера IBM PC и запись на магнитные носители черно-белых изображений различных объектов и состоит из телекамеры 7 и интерфейсной платы-контроллера (framegrabber). Сопряжение телекамеры 7 с микроскопом осуществляется через оптический адаптер 33, устанавливаемый на отдельном канале микроскопа.

Для уменьшения габаритов телекамеры, устанавливаемой на микроскопе, основная часть электронной схемы телекамеры внесена в отдельный блок сопряжения 8, который выполнен в виде отдельной платы, размещенной в отдельном кожухе размером 175 · 135 · 30 мм, с входным и выходным разъемами для соединения с телекамерой и интерфейсной платой компьютера.

В качестве компьютера 9 может быть применен IBM PC- совместимый персональный компьютер, в котором должно быть:
- наличие VGA или SVGA адаптера и дисплея;
- наличие двух свободных слот;
- наличие одного свободного разъема разрядной ниши ISA;
- объем ОЗУ не менее 1 Мб;
- операционная система MS DOS 3,0 и выше;
- наличие одного накопителя на жестком и одного на мягком диске;
- тип процессора 286, 386, 486 и выше;
- программное обеспечение.

Интерфейсная плата 10 питания привода и управления сканирующим столиком имеет ножевой разъем для установки в свободный слот материнской платы компьютера. Габариты платы 200 · 98 · 28 мм. Сканирующий столик подключается к плате через 31 - контактный разъем. В верхней части платы размещен 4-контактный разъем для подключения внутренней системы питания компьютера. Дополнительные регулировки элементов платы при установке в компьютер не предусматриваются.

Интерфейсная плата 11 типа "Контраст-2" в составе PC Vision-2 имеет ножевой разъем для установки в свободный слот материнской платы IBM PC. Габариты 300 · 102 · 20 мм.

Внешние устройства подключаются к плате через 25-контактный разъем.

Дисплей 12 может быть выполнен на электроннолучевой трубке.

В качестве источника сине-фиолетового света 13 может быть применена ртутная лампа, например, ДРШ 100-2 или металло-галогенная лампа ДРИ-100.

Подвижная шторка 14 выполняется непрозрачной.

Коллектор 15 может быть выполнен из двух линз, например, асферических.

Теплопоглощающий фильтр 16 может быть встроенным или сменным и выполняется из цветного стекла, например, марки СЗС-24.

Полевая диафрагма 17 выполняется из непрозрачного материала черного цвета.

Селективный светофильтр 18 выполняется сменяемым из цветного стекла, например, марки ФС-1 или СС-15 и служит для выделения из спектра излучения спектральной области возбуждения люминесценции в сине-фиолетовой области спектра.

Отрицательная линза 19 выполнена из оптического стекла.

Отражатель 22 выполнен эллиптическим, формирующим сходящийся пучок источника света 13.

Тороидальные линзы 25 и 26 выполнены из оптического стекла.

Запирающий светофильтр 29 выполнен двухслойным из цветного стекла, например, марки ЖС-18 и ЖС-19.

Подвижное зеркало 30 выполняется непрозрачным.

Видеоадаптер 33 выполнен в виде окуляра.

Исследуемый объект 34 - мазок с ВИПБ, нанесен на предметное стекло.

Пример осуществления изобретения.

Установка автоматической диагностики ВИПБ содержит (фиг. 1) люминесцентный микроскоп 1, осветительную систему в отраженном 2 и проходящем свете 3, сканирующий по двум ортогональным координатам столик 4 микроскопа с окном, два шаговых электродвигателя 5 и 6, телекамеру 7, видеоадаптер 33, персональный компьютер 9, блок сопряжения 8, интерфейсную плату 10 питания шаговых двигателей 5 и 6 и управления столиком 4, интерфейсную плату 11 для управления телекамерой и ввода видеоизображений в компьютер и дисплей 12. Цитологический препарат 34 с анализируемыми ВИПБ размещается на предметном стекле предметного столика 4.

Осветительная система 2 в отраженном свете (по ходу распространения света) содержит последовательно установленные источник света 13, подвижную непрозрачную шторку 14, коллектор 15, теплопоглощающий светофильтр 16, полевую диафрагму 17, второй теплопоглощающий светофильтр 16, сменный селективный светофильтр 18 и дихроичное зеркало 20, установленное под углом 45^o к оптической оси системы 2, микрообъектив 21, установленный под углом 90^o к оптической оси системы 2, соосно ему установлен запирающий светофильтр 29, видеоадаптер 33 и объектив 32.

Осветительная система 3 в проходящем свете включает (по ходу распространения света) дуговой источник 13 света сине-фиолетовой области длин волн, отражатель 22, светоотделительную пластинку 23 с теплопропускающим (ТПП) дихроичным покрытием, установленную под углом 45^o к оптической оси источника света, отрицательную линзу 19, установленную под углом 90^o к оптической оси источника света 13, теплопоглощающий светофильтр 16, селективный светофильтр 24 из цветного стекла, тороидальную линзу 25, установленные соосно линзе 19, вторую светоотделительную пластинку 23 с дихроичным покрытием, установленную под углом 45^o к оптической оси тороидальной линзы 25, вторую тороидальную линзу 26, установленную под углом 90^o к оптической оси первой тороидальной линзы 25, и установленный соосно второй тороидальной линзе 26 конденсатор с входным 27 и выходным 28 зрачками под окном предметного столика 4.

Телекамера 7 установлена на микроскопе 1 соосно видеоадаптеру 33, выход которого через блок 8 сопряжения соединен с интерфейсной платой 11 управления телекамерой. Интерфейсная плата 11 установлена в свободном слоте компьютера 9.

Выход компьютера 9 соединен со входом дисплея 12.

Блок 10 управления электродвигателями выполнен в виде интерфейсной платы, установленной в свободном слоте компьютера 9, и электрически соединен с шаговыми электродвигателями 5 и 6, которые кинематически связаны с предметным столиком 4.

Свет, отраженный от люминесцентных микрообъектов препарата, проходит через дихроичное зеркало 20, запирающий светофильтр 29, при откинутом зеркале 30, проходит через видеоадаптер 33 и объектив 32 в телекамеру 7. С выхода телекамеры 7 сигнал через блок сопряжения 8 поступает на интерфейсную плату 11 для управления телекамерой и ввода видеоизображения в компьютер 9, а из него на вход дисплея 12. При визуальном наблюдении свет, отраженный от люминесцентных микрообъектов препарата, отражается от подвижного зеркала 30 и попадает в окуляр микроскопа 31.

Система визуального наблюдения микроскопа состоит из дихроичного зеркала 20, запирающего светофильтра 29, поворотного зеркала 30 и окуляра 31. Назначение светофильтра 29 - устранение света возбуждения в системе наблюдения люминесценции.

Систему телевизионного наблюдения образуют видеоадаптер 33, объектив 32 и CCD-матрица миниатюрной телекамеры 7. Система работает при выведенном из оптического тракта поворотном зеркале 30.

Предметный столик обеспечивает перемещение предметного стекла с препаратом на расстояния: продольное - 40 мм и поперечное - 20 мм. Шаг платформы 1 мкм. Вертикальное смещение платформы при сканировании меньше 5 мкм.

Техника приготовления мазка мокроты или другого биологического материала заключается в следующем.

Используемый материал (или посевной осадок) наносят на предметное стекло (ГОСТ 9284-59).

Стекла должны быть чистыми, предварительно хорошо обезжиренными смесью Никифорова в течение 24-х часов, не иметь трещин и царапин. Для исследования материала, не содержащего белок (промывные воды бронхов, моча), используют стекла с нанесенной белковой подложкой из яичного белка, сыворотки и т.д.

Препарат высушивают и фиксируют в сушильном шкафу при 75^oC в течение 2-х часов. Затем препарат окрашивают, заливая флурохромом, содержащим аурамин (1 : 1000) и родамин с ДКЭ (1 : 10000), на 60 мин. Расход красителя - до 2-х мл на одно стекло.

Далее мазок промывают дистиллированной водой, обесцвечивают 3-х %-ным солянокислым спиртом, приготовленным на 70%-ном этаноле, в течение 3 - 5 мин, вновь промывают дистиллированной водой и заливают гасителем фона (0,015% оксазин - цинк хлор) на 15 с.

Мазок промывают, высушивают на воздухе, после чего он готов к просмотру.

Работает установка автоматической диагностики следующим образом.

Приготовленный на предметном стекле препарат размещают на предметном столике люминесцентного микроскопа, освещают препарат осветителем с помощью светофильтра, вырезающего из ультрафиолетового спектра источника света сине-фиолетовую область - свет возбуждения люминесценции красителя (фиг. 1). Производят поиск ВИПБ при сканировании препарата в поле зрения микроскопа 1 по двум координатам с помощью предметного столика 4, приводимого в движение шаговыми электродвигателями 5 и 6 по заданной программе. Распознают и идентифицируют ВИПБ по характерной кривой люминесценции с помощью телекамеры 7, установленной на микроскопе через видеоадаптер 33, и компьютера 9, снабженного программой, обеспечивающей запись видеоизображения ВИПБ в его память и имеющего в памяти образы исследуемых возбудителей.

Сканирование препарата ведут программно по заданной траектории просмотра полей зрения с предварительным выбором шага сканирования, включая возможность возврата на поле зрения с зафиксированными в памяти компьютера ВИПБ с помощью предметного столика 4 на каждой из координат, управляемого от компьютера 9 через интерфейсную плату 10.

Основные операции диагностики, выбор последовательности и режима их осуществления задает оператор через меню пользователя и выполняются автоматически, под управлением программы-оболочки, включающей подпрограммы, каждая из которых обеспечивает циклическое выполнение операций сканирования, захвата и переноса видеоизображения каждого поля зрения в память компьютера, анализ, включающий поиск, распознавание и идентификацию ВИПБ по заданному алгоритму, накопление видеоизображения с обнаруженными ВИПБ в памяти компьютера с фиксацией координат поля зрения, выдачу информации о текущих результатах анализа на экран дисплея и принятия решения о порядке и режиме осуществления сканирующего цикла диагностики препарата.

Компьютерный поиск, распознавание и идентификацию ВИПБ осуществляют программно на базе алгоритма, основанного на построчном сканировании видеоизображения каждого поля зрения окном, характерный размер которого превышает максимальный размер паразита, с шагом, составляющим не более 0,5 от характерного размера окна, и сопоставляют пространственное распределение яркости выделения окном объектов с типовыми распределителями, полученными по результатам предварительного анализа изображений ВИПБ на различных стадиях их развития, идентифицированных специалистами-микробиологами, и занесенными в память компьютера.

Видеоизображения люминесцирующих ВИПБ, полученные с помощью телекамеры 7, установленной на люминесцентный микроскоп 1, передается в память персонального компьютера 9 и анализируется с целью обнаружения, распознавания и подсчета числа ВИПБ. Его оптические системы 2 и 3 позволяют работать раздельно как в отраженном, так и в проходящем свете, а также при смешанном освещении (фиг. 1).

При работе в отраженном свете используется осветительная система 2. В этом случае дуговой разряд источника света 13 с помощью двухлинзового коллектора 15, линзы 19 и светоделительной пластинки 20 проецируется в выходной зрачок объектива 21.

Из спектра излучения источника спектральная область возбуждения люминесценции выделяется с помощью сменных светофильтров 18. Теплопоглощающие светофильтры 16 (один встроенный и один сменный) предохраняют светофильтры 18 от нагрева. На светоделительной пластинке 20 нанесено дихроичное покрытие, которое отражает до 80% света в области возбуждения 400-440 нм и пропускает до 80% света в области люминесценции 520-700 нм.

Полевая диафрагма 17 линзой 19, светоделительной пластинкой 20 и объективом 21 проецируется в плоскость исследуемого препарата 34 с анализируемыми ВИПБ.

Работа в проходящем свете обеспечивается осветителем 3 в комплекте с конденсором светлого и темного поля типа ОИ-10. Коллиматор, выполненный в виде эллиптического отражателя 22 в сочетании с конфокально установленной линзой 19, формирует параллельный пучок света от источника 13, который телескопической системой, образованной двумя тороидальными линзами 25 и 26, преобразуется в кольцевой пучок, согласованный по размеру с входным зрачком 27 конденсора. Фокусировка конденсора в плоскость исследуемого препарата 34 обеспечивает его освещение с возможностью наблюдения в темном поле.

Выделение спектра возбуждения в данном случае осуществляется комбинацией светофильтров 18 и 24 и светоделительной пластинкой 23 с дихроичным покрытием.

Назначение светофильтра 29 - устранение света возбуждения в системе наблюдения люминесценции.

Сведения о модуле IBM PC и программном обеспечении следующие.

Модуль IBM PC - совместимого компьютера.

Коммерческий компьютер при работе в составе УДА дополнительно оснащается интерфейсными платами 10 и 11, устанавливаемыми в свободные слоты компьютера.

Программное обеспечение выполнено в виде оконного интерфейса, работающего в среде Norton Commander (рекомендованная версия 4.0).

Основные задачи, возложенные на программное обеспечение:
- ввод в память компьютера и оперативная визуализация на экране дисплея черно-белого изображения, переданного ТВК;
- запись на диск и чтение изображений с максимальным размером 248х200 пикселей в формате "один байт - один пиксель";
- регулировка параметров ввода изображения "ЭКСПОЗИЦИЯ", "ЯРКОСТЬ", КОНТРАСТ";
- выбор и фиксация фрагментов изображения задаваемого оператором размера;
- анализ яркости каждого пикселя, фрагмента и изображения в целом;
- определение и фиксация параметров, характеризующих объекты, выбранные оператором;
- ручное (пошаговое) и автоматическое сканирование препарата с помощью микроскопного столика;
- поиск объектов в фиксированных изображениях и в процессе сканирования;
- автоматическая запись на жесткий диск изображений с обнаруженными объектами в процессе сканирования препарата.

Работа программ идентификации возбудителей заболеваний заключается в следующем.

Головное меню программы располагается в виде строки в верхней части экрана и содержит следующие пункты: "РАБОТА", "ПРОСМОТР", "ФАЙЛ", "НАСТРОЙКА", "ДАННЫЕ", "ВЫХОД". При установке курсора на любой из пунктов меню и нажатии клавиши "ENTER" отрывается выбранное частное меню (фиг. 2).

Пункт головного меню "РАБОТА" включает в себя режим работы программ: "АВТОМАТИЧЕСКАЯ", "РУЧНАЯ", "ПОИСК В ТЕКУЩЕМ КАДРЕ", "ПЕРЕМЕЩЕНИЕ", "РУЧНОЙ ПРОГОН", "УСТАНОВКА НУЛЯ" И "СБРОС".

Настройку компьютера на работу с препаратом следует проводить в режиме "РУЧНАЯ" работа, в котором на экран монитора выводится изображение в реальном масштабе времени. При нажатии клавиши F2 происходит автоматическая настройка яркости и контраста изображения в соответствии с условиями, предложенными в пункте "НАСТРОЙКА". При необходимости возможна ручная коррекция этих параметров клавишами "Q"-"W" - для тонкой настройки яркости, "A"-"S" - для грубой настройки яркости, "Z"-"X" - для настройки контакта. С помощью клавиш "1"-"2" меняют экспозицию, клавиши "+" - "-" используют для изменения размеров выделенного фрагмента.

Справа от кадра на экране дисплея располагается служебная информация (фиг. 2), в т.ч.:
- координаты изображения в количестве шагов от начального положения сканирующего столика;
- экспозиция;
- яркость точно; - яркость грубо; - контраст;
- размер выбранного фрагмента в пикселях;
- уровень яркости изображения в целом;
- гистограмма яркости изображения;
- псевдоцветовая палитра гистограммы;
- правая и левая граница гистограммы в 64 градациях в соответствии с условиями, назначенными в меню "НАСТРОЙКА";
- повтор последних 4-х положений для фрагмента изображения.

Нажатие клавиш курсора используется для пошагового сканирования столика.

Выход из режима осуществляется нажатием клавиши "ESC".

В режиме "ПОИСК В ТЕКУЩЕМ КАДРЕ" проводится детальный анализ изображения. В частном случае, когда алгоритм анализа основан на выявлении в составе фрагментов изображения пикселей средней яркости, принадлежащих заданному диапазону яркости и условно названных "мезонами", а также пикселов, превышающих по яркости заданный уровень и названных "барионами", определяются границы диапазонов.

При первичном входе в этот режим после нажатия клавиши "ENTER" в правом нижнем углу экрана открывается таблица, сообщающая о размерах и площади анализируемого фрагмента препарата в пикселях, размерах и площади его ядра и периферии, текущих границах диапазона "мезонов" в 256 градациях, минимальном и максимальном числе "мезонов" в ядре и перевесе, т.е. минимально допустимой разности мезонов, содержащихся в ядре и на периферии, максимально допустимом числе "барионов". При повторном нажатии клавиши "ENTER" на экране дисплея в левом верхнем секторе выводится анализируемое изображение с рамкой для выделения фрагментов, перемещаемой стрелками курсора или цифровой клавиатуры; шаг перемещения увеличивается в 10 раз при нажатии клавиши "SHIFT". В правовом верхнем секторе сообщается о размерах изображения в целом, размерах и текущих координатах фрагмента. Здесь же даны два изображения фрагмента: в текущей палитре и бинаризованном виде, где белая окраска придана пикселям, принадлежащим классу "мезоны".

Под этими изображениями размещена служебная таблица, сообщающая о диапазоне градаций яркости, соответствующем "мезонам". Этот диапазон устанавливается согласно первому пункту субменю "ДАННЫЕ" с учетом автоматической подстройки под гистограмму данного изображения. В этой же таблице сообщается о количестве "мезонов" в центральной и периферийной части фрагмента и их разности.

В нижней части экрана расположена гистограмма яркости в 256 градациях изображения в целом и текущего фрагмента. При нажатии клавиши F8 происходит перестройка изображения в соответствии с палитрой, размещенной под гистограммой изображения. В частности, при F8=Rule4 изображение в целом бинаризуется относительно "мезонов". Нажатие клавиши F3 позволяет изменять диапазон "мезонов", при этом клавиша "TAB" определяет, какая граница диапазона должна меняться, а стрелки курсора определяют направление изменения.

Выход из режима осуществляется нажатием клавиши "ENTER" при необходимости сохранения нового диапазона мезонов или клавиши "ESCAPE" в противном случае.

Режимы "ПЕРЕМЕЩЕНИЕ" и "РУЧНОЙ ПРОГОН" используются для автоматического и пошагового выхода на изображение с заданными координатами без визуализации текущих изображений.

Основным пунктом меню является "АВТОМАТИЧЕСКАЯ РАБОТА". Перед включением этого режима необходимо войти в режим "УСТАНОВКА НУЛЯ". В режиме "АВТОМАТИЧЕСКАЯ РАБОТА" будет выполнен анализ на наличие объектов с определенными параметрами в N х M кадров, где N и M - число шагов по обеим координатам плоскости, задаваемое в режиме "НАСТРОЙКА". Каждый кадр, содержащий изображение возбудителей (ВИПБ), записывается на жесткий диск. Работа данного пункта меню заканчивается высвечиванием на экране дисплея информации об уровне паразитемии рассматриваемого препарата.

Пункт головного меню "ПРОСМОТР" выводит на экран текущее изображение, находящееся в ОЗУ, независимо от того, получено оно непосредственно с ТВК, из памяти (с диска) или является продуктом режима "ПОИСК В ТЕКУЩЕМ КАДРЕ". Так же как и в режиме "РУЧНАЯ РАБОТА", справа от изображения располагается служебная информация, за исключением первых пяти пунктов, начиная с размера выбранного фрагмента.

Пункт головного меню - "ФАЙЛ" включает режимы записи и воспроизведение изображений при обмене с накопителем.

Пункт головного меню - "НАСТРОЙКА" разбит на четыре функциональных блока.

Первый блок определяет язык общения с оператором, информирует о параметрах ввода изображений и допускает их изменение при установке курсора на соответствующую строку и нажатии клавиши "ENTER". При выборе значений параметров следует иметь в виду, что
- яркость и контраст устанавливается программой автоматически;
- экспозиция 40 мс является оптимальной для работы ТВК и может изменяться в широких пределах в специальных случаях;
- отступы позволяют совместить центр изображения на экране с центром визуального изображения;
- максимальный размер изображения на экране 246 х 200 пикселей.

Второй блок определяет условия автоматической настройки программы на оптимальное восприятие изображения и корректировку параметров выделения объектов по отклонению яркости и контраста текущего изображения и анализируемого фрагмента от начально заданных;
- границы гистограммы (по шкале "a") выбираются из условия наиболее благоприятного восприятия изображения;
- минимальная ширина гистограммы (по шкале "a") исключает периферийные узкие участки гистограммы из рассмотрения в процессе автоматической настройки яркости и контраста;
- минимальный запас уровня "мезонов" (по шкале "b") устанавливает минимальное расстояние между верхней границей гистограммы изображения и нижней границей диапазона "мезонов";
- максимальное превышение яркости рамки в % исключает из анализа на содержание возбудителей фрагменты, яркость которых выше средней яркости всего изображения на указанную величину;
- минимальная и максимальная яркости (по шкале "b") ограничивают возможный рабочий диапазон яркостей для сокращения времени автоматической настройки;
- минимальная и максимальная контрастности (0 - 15) обеспечивают сокращение времени автоматической настройки.

Третий блок определяет режим сканирования столика:
- задержка необходима для успокоения вибрации после перемещения сканирующего столика на заданный шаг;
- выбор шага перемещения зависит от используемого увеличения оптической системы, например, 130 мкм соответствует оптическому увеличению микроскопа х 400;
- поле перемещения по X и Y в количестве шагов задается оператором;
- начальный отступ определяет количество шагов холостого прогона для работы в автоматическом режиме на "свежем" препарате.

Остальные пункты этого блока устанавливаются специалистами при настройке установки.

В четвертом блоке находится служебная вспомогательная информация:
- псевдоцвет изображения в режимах "РУЧНАЯ РАБОТА" и "ПРОСМОТР" позволяет оценивать равномерность освещенности наблюдаемого поля и проводить необходимую юстировку осветителей;
- путь по умолчанию определяет директория для записи изображения в режиме работы "АВТОМАТИЧЕСКАЯ";
- при значении "алгоритм анализа" - "1" сканирование в автоматическом режиме завершается при обнаружении первого возбудителя, а в случае "2" - идет непрерывно до окончания сканирования заданной поверхности препарата;
- размер квадратного окна (анализируемого фрагмента, рамки) в пикселях зависит от увеличения оптической системы; значение этого размера, установленное оператором в режимах "РУЧНАЯ" работа и "ПРОСМОТР" переносится в эту графу автоматически, например, 12 пикселей - оптимальный размер для увеличения микроскопа х400;
- максимальное число "особенностей" ограничивает возможное число зарегистрированных возбудителей в одном кадре;
- последний пункт блока предлагает расставлять или не расставлять рамки вокруг обнаруженных возбудителей как в ручном, так и в автоматическом режиме работы.

Пункт головного меню - "ДАННЫЕ" определяет значения параметров, по которым ведется поиск и выделяется объект. Информация, необходимая для заполнения таблицы "ПАРАМЕТРЫ":
- границы диапазона "мезонов" задаются по шкале "b" и их значения в таблице в процессе анализа изображения не изменяются, т.е. могут отличаться от рабочих значений режима "ПОИСК В ТЕКУЩЕМ КАДРЕ";
- максимальное и минимальное содержание "мезонов" в ядре фрагментов дано в процентах от площади ядра;
- разность числа "мезонов" в ядре и на периферии фрагмента дана в пикселях;
- минимальный шаг перемещения фрагментов по изображению в один пиксель дает качественный анализ изображения; для существенного увеличения скорости анализа шаг можно увеличить, но он должен быть менее половины линейного размера фрагмента;
- при выводе на экран результатов анализа текущего изображения после окончания анализа на экран выводится список обнаруженных возбудителей с указанием их координат и "перевеса" (dir); список ограничен числом, указанным в пункте "МАКС. ЧИСЛО ОСОБЕННОСТЕЙ", если возбудителей меньше этого числа, список дополняется объектами, похожими на возбудителей без указания порядкового номера;
- если в пункте "КОЛИЧЕСТВО ПУСКОВ KISHI" установлен 0, работа в режиме "ПОИСК В ТЕКУЩЕМ КАДРЕ" проводится без исключения аналитического окна и корректировки параметров;
- предварительная обработка изображений медианным фильтром позволяет устранить мелкие "шумы";
- псевдоцвет позволяет визуально оценивать равномерность яркости в аналитическом окне;
- нижняя граница диапазона "барионов" дана по шкале "a";
- содержание "барионов" в фрагменте задается в процентах от площади фрагмента.

Формула изобретения

1. Способ диагностики возбудителя инфекционных и паразитарных болезней в исследуемом препарате, состоящий в приготовлении окрашенного видеоспецифичным флуоресцентным красителем стандартного препарата, размещении его на предметном стекле предметного столика люминесцентного микроскопа, освещении препарата источником, пригодным для возбуждения люминесценции красителя, поиска возбудителей инфекционных и паразитарных болезней при сканировании препарата в поле зрения микроскопа, распознавании и идентификации по характерной картине люминесценции, отличающийся тем, что сканирование осуществляют предметным столиком с последующей телевизионной разверткой микроизображений по двум координатам, а распознавание и идентификацию возбудителей инфекционных и паразитарных болезней ведут с помощью телевизионной камеры, сопряженной с микроскопом через видеоадаптер, и компьютера, причем компьютерный поиск, распознавание и идентификацию возбудителей инфекционных и паразитарных болезней осуществляют по программе на базе алгоритма, основанного на построчном сканировании видеоизображения каждого поля зрения окном, характерный размер которого превышает максимальный размер возбудителей инфекционных и паразитарных болезней, и сопоставлении пространственного распределения яркости выделенных окном объектов с типовыми распределениями, полученными по результатам предварительного анализа изображений возбудителей инфекционных и паразитарных болезней на различных стадиях развития, идентифицированных специалистами-микробиологами, и занесенными в память компьютера при настройке.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что сканирование ведут программно по заданной траектории просмотра полей зрения с предварительным выбором шага сканирования не более 0,5 характерного размера окна, включая возможность возврата на поле зрения с зафиксированными в памяти компьютера изображениями возбудителей инфекционных и паразитарных болезней с помощью предметного столика, управляемого от компьютера, по каждой из координат.

3. Способ по пп.1 и 2, отличающийся тем, что основные операции диагностики, выбор последовательности и режима их осуществления задает оператор через меню пользователя и они выполняются автоматически под управлением программы-оболочки, включающей подпрограммы, каждая из которых обеспечивает циклическое выполнение операций сканирования, захвата и переноса видеоизображения каждого поля зрения в память компьютера, анализ, включающий поиск, распознавание и идентификацию возбудителей инфекционных и паразитарных болезней по заданному алгоритму, накопление видеоизображений с обнаруженными возбудителями инфекционных и паразитарных болезней в памяти компьютера с фиксацией координат поля зрения, выдачу информации о текущих результатах анализа на экран дисплея и принятия решения о порядке и режиме осуществления следующего цикла диагностики препарата.

4. Установка диагностики возбудителей инфекционных и паразитарных болезней, содержащая люминесцентный микроскоп с осветительной системой в отраженном свете, сканирующий предметный столик, блок управления электродвигателем, электродвигатель, кинематически связанный с предметным столиком и электрически соединенный с блоком управления, последовательно установленные селективный светофильтр, дихроичное зеркало с запирающий светофильтр, отличающаяся тем, что в нее введены осветительная система для люминесцентной темнопольной подсветки препарата в проходящем свете, телевизионная камера, дисплей, персональный компьютер, блок сопряжения, интерфейсная плата управления телекамерой, второй электродвигатель, кинематически связанный с предметным столиком, а электрически соединенный с блоком управления, причем электродвигатели выполнены шаговыми, блок управления электродвигателями выполнен в виде интерфейсной платы, телевизионная камера установлена на микроскопе, кроме того, сканирующий столик выполнен со сквозным окном, выход телевизионной камеры через блок сопряжения соединен с интерфейсной платой управления телекамерой, а выход компьютера - с дисплеем.

5. Установка по п. 4, отличающаяся тем, что осветительная система для люминесцентной темнопольной подсветки препарата в проходящем свете включает дуговой источник света синефиолетовой области длин волн, отражатель, светоделительную пластинку с дихроичным покрытием, отрицательную линзу, теплопоглощающий фильтр, тороидальную линзу, вторую светоделительную пластинку с теплопропускающим дихроичным покрытием, вторую тороидальную линзу и конденсор темно-светлого поля с входным и выходным зрачками, установленными последовательно по направлению распространения света.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2