Способ получения водорастворимого фитоэкстракта, обладающего противовирусной активностью

 

Изобретение относится к медицине, а именно к химико-фармацевтической промышленности. Вещество с противовирусной активностью получают из растения курильского чая кустарникового (пятилистника кустарникового, Pentaphylloides fruticosa (L. ) O. Schwarz) путем экстрагирования данного вещества водой. Изобретение позволяет упростить процесс, повысить выход продукта и использовать его в виде инъекций. 4 з.п.ф-лы, 4 табл.

Изобретение относится к медицине, а именно к химико-фармацевтической промышленности.

Известен способ получения вещества, обладающего противовирусной активностью, из курильского чая кустарникового путем выделения фитоэкстракта из сырья 75%-ным спиртом при соотношении растительного сырья и экстрагента 1:10 соответственно. Экстракция производится до получения бесцветной порции растворителя. Затем экстракт сгущают на ротационном испарителе до полного удаления спирта, трехкратно обрабатывают водный остаток хлороформом для удаления смолообразных веществ, упаривают очищенный от смол экстракт в вакуум-сушильном шкафу и сушат до сыпучего состояния. Полученный полифенольный комплекс обладает противовирусной и иммуностимулирующей активностью (патент РФ 2072865 на "Способ получения вещества, обладающего противовирусной и иммуностимулирующей активностью" авторов Грека О.Р., Волхонской Т.А., Триль В. М. , Письмеровой С.О., Яворовской В.Е., Евстропова А.Н., Аристова И.В., Николина Е.Р., Колесниковой О.П., Козлова В.А. - прототип).

Однако предложенный способ является трудоемким, дорогостоящим и требует использования вредных растворителей, например хлороформа. Полученный сухой продукт слабо растворяется в воде, что затрудняет его использование для инъекций.

Известны способы получения из курильского чая кустарникового водорастворимых фитоэкстрактов (патент РФ 2043726, патент РФ 2053678), однако указанные способы относятся к чайной промышленности и касаются способов получения заменителей чая.

Сущность предлагаемого способа состоит в том, что вещество с противовирусной активностью получают из растения курильского чая кустарникового (пятилистника кустарникового, Pentaphylloides fruticosa (L.) O.Schwarz) путем экстрагирования данного вещества водой.

Способ осуществляется следующим образом. Облиственные побеги курильского чая (длиной, например, 15-20 см) заливают кипящей (99^o-100^o) питьевой водой при соотношении сырья и воды, например, 1 к 50 соответственно. Экстракцию проводят при помешивании, например, в течение часа при температуре воды выше 50^oС. Затем экстракт отделяют от сырья, например, фильтрацией; концентрируют, например, вакуумной сушкой до содержания сухого вещества в экстракте 25-30% и получают сухой порошок, например, сублимацией при температуре воздуха на входе, например, 160-145^oС и на выходе, например, 90-85^oС при скорости подачи концентрата, например, 2,5-3 л/ч.

Выход сухого вещества составляет до 15% по отношению к весу исходного сухого сырья.

Технический результат изобретения заключается в том, что предлагаемый способ получения вещества с противовирусной активностью из чая курильского является, по сравнению с прототипом, более простым и технологичным, более безопасным (т.к. не используется, например, хлороформ), более дешевым (т.к. в качестве растворителя может быть использована питьевая водопроводная вода), дает более высокий выход вещества. Противовирусное вещество, получаемое предлагаемым способом, является значительно менее токсичным по сравнению с противовирусным веществом, получаемым способом-прототипом, практически нетоксичным. Полученное вещество хорошо растворяется в воде, что делает возможным его использование в виде инъекций.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения с реализацией назначения Пример: 1 кг резаных сухих облиственных побегов курильского чая кустарникового помещают в емкость, заливают 50 л кипящей воды (100^oC) и проводят экстрагирование в течение 60 минут при помешивании. После фильтрации раствор концентрируют на вакуумном испарителе до содержания сухого вещества 30%. Затем концентрат подают на распылительную сушку при температуре воздуха на входе 160^oС, на выходе 90^oС, скорости подачи концентрата 3 л/ч.

Перед исследованием противовирусной активности полученного водорастворимого фитоэкстракта была определена токсичность испытуемого вещества (ИВ) для культуры клеток (КК), для чего к питательной среде Игла добавлялись уменьшающиеся дозы препарата, начиная с 5000 мкг/мл. Наблюдение за КК велось на продолжении 4 суток. За максимальную переносимую дозу (МПД) ИВ принималась его наибольшее количество, не вызывавшее дегенерацию КК.

Противовирусная активность препарата оценивалась по следующим методикам: а) метод предварительной адсорбции 100 ТЦД50 вируса (титр цитопатического действия вируса в 50% взятых в опыт флаконах с КК) в течение часа при 37^oС с последующей отмывкой КК и внесением различных доз ИВ; б) метод предварительной обработки КК различными количествами ИВ в течение 24 часов с последующим внесением 100 ТЦД50 вируса. Данный метод позволяет получить сведения о возможности использовать противовирусное вещество с профилактической целью; в) метод определения вирулицидного действия препарата путем контакта ИВ и 100 ТЦД50 вируса в течение 1 часа при комнатной температуре с последующим внесением в КК, который позволяет получить сведения о возможности воздействия препарата на внеклеточные вирионы. Наблюдение проводилось в течение 72 часов. Отсутствие цитопатического действия в опыте при наличии его в контроле позволяло считать испытуемое соединение активным в данной концентрации.

В каждом случае определялась величина химиотерапевтического индекса (ХТИ), равная отношению МПД к ИД50 - минимальной ингибирующей дозе, при которой выживает 50% клеток. Активность препарата определялась величиной ХТИ, равной 4 и выше.

Также определялись величины снижения инфекционного титра вируса по сравнению с контрольным 5,5 lg ТЦД 50/0,1 мл для разных доз ИВ. Доза препарата, снижавшая титр вируса на 1,5 lg и более, считалась эффективной.

Противовирусную активность определяли по отношению к тест-вирусам, в качестве которых использовали вирусы Коксаки группы В (KB) 1-6 типов. Исследования были проведены в КК Нер-2.

В результате установлено, что МПД ИВ для КК составляет 1500 мкг/мл, что указывает на его низкую токсичность.

Внесение препарата в КК, спустя 1 час после внесения вируса, подавляло его репродукцию в ИД50 31,25 мкг/мл для вирусов КВ1, КВ2, КВ3 и в дозе 62,5 мкг/мл для вирусов КВ4, КВ5, КВ6. После контакта ИВ и вируса в течение часа с последующим внесением в КК, ИД50 составила 15,6 мкг/мл для KB1, 31,25 мкг/мл для КВ3 и 62,5 мкг/мл для КВ2, КВ4, КВ5 и КВ6. При внесении вируса через 24 часа после обработки КК препаратом ИД50 составила 31,25 мкг/мл для KB1, КВ2, КВ3, КВ4, КВ5 и 62,5 мкг/мг для КВ6. Исходя из полученных результатов были определены значения величин химиотерапевтического индекса, свидетельствующие о выраженной противовирусной активности ИВ (таблица 1).

Эффективные значения снижения инфекционного титра вируса показаны: в методике предадсорбции вируса для всех KB вирусов в дозах 62,5 и 31,25 мкг/мл и для KB 1-3 в дозе 15,6 мкг/мл; в методике предобработки у всех KB вирусов снижался титр при использовании ИВ в дозе 62,5 мкг/мл и у КВ2, КВ4 и КВ5 - в 31,25 мкг/мл; при оценке вирулицидного действия препарата снижение титра отмечалось у всех KB вирусов при использовании 62,5 и 31,25 мкг/мл ИВ и у КВ1 и КВ3 - в 15,6 мкг/мл. Полученные результаты приведены в таблицах 2-4.

Предлагаемый способ дает более высокий выход вещества (15%) по сравнению с прототипом (12%).

Получаемое данным способом вещество обладает меньшей токсичностью по сравнению с веществом, получаемым способом-прототипом. Так, в прототипе максимально переносимая доза составляла 62,5 мкг/мл (по отношению к культуре клеток Л-41), а для предлагаемого способа МПД равна 1500 мкг/мл (по отношению к культуре клеток Нер-2). Несмотря на неидентичность штаммов культуры клеток, использованных в опытах по определению токсичности вещества, различие в величине МПД столь велико (1500 против 62,5), что оно позволяет сделать вывод о значительно меньшей токсичности вещества, полученного предлагаемым способом.

Сравнение противовирусной активности вещества, получаемых предлагаемым способом и прототипом, может быть проведено в отношении вирусов Коксаки ВЗ, сведения по которым имеются в прототипе. Соотношение величин минимальных ингибирующих доз, полученных по методу предварительной адсорбции вирусов (31,24 - в предлагаемом способе, 62,5 - в прототипе), а также значений ХТИ (48 в предлагаемом способе, 4 - в прототипе) показывают более высокую лечебную противовирусную активность вещества, получаемого предлагаемым способом.

Формула изобретения

1. Способ получения вещества с противовирусной активностью из Pentaphylloides fruticosa (L.) O.Schwarz (курильского чая кустарникового) путем экстракции его водой.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что экстракцию начинают при температуре воды 100^o и проводят при температуре выше 50^oС.

3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что фильтрат концентрируют и сушат сублимацией при температуре воздуха на входе 160-145^oС, на выходе 90-85^oС.

4. Способ по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что получают вещество, эффективное против энтеровирусов.

5. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что получают вещество, эффективное против вирусов Коксаки.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4