Модифицированный ген bacillus thuringiensis для борьбы с чешуекрылыми насекомыми в растениях

 

Изобретение относится к генной инженерии и может быть использовано в селекции растений. Растение трансформируют, вводя в его геном нуклеиновую кислоту, кодирующую токсичный для насекомых белок из Bacillus thuringiensis. Устойчивость растения к насекомым повышается за счет того, что нуклеиновую кислоту синтезируют, подбирая предпочтительные для растения кодоны нуклеотидов. 8 с. и 22 з.п.ф-лы, 22 табл., 11 ил.

Текст описания в факсимильном виде (см. графическую часть)н

Формула изобретения

1. Оптимизированная для растений нуклеотидная последовательность, эффективная для кодирования инсектицидного кристаллического белка (ICP), содержащая кодоны, эффективные для кодирования ICP с примерно 589-619 аминокислотами, причем эта оптимизированная для растений нуклеотидная последовательность приблизительно на 71% гомологична нативной нуклеотидной последовательности Bacillus thuringiensis, кодирующей ICP, и приблизительно на 63% гомологична нуклеотидным последовательностям кукурузы, причем использование кодонов в оптимизированной для растений нуклеотидной последовательности имеет отклонение от использования кодонов клеткой растения-хозяина приблизительно 0,23-3,48.

2. Оптимизированная для растений нуклеотидная последовательность по п.1, где использование кодонов в оптимизированной для растений нуклеотидной последовательности имеет отклонение от использования кодонов клеткой растения-хозяина примерно 1,075.

3. Оптимизированная для растений нуклеотидная последовательность по п.1, где оптимизированная для растений нуклеотидная последовательность представляет собой SEQ ID №1.

4. Синтетическая генная конструкция, способная экспрессироваться в клетках растений, содержащая в последовательности от 5' к 3' промоторную последовательность, эффективную для инициации транскрипции в клетках растений; трансляционную энхансерную последовательность; оптимизированную для растений нуклеотидную последовательность, кодирующую ICP с примерно 589-619 аминокислотами, причем эта оптимизированная для растений нуклеотидная последовательность приблизительно на 71% гомологична нативной нуклеотидной последовательности Bacillus thuringiensis, кодирующей ICP, и приблизительно на 63% гомологична нуклеотидной последовательности кукурузы, и причем использование кодонов в оптимизированной для растений нуклеотидной последовательности имеет отклонение от использования кодонов клеткой растения-хозяина, приблизительно, 0,23-3,48; и последовательность полиаденилирования, причем вышеупомянутые промоторная последовательность, трансляционная энхансерная последовательность, оптимизированная для растений нуклеотидная последовательность и последовательность полиаденидирования оперативно связаны.

5. Синтетическая генная конструкция по п.4, где использование кодонов в оптимизированной для растений нуклеотидной последовательности имеет отклонение от использования кодонов клеткой растения-хозяина примерно 1,075.

6. Синтетическая генная конструкция по п.4, где промотор выбран из группы, состоящей из индуцируемых промоторов, конститутивных промоторов, временно-регулируемых промоторов, регулируемых стадией развития промоторов, тканепредпочтительных и тканеспецифичных промоторов.

7. Синтетическая генная конструкция по п.4, где промотор является промотором 35S CaMV.

8. Синтетическая генная конструкция по п.4, где трансляционный энхансер представляет собой интрон кукурузы.

9. Синтетическая генная конструкция по п.4, где синтетическая генная конструкция представляет собой SEQ ID №1.

10. Синтетическая генная конструкция по п.8, где интрон кукурузы представляет собой интрон 1 или интрон 6 Adhl.S.

11. Оптимизированная для растений нуклеотидная последовательность согласно п.1, находящаяся в трансгенном растении кукурузы, клетки которого трансформированы названной последовательностью, причем названная последовательность эффективна в кодировании инсектицидного белка (ICP) и эта нуклеотидная последовательность содержит кодоны, эффективные для кодирования ICP с примерно 589-619 аминокислотами, и, кроме того, эта последовательность, приблизительно на 71% гомологична нативной нуклеотидной последовательности Bacillus thuringiensis, кодирующей IPC, и приблизительно на 63% гомологична нуклеотидным последовательностям кукурузы, причем использование кодонов в оптимизированной для растений нуклеотидной последовательности имеет среднее отклонение от использования кодонов клеткой растения-хозяина приблизительно 0,23-3,48.

12. Оптимизированная для растений нуклеотидная последовательность по п.11, где использование кодонов в оптимизированной для растений нуклеотидной последовательности имеет среднее отклонение от использования кодонов клеткой растения-хозяина примерно 1,075.

13. Оптимизированная для растений нуклеотидная последовательность по п.11, где указанная последовательность представляет собой SEQ ID №1.

14. Оптимизированная для растений нуклеотидная последовательность согласно п.1, находящаяся в семени растения, имеющего в своем геноме наследуемый синтетический ген, причем этот синтетический ген содержит оптимизированную для растений нуклеотидную последовательность, эффективную для кодирования инсектицидного кристаллического белка (ICP), где эта нуклеотидная последовательность содержит кодоны, эффективные для кодирования ICP с примерно 589-619 аминокислотами, и эта оптимизированная для растений нуклеотидная последовательность приблизительно на 71% гомологична нативной нуклеотидной последовательности Bacillus thuringiensis, кодирующей ICP, и приблизительно на 63% гомологична нуклеотидным последовательностям кукурузы, причем использование кодонов в оптимизированной для растений нуклеотидной последовательности имеет среднее отклонение от использования кодонов клеткой растения-хозяина приблизительно 1,075.

15. Оптимизированная для растений нуклеотидная последовательность по п.14, где указанная последовательность представляет собой SEQ ID №1.

16. Способ конструирования специфической оптимизированной для кукурузы последовательности инсектицидного гена, предусматривающий a) определение процентной частоты нуклеиновых кислот в кодирующей последовательности (последовательностях) гена для нативного инсектицидного белка; b) образование ДНК-последовательности обратной трансляцией аминокислотной последовательности (последовательностей), причем полученная обратнотранслированная кодирующая последовательность (последовательности) гена кодирует те же самые аминокислоты, которые находятся в нативном инсектицидном белке, но нуклеиновые кислоты, кодирующие эти аминокислоты, заменены первыми предпочтительными последовательностями кодонов в кукурузе; c) модификацию последовательности ДНК, полученной в стадии b), путем идентификации и замены нуклеиновых кислот предпочтительными кодонами второго и третьего выбора кукурузы, причем кодоны, которые заменяются, элиминируют один или несколько из следующих элементов цепи: сайты рестриктаз, 5'-границы сплайсинга экзон:интрон, сигналы присоединения поли А, сигналы терминации РНК-полимеразы или дублеты ТА или GC; и d) модификацию последовательности ДНК, полученной на стадии с), путем идентификации блоков последовательностей G или С, которые имеют более четырех остатков, которые являются одинаковыми, и замены G или С другим нуклеотидом так, что эти блоки прерываются отличающейся нуклеотидной последовательностью таким образом, что белок, кодируемый этой последовательностью, является неизмененным.

17. Способ по п.16, где нативный инсектицидный белок получен из Bacillus thurngiensis.

18. Способ по п.17, где белок представляет собой токсин, продуцируемый Bacillus thuringiensis, и этот токсин представляет собой HD73.

19. Способ по п.18, где HD73 представляет собой HD73 СrуlА(с).

20. Ген ICP, идентифицированный в виде SEQ ID №1.

21. Ген ICP по п.20, где этот ген ICP встроен в вектор pDAB 917.

22. Специфическая оптимизированная для кукурузы последовательность инсектицидного гена, полученная согласно способу по п.16, где эта последовательность гена содержит примерно 63% кодонов первого выбора, примерно 22-37% кодонов второго выбора и примерно 15-0% кодонов третьего и/или кодонов четвертого выбора, причем общий процент равен 100%.

23. Специфическая оптимизированная для кукурузы последовательность инсектицидного гена по п.22, где эта последовательность гена содержит примерно 63% кодонов первого выбора, примерно 22-37% кодонов второго выбора и примерно 15-0% кодонов третьего выбора, причем общий процент равен 100%.

24. Специфическая оптимизированная для кукурузы последовательность инсектицидного гена по п.22, где эта последовательность гена содержит примерно 63% кодонов первого выбора, по меньшей мере, примерно 22% кодонов второго выбора, примерно 7,5% кодонов третьего выбора и примерно 7,5% кодонов четвертого выбора, причем общий процент равен 100%.

25. Синтетическая генная конструкция по п.4, взаимное расположение промотора и трансляционного энхансера в которой представлена на фиг.10.

26. Рекомбинантный промотор, содержащий SEQ ID №43.

27. Рекомбинантный промотор, содержащий SEQ ID №46.

28. Оптимизированная для растений нуклеотидная последовательность по п.1, находящаяся в трансгенном растении, содержащем рекомбинантный промотор, описанный в SEQ ID №43, и экспрессируемый в растении структурный ген, помещенный 3' относительно этого промотора так, что этот структурный ген экспрессируется под контролем этого промотора.

29. Оптимизированная для растений нуклеотидная последовательность по п.28, где растение является однодольным растением.

30. Оптимизированная для растений нуклеотидная последовательность по п.28, где растение является двудольным растением.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10, Рисунок 11, Рисунок 12, Рисунок 13, Рисунок 14, Рисунок 15, Рисунок 16, Рисунок 17, Рисунок 18, Рисунок 19, Рисунок 20, Рисунок 21, Рисунок 22, Рисунок 23, Рисунок 24, Рисунок 25, Рисунок 26, Рисунок 27, Рисунок 28, Рисунок 29, Рисунок 30, Рисунок 31, Рисунок 32, Рисунок 33, Рисунок 34, Рисунок 35, Рисунок 36, Рисунок 37, Рисунок 38, Рисунок 39, Рисунок 40, Рисунок 41, Рисунок 42, Рисунок 43, Рисунок 44, Рисунок 45, Рисунок 46, Рисунок 47, Рисунок 48, Рисунок 49, Рисунок 50, Рисунок 51, Рисунок 52, Рисунок 53, Рисунок 54, Рисунок 55, Рисунок 56, Рисунок 57, Рисунок 58, Рисунок 59, Рисунок 60, Рисунок 61, Рисунок 62, Рисунок 63, Рисунок 64, Рисунок 65, Рисунок 66, Рисунок 67, Рисунок 68, Рисунок 69, Рисунок 70, Рисунок 71, Рисунок 72, Рисунок 73, Рисунок 74, Рисунок 75, Рисунок 76, Рисунок 77, Рисунок 78, Рисунок 79, Рисунок 80, Рисунок 81, Рисунок 82, Рисунок 83, Рисунок 84, Рисунок 85, Рисунок 86, Рисунок 87, Рисунок 88, Рисунок 89, Рисунок 90, Рисунок 91, Рисунок 92, Рисунок 93, Рисунок 94, Рисунок 95, Рисунок 96, Рисунок 97, Рисунок 98, Рисунок 99, Рисунок 100, Рисунок 101, Рисунок 102, Рисунок 103, Рисунок 104, Рисунок 105, Рисунок 106, Рисунок 107, Рисунок 108, Рисунок 109, Рисунок 110, Рисунок 111, Рисунок 112, Рисунок 113, Рисунок 114, Рисунок 115, Рисунок 116, Рисунок 117, Рисунок 118, Рисунок 119, Рисунок 120, Рисунок 121, Рисунок 122, Рисунок 123, Рисунок 124, Рисунок 125, Рисунок 126, Рисунок 127, Рисунок 128, Рисунок 129, Рисунок 130, Рисунок 131, Рисунок 132, Рисунок 133, Рисунок 134, Рисунок 135, Рисунок 136, Рисунок 137, Рисунок 138, Рисунок 139, Рисунок 140, Рисунок 141, Рисунок 142, Рисунок 143, Рисунок 144, Рисунок 145, Рисунок 146