Хладоограждающий раствор для замораживания лейкоцитов при субумеренно-низкой температуре

 

Изобретение относится к физиологии и медицине, касается создания хладоограждающего раствора для замораживания лейкоцитов и сохранения их в физиологически активном состоянии после оттаивания. Хладоограждающий раствор для замораживания лейкоцитов в соотношении 1:1 при умеренно-низкой температуре и рН 7,0-7,4, содержащий гексаметиленбистетраоксиэтилмочевину и воду для инъекций, при этом замораживают лейкоциты до -20°С, а раствор дополнительно содержит оксиметилэтилпиридин сукцинат при следующем соотношении ингредиентов, %: гексаметиленбистетраоксиэтилмочевина 26,0-30,0, оксиметилэтилпиритдин сукцинат 0,1-0,2, вода для инъекций до 100 мл. Технический результат заявленного изобретения - хладоограждающий раствор при замораживании лейкоконцентрата до -20°С обеспечивает сохранность высокого процента физиологически активных лейкоцитарных клеток. 3 табл.

Изобретение относится к физиологии, медицине, а именно к созданию хладоограждающего раствора для замораживания лейкоцитов, в частности человека.

В качестве прототипа нами выбран криозащитный раствор для замораживания лейкоцитов [Патент 2184449 РФ. Криозащитный раствор для замораживания лейкоцитов при умеренно-низкой температуре // Сведенцов Е.П. и соавт., 2001], включающий гексаметиленбистетраоксиэтилмочевину, фумарат натрия, лимонную кислоту и воду.

Существенным недостатком прототипа является то, что фумарат натрия, примененный в растворе для криконсервирования лейкоцитов, не обладает мембраностабилизирующим действием, не восстанавливает нарушенные структуры и функции мембран, не тормозит процессы перекисного окисления липидов, а также указанный раствор для замораживания лейкоцитов до -20°С не использовался, т.к. этот способ не был разработан.

Техническим результатом настоящего изобретения является создание хладоограждающего раствора для замораживания лейкоцитов при температуре до -20°С.

Технический результат достигается тем, что раствор для замораживания лейкоцитов при субумеренно-низкой температуре (до -20°С), включающий криопротектор-гексаметиленбистетраоксиэтилмочевину (ГМБТОЭМ) и воду, дополнительно содержит оксиметилэтилпиридина сукцинат (ОМЭПС). Оксиметилэтилпиридина сукцинат (ОМЭПС) обладает антиоксидантным, мембраностабилизирующим действием, восстанавливает нарушенные структуры и функции мембран клеток, а также тормозит процессы перекисного окисления липидов, которые имеют место при криоконсервировании. Надо отметить, что сукцинат - производное янтарной кислоты [Мецлер Д. Биохимия. Химические реакции в живой клетке. Т.2. - М.: Мир, 1980. - с.317-319, с.321-322] участвуют в энергетическом обмене клетки, обеспечивающем ее жизнедеятельность, а пиридин - в нуклеиновом обмене [Герман А.С. Пиридин. Большая медицинская энциклопедия. - М., 1981. - Т.17. - с.1054-1055]. Хладоограждающий раствор имеет оптимальный для лейкоцитарных клеток рН среды 7,0-7,4. Все ингредиенты, примененные в данном растворе, тропны лейкоцитарным клеткам и производятся в Российской Федерации.

ПРИМЕР ИСПОЛЬЗОВАНИЯ СРЕДСТВА

Хладоограждающий раствор, содержащий ГМБТОЭМ в концентрации 28%, оксиметилэтилпиридина сукцинат - 0,15%, воду для инъекций до 100 мл и имеющий рН 7,0-7,4, смешивают в отношении 1:1 с концентратом лейкоцитов в полимерном контейнере “Компопласт”. Смесь, выдержав 20 мин при комнатной температуре, охлаждают по экспоненциальной программе в электрическом морозильнике в 4-литровой ванне с этиловым 96° спиртом, имеющим температуру -28°С, до -20°С в течение 9-14 минут. Затем замороженный лейкоконцентрат переносят в камеру электроморозильника, в которой температура -20°С. Термограмму записывают по термопаре, введенной в контейнер “Компопласт” с хладоограждающим раствором в конечной концентрации. Размораживание проводят в 20-литровой водяной ванне при температуре +38°С в течение 25-50 секунд при покачивании контейнера 3-4 раза в сек. Температура оттаянного лейкоконцентрата в контейнере должна быть в пределах от +2 до +4°С. Затем определяют морфологическую сохранность размороженных лейкоцитарных клеток, их жизнеспособность по витальному красителю (с 1%-ным раствором эозина) и фагоцитарную активность нейтрофилов в пробе с латексом (по Потаповой С.Г. и соавт.//Проблемы гематологии и переливания крови. - 1977. - N9. – с.58-59). Расчет выражают в процентах в сравнении с аналогичными показателями клеток до замораживания.

Экспериментальные исследования выполнены на базе лаборатории криофизиологии крови Института физиологии Коми НЦ УрО РАН и консервирования крови и тканей ГУ Кировского НИИ гематологии и переливания крови МЗ РФ.

Изучены три варианта хладоограждающих растворов для лейкоконцентрата, различающихся по концентрации входящих в них ингредиентов. Состав растворов представлен в таблице 1.

Конечная концентрация веществ, входящих в состав растворов N1, N2 и N3 после смешивания 1:1 с лейкоконцентратом, оказывалась в 2 раза ниже исходной (таблица 2), рН среды не изменялась, оставаясь в пределах 7,0-7,4.

При проведении исследований по введению лейкоцитов в холодовой анабиоз (-20°С) определена их морфологическая сохранность и функциональная активность (табл.3).

Биологическую полноценность лейкоцитов, прежде всего нейтрофилов, определяет их фагоцитарная активность. Этот тест, наиболее надежно характеризующий физиологические свойства клеток, был лучшим после замораживания - отогрева при использовании хладоограждающего раствора с оптимальным соотношением его ингредиентов.

Готовый оптимальный раствор прозрачен, с легким желтоватым оттенком, без запаха, рН 7,0-7,4, хорошо смешивается во всех соотношениях с лейкоцитным концентратом, не вызывает конгломерацию клеток и обеспечивает функциональную и морфологическую сохранность при положительной температуре до замораживания. Раствор проявляет выраженное хладоограждающее свойство при замораживании лейкоцитов по экспоненциальной программе с +20°С до -20°С.

Таким образом, разработанный хладоограждающий раствор при замораживании лейкоконцентрата до -20°С обеспечил сохранность высокого процента физиологически активных лейкоцитарных клеток. Он может быть применен в учреждениях медицинского профиля, где имеется необходимое холодильное оборудование.

Формула изобретения

Хладоограждающий раствор для замораживания лейкоцитов в соотношении 1:1 при умереннонизкой температуре и рН 7,0-7,4, содержащий гексаметиленбистетраоксиэтилмочевину и воду для инъекций, отличающийся тем, что замораживают лейкоциты до -20°С, а раствор дополнительно содержит оксиметилэтилпиридина сукцинат при следующем соотношении ингредиентов, %:

Гексаметиленбистетраоксиэтилмочевина 26,0-30,0

Оксиметилэтилпиридина сукцинат 0,1-0,2

Вода для инъекций До 100 мл