Иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты

Изобретение относится к области медицины, а именно к способу стимуляции иммунного ответа композициями иммуностимулирующих нуклеиновых кислот, композиции, содержащей олигонуклеотид, и к способу лечения или профилактики аллергии или астмы. Сущность изобретения состоит в том, что для стимуляции иммунного ответа вводят обогащенную тимидином нуклеиновую кислоту, содержащую последовательности поли-Т и/или содержащую более 60% нуклеотидных остатков тимидина. Техническим результатом является новый способ стимуляции иммунного ответа за счет введения предложенной иммуностимулирующей нуклеиновой кислоты. 3 н. и 24 з.п. ф-лы, 12 ил., 10 табл.

 

Предшествующий уровень техники

Бактериальная ДНК, но не ДНК позвоночных обладает иммуностимулирующими эффектами на мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) in vitro (Krieg et al., 1995). Бактериальная ДНК, но не ДНК позвоночных характеризуется иммуностимулирующими эффектами в отношении активации В-клеток и клеток-естественных киллеров (Tokunaga, Т., et al., 1988. Jpn. J. Cancer Res. 79: 682-686; Tokunaga, Т., et ai., 1984, JNCI 72: 955-962; Messina, J.P., et al., 1991, J.Immunol. 147: 1759-1764; и в обзоре Krieg, 1998, In: Applied Oligonucieotide Technology, C.A. Stein and A.M. Krieg, (Eds.), Jone Wiley and Sons, Inc., New York, NY, pp.431-448). Сейчас ясно, что данные иммуностимулирующие эффекты бактериальной ДНК являются результатом присутствия неметилированных CpG-динуклеотидов в особых контекстах оснований (мотивы CpG), которые обычны для бактериальной ДНК, но метилированы и недостаточно представлены (уменьшение CpG от 1/50 до 1/60) в ДНК позвоночных (Krieg et al, 1995 Nature 374: 546-549; Krieg, 1999 Biochim. Biophys. Acta 93321: 1-10). Иммуностимулирующие эффекты бактериальной ДНК могут быть смоделированы с помощью синтетических олигодезоксинуклеотидов (ОДН), содержащих данные CpG-мотивы. Представляется вероятным, что быстрая активация иммунной системы в ответ на CpG-ДНК может развиваться как один из компонентов природных иммунных защитных механизмов, которые узнают структурные характеристики, специфичные для молекул микробов.

ОДН CpG обладают сильными стимулирующими эффектами в отношении лейкоцитов человека и мыши, индуцируя пролиферацию почти всех (>95%) В-клеток, и увеличивают секрецию иммуноглобулинов (Ig); секрецию цитокинов; лизисную активность клеток-естественных киллеров (NK) и секрецию lFN-γ; и активацию дендритных клеток (DC) и других антиген-представляющих клеток в отношении экспрессии костимулирующих молекул и секреции цитокинов, особенно Th1-подобных цитокинов, которые важны для поддержки развития Th1-подобных ответов Т-клеток. Активация В-клеток под действием CpG-ДНК является независимой от Т-клеток и антигеннеспецифической. Однако активация В-клеток низкими концентрациями CpG-ДНК характеризуется выраженным синергизмом с сигналами, передаваемыми через антигенные рецепторы В-клеток, в отношении как пролиферации В-клеток, так и секреции Ig (Krieg et al., 1995). Данный выраженный синергизм между сигнальными путями В-клеток, триггером которых является антигенный рецептор В-клеток, и CpG-ДНК способствует развитию антигенспецифическимх иммунных ответов. В дополнение к их прямым эффектам на В-клетки CpG-ДНК также прямо активируют моноциты, макрофаги и дендритные клетки в отношении секреции цитокинов, включая высокие уровни ИЛ-12 (Klinman et al., 1996; Halpern et al., 1996; Cowdery et al., 1996). Данные цитокины стимулируют клетки-естественные киллеры (NK) для секреции интерферона гамма (IFN-γ) и увеличивают их лизисную активность (Klinman et al., 1996, выше; Cowdery et al., 1996, выше; Yamamota et al., 1992; Ballas et al., 1996). В общем CpG-ДНК индуцирует Th1-подобный характер продукции цитокинов с преобладанием ИЛ-12 и IFN-γ и с небольшой секрецией Th2-цитокинов (Klinman et al., 1996). Сильные прямые эффекты (независимые от Т-клеток) CpG-ДНК на В-клетки, также как индукция цитокинов, которые могут характеризоваться непрямыми эффектами на В-клетки через Т-хелперные пути, предполагает использование CpG-ДНК в форме ОДН в качестве адъюванта вакцины. (Смотри патентную заявку РСТ, публикация No.: WO 98/40100).

Данные иммуностимулирующие эффекты природного фосфодиэфирного остова CpG ОДН высокоспецифичны для CpG так, что эффекты практически исчезают, если мотив CpG метилирован, изменен на GpC или уничтожен или изменен другим путем (Krieg et al., 1995 Nature 374: 546-549; Hartmann et al, 1999 Proc. Natl. Acad. Sci USA 96: 9305-10). Фосфодиэфирные CpG ОДН могут быть заключены в пузырьки из липидов, квасцов или в пузырьки других типов со свойствами запасания или улучшенного захвата клетками для увеличения иммуностимулирующих эффектов (Yamamoto et al., 1994 Microbiol. Immunol. 38: 831-836; Gramzinski et al., 1998 Mol. Med. 4: 109-118).

В ранних исследованиях предполагалось, что иммуностимулирующий мотив CpG соответствует формуле пурин-пурин-СрG-пиримидин-пиримидин (Krieg et al., 1995 Nature 374: 546-549; Pisetsky, 1996 J. Immunol. 156: 421-423; Hacker et al., 1998 EMBO J. 17: 6230-6240; Lipford et al., 1998 Trends in Microbiol. 6:496-500). Однако сейчас ясно, что лимфоциты мыши вполне хорошо отвечают на фосфодиэфирные CpG-мотивы, которые не соответствуют данной "формуле" (Yi et al., 1998 J. Immunol. 160: 5898-5906), и то же самое справедливо для В-клеток человека и дендритных клеток (Hartmann et al., 1999 Proc. Natl. Acad. Sci USA 96: 9305-10; Liang, 1996 J. Clin. Invest. 98: 1119-1129).

Несколько исследователей в прошлом изучали, может ли содержание нуклеотидов в ОДН действовать независимо от последовательности ОДН. Интересно, что было обнаружено, что антисмысловые ОДН обычно обогащены GG, ССС, СС, САС и CG последовательностями, в то же время имея сниженную частоту нуклеотидных последовательностей ТТ или ТСС по сравнению с ожидаемым, если использование оснований было случайным (Smetsers et al., 1996 Antisense Nucleic Acid Drug Develop. 6: 63-67). Это увеличивает возможность того, что представленные в большем количестве последовательности могут содержать предпочтительные элементы, направленные на мишень в виде антисмысловых олигонуклеотидов, и наоборот. Одна из причин избегать применения тимидин-обогащенных ОДН для экспериментов по антисмысловым последовательностям заключается в том, что разрушение ОДН нуклеазами, присутствующими в клетках, ведет к высвобождению свободного тимидина, который конкурирует с ³H-тимидином, который часто применяют в экспериментах для оценки клеточной пролиферации (Matson et al., 1992 Antisense Research and Development 2:325-330).

Краткое изложение существа изобретения

Настоящее изобретение относится частично к обогащенным пиридином (Ру-обогащенным) и в некоторых осуществлениях к обогащенных тимидином (Т) иммуностимулирующим нуклеиновым кислотам, для которых не требуется присутствие CpG-мотива. Настоящее изобретение также относится частично к открытию того, что нуклеиновые кислоты, которые содержат TG-динуклеотидный мотив, также являются иммуностимулирующими. Изобретение частично основано на неожиданных данных о том, что последовательности нуклеиновых кислот, которые не содержат CpG-мотивы, являются иммуностимулирующими. При анализе иммуностимулирующих свойств многих последовательностей нуклеиновых кислот было открыто, что данные последовательности могут быть Ру-обогащенными, например Т-обогащенными, или они могут содержать TG-мотивы. Было также открыто, что данные последовательности предпочтительно активируют иммунные клетки животных, отличных от грызунов. Ру-обогащенные и TG-последовательности обладают только минимальными иммуностимулирующими свойствами в отношении иммунных клеток грызунов по сравнению с иммунными клетками животных, отличных от грызунов. Таким образом, возможно в соответствии со способами изобретения индуцировать иммунный ответ у субъекта, не являющегося грызуном, путем введения Ру-обогащенных или содержащих TG-мотивы иммуностимулирующих нуклеиновых кислот. Ру-обогащенные или содержащие TG-мотивы иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты согласно изобретению могут - необязательно - включать в себя CpG-мотивы. Эти данные имеют важное значение для развития клинического применения иммуностимулирующих содержащих CpG и не содержащих CpG нуклеиновых кислот.

В одном варианте изобретения предлагается фармацевтическая композиция, содержащая эффективное количество для стимуляции иммунного ответа выделенных Ру-обогащенных или содержащих TG-мотивы иммуностимулирующих нуклеиновых кислот и фармацевтически приемлемый носитель. В других вариантах изобретения предлагается композиция предмета изобретения, включающая в себя выделенную Ру-обогащенную или содержащую TG-мотивы иммуностимулирующую нуклеиновую кислоту. В других осуществлениях иммуностимулирующая нуклеиновая кислота может быть Т-обогащенной. Еще в одном аспекте иммуностимулирующая нуклеиновая кислота может быть Т-обогащенной и также иметь по меньшей мере один TG-мотив.

Предпочтительно Ру-обогащенная нуклеиновая кислота представляет собой Т-обогащенную нуклеиновую кислоту. В некоторых осуществлениях Т-обогащенная нуклеиновая кислота представляет собой поли-Т нуклеиновую кислоту, включающую в себя 5’ТТТТ3’. Еще в одном осуществлении поли-Т нуклеиновая кислота включает в себя в себя 5’Х₁Х₂ТТТТХ₃Х₄3’, где X₁, Х₂, Х₃ и Х₄ являются нуклеотидами. В некоторых осуществлениях X₁X₂ представляют собой ТТ и/или Х₃Х₄ представляют собой ТТ. В других осуществлениях X₁X₂ выбирают из группы, состоящей из ТА, TG, ТС, AT, АА, AG, АС, СТ, СС, СА, CG, GT, GG, GA и GC; и/или Х₃Х₄ выбирают из группы, состоящей из ТА, TG, ТС, AT, АА, AG, АС, СТ, СС, СА, CG, GT, GG, GA и GC.

Т-обогащенная иммуностимулирующая нуклеиновая кислота может иметь только один поли-Т-мотив или она может иметь множество поли-Т-мотивов нуклеиновой кислоты. В некоторых осуществлениях Т-обогащенная иммуностимулирующая нуклеиновая кислота включает в себя по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7 или по меньшей мере 8 Т-мотивов. В других осуществлениях она включает в себя по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7 или по меньшей мере 8 CpG-мотивов. В предпочтительных осуществлениях множество CpG-мотивов и поли-Т-мотивов рассеяно.

Еще в одном осуществлении по меньшей мере одно из множеств поли-Т-мотивов содержит по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6 по меньшей мере 7, по меньшей мере 8 или по меньшей мере 9 соприкасающихся Т-нуклеотидных остатка. В других осуществлениях множество поли-Т-мотивов представляет собой по меньшей мере 3 мотива и из данных по меньшей мере 3 мотивов, каждый включает в себя по меньшей мере 3 соприкасающихся Т-нуклеотидных остатка или множество поли-Т-мотивов представляет собой по меньшей мере 4 мотива и из данных по меньшей мере 4 мотивов, каждый включает в себя по меньшей мере 3 соприкасающихся Т-нуклеотидных остатка.

В некоторых случаях Т-обогащенная иммуностимулирующая нуклеиновая кислота может быть свободной от поли-Т-мотивов, но может предпочтительно включать в себя нуклеотидный состав с более чем 25% Т. В других осуществлениях Т-обогащенные иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты имеют поли-Т-мотивы и также включают в себя нуклеотидный состав с более чем 25% Т. В предпочтительных осуществлениях Т-обогащенная иммуностимулируюшая нуклеиновая кислота включает в себя нуклеотидный состав с более чем 35% Т, более чем 40% Т, более чем 50% Т, более чем 60% Т, более чем 80% Т или более чем 90% Т-нуклеотидных остатков. В важных осуществлениях нуклеиновая кислота имеет по меньшей мере 50% Т.

Т-обогащенные и иммуностимулирующие TG-нуклеиновые кислоты могут иметь любую длину, большую, чем 7 нуклеотидов, но в некоторых осуществлениях могут иметь между 8 и 100 нуклеотидными остатками в длину. В предпочтительных осуществлениях Т-обогащенная иммуностимулирующая нуклеиновая кислота включает в себя по меньшей мере 20 нуклеотидов, по меньшей мере 24 нуклеотида, по меньшей мере 27 нуклеотидов или по меньшей мере 30 нуклеотидов. В предпочтительных осуществлениях иммуностимулирующая TG-нуклеиновая кислота в длину составляет между 15 и 25 нуклеотидами. Т-обогащенная и иммуностимулирующие TG-нуклеиновые кислоты могут быть односпиральными и двуспиральными.

В одном предпочтительном осуществлении иммуностимулирующая нуклеиновая кислота имеет Т-обогащенную область, расположенную в середине ее длины (т.е. приблизительно равное количество нуклеотидов прилегает к Т-обогащенной области с 5’ и 3’ концов).

Т-обогащенную нуклеиновую кислоту в некоторых осуществлениях выбирают из группы, состоящей из SEQ ID NO: 59-63, 73-75, 142, 215, 226, 241, 267-269, 282, 301, 304, 330, 342, 358, 370-372, 393, 433, 471, 479, 486, 491, 497, 503, 556-558, 567, 694, 793-794, 797, 833, 852, 861, 867, 868, 882, 886, 905, 907, 908 и 910-913. В других осуществлениях Т-обогащенные нуклеиновые кислоты представляют собой последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 64, 98, 112, 146, 185, 204, 208, 214, 224, 233, 244, 246, 247, 258, 262, 263, 265, 270-273, 300, 305, 316, 317, 343, 344, 350, 352, 354, 374, 376, 392, 407, 411-413, 429-432, 434, 435, 443, 474, 475, 498-501, 518, 687, 692, 693, 804, 862, 883, 884, 888, 890 и 891.

В других осуществлениях Ру-обогащенная иммуностимулирующая нуклеиновая кислота представляет собой С-обогащенную нуклеиновую кислоту. Иммуностимулирующая С-обогащенная нуклеиновая кислота представляет собой нуклеиновую кислоту, содержащую по меньшей мере одну, и предпочтительно по меньшей мере 2 поли-С-области, или содержащую 50% или более С-нуклеотидов.

Ру-обогащенные и иммуностимулирующие TG-нуклеиновые кислоты могут включать в себя один или более CpG-мотивов. Мотивы могут быть метилированы или неметилированы. В других осуществлениях Ру-обогащенные и иммуностимулирующие TG-нуклеиновые кислоты свободны от одного или более CpG-динуклеотидов.

В других осуществлениях Ру-обогащенные и иммуностимулирующие TG-нуклеиновые кислоты также включают в себя поли-А, поли-G и/или поли-С мотивы. Еще в одном осуществлении Ру-обогащенная или иммуностимулирующая TG-нуклеиновая кислота свободна от двух поли-С-последовательностей из по меньшей мере 3 смежных С-нуклеотидных остатков или свободна от двух поли-А-последовательностей из по меньшей мере 3 соприкасающихся А-нуклеотидных остатков. В других осуществлениях Ру-обогащенная или иммуностимулирующая TG-нуклеиновая кислота имеет нуклеотидный состав из более чем 25% С или более чем 25% А. Еще в одном осуществлении Ру-обогащенная или иммуностимулирующая TG-нуклеиновая кислота свободна от поли-С-последовательностей, поли-С-последовательностей или поли-А-последовательностей.

Поли-G нуклеиновую кислоту в некоторых осуществлениях выбирают из группы, состоящей из SEQ ID NO: 5, 6, 73, 215, 267-269, 276, 282, 288, 297-299, 355, 359, 386, 387, 444, 476, 531, 557-559, 733, 768, 795, 796, 914-925, 928-931, 933-936 и 938. В других осуществлениях поли-G нуклеиновая кислота включает в себя последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 67, 80-82, 141, 147, 148, 173, 178, 183, 185, 214, 224, 264, 265, 315, 329, 434, 435, 475, 519, 521-524, 526, 527, 535, 554, 565, 609, 628, 660, 661, 662, 725, 767, 825, 856, 857, 876, 892, 909, 926, 927, 932 и 937.

В соответствии с другим вариантом изобретения иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты могут быть определены как таковые, обладающие TG-мотивом, их здесь обозначают как иммуностимулирующие TG-нуклеиновые кислоты. TG-нуклеиновая кислота в одном осуществлении содержит по меньшей мере один TG-динуклеотид, имеющий последовательность, включающую в себя по меньшей мере следующую формулу: 5’N₁X₁TGX₂N₂3’. В сходных осуществлениях N₁ представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, состоящую из количества нуклеотидов, колеблющегося в диапазоне от (11-N₂) до (21-N₂), и N₂ представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, состоящую из количества нуклеотидов, колеблющегося в диапазоне oт (11-N₂) до (21-N₁). В предпочтительном осуществлении X₂ представляет собой тимидин.

В других осуществлениях TG-нуклеиновая кислота имеет по меньшей мере следующую формулу: 5’X₁X₂TGX₃X₄3’. Еще в одном осуществлении TG-нуклеиновая кислота включает в себя следующую последовательность: 5’N₁X₁X₂TGX₃X₄N₂3’. В сходном осуществлении N₁ представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, состоящую из количества нуклеотидов, колеблющегося в диапазоне от (9-N₂) до (19-N₂), и N₂ представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, состоящую из количества нуклеотидов, колеблющегося в диапазоне от (9-N₁) до (19-N₁). В одном предпочтительном осуществлении Х₃ представляет собой тимидин. Х₁Х₂ представляют собой нуклеотиды, которые могут быть выбраны из группы, состоящей из GT, GG, GA, АА, AT, AG, СТ, СА, CG, ТА и ТТ, а Х₃Х₄ представляют собой нуклеотиды, которые могут быть выбраны из группы, состоящей из ТТ, СТ, AT, AG, CG, TC, АС, СС, ТА, АА и СА. В некоторых предпочтительных осуществлениях Х₃ представляет собой тимидин. В важных осуществлениях Х₃Х₄ представляют собой нуклеотиды, которые могут быть выбраны из группы, состоящей из ТТ, TC, ТА и TG. В другом осуществлении X₁X₂ представляют собой GA или GT, а Х₃Х₄ представляют собой ТТ. Еще в одном осуществлении X₁ или Х₂, или оба являются пуринами, а Х₃ или Х₄, или оба являются пиримидинами, или X₁X₂ представляют собой GpA, а Х₃ или Х₄, или оба они являются пиримидинами. В одном осуществлении X₂ представляет собой Т, а Х₃ является пиримидином.

В одном осуществлении 5’X₁X₂TGX₃X₁3’ последовательность TG-нуклеиновой кислоты либо TG-нуклеиновая кислота полной длины, либо ее некоторый фрагмент представляют собой непалиндромную последовательность, а в других осуществлениях - палиндромную последовательность.

В некоторых предпочтительных осуществлениях TG-нуклеиновая кислота является также Т-обогащенной.

Ру-обогащенные и иммуностимулирующие TG-нуклеиновые кислоты в некоторых осуществлениях имеют нуклеотидный остов, который включает в себя по меньшей мере одну модификацию остова, такую как фосфортиоатная модификация. Нуклеотидный остов может быть гибридным или предпочтительно нуклеотидный остов является полностью модифицированным. В одном предпочтительном осуществлении иммуностимулирующая нуклеиновая кислота имеет поли-Т-мотив и фосфортиоатный остов.

В другом варианте изобретение представляет собой композицию иммуностимулирующей нуклеиновой кислоты в форме Ру-обогащенной или иммуностимулирующей TG-нуклеиновой кислоты и антигена, где нуклеиновая кислота является свободной от неметилированных CpG-мотивов.

Другая композиция согласно изобретению представляет собой Ру-обогащенную или иммуностимулирующую TG-нуклеиновую кислоту и противомикробный агент, где Ру-обогащенная или TG-нуклеиновая кислота является свободной от неметилированных CpG-мотивов. Предпочтительно противомикробный агент выбирают из группы, состоящей из противовирусного агента, антипаразитарного агента, антибактериального агента и противогрибкового агента.

Композиция устройства с постоянным высвобождением, включающая в себя Ру-обогащенную и/или иммуностимулирующую TG-нуклеиновую кислоту, где Ру-обогащенная и/или TG-нуклеиновая кислота является свободной от неметилированных CpG-мотивов, предлагается в соответствии с другим вариантом изобретения.

Изобретение также включает в себя пищевые добавки Ру-обогащенной или иммуностимулирующей TG-нуклеиновой кислоты и устройство для доставки, выбранное из группы, состоящей из капсулы, пилюли и подъязычной таблетки, где Ру-обогащенная или TG-нуклеиновая кислота является свободной от неметилированных CpG-мотивов.

Должно быть понятно, что когда полезно вводить Ру-обогащенный, например поли-Т, Т-обогащенный, С-обогащенный или TG-олигонуклеотид и CpG-олигонуклеотид, может быть также желательным совместное введение Ру-обогащенного или TG-олигонуклеотида вместе с физически отдельным CpG, Py-обогащенным или TG-олигонуклеотидом. В противоположном варианте CpG, Ру-обогащенный или TG-мотив может присутствовать в одной и той же нуклеиновой кислоте в виде прилегающего Ру-обогащенного или TG-олигонуклеотида. Еще в одном осуществлении все или некоторые сочетания Ру-обогащенной, TG- и CpG-нуклеиновых кислот можно вводить совместно либо как отдельные нуклеиновые кислоты, либо в одной и той же молекуле нуклеиновой кислоты. Под совместным введением подразумевается, что нуклеиновые кислоты будут вводиться достаточно близко по времени одна к другой для достижения объединенного полезного действия обоих олигонуклеотидов, предпочтительно большего, чем полезное действие, достигаемое введением каждого из олигонуклеотидов по отдельности в той же дозе.

CpG-олигонуклеотиды имеют в целом формулу 5’X₁X₂CGX₃X₄3’, где X₁, X₂, Х₃ и Х₄ представляют собой нуклеотиды и где по меньшей мере С из CpG неметилирован. Предпочтительные CpG-олигонуклеотиды составляют 8-100 нуклеотидов в длину и имеют модифицированные остовы. Конкретные структуры подробно описаны в опубликованных заявках РСТ, заявках США и цитированных здесь ссылках, открытия которых включены здесь полностью. В одном осуществлении CpG-олигонуклеотид свободен от поли-Т и TG-мотивов и не является Т-обогащенным.

В других осуществлениях CpG-олигонуклеотид имеет последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: I, 3, 4, 14-16, 18-24, 28, 29, 33-46, 49, 50, 52-56, 58, 64-67, 69, 71, 72, 76-87, 90, 91, 93, 94, 96, 98, 102-124, 126-128, 131-133, 136-141, 146-150, 152-153, 155-171, 173-178, 180-186, 188-198, 201, 203-214, 216-220, 223, 224, 227-240, 242-256, 258, 260-265, 270-273, 275, 277-281, 286-287, 292, 295-296, 300, 302, 305-307, 309-312, 314-317, 320-327, 329, 335, 337-341, 343-352, 354, 357, 361-365, 367-369, 373-376, 378-385, 388-392, 394, 395, 399, 401-404, 406-426, 429-433, 434-437, 439, 441-443, 445, 447, 448, 450, 453-456, 460-464, 466-469, 472-475, 477, 478, 480, 483-485, 488, 489, 492, 493, 495-502, 504-505, 507-509, 511, 513-529, 532-541, 543-555, 564-566, 568-576, 578, 580, 599, 601-605, 607-611, 613-615, 617, 619-622, 625-646, 648-650, 653-664, 666-697, 699-706, 708, 709, 711-716, 718-732, 736, 737, 739-744, 746, 747, 749-761, 763, 766-767, 769, 772-779, 781-783, 785-786, 7900792, 798-799, 804-808, 810, 815, 817, 818, 820-832, 835-846, 849-850, 855-859, 862, 865, 872, 874-877, 879-881, 883-885, 888-904 и 909-913.

В другом осуществлении Ру-обогащенный или TG-олигонуклеотид свободен от CpG-мотивов. Данное осуществление изобретения также включает в себя фармацевтические композиции и наборы, которые содержат как CpG-олигонуклеотид (который может быть свободен от поли-Т и TG-мотивов и не является Т-обогащенным), так и Ру-обогащенный и/или TG-олигонуклеотид, физически отдельный от CpG-олигонуклеотида. Фармакологические препараты находятся в эффективных количествах и обычно включают в себя фармацевтически приемлемые носители - все, как здесь подробно объясняется, для Ру-обогащенных и TG-олигонуклеотидов. Наборы включают в себя по меньшей мере один контейнер, содержащий олигонуклеотид, который представляет собой Ру-обогащенный или TG-олигонуклеотид (или некоторые их сочетания). Тот же контейнер или в других осуществлениях второй контейнер может содержать олигонуклеотид с CpG-мотивом, который может быть свободен от Ру-обогащенного и/или TG-мотивов. Набор также содержит инструкции для введения олигонуклеотидов субъекту. Наборы также могут включать в себя контейнер, содержащий растворитель или разбавитель.

В целом, как здесь полностью цитируется, CpG-олигонуклеотид, физически отделенный от Ру-обогащенного или TG-олигонуклеотида, может быть применен совместно с Ру-обогащенным или TG-олигонуклеотидами в способах, композициях и продуктах, описанных выше.

Изобретение относится к другим аспектам иммуностимулирующих олигонуклеотидов, которые имеют химерные остовы и которые не требуют присутствия CpG-мотива. Изобретение частично основано на открытии того, что последовательности нуклеиновых кислот, которые не содержали CpG-мотивов, были иммуностимупирующими, и что те, которые имеют химерные остовы, обладают неожиданно увеличенными иммуностимулирующими свойствами. Таким образом, изобретение в одном варианте относится к составу олигонуклеотида, имеющего формулу: 5’Y₁N₁ZN₂Y₂3’, где Y₁ и Y₂ независимо друг от друга представляют собой молекулы нуклеиновых кислот, имеющие от 1 до 10 нуклеотидов, где Y₁ включает в себя по меньшей мере одну модифицированную межнуклеотидную связь, a Y₂ включает в себя по меньшей мере одну модифицированную межнуклеотидную связь, и где N₁ и N₂ представляют собой молекулы нуклеиновых кислот, которые независимо друг от друга имеют от 0 до 5 нуклеотидов, но где N₁ZN₂ имеет по меньшей мере 6 нуклеотидов в сумме, и где нуклеотиды N₁ZN₂ имеют фосфодиэфирный остов, и где Z представляет собой иммуностимулирующий мотив нуклеиновой кислоты, но не включает в себя CG. В одном осуществлении Z представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, выбранную из группы, состоящей из ТТТТ, TG, и последовательности, в которой по меньшей мере 50% оснований последовательности представляют собой Ts.

В некоторых осуществлениях Y₁ и/или Y₂ имеют от 3 до 8 нуклеотидов. В других осуществлениях Y₁ и/или Y₂ включают в себя по меньшей мере три Gs, по меньшей мере четыре Gs, по меньшей мере семь Gs или все Gs. В других осуществлениях Y₁ и/или Y₂ выбирают из группы, состоящей из TCGTCG, TCGTCGT и TCGTCGTT (SEQ ID NO:1145). Еще в одном осуществлении Y₁ и/или Y₂ включают в себя по меньшей мере одну, две, три, четыре или пять поли-А, поли-Т или поли-С-последовательности.

Центральные нуклеотиды (N₁ZN₂) формулы Y₁N₁ZN₂Y₂ имеют фосфодиэфирные межнуклеотидные связи, а Y₁ и Y₂ имеют по меньшей мере одну модифицированную межнуклеотидную связь. В некоторых осуществлениях Y₁ и/или Y₂ имеют по меньшей мере две модифицированные межнуклеотидные связи. В других осуществлениях Y₁ и/или Y₃ имеют от двух до пяти модифицированных межнуклеотидных связей. Еще в одном осуществлении Y₁ имеет две модифицированные межнуклеотидные связи, и Y₂ имеет пять модифицированных межнуклеотидных связей или Y₁ имеет пять модифицированных межнуклеотидных связей и Y₂ имеет две модифицированные межнуклеотидные связи. Модифицированная межнуклеотидная связь в некоторых осуществлениях представляет собой фосфортиоатную модифицированную связь, фосфордитиоатную модифицированную связь или п-этокси-модифицированную связь.

Части формулы Y₁N₁ZN₂Y₂ могут необязательно формировать палиндром. Таким образом, в некоторых осуществлениях нуклеотиды N₁ZN₂ образуют палиндром. В некоторых осуществлениях палиндром не представляет собой прямой повтор. Еще в одних осуществлениях нуклеотиды N₁ZN₂ не образуют палиндром.

В соответствии с другими осуществлениями N₁ZN₂ имеют последовательность нуклеотидов, выбранную из группы, состоящей из

GATTTTATCGTC (SEQ ID NO: 1098),

TCGATTTTTCGA (SEQ ID NO: 1099); TCATTTTTATGA (SEQ ID NO: 1100);

GTTTTTTACGAC (SEQ ID NO: 1101); TCAATTTTTTGA (SEQ ID NO: 1102);

ACGTTTTTACGT (SEQ ID NO: 1103); TCGTTTTTACGA (SEQ ID NO: 1104);

TCGATTTTTACGTCGA (SEQ ID NO: 1105); AATTTTTTAACGTT (SEQ ID NO:

1106); ТСGТTTTTTAACGA (SEQ ID NO: 1107); ACGTTTTTTAACGT (SEQ ID

NO: 1108); GATTTTTATCGTC (SEQ ID NO: 1109); GACGATTTTTCGTC (SEQ

ID NO: 1110); GATTTTAGCTCGTC (SEQ ID NO: 1111); GATTTTTACGTC

(SEQ ID NO: 1112); ATTTTATCGT (SEQ ID NO: 1113); AACGATTTTTCGTT

(SEQ ID NO: 1114); TCACTTTTGTGA (SEQ ID NO: 1115); TCGTATTTTA (SEQ ID NO: 1116); ACTTTTGTACCGGT (SEQ ID NO: 1117); TCGATTTTTCGACGTCGA (SEQ ID NO: 1118); ACGATTTTTCGT (SEQ ID NO: 1119); GATGATCGTC (SEQ ID NO: 1120); TCGATGTCGA (SEQ ID NO: 1121); TCATGTATGA (SEQ ID NO: 1122);

GTGTTACGAC (SEQ ID NO: 1123); TCAATGTTGA (SEQ ID NO: 1124);

ACGTGTACGT (SEQ ID NO: 1125); TCGTGTACGA (SEQ ID NO: 1126);

TCGATGTACGTCGA (SEQ ID NO: 1127); AATGTTAACGTT (SEQ ID NO:

1128);

TCGTGTTAACGA (SEQ ID NO: 1129); ACGTGTTAACGT (SEQ ID NO: 1130);

GATGTATCGTC (SEQ ID NO: 1131); GACGATGTCGTC (SEQ ID NO: 1132);

GATGAGCTCGTC (SEQ ID NO: 1133); GATGTACGTC (SEQ ID NO: 1134);

ATGATCGT (SEQ ID NO: 1135); AACGATGTCGTT (SEQ ID NO: 1136);

TCACTGGTGA (SEQ ID NO: 1137); TCGTATGA (SEQ ID NO: 1138);

ACTGGTACCGGT (SEQ ID NO: 1139); TCGATGTCGACGTCGA (SEQ ID NO:

1140); и ACGATGTCGT(SEQIDNO:1141).

Композиция может необязательно включать в себя фармацевтический носитель и/или может быть составлена в виде устройства для доставки. В некоторых осуществлениях устройство для доставки выбирают из группы, состоящей из катионных липидов, проникающих в клетку белков, и устройств с постоянным высвобождением. В одном предпочтительном осуществлении устройство с постоянным высвобождением представляет собой биодеградируемый полимер. В другом осуществлении устройство с постоянным высвобождением представляет собой микрочастицу.

В другом варианте в изобретении предлагается композиция иммуностимулирующего олигонуклеотида, имеющего формулу Y₁N₁ZN₂Y₂, и антигена.

Другая композиция согласно изобретению представляет собой иммуностимулирующий олигонуклеотид, имеющий формулу Y₁N₁ZN₂Y₂, и противомикробный терапевтический агент. Предпочтительно противомикробный терапевтический агент выбирают из группы, состоящей из противовирусного агента, антипаразитарного агента, антибактериального агента или противогрибкового агента.

Композиция устройства для постоянного высвобождения, включающая в себя иммуностимулирующий олигонуклеотид, имеющий формулу Y₁N₁ZN₂Y₂, предлагается в соответствии с другим вариантом изобретения.

Изобретение также включает в себя пищевые добавки иммуностимулирующего олигонуклеотида, имеющего формулу Y₁N₁ZN₂Y₂, в устройстве для доставки, выбранное из группы, состоящей из капсулы, подъязычной таблетки и пилюли.

В другом варианте композиции, описанные выше, также включают в себя иммуностимулирующую нуклеиновую кислоту, имеющую неметилированный CG-динуклеотид, TG-нуклеотид или Ру-обогащенную последовательность, где иммуностимулирующая нуклеиновая кислота, имеющая неметилированный CG-динуклеотид, TG-динуклеотид или Ру-обогащенную последовательность, имеет последовательность, отличную от олигонуклеотида, включающего в себя 5’Y₁N₁ZN₂Y₂3’.

В некоторых осуществлениях иммуностимулирующая нуклеиновая кислота, имеющая неметилированный CG-динуклеотид, TG-динуклеотид или Ру-обогащенную последовательность, имеет полностью фосфодиэфирный остов, и в других осуществлениях иммуностимулирующая нуклеиновая кислота, имеющая неметилированный CG-динуклеотид, TG-динуклеотид или Ру-обогащенную последовательность, имеет модифицированный остов, который необязательно может иметь межнуклеотидные связи, выбранные из группы, состоящей из фосфортиоата, фосфордитиоата и п-этокси.

В одном осуществлении иммуностимулирующая нуклеиновая кислота, имеющая неметилированный CG-динуклеотид, имеет формулу, включающую в себя 5’X₁X₂CGX₃X₄3’, где X₁, Х₂, Х₃ и Х₄ представляют собой нуклеотиды. В других осуществлениях последовательность иммуностимулирующей нуклеиновой кислоты включает в себя по меньшей мере следующую формулу:

5’TCNTX₁X₂CGX₃X₄3’, где N представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, состоящую приблизительно из 0-25 нуклеотидов, где по меньшей мере один нуклеотид имеет модифицированную межнуклеотидную связь и где нуклеиновая кислота имеет менее чем или ровно 100 нуклеотидов. В соответствии с некоторыми осуществлениями X₁X₂ представляют собой нуклеотиды, выбранные из группы, состоящей из GT, GG, GA и АА, а Х₃Х₄ представляют собой нуклеотиды, выбранные из группы, состоящей из ТТ, СТ или GT. В предпочтительном осуществлении X₁X₂ представляют собой GA, a Х₃Х₄ представляют собой ТТ.

В другом осуществлении последовательность иммуностимулирующей нуклеиновой кислоты, имеющая неметилированный CG-динуклеотид, включает в себя по меньшей мере одну из следующих последовательностей:

ATCGACTCTCGAGCGTTCTC (SEQ ID No. 15); TCCATGTCGGTCCTGCTGAT

(SEQ ID No. 32); TCCATGTCGGTZCTGATGCT (SEQ ID No. 31);

ATCGACTCTCGAGCGTTZTC (SEQ ID No. 18); TCCATGTCGGTCCTGATGCT

(SEQ ID No. 28); GGGGGG (SEQ ID No. 12); TCCATGACGGTCCTGATGCT

(SEQ ID No. 35); TCCATGGCGGTCCTGATGCT (SEQ ID No. 34);

TCCATGACGTTCCTGATGCT (SEQ ID No. 7); TCCATGTCGTTCCTGATGCT

(SEQ ID No. 38); GGGGTCAGTCTTGACGGGG (SEQ ID No. 41);

TCCATGTCGCTCCTGATGCT (SEQ ID No. 37); TCCATGTCGATCCTGATGCT

(SEQ ID No. 36); TCCATGCCGGTCCTGATGCT (SEQ ID No. 33);

TCCATAACGTTCCTGATGCT (SEQ ID No. 3); TCCATGACGTTCCTGATGCT

(SEQ ID No. 7); TCCATGACGTCCCTGATGCT (SEQ ID No 39);

TCCATCACGTGCCTGATGCT (SEQ ID No. 48); TCCATGACGTTCCTGACGTT

(SEQ ID No. 10); ATGACGTTCCTGACGTT (SEQ ID No. 70);

TCTCCCAGCGCGCGCCAT (SEQ ID No. 72); TCCATGTCGTTCCTGTCGTT

(SEQ ID No. 73); TCCATAGCGTTCCTAGCGTT (SEQ ID No. 74);

TCCTGACGTTCCTGACGTT (SEQ ID No. 76); TCCTGTCGTTCCTGTCGTT

(SEQ ID No. 77); TCCTGTCGTTCCTTGTCGTT (SEQ ID No. 52);

TCCTTGTCGTTCCTGTCGTT (SEQ ID No 121); TCCTGTCGTTTTTTGTCGTT

(SEQ ID No. 208); TCGTCGCTGTTGTCGTTTCTT (SEQ ID No. 120);

TCCATGCGTTGCGTTGCGTT (SEQ ID No. 81); TCCACGACGTTTTCGACGTT

(SEQ ID No. 82); TCGTCGTTGTCGTTGTCGTT (SEQ ID No. 47);

TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT (SEQ ID No. 46);

TCGTCGTTGTCGTTTTGTCGTT (SEQ ID No. 49);

GCGTGCGTTGTCGTTGTCGTT (SEQ ID No. 56);

TGTCGTTTGTCGTTTGTCGTT (SEQ ID No. 48);

TGTCGTTGTCGTTGTCGTTGTCGTT (SEQ ID No. 84);

TGTCGTTGTCGTTGTCGTT (SEQ ID No. 50); TCGTCGTCGTCGTT (SEQ ID No.

51); и TGTCGTTGTCGTT (SEQ ID No. 85).

В другом осуществлении иммуностимулирующая нуклеиновая кислота, имеющая Ру-обогащенную или TG-последовательность, представляет собой нуклеиновую кислоту, описанную выше.

В другом осуществлении изобретение относится к фармацевтическим композициям и наборам, которые содержат как олигонуклеотид, имеющий формулу Y₁N₁ZN₂Y₂, так и CpG-олигонуклеотид (который необязательно может быть свободен от поли-Т и TG-мотивов и не быть Ру-обогащенным), Ру-обогащенный и/или TG-олигонуклеотид, физически отдельные от олигонуклеотида, имеющего формулу Y₁N₁ZN₂Y₂. Фармацевтические препараты находятся в эффективных количествах и обычно включают в себя фармацевтически приемлемые носители, и все это здесь подробно объясняется. Наборы включают в себя по меньшей мере один контейнер, содержащий олигонуклеотид, который имеет формулу Y₁N₁ZN₂Y₂. Тот же контейнер или в других осуществлениях второй контейнер может содержать олигонуклеотид с CpG-мотивом, который необязательно может быть свободен от Ру-обогащенного и/или TG-мотивов, и/или Ру-обогащенный или TG-олигонуклеотид (или некоторое их сочетание). Набор также содержит инструкции для введения олигонуклеотидов субъекту. Наборы также могут включать в себя контейнер, содержащий растворитель или разбавитель.

В целом, как здесь полностью цитируется, олигонуклеотид, имеющий формулу Y₁N₁ZN₂Y₂, который физически отделен от CpG, Ру-обогащенного или TG-олигонуклеотида, может быть применен совместно с CpG, Ру-обогащенным или TG-олигонуклеотидами в описанных здесь способах, композициях и продуктах.

В другом варианте изобретение относится к фармацевтической композиции, включающей в себя по меньшей мере два олигонуклеотида согласно изобретению, где по меньшей мере два олигонуклеотида имеют отличные друг от друга последовательности, и фармацевтически приемлемый носитель.

В соответствии с другим вариантом изобретения предлагается состав вакцины. Вакцина включает в себя любую из композиций в сочетании с антигеном.

В соответствии с другим вариантом изобретения предлагается способ стимуляции иммунного ответа. Способ включает в себя введение Ру-обогащенной или иммуностимулирующей TG-нуклеиновой кислоты субъекту, не являющемуся грызуном, в количестве, эффективном для индукции иммунного ответа у субъекта, не являющегося грызуном. Предпочтительно Ру-обогащенную или иммуностимулирующую TG-нуклеиновую кислоту вводят перорально, местно, в устройстве с постоянным высвобождением, на слизистую поверхность, системно, парентерально или внутримышечно. Когда Ру-обогащенную или иммуностимупирующую TG-нуклеиновую кислоту вводят на слизистую поверхность, она должна быть доставлена в количестве, эффективном для индукции иммунного ответа в слизистой или системного иммунного ответа. В предпочтительных осуществлениях слизистую поверхность выбирают из группы, состоящей из поверхности ротовой полости, носовой полости, ректальной, влагалищной поверхности и поверхности глазной полости.

В некоторых осуществлениях способ включает в себя введение субъекту антигена, когда иммунный ответ является антиген-специфическим иммунным ответом. Антиген может кодироваться вектором нуклеиновой кислоты, который может доставляться субъекту. В некоторых осуществлениях антиген выбирают из группы, состоящей из опухолевого антигена, вирусного антигена, бактериального антигена, паразитарного антигена и пептидного антигена.

Ру-обогащенные и иммуностимулирующие TG-нуклеиновые кислоты способны вызывать широкий спектр иммунного ответа. Например, данные иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты могут быть применены для переключения иммунного ответа с Th2 на Th1. Ру-обогащенные и TG-нуклеиновые кислоты можно также применять для активации иммунной клетки, такой как лейкоцит, дендритная клетка и клетка NK. Активация может быть проведена in vivo, in vitro или ex vivo, т.е. путем выделения иммунной клетки у субъекта, контактирования иммунной клетки с эффективным количеством Ру-обогащенной или иммуностимулирующей TG-нуклеиновой кислоты для активации иммунной клетки и повторного введения активированной иммунной клетки субъекту. В некоторых осуществлениях дендритная клетка экспрессирует раковый антиген. Дендритная клетка может быть экспонирована с раковым антигеном ex vivo.

Иммунный ответ, вызываемый Ру-обогащенными или TG-нуклеиновыми кислотами, может также приводить к индукции продукции цитокинов, например продукции ИЛ-6, ИЛ-12, ИЛ-18, TNF, IFN-α и IFN-γ.

Еще в одном осуществлении Ру-обогащенные и TG-нуклеиновые кислоты полезны для лечения рака. Ру-обогащенные и TG-нуклеиновые кислоты в соответствии с другими вариантами изобретения полезны также в профилактике рака (например, снижении риска развития рака) у субъекта с риском развития рака. Рак может быть выбран из группы, состоящей из рака желчных путей, рака молочной железы, рака шейки матки, хориокарциномы, рака прямой кишки, рака эндометрия, рака желудка, внутриэпителиальных неоплазий, лейкозов, рака печени, рака легких (например, мелкоклеточного и немелкоклеточного), меланомы, нейробластом, рака ротовой полости, рака яичников, рака поджелудочной железы, рака простаты, ректального рака, сарком, рака щитовидной железы и рака почек, так же как и других карцином и сарком. В некоторых важных осуществлениях рак выбирают из группы, состоящей из рака костей, мозга и рака ЦНС, рака соединительной ткани, рака пищевода, рака глаз, лимфомы Ходжкина, рака гортани, рака ротовой полости, рака кожи и рака семенников.

Ру-обогащенные и TG-нуклеиновые кислоты можно также применять для увеличения ответа раковых клеток на терапию рака (например, противораковую терапию), необязательно когда Ру-обогащенную и иммуностимулирующую TG-нуклеиновую кислоту вводят в сочетании с противораковой терапией. Противораковая терапия может быть химиотерапией, вакцинацией (например, активированная in vitro вакцина дендритных клеток или вакцина ракового антигена) или терапией на основе антител. Данный последний вариант терапии может также включать в себя введение антитела, специфичного для антигена клеточной поверхности, например раковой клетки, когда иммунный ответ проявляется в виде антиген-зависимой клеточной цитотоксичности (ADCC). В одном осуществлении антитело может быть выбрано из группы, состоящей из рубитаксина, герцепина, квадрамета, панорекса, UDEC-Y2B8, ВЕС2, С225, онколима, SMART M195, ATRAGEN, оварекса, Bexxar, LDP-03, ior t6, MDX-210, MDX-11, MDX-22, OV103, 3622W94, анти-VEGF, зенапакса, MDX-220, MDX-447, MELIMMUNE-2, MELIMMUNE-1, CEACIDE, претаргета, NovoMAb-G2, TNT, Gliomab-H, GNI-250, EMD-72000, LymphoCide, CMA 676, монофарма-С, 4В5, ior egf.r3, ior c5, BABS, anti-FLK-2, MDX-260, ANA Ab, SMART 1D10 Ab, SMART ABL 364 Ab и ImmuRAIT-CEA.

Таким образом, в соответствии с некоторыми вариантами изобретения, субъекту, страдающему раком или имеющему риск развития рака, вводят иммуностимулирующую нуклеиновую кислоту и проводят противораковую терапию. В некоторых осуществлениях противораковую терапию выбирают из группы, состоящей из химиотерапевтического агента, иммунотерапевтического агента и противораковой вакцины. Химиотерапевтический агент может быть выбран из группы, состоящей из метотрексата, винкристина, адриамицина, цисплатина, не содержащих сахар хлорэтилнитрозомочевин, 5-фторурацила, митомицина С, блеомицина, доксорубицина, дакарбазина, таксола, фрагилина, мегламина GLA, валрубицина, кармустаина и полиферпозана, MMI270, BAY 12-9566, RAS ингибитора фамезилтрансферазы, ингибитора фамезилтрансферазы, ММР, MTA/LY231514, LУ264618/лометексола, гламолека, CI-994, TNP-470, гикамтина/топотекана, РКС412, валсподара/PSC833, новантрона/митроксантрона, метарета/сурамина, батимастата, Е7070, ВСН-4556, CS-682, 9-АС AG3340, AG3433, инцела/VХ-710, VX-853, ZD0101, ISI641, ОДН 698, ТА 2516/мармистата, ВВ2516/мармистата, CDP 845, D2163, PD183805, DX8951f, лемонала, DP 2202, FK 317, пицибанила/ОК-432, AD32/валрубицина, метастрона/производного стронция, темодала/темозоломида, эвацета/липосомального доксорубицина, ювтаксана/плацлитаксела, таксола/паклитаксела, кселоада/капецитабина, фуртулона/доксифлуридина, циклопакса/перорального паклитаксела, перорального таксоида, SPU-077/цисплатина, HMR 1275/флавопиридола, СР-358 (774)/EGFR, СР-609 (754)/ингибитора онкогена RAS, BMS-182751/пероральной платины, UFT(тегафура/урацила), эргамизола/левамизола, эниурацила/776С85/5FU усилителя, кампто/левамизола, камптозара/иринотекана, тумодекса/ралитрекседа, леустатина/кладрибина, паксекса/паклитаксела, доксила/липосомального доксорубицина, целикса/липосомального доксорубицина, флудара/флударабина, фармарубицина/эпирубицина, депоцита, ZD1839, LU 79553/бис-нафталимида, LU 103793/доластаина, цетикса/липосомального доксорубицина, гемзара/гемцитабина, ZD 0473/анормеда, YM 116, шариков иода, ингибиторов CDK4 и CDK2, ингибиторов PARP, D4809/дексифозамида, ифеса/меснекса/ифозамида, вумона/тенипозида, параплатина, карбоплатина, плантинола/цисплатина, вепезида/этопозида, ZD 9331, таксотера/доцетаксела, пролекарства гуанинарабинозида, аналога таксана, нитрозомочевин, алкилирующих агентов, таких как мелфелан и циклофосфамид, аминоглутетимида, аспарагиназы, бусульфана, карбоплатина, хлоромбуцила, цитарабина NCl, дактиномицина, даунорубицина НСl, натриевой соли эстрамустинфосфата, этопозида (VP16-213), флоксуридина, фторурацила (5-FU), флутамида, гидроксимочевины (гидроксикарбамида), ифосфамида, интерферона альфа-2а, альфа-2b, леупролида ацетата (аналога LHRH-рилизинг фактора), ломустина (CCNU), мехлорэтамина НСl (горчичного азота), меркаптопурина, месны, митотана (орто-пара’-DDD), митоксантрона НСl, октреотида, пликамицина, прокарбазина НСl, стрептозоцина, тамоксифена цитрата, тиогуанина, тиотепа, винбластина сульфата, амсакрина (m-AMSA), азацитидина, эртропоэтина, гексаметилмеламина (НММ), интерлейкина 2, митогуазона (метил-GAG; метилглиоксаль-бис-гуанилгидразона; MGBG), пентостатина (2’дезоксикоформицина), семустина (метил-CCNU), тенипозида (VM-26) и виндезина сульфата, но этим не ограничивающейся.

Иммунотерапевтический агент может быть выбран из группы, состоящей из рибутаксина, герцептина, квадрамета, панорекса, IDEC-Y2B8, ВЕС2, С225, онколима, SMART M195, ATRAGEN, оварекса, Bexxar, LDP-03, ior t6, MDX-210, MDX-11, MDX-22, OV103, 3622W94, анти-VEGF, зенапакса, MDX-220, MDX-447, MFLIMMUNE-2, MELIMMUNE-1, CEACIDE, претаргета, NovoMAb-G2, TNT, Gliomab-H, GNI-250, EMD-72000, лимфоцида, СМА 676, монофарма-С, 4В5, ior egf.r3, ior c5, BABS, анти-FLK-2, MDX-260, ANA Ab, SMART 1D10 Ab, SMART ABL 364 Ab и ImmuRAIT-CEA, но этим не ограничивающейся.

Противораковая вакцина может быть выбрана из группы, состоящей из EGF, антиидиотипических противораковых вакцин, антигена Gp75, меланомной вакцины GMK, вакцины конъюгата MGV ганглиозида, Her2/neu, оварекса, M-Vax, O-Vax, L-Vax, STn-KHL тератопа, BLP25 (MUC-1), липосомальной идиотипической вакцины, мелацина, вакцин пептидных антигенов, вакцин токсинов/антигенов, вакцины на основе MVA, PACIS, вакцины BCG, TA-HPV, TA-CIN, DISC-вируса и ImmuCyst/TheraCys, но этим не ограничивающейся.

Еще в одном осуществлении способов, направленных на профилактику или лечение рака, субъекту может быть дополнительно введен интерферон-α.

В других вариантах изобретение относится к способам профилактики заболевания у субъекта. Способ включает в себя регулярное введение субъекту Ру-обогащенной или иммуностимулирующей TG-нуклеиновой кислоты для поддержания ответа иммунной системы для профилактики заболевания у субъекта. Примеры заболеваний или состояний, которые стремятся предотвратить с применением способов профилактики согласно изобретению, включают в себя микробные инфекции (например, заболевания, передающиеся половым путем) и анафилактический шок от пищевой аллергии.

В других вариантах в изобретении предлагается способ индукции природного иммунного ответа путем введения субъекту Ру-обогащенной или иммуностимулирующей TG-нуклеиновой кислоты в количестве, эффективном для активации природного иммунного ответа.

В соответствии с другим вариантом изобретения предлагается способ лечения или профилактики вирусной или ретровирусной инфекции. Способ включает в себя введение субъекту, подверженному риску вирусной или ретровирусной инфекции или страдающему от нее, эффективного количества любой из композиций согласно изобретению для лечения или профилактики вирусной или ретровирусной инфекции. В некоторых осуществлениях вирусное заболевание вызывается вирусом гепатита, ВИЧ, гепатита В, гепатита С, вирусом герпеса или папилломавирусом.

В соответствии с другим вариантом изобретения предлагается способ лечения или профилактики бактериальной инфекции. Способ включает в себя введение субъекту, подверженному риску заболевания бактериальной инфекцией или страдающему от нее, эффективного количества любой из композиций согласно изобретению для лечения или профилактики бактериальной инфекции. В одном осуществлении бактериальная инфекция обусловливается внутриклеточными бактериями.

В другом варианте изобретения предлагается способ лечения или профилактики паразитарной инфекции с помощью введения субъекту, имеющему риск или страдающему от паразитарной инфекции, эффективного количества любой из композиций согласно изобретению для лечения или профилактики паразитарной инфекции. В одном осуществлении паразитарная инфекция обусловливается паразитом - не гельминтом.

В некоторых осуществлениях субъект является человеком, а в других осуществлениях субъект является позвоночным, не являющимся человеком, выбранным из группы, состоящей из собаки, кошки, лошади, коровы, свиньи, козы, рыбы, обезьяны, цыпленка и овцы.

Еще в одном варианте в изобретении предлагается способ лечения или профилактики астмы с помощью введения субъекту, имеющему риск или страдающему от астмы, эффективного количества любой из композиций согласно изобретению для лечения или профилактики астмы. В одном осуществлении астма является аллергической астмой.

В другом варианте изобретение относится к способу лечения или профилактики аллергии. Способ включает в себя введение субъекту, имеющему риск или страдающему от аллергии, эффективного количества любой из композиций согласно изобретению для лечения или профилактики аллергии.

В соответствии с другим вариантом изобретения, предлагается способ лечения или профилактики иммунодефицита. Способ включает в себя введение субъекту, имеющему риск или страдающему от иммунодефицита, эффективного количества любой из композиций согласно изобретению для лечения или профилактики иммунодефицита.

В другом варианте изобретение относится к способу индукции ТН1 иммунного ответа с помощью введения субъекту любой из композиций согласно изобретению в эффективном количестве для индукции ТН1 иммунного ответа.

В одном осуществлении способы согласно изобретению включают в себя введение олигонуклеотида, имеющего формулу 5’Y₁N₁ZN₂Y₂3’, и иммуностимулирующей нуклеиновой кислоты, имеющей неметилированный CG-динуклеотид, TG-динуклеотид или Т-обогащенную последовательность. В осуществлении олигонуклеотид, включающий в себя 5’Y₁N₁ZN₂Y₂3’, вводят отдельно от иммуностимулирующей нуклеиновой кислоты. В некоторых осуществлениях олигонуклеотид, включающий в себя 5’Y₁N₁ZN₂Y₂3’, и иммуностимулирующую нуклеиновую кислоту, вводят по очереди по неделе, а в других осуществлениях олигонуклеотид, включающий в себя 5’Y₁N₁ZN₂Y₂3’ и иммуностимулирующую нуклеиновую кислоту, вводят по очереди по две недели.

В другом варианте в изобретении предлагается композиция, включающая в себя иммуностимулирующую нуклеиновую кислоту и агент противораковой терапии, в составе с фармацевтически приемлемым носителем и в эффективном количестве для лечения рака или снижения риска развития рака. В важных осуществлениях иммуностимулирующую нуклеиновую кислоту выбирают из группы, состоящей из Т-обогащенной нуклеиновой кислоты, TG-нуклеиновой кислоты и С-обогащенной нуклеиновой кислоты.

В изобретении дополнительно предлагается набор, включающий в себя первый контейнер, содержащий иммуностимулирующую нуклеиновую кислоту и по меньшей мере еще один контейнер (например, второй контейнер), содержащий агент противораковой терапии, и инструкцию по применению. В одном осуществлении набор дополнительно включает в себя интерферон-α, который может быть включен отдельно еще в один контейнер (например, третий контейнер). В важном осуществлении набор включает в себя пузырьки с постоянным высвобождением, содержащие иммуностимулирующую нуклеиновую кислоту, и по меньшей мере один контейнер, содержащий агент противораковой терапии, и инструкцию по режиму введения агента противораковой терапии. Иммуностимулирующая нуклеиновая кислота может быть выбрана из группы, состоящей из Ру-обогащенной нуклеиновой кислоты, TG-нуклеиновой кислоты и CpG нуклеиновой кислоты, где CpG нуклеиновая кислота имеет последовательность нуклеотидов, включающую в себя SEQ ID NO: 246.

В изобретении дополнительно предлагается способ профилактики или лечения астмы или аллергии, включающий в себя введение иммуностимулирующей нуклеиновой кислоты и лекарства для лечения астмы/аллергии в количестве, эффективном для лечения или предотвращения астмы или аллергии. В важных осуществлениях иммуностимулирующую нуклеиновую кислоту выбирают из группы, состоящей из T-обогащенной нуклеиновой кислоты, TG-нуклеиновой кислоты и С-обогащенной нуклеиновой кислоты.

В одном осуществлении иммуностимулирующая нуклеиновая кислота представляет собой Т-обогащенную нуклеиновую кислоту. В относящихся к этому осуществлениях Т-обогащенная нуклеиновая кислота имеет последовательность нуклеотидов, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 59-63, 73-75, 142, 215, 226, 241, 267-269, 282, 301, 304, 330, 342, 358, 370-372, 393, 433, 471, 479, 486, 491, 497, 503, 556-558, 567, 694, 793-794, 797, 833, 852, 861, 867, 868, 882, 886, 905, 907, 908 и 910-913. В других осуществлениях Т-обогащенные нуклеиновые кислоты имеют последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 64, 98, 112, 146, 185, 204, 208, 214, 224, 233, 244, 246, 247, 258, 262, 263, 265, 270-273, 300, 305, 316, 317, 343, 344, 350, 352, 354, 374, 376, 392, 407, 411-413, 429-432, 434, 435, 443, 474, 475, 498-501, 518, 687, 692, 693, 804, 862, 883, 884, 888, 890 и 891.

В дополнительном относящемся к этому осуществлении Т-обогащенная нуклеиновая кислота не является TG-нуклеиновой кислотой. Еще в одном осуществлении Т-обогащенная нуклеиновая кислота не является CpG-нуклеиновой кислотой.

В одном осуществлении иммуностимулирующая нуклеиновая кислота представляет собой TG-нуклеиновую кислоту. В дополнительном, относящемся к этому осуществлении TG-нуклеиновая кислота не является Т-обогащенной нуклеиновой кислотой. В другом относящемся к этому осуществлении TG-нуклеиновая кислота не является CpG нуклеиновой кислотой.

В одном осуществлении иммуностимулирующая нуклеиновая кислота представляет собой CpG нуклеиновую кислоту, где CpG нуклеиновая кислота имеет последовательность нуклеотидов, включающую в себя SEQ ID NO: 246.

В другом осуществлении лекарство против астмы/аллергии представляет собой лекарство, выбранное из группы, состоящей из ингибитора PDE-4, бронходилататора/бета-2 агониста, лекарства для открытия К+ каналов, антагониста VLA-4, антагониста нейрокинина, ингибитора синтеза ТХА2, ксантанина, антагониста арахидоновой кислоты, ингибитора 5-липоксигеназы, антагониста рецептора тромбоксина А2, антагониста тромбоксана А2, ингибитора 5-липокс-активаторного белка и ингибитора протеазы, но не ограничивающейся этим. В некоторых важных осуществлениях лекарство против астмы/аллергии представляет собой бронходилататор/бета-2 агонист, выбранный из группы, состоящей из сальметерола, сальбутамола, тербуталина, D2522/формотерола, фенотерола и орципреналина.

В другом осуществлении лекарство против астмы/аллергии представляет собой лекарство, выбранное из группы, состоящей из антигистаминных препаратов и индукторов простагландинов. В одном осуществлении антигистамин выбирают из группы, состоящей из лоратидина, цетиризина, баклизина, аналогов цетеризина, фексофенадина, терфенадина, деслоратадина, норастемизола, эпинастина, эбастина, астемизола, левокабастина, азеластина, траниласта, терфенадина, мизоластина, бетатастина, CS 560 и HSR 609. В другом осуществлении индуктор простагландинов представляет собой S-5751.

Еще в одном осуществлении лекарство против астмы/аллергии выбирают из группы, состоящей из стероидов и иммуномодуляторов. Иммуномодуляторы могут быть выбраны из группы, состоящей из противовоспалительных агентов, антагонистов лейкотриенов, мутеинов ИЛ-4, растворимых рецепторов ИЛ-4, иммуносупрессантов, анти-ИЛ-4-антител, антагонистов ИЛ-4, анти-ИЛ-5-антител, растворимых рецепторов ИЛ-13-Fc гибридных белков, анти-ИЛ-9 антител, CCR3 антагонистов, CCR5 антагонистов, VLA-4 ингибиторов и негативных регуляторов IgE, но не ограничивающейся этим. В одном осуществлении негативным регулятором IgE является анти-IgE.

В другом осуществлении стероиды выбирают из группы, состоящей из беклометазона, флутиказона, трамцинолона, будесонида и будесонида. Еще в одном осуществлении иммуносупрессор представляет собой вакцину толерантного пептида.

В одном осуществлении иммуностимулирующую нуклеиновую кислоту вводят одновременно с лекарством против астмы/аллергии. В другом осуществлении субъект является субъектом с нарушением иммунной системы.

Иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты для введения субъекту в раскрытых здесь способах, относящихся к профилактике и лечению астмы/аллергии, являются такими, как описано для других методических аспектов изобретения.

В другом варианте в изобретении предлагается набор, включающий в себя первый контейнер, содержащий иммуностимулирующую нуклеиновую кислоту, и по меньшей мере другой контейнер (например, второй контейнер), содержащий лекарство против астмы/аллергии, и инструкции по применению. Иммуностимулирующая нуклеиновая кислота, используемая в наборе, представляет собой описанное здесь. В важных осуществлениях иммуностимулирующую нуклеиновую кислоту выбирают из группы, состоящей из Т-обогащенной нуклеиновой кислоты, TG-нуклеиновой кислоты и С-обогащенной нуклеиновой кислоты. В другом важном осуществлении набор включает в себя пузырьки с постоянным высвобождением, содержащие иммуностимулирующую нуклеиновую кислоту, и по меньшей мере один контейнер, содержащий лекарство против астмы/аллергии, и инструкции по режиму введения лекарства против астмы/аллергии. Лекарство против астмы/аллергии может быть выбрано из группы лекарств против астмы/аллергии, описанных в вышеизложенных способах, направленных на профилактику или лечение астмы/аллергии.

Еще в одном варианте в изобретении предлагается композиция, включающая в себя иммуностимулирующую нуклеиновую кислоту и лекарство против астмы/аллергии в составе с фармацевтически приемлемым носителем, в количестве, эффективном для профилактики или лечения иммунного ответа, связанного с экспозицией с посредником астмы или аллергии. Иммуностимулирующая нуклеиновая кислота может быть выбрана из группы иммуностимулирующих нуклеиновых кислот, описанных в изложенных выше способах и композициях. В важных осуществлениях иммуностимулирующую нуклеиновую кислоту выбирают из группы, состоящей из Т-обогащенной нуклеиновой кислоты, TG-нуклеиновой кислоты и С-обогащенной нуклеиновой кислоты. Лекарство против астмы/аллергии может быть выбрано из группы лекарств против астмы и лекарств против аллергии, описанных в изложенных выше способах и композициях.

Еще в одном варианте в изобретении предлагается композиция, включающая в себя иммуностимулирующую нуклеиновую кислоту, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 95-136, SEQ ID NO: 138-152, SEQ ID NO: 154-222, SEQ ID NO: 224-245, SEQ ID NO: 247-261, SEQ ID NO: 263-299, SEQ ID NO: 301, SEQ ID NO: 303-4109, SEQ ID NO: 414-420, SEQ ID NO: 424, SEQ ID NO: 426-947, SEQ ID NO: 959-1022, SEQ ID NO: 1024-1093, и фармацевтически приемлемый носитель. Предпочтительно иммуностимулирующая нуклеиновая кислота присутствует в композиции в эффективном количестве. В одном осуществлении иммуностимулирующая нуклеиновая кислота присутствует в эффективном количестве для индукции иммунного ответа. В другом осуществлении иммуностимулирующая нуклеиновая кислота присутствует в эффективном количестве для профилактики или лечения рака. Еще в одном осуществлении иммуностимулирующая нуклеиновая кислота присутствует в эффективном количестве для профилактики или лечения астмы/аллергии. В изобретении также предлагаются наборы, включающие в себя композиции любых описанных выше иммуностимулирующих нуклеиновых кислот и инструкции по их применению.

В другом варианте изобретение включает в себя композицию иммуностимулирующей нуклеиновой кислоты, состоящей по существу из 5’M₁TCGTCGTTM₂3’, где по меньшей мере один из С не метилирован, где M₁ представляет собой нуклеиновую кислоту, имеющую по меньшей мере один нуклеотид, где М₂ представляет собой нуклеиновую кислоту, имеющую от 0 до 50 нуклеотидов, и где иммуностимулирующая нуклеиновая кислота имеет менее 100 нуклеотидов.

Еще в одном варианте изобретение относится к фармацевтической композиции иммуностимулирующей нуклеиновой кислоты, включающей в себя: 5’TCGTCGTT3’, где по меньшей мере один из С не метилирован, где иммуностимулирующая нуклеиновая кислота имеет менее 100 нуклеотидов и фосфодиэфирный остов, и устройства для постоянного высвобождения. В некоторых осуществлениях устройство для постоянного высвобождения представляет собой микрочастицу. В других осуществлениях композиция включает в себя антиген.

Каждое из ограничений изобретения может охватывать различные аспекты изобретения. Следовательно, ожидается, что каждое из ограничений изобретения, включая любой элемент или сочетание элементов, может быть включено в каждый вариант изобретения.

Краткое описание фигур

Фигура 1А представляет собой гистограмму экспрессии CD86 (ось Y) CD19+ клетками после экспозиции данных клеток с олигонуклеотидами, представленными на оси X, в концентрации 0,15 мкг/мл.

Фигура 1В представляет собой таблицу с данными из фигуры 1А.

Фигура 1С представляет собой гистограмму экспрессии CD86 (ось Y) CD19+ клетками после экспозиции данных клеток с олигонуклеотидами, представленными на оси X, в концентрации 0,30 мкг/мл.

Фигура 1D представляет собой таблицу с данными из фигуры 1С.

Фигура 2 представляет собой график сравнения способности

ОДН 2137, ОДН 2177, ОДН 2200 и ОДН 2202 к стимуляции пролиферации В-клеток при концентрациях в диапазоне от 0,2 до 20 мкг/мл.

Фигура 3 представляет собой график сравнения способности ОДН 2188, ОДН 2189, ОДН 2190 и ОДН 2182 к стимуляции пролиферации В-клеток при концентрациях в диапазоне от 0,2 до 20 мкг/мл.

Фигура 4 представляет собой гистограмму, описывающую дозозависимую активацию В-клеток, вызываемую ОДН, не содержащими CpG. PBMC крови донора инкубировали с указанными концентрациями ОДН 2006 (SEQ ID NO.: 246), 2117 (SEQ ID NO.: 358), 2137 (SEQ ID NO.: 886), 5126 (SEQ ID NO.: 1058) и 5162 (SEQ ID NO.: 1094) и окрашивали mAb против CD19 (маркер В-клеток) и CD86 (маркер активированных В-клеток, В7-2). Экспрессию измеряли посредством проточной цитометрии.

Фигура 5 представляет собой гистограмму, описывающую стимуляцию В-клеток разнообразным набором ОДН, не содержащих CpG. PBMC крови одного репрезентативного донора стимулировали 0,4 мкг/мл, 1,0 мкг/мл или 10,0 мкг/мл следующих ОДН: 2006 (SEQ ID NO.: 246), 2196 (SEQ ID NO.: 913), 2194 (SEQ ID NO.: 911), 5162 (SEQ ID NO.: 1094) и 5163 (SEQ ID NO.: 1095), 5168 (SEQ ID NO.: 1096) и 5169 (SEQ ID NO.: 1097), и экспрессию маркера активации CD86 (В7-2) на CD19-позитивных В-клетках измеряли посредством проточной цитометрии.

Фигура 6 представляет собой гистограмму, описывающую активацию В-клеток, вызываемую ОДН 1982 и 2041, не содержащими CpG. PBMC инкубировали с указанными концентрациями ОДН 2006 (SEQ ID NO.: 246), 1982 (SEQ ID NO.: 225) и 2041 (SEQ ID NO.: 282), и активацию В-клеток (экспрессию маркера активации CD86) измеряли проточной цитометрией.

Фигура 7 представляет собой гистограмму, описывающую NK-клетки, активированные ОДН, не содержащими CpG. PBMC инкубировали с 6 мкг/мл следующих ОДН: ОДН 2006 (SEQ ID NO.: 246), 2117 (SEQ ID NO.: 358), 2137 (SEQ ID NO.: 886), 2183 (SEQ ID NO.: 433), 2194 (SEQ ID NO.: 911) и 5126 (SEQ ID NO.: 1058) и окрашивали mAb против CD3 (маркер Т-клеток), CD56 (маркер NK-клеток) и CD69 (маркер ранней активации). Экспрессию CD69 на CD56 позитивных NK-клетках измеряли посредством проточной цитометрии.

Фигура 8 представляет собой гистограмму, показывающую, что опосредуемая NK цитотоксичность увеличивается с помощью ОДН, не содержащих CpG. Опосредованный NK лизис клеток-мишеней К-562 измеряли после инкубации PBMC в течение ночи с 6 мкг/мл ОДН 2006 (SEQ ID NO.: 246), 2194 (SEQ ID NO.: 911) и 5126 (SEQ ID NO.: 1058).

Фигура 9 представляет собой гистограмму, показывающую, что NKT-клетки могут быть активированы ОДН, не содержащими CpG. PBMC одного репрезентативного донора инкубировали в присутствии 6 мкг/мл ОДН: 2006 (SEQ ID NO.: 246), 2117 (SEQ ID NO.: 358), 2137 (SEQ ID NO.: 886), 2183 (SEQ ID NO.: 433) и 2194 (SEQ ID NO.: 911) и 5126 (SEQ ID NO.: 1058) в течение 24 час и активацию NKT-клеток измеряли посредством проточной цитометрии после окрашивания клеток mAb против CD3 (маркер Т-клеток), CD56 (маркер NK-клеток) и CD69 (маркер ранней активации).

Фигура 10 представляет собой гистограмму, описывающую стимуляцию моноцитов различными ОДН, содержащими CpG и не содержащими CpG. PBMC инкубировали в присутствии 6 мкг/мл 2006 (SEQ ID NO.: 246), 2117 (SEQ ID NO.: 358), 2137 (SEQ ID NO.: 886), 2178 (SEQ ID NO.: 428), 2183 (SEQ ID NO.: 433), 2194 (SEQ ID NO.: 911), 5126 (SEQ ID NO.: 1058) и 5163 (SEQ ID NO.: 1095) и окрашивали на CD14 (маркер моноцитов) и CD80 (маркер активации, В7-1). Экспрессию измеряли посредством проточной цитометрии.

Фигура 11 представляет собой гистограмму, описывающую секреции TNFα при культивировании клеток человека с ОДН, не содержащими CpG. PBMC культивировали в течение 24 час с или без 6 мкг/мл указанных ОДН или с 1 мкг/мл LPS в качестве позитивного контроля и TNFα измеряли с помощью ТИФА.

Фигура 12 представляет собой гистограмму, показывающую, что секреция ИЛ-6 после культивирования с ОДН, не содержащими CpG, имеет тот же характер, что и TNFα. PBMC культивировали указанными ОДН (1,0 мкг/мл)/ и ИЛ-6 измеряли в супернатантах с помощью ТИФА.

Подробное описание

В одном варианте изобретение включает в себя данные о том, что пиримидин (Ру)-обогащенные и предпочтительно тимидин (Т)-обогащенные нуклеиновые кислоты, так же как нуклеиновые кислоты, которые содержат TG-динуклеотидные мотивы, эффективны в опосредовании иммуностимулирующих эффектов. На предшествующем уровне техники было известно, что нуклеиновые кислоты, содержащие CpG, являются терапевтическими и профилактическими композициями, которые стимулируют иммунную систему для лечения рака, инфекционных заболеваний, аллергии, астмы и других нарушений, и помогают защитить против инфекций, вызываемых условно-патогенными микроорганизмами, после химиотерапии рака. Сильные, но сбалансированные, клеточный и гуморальный иммунные ответы, которые возникают благодаря стимуляции CpG, отражают индивидуальную природную защитную систему организма против болезнетворных патогенов и раковых клеток. Последовательности CpG, хотя относительно редки в ДНК человека, обычно обнаруживаются в ДНК инфекционных организмов, таких как бактерии. Иммунная система человека, очевидно, развивалась в направлении узнавания последовательностей CpG как раннего предупреждающего признака инфекции и инициации немедленного и сильного иммунного ответа против болезнетворных патогенов без развития неблагоприятных реакций, часто наблюдаемых в отношении других иммуностимулирующих агентов. Таким образом, нуклеиновые кислоты, содержащие CpG, на основании природного иммунного защитного механизма, могут быть использованы как уникальный и природный путь иммунной терапии. Модулирующие эффекты нуклеиновых кислот, содержащих CpG, на иммунную систему были раскрыты заявителями данной патентной заявки и подробно описаны в совместно поданных патентных заявках, таких как патентные заявки США, серийные Nos: 08/386063, зарегистрированная 02/07/95 (и относящийся к этому патент РСТ US 95/01570); 08/738652, зарегистрированная 10/30/96; 08/960774, зарегистрированная 10/30/97 (и относящийся к этому патент PCT/US 97/19791, WO 98/18810); 09/191170, зарегистрированная 11/13/98; 09/030701, зарегистрированная 02/25/98 (и относящийся к этому патент PCT/US 98/03678; 09/082649, зарегистрированная 05/20/98 (и относящийся к этому патент PCT/US 98/10408); 09/325193, зарегистрированная 06/03/99 (и относящийся к этому патент PCT/US 98/04703); 09/286098, зарегистрированная 04/02/99 (и относящийся к этому патент PCT/US 99/07335); 09/306281, зарегистрированная 05/06/99 (и относящийся к этому патент PCT/US 99/09863). Полное содержание каждого из данных патентов и патентных заявок включено здесь в качестве ссылки.

Данные настоящего изобретения применимы ко всем описанным выше применениям нуклеиновых кислот, содержащих CpG, так же как к любому другому известному применению нуклеиновых кислот, содержащих CpG. В одном варианте изобретение связано с открытием того, что Ру-обогащенные и предпочтительно Т-обогащенные и TG-нуклеиновые кислоты имеют сходные с CpG-олигонуклеотидами иммуностимулирующие свойства, независимо от присутствия CpG-мотива. Таким образом, изобретение полезно для любого способа стимуляции иммунной системы с применением Ру-обогащенных и TG-нуклеиновых кислот. Неожиданно было также открыто, в соответствии с изобретением, что химерные олигонуклеотиды, у которых отсутствует CpG-мотив, являются иммуностимулирующими и имеют многие из тех же профилактических и терапевтических активностей, что и CpG-олигонуклеотиды.

Ру-обогащенная нуклеиновая кислота представляет собой T-обогащенную или С-обогащенную иммуностимулирующую нуклеиновую кислоту. В некоторых осуществлениях Т-обогащенные нуклеиновые кислоты предпочтительны. Т-обогащенная нуклеиновая кислота представляет собой нуклеиновую кислоту, которая включает в себя по меньшей мере одну поли-Т-последовательность и/или которая имеет композицию нуклеотидов с более чем 25% Т-нуклеотидных остатков. Нуклеиновая кислота, имеющая поли-Т-последовательность, включает в себя по меньшей мере четыре Т в ряд, такой как 5’TTTT3’. Предпочтительно Т-обогащенная нуклеиновая кислота включает в себя более одной поли-Т-последовательности. В предпочтительных осуществлениях Т-обогащенная нуклеиновая кислота может иметь 2, 3, 4 и т.д. поли-Т-последовательностей, таких как олигонуклеотид #2006 (SEQ ID NO: 246). Один из Т-обогащенных олигонуклеотидов с наиболее сильными иммуностимулирующими свойствами представляет собой нуклеиновую кислоту, состоящую полностью из Т-нуклеотидных остатков, например, олигонуклеотид #2183 (SEQ ID NO: 433). Другие Т-обогащенные нуклеиновые кислоты в соответствии с изобретением имеют нуклеотидный состав с более чем 25% Т-нуклеотидных остатков, но необязательно включают в себя поли-Т-последовательность. В данных Т-обогащенных нуклеиновых кислотах Т-нуклеотидные остатки могут быть отделены один от другого другими типами нуклеотидных остатков, т.е. G, С и А. В некоторых осуществлениях Т-обогащенные нуклеиновые кислоты имеют нуклеотидный состав с более 35%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% и 99% Т-нуклеотидных остатков и каждый целый % между ними. Предпочтительно Т-обогащенные нуклеиновые кислоты имеют по меньшей мере одну поли-Т-последовательность и нуклеотидный состав с более чем 25% Т-нуклеотидных остатков.

В соответствии с изобретением, было открыто, что содержание Т в ОДН имеет существенное действие на иммуностимулирующий эффект ОДН и что Т-обогащенные ОДН могут активировать многие типы клеток иммунной системы человека в отсутствие каких-либо CpG-мотивов. Олигонуклеотид, имеющий 3’поли-Т-область и 2 5’CGs, например, ОДН 2181 (SEQ ID NO: 431), обладает высокой иммуностимулирующей активностью. Олигонуклеотид сходной длины, ОДН 2116 (SEQ ID NO: 357), который содержит два CG-динуклеотида на 5'-конце и поли-С область на 3’-конце, также был иммуностимулирующим, но в меньшей степени, чем Т-обогащенный олигонуклеотид, при применении стандартных экспериментальных условий. Таким образом, хотя С и Т имеют почти идентичные структуры, их влияние на иммунные свойства ОДН различны. Они оба способны индуцировать иммунный ответ, но в разной степени. Таким образом, как Т-обогащенные, так и С обогащенные олигонуклеотиды полезны в соответствии с изобретением, но Т-обогащенные олигонуклеотиды являются предпочтительными. Более того, если содержание Т в ОДН снижено путем включения других оснований, таких как G, А или С, то иммуностимулирующие эффекты снижены (ОДН #2188 (SEQ ID NO: 905), 2190 (SEQ ID NO: 907), 2191 (SEQ ID NO: 908) и 2193 (SEQ ID NO: 910).

С-обогащенная нуклеиновая кислота представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, которая имеет по меньшей мере одну или предпочтительно по меньшей мере две поли-С области, или которая состоит по меньшей мере из 50% С нуклеотидов. Поли-С область имеет по меньшей мере четыре С остатка в ряд. Таким образом, поли-С область охватывается формулой 5’СССС3’. В некоторых осуществлениях предпочтительно, чтобы поли-С область имела формулу 5’СССССС3’. Другие С-обогащенные нуклеиновые кислоты в соответствии с изобретением имеют нуклеотидный состав с более 50% С-нуклеотидных остатков, но не обязательно включают в себя поли-С-последовательность. В данных С-обогащенных нуклеиновых кислотах С-нуклеотидные остатки могут быть отделены один от другого другими типами нуклеотидных остатков, т.е. G, Т и А. В некоторых осуществлениях С-обогащенные нуклеиновые кислоты имеют нуклеотидный состав с более 60%, 70%, 80%, 90% и 99% С-нуклеотидных остатков и каждый целый процент между ними. Предпочтительно С-обогащенные нуклеиновые кислоты имеют по меньшей мере одну поли-С-последовательность и нуклеотидный состав с более чем 50% С-нуклеотидных остатков и в некоторых осуществлениях являются также Т-обогащенными.

Как показано в примерах, несколько ОДН, ранее считавшиеся не обладающими иммуностимулирующими свойствами, включая два ОДН SEQ ID NO.:225 и SEQ ID NO.:282, ранее описанные как не обладающие иммуностимулирующими свойствами и применявшиеся главным образом как контрольные ОДН (Takahashi, Т et al 2000. J. Immunol. 164:4458), как обнаружено, являются иммуностимулирующими. Эксперименты авторов изобретения показали, что данные ОДН могут стимулировать В-клетки, хотя при более высоких концентрациях по сравнению с CpG ОДН (фиг.6). Длинный поли-Т ОДН (30 членов) индуцировал, по меньшей мере в некоторых экспериментах, активацию В-клеток, сравнимую по силе с одними из наиболее сильных CpG-олигонуклеотидных активаторов В-клеток. С помощью данных экспериментов выявлены также неожиданные данные о том, что даже поли-С ОДН могут вести к стимуляции В-клеток.

Иммуностимуляция с помощью данных ОДН, однако, не ограничивается В-клетками человека. Различные экспериментальные тесты ясно продемонстрировали, что дополнительно моноциты, МК-клетки и даже NKT клетки могут быть проактивированы с помощью таких не содержащих CpG ОДН (фиг.7-10). В отличие от поли-Т и поли-С-последовательностей, иммуностимуляция с помощью поли-А-последовательностей (по меньшей мере, для моноцитов и NK-клеток) не была достигнута. Интересно, что было обнаружено, что введение CpG-мотива в SEQ ID NO.: 225 увеличивало иммуностимулирующую активность, в то время как элонгация с применением поли-Т удлинения не увеличивала иммуностимуляцию. Это предполагает, что CpG- и Т-обогащенные ОДН могут действовать с помощью различных механизмов или путей. Возможно также, что введение поли-Т-мотива в различные позиции SEQ ID NO.: 225 может вести к изменениям иммуностимулирующих свойств.

Применяемый здесь термин "TG-нуклеиновая кислота" или "иммуностимулирующая TG-нуклеиновая кислота" представляет собой нуклеиновую кислоту, содержащую по меньшей мере один TpG-динуклеотид (тимидин-гуанин динуклеотидную последовательность, т.е. "TG-ДНК" или ДНК, содержащую 5’-тимидин, за которым следует 3’-гуанозин, связанные фосфатной связью), которая активирует компонент иммунной системы.

В одном осуществлении в изобретении предлагается TG-нуклеиновая кислота, представленная по меньшей мере формулой:

5’N₁X₁TGX₂N₂3’

где X₁ и Х₂ являются нуклеотидами и N представляет собой любой нуклеотид, а N₁ и N₂ являются последовательностями нуклеиновых кислот, составленными из любого числа N, предлагаемыми так, что общая сумма N₁ и N₂ находится в диапазоне от 11 до 21. В качестве примера, если N₁ равно 5, то N₁ может составлять 6 (приводя к общей длине олигонуклеотида, составляющей 15 нуклеотидов). TG может быть локализован в любом месте по длине нуклеотида, включая 5’-конец, центр и 3’конец. Таким образом, N₁ может составлять от нуля до 21 включительно, при условии, что N₂ выбирают соответственно, чтобы получить сумму n₂ и N₁, равную от 11 до 21 включительно. Сходно N₂ может составлять от нуля до 21 включительно, при условии, что общая сумма N₁ и N₂ равна от 11 до 21 включительно. В некоторых осуществлениях X₁ представляет собой аденин,

гуанин или тимидин, и X₂ представляет собой цитозин, аденин или тимидин. В одном предпочтительном осуществлении Х₂ представляет собой тимидин. В других осуществлениях X₁ представляет собой цитозин и Х₂. представляет собой гуанин. В других осуществлениях, как здесь обсуждается, нуклеиновая кислота может охватывать другие мотивы, предлагаемые так, чтобы они были достаточно длинны, чтобы выполнять интересующую функцию.

В других осуществлениях TG-нуклеиновая кислота представлена по меньшей мере формулой:

5’N₁X₁X₂TGX₃X₄N₂3’

где X₁, Х₂, Х₃ и X₁ являются нуклеотидами. В некоторых осуществлениях Х₁X₂ представляют собой нуклеотиды, которые выбраны из группы, состоящей из: GpT, GpG, GpA, ApA, ApT, ApG, CpT, CpA, ТрА и ТрТ; а Х₃Х₄ представляют собой нуклеотиды, которые выбраны из группы, состоящей из ТрТ, CpT, ApT, ApG, ТрС, АрС, СрС, ТрА, ApA и CpA; N представляет собой любой нуклеотид, a N₁ и N₂ являются последовательностями нуклеиновых кислот, составленными из любого числа нуклеотидов, при условии, что общая сумма N₁ и N₂ находится в диапазоне от 9 до 19. В некоторых осуществлениях Х₁Х₂ представляют собой GpA или GpT, а Х₃Х₄ представляют собой ТрТ.

В других осуществлениях X₁ или X₂, или оба являются пуринами, а Х₃ или Х₄, или оба являются пиримидинами, или Х₁Х₂ представляют собой GpA, а Х₃ или Х₄, или оба, являются пиримидинами. В одном предпочтительном осуществлении Х₃Х₄ представляют собой нуклеотиды, выбранные из группы, состоящей из ТрТ, ТрС и ТрА.

Иммуностимулирующая нуклеиновая кислота может быть любого размера (т.е. длины), при условии, что имеет по меньшей мере 4 нуклеотида. В важных осуществлениях иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты имеют длину в диапазоне между 6 и 100. Еще в одних осуществлениях длина заключена в диапазоне между 8 и 35 нуклеотидов. Предпочтительно, чтобы TG-олигонуклеотиды колебались по размеру от 15 до 25 нуклеотидов.

Размер (т.е. число нуклеотидных остатков по длине нуклеиновой кислоты) иммуностимулирующей нуклеиновой кислоты может также вносить вклад в стимулирующую активность нуклеиновой кислоты. Неожиданно было открыто, что даже для иммуностимулирующих нуклеиновых кислот с высокой иммуностимулирующей активностью длина нуклеиновой кислоты влияет на степень иммунной стимуляции, которая может быть достигнута. Было показано, что увеличение длины Т-обогащенной нуклеиновой кислоты до 24 нуклеотидов вызывает увеличение иммунной стимуляции. Эксперименты, представленные в примерах, демонстрируют, что когда длина Т-обогащенной нуклеиновой кислоты возрастает с 18 до 27 нуклеотидов, способность нуклеиновой кислоты стимулировать иммунный ответ значительно увеличивается (сравните ОДН #2194, 2183, 2195 и 2196, снижающиеся в размере от 27 до 18 нуклеотидов). Увеличение длины нуклеиновой кислоты до 30 нуклеотидов имеет существенный вклад в биологические свойства нуклеиновой кислоты, но увеличение длины выше 30 нуклеотидов, по-видимому, дополнительно не влияет на иммуностимулирующий эффект (например, сравните ОДН с 2179 до 2006).

Было показано, что TG-нуклеиновые кислоты с диапазоном длины от 15 до 25 нуклеотидов могут проявлять усиленные иммуностимулирующие свойства. Таким образом, в изобретении предлагается олигонуклеотид, который имеет 15-27 нуклеотидов в длину (т.е. олигонуклеотид длиной в 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 или 27 нуклеотидов), который может быть Т-обогащенной нуклеиновой кислотой или может быть как Т-обогащенной, так и TG-нуклеиновой кислотой. В одном осуществлении олигонуклеотид не представляет собой ни Т-обогащенную нуклеиновую кислоту, ни TG-нуклеиновую кислоту. В других осуществлениях олигонуклеотид не имеет CG-мотива. В изобретении сходно предлагаются олигонуклеотиды, которые имеют в длину 15-27 нуклеотидов, олигонуклеотиды, которые имеют в длину 18-25 нуклеотидов, олигонуклеотиды, которые имеют в длину 20-23 нуклеотида, и олигонуклеотиды, которые имеют в длину 23-25 нуклеотидов. Любое из упомянутых выше осуществлений, относящихся к олигонуклеотидам длиной в 15-27 нуклеотидов, также относится к олигонуклеотидам с данными различными длинами. Изобретение дополнительно охватывает применение любого из данных указанных выше нуклеотидов в цитированных здесь способах.

Хотя максимальный уровень иммунной стимуляции достигается с некоторыми Т-обогащенными нуклеиновыми кислотами, когда нуклеиновая кислота имеет в длину 24-30 нуклеотидных остатков, так же как с некоторыми TG-нуклеиновыми кислотами, длина которых заключена в диапазоне от 15 до 25 нуклеотидов, более короткие или более длинные иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты также могут быть применены в соответствии со способами изобретения. Для ускорения захвата клетками иммуностимулирующих нуклеиновых кислот предпочтительна минимальная длина из 6 нуклеиновых остатков. Нуклеиновые кислоты любого размера больше 6 нуклеотидов (даже длиной больше многих т.п.н.) способны индуцировать иммунный ответ в соответствии с изобретением, если присутствует достаточное количество иммуностимулирующих мотивов, так как более крупные нуклеиновые кислоты деградируют внутри клетки. Предпочтительно иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты составляют в длину диапазон между 8 и 100 нуклеотидами, а в некоторых осуществлениях иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты, содержащие Т-обогащенные участки, составляют в длину между 24 и 40 нуклеотидами, и иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты, содержащие TG, составляют в длину между 15 и 25 нуклеотидами.

В одном осуществлении Т-обогащенная нуклеиновая кислота представлена по меньшей мере формулой:

5’Х₁Х₂ТТТТХ₃Х₄3’,

где X₁, Х₂, Х₃ и Х₄ являются нуклеотидами. В одном осуществлении Х₁Х₂ представляют собой ТТ и/или X₃Х₄ представляют собой ТТ. В другом осуществлении Х₁Х₂ представляет собой один любой из следующих нуклеотидов ТА, TG, ТС, AT, АА, AG, АС, СТ, СС, СА, GT, GG, GA и GC; а Х₃Х₄ представляет собой один любой из следующих нуклеотидов ТА, TG, ТС, AT, АА, AG, АС, СТ, СС, СА, GT, GG, GA и GC.

В некоторых осуществлениях предпочтительно, чтобы иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты не содержали поли-С (СССС) или поли-А (АААА). В других осуществлениях предпочтительно, чтобы иммуностимулирующая нуклеиновая кислота включала поли-С, поли-А, поли-G (GGGG) или множественные GG. В особенности поли-G или множественные GG мотивы оказывают существенные эффекты на некоторые иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты. Эффект таких не содержащих Т-последовательностей частично зависит от статуса остова нуклеиновой кислоты. Например, если нуклеиновая кислота имеет фосфодиэфирный остов или химерный остов, включение данных последовательностей в нуклеиновую кислоту должно оказывать только минимальный, если вообще какой-либо, эффект на биологическую активность нуклеиновой кислоты. Если остов полностью фосфортиоатный (или с другой фосфатной модификацией) или в значительной степени фосфортиоатный, то включение данных последовательностей может иметь большее влияние на биологическую активность или кинетику биологической активности, вызывая снижение потенциала Т-обогащенных и иммуностимулирующих TG-нуклеиновых кислот.

Хотя показано, что С-обогащенные нуклеиновые кислоты обладают иммуностимулирующими свойствами, введение поли-С-последовательностей в Т-обогащенную нуклеиновую кислоту таким образом, чтобы снизить относительную пропорцию Т-нуклеотидов в нуклеиновой кислоте может вносить негативный вклад в нуклеиновую кислоту. Хотя авторы изобретения не связаны предполагаемым механизмом, предполагается, что иммунная система разработала механизмы для различения нуклеиновых кислот, имеющих разные нуклеотидные свойства, возможно, в результате различной посадки связывающих белков, которые узнают различные последовательности, или специфически связывающих белков, которые узнают все иммуностимулирующие последовательности, но связываются с ними с различным сродством. В целом нуклеиновые кислоты, включающие в себя неметилированные CpG-мотивы, являются в наибольшей степени иммуностимулирующим, за ними следуют Т-обогащенные нуклеиновые кислоты, TG-нуклеиновые кислоты и С-обогащенные нуклеиновые кислоты. Данное обобщение, однако, имеет много исключений. Например, существенно Т-обогащенная нуклеиновая кислота, подобная SEQ ID NO.: 886, является в большей степени иммуностимулирующей в некоторых тестах, чем некоторые CpG содержащие нуклеиновые кислоты (например, фосфортиоатная CpG нуклеиновая кислота, содержащая единственные CpG-мотивы).

Было также открыто, что добавление поли-А хвоста к иммуностимулирующей нуклеиновой кислоте может увеличивать активность нуклеиновой кислоты. Было открыто, что когда сильную иммуностимулирующую CpG нуклеиновую кислоту (SEQ ID NO.: 246) модифицировали путем добавления поли-А-хвоста (АААААА) или поли-Т-хвоста (ТТТТТТ), полученные олигонуклеотиды увеличивали свою иммуностимулирующую активность. Способность поли-А и поли-Т-хвоста увеличивать иммуностимулирующие свойства олигонуклеотида очень сходны. SEQ ID NO.: 246 представляет собой Т-обогащенный олигонуклеотид. Вероятно, что если поли-А- и поли-Т-хвосты добавляют к нуклеиновой кислоте, которая не является Т-обогащенной, это должно внести больший вклад в иммуностимулирующую способность нуклеиновой кислоты. Так как поли-Т-хвост добавляли к нуклеиновой кислоте, которая уже была высоко Т-обогащенной, иммуностимулирующие свойства добавления поли-Т в некоторой степени, но не полностью, размываются. Данные результаты имеют важное значение для применения поли-А-областей. Таким образом, в некоторых осуществлениях иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты включают в себя поли-А область, а в других осуществлениях они не включают в себя ее.

Некоторые из иммуностимулирующих нуклеиновых кислот согласно изобретению включают в себя один или более CG-мотивов. Присутствие CG-мотивов в иммуностимулирующих нуклеиновых кислотах также оказывает влияние на биологическую активность нуклеиновых кислот. Если суммарная длина иммуностимулирующей нуклеиновой кислоты составляет 20 нуклеотидных остатков или менее, то CpG-мотивы важны для определения иммунного эффекта нуклеиновой кислоты, и метилирование данных мотивов снижает силу иммуностимулирующих эффектов нуклеиновой кислоты. Если длину иммуностимулирующей нуклеиновой кислоты увеличивают до 24, то иммуностимулирующие эффекты нуклеиновой кислоты становятся менее зависимыми от CpG-мотивов и не уничтожаются более путем метилирования CpG-мотивов или путем их инверсии в GC-динуклеотиды, что дает представленные здесь другие иммуностимулирующие свойства.

Например, ОДН 2006 (SEQ ID NO: 246) представляет собой сильную иммуностимулирующую Т-обогащенную нуклеиновую кислоту из 24 нуклеотидных остатков в длину с четырьмя CpG-динуклеотидами. Однако ОДН 2117 (SEQ ID NO: 358), в котором CpG-мотивы метилированы, также является сильным иммуностимулирующим олигонуклеотидом. ОДН 2137 (SEQ ID NO: 886), в котором CpG-мотивы ОДН 2006 инвертированы до GpC и который в результате обладает шестью TG-динуклеотидами, также является иммуностимулирующим олигонуклеотидом. Иммуностимулирующие эффекты нуклеиновых кислот, таких как ОДН 2117 и 2137, регулируются с помощью по содержанию в них Т и TG. Каждая из данных трех нуклеиновых кислот является Т-обогащенной и ОДН 2137 дополнительно TG-обогащенной. Если содержание в них Т снижено путем введения других оснований, таких как А (ОДН 2117 (SEQ ID NO: 358)), или если содержание в них TG снижено за счет замены TG на AG, то иммуностимулирующие эффекты в некоторой степени снижаются. В другом примере нуклеиновая кислота с 24 нуклеотидами в длину, в которой все из положений рандомизированы, имеет только умеренный иммуностимулирующий эффект (ОДН 2182 (SEQ ID NO: 432)). Подобно этому нуклеиновая кислота с 24 нуклеотидами в длину с другими составами нуклеотидов имеет различающиеся иммуностимулирующие эффекты в зависимости от содержания в них Т (ОДН 2188 (SEQ ID NO: 905), 2189 (SEQ ID NO: 906), 2190 (SEQ ID NO: 907), 2191 (SEQ ID NO: 908), 2193 (SEQ ID NO: 910), 2183 (SEQ ID NO: 433) и 2178 (SEQ ID NO: 428)). ОДН 2190, который содержит TGT мотивы, является более иммуностимулирующим, чем ОДН 2202, который содержит TGG мотивы. Таким образом, в некоторых осуществлениях TGT мотивы являются предпочтительными. Еще в одних осуществлениях важно число TG-мотивов, поскольку увеличение числа TG-мотивов ведет к увеличению иммунной стимуляции. Некоторые предпочтительные TG-нуклеиновые кислоты содержат по меньшей мере три TG-мотива.

Примеры CpG нуклеиновых кислот включают в себя, но не ограничиваясь этим, перечисленные в таблице А последовательности, такие как SEQ ID NO: I, 3, 4, 14-16, 18-24, 28, 29, 33-46, 49, 50, 52-56, 58, 64-67, 69, 71, 72, 76-87, 90, 91, 93, 94, 96, 98, 102-124, 126-128, 131-133, 136-141, 146-150, 152-153, 155-171, 173-178, 180-186, 188-198, 201, 203-214, 216-220, 223, 224, 227-240, 242-256, 258, 260-265, 270-273, 275, 277-281, 286-287, 292, 295-296, 300, 302, 305-307, 309-312, 314-317, 320-327, 329, 335, 337-341, 343-352, 354, 357, 361-365, 367-369, 373-376, 378-385, 388-392, 394, 395, 399, 401-404, 406-426, 429-433, 434-437, 439, 441-443, 445, 447, 448, 450, 453-456, 460-464, 466-469, 472-475, 477, 478, 480, 483-485, 488, 489, 492, 493, 495-502, 504-505, 507-509, 511, 513-529, 532-541, 543-555, 564-566, 568-576, 578, 580, 599, 601-605, 607-611, 613-615, 617, 619-622, 625-646, 648-650, 653-664, 666-697, 699-706, 708, 709, 711-716, 718-732, 736, 737, 739-744, 746, 747, 749-761, 763, 766-767, 769, 772-779, 781-783, 785-786, 790-792, 798-799, 804-808, 810, 815, 817, 818, 820-832, 835-846, 849-850, 855-859, 862, 865, 872, 874-877, 879-881, 883-885, 888-904 и 909-913.

В некоторых осуществлениях изобретения иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты включают в себя CpG-динуклеотиды, и в других осуществлениях иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты свободны от CpG-динуклеотидов. CpG-динуклеотиды могут быть метилированы или неметилированы. Нуклеиновая кислота, содержащая по меньшей мере один неметилированный CpG-динуклеотид, является молекулой нуклеиновой кислоты, которая содержит неметилированную цитозин-гуанин динуклеотиднуго последовательность (т.е. "CpG-ДНК" или ДНК, содержащую неметилированный 5'-цитозин, за которым следует 3'-гуанозин, связанные фосфатной связью), и активирует иммунную систему. Нуклеиновая кислота, содержащая по меньшей мере один метилированный CpG-динуклеотид, является нуклеиновой кислотой, которая содержит метилированную цитозин-гуанин динуклеотидную последовательность (т.е. метилированный 5’-цитозин, за которым следует 3’-гуанозин, связанные фосфатной связью).

Примеры Т-обогащенных нуклеиновых кислот, которые свободны от CpG нуклеиновых кислот, включают в себя, не ограничиваясь представленными в таблице А, последовательности, такие как SEQ ID NO: 59-63, 73-75, 142, 215, 226, 241, 267-269, 282, 301, 304, 330, 342, 358, 370-372, 393, 433, 471, 479, 486, 491, 497, 503, 556-558, 567, 694, 793-794, 797, 833, 852, 861, 867, 868, 882, 886, 905, 907, 908 и 910-913. Примеры Т-обогащенных нуклеиновых кислот, которые включают в себя CpG нуклеиновые кислоты, включают в себя, но не ограничиваются представленными в таблице А, такими как SEQ ID NO: 64, 98, 112, 146, 185, 204, 208, 214, 224, 233, 244, 246, 247, 258, 262, 263, 265, 270-273, 300, 305, 316, 317, 343, 344, 350, 352, 354, 374, 376, 392, 407, 411-413, 429-432, 434, 435, 443, 474, 475, 498-501, 518, 687, 692, 693, 804, 862, 883, 884, 888, 890 и 891.

Иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты могут быть односпиральными и двуспиральными. Обычно двуспиральные молекулы более стабильны in vivo, в то время как односпиральные молекулы имеют повышенную иммунную активность. Таким образом, в некоторых вариантах изобретения предпочтительно, чтобы нуклеиновая кислота была односпиральной, а в других вариантах предпочтительно, чтобы нуклеиновая кислота была двуспиральной.

Применяемый здесь термин Т-обогащенная нуклеиновая кислота и TG-нуклеиновая кислота относится к иммуностимулирующей Т-обогащенной нуклеиновой кислоте и к иммуностимулирующей TG-нуклеиновой кислоте соответственно, если не указано иначе. Т-обогащенные последовательности нуклеиновой кислоты изобретения представляют собой те, которые подробно описаны выше, так же как нуклеиновые кислоты, представленные в таблице А, которые имеют по меньшей мере один поли-Т-мотив и/или которые имеют состав с более чем 25% или предпочтительно 35% Т-нуклеотидных остатков. С-обогащенные нуклеиновые кислоты изобретения представляют собой те, которые имеют по меньшей мере одну и предпочтительно две поли-С области. TG-нуклеиновые кислоты согласно изобретению представляют собой те, которые подробно описаны выше, так же как специфические нуклеиновые кислоты, представленные в таблице А, которые имеют по меньшей мере один TG-мотив.

Нуклеиновые кислоты согласно изобретению могут, но необязательно, также включать в себя поли-G мотив. Поли-G, содержащие нуклеиновые кислоты, также являются иммуностимулирующими. В различных ссылках, включая Pisetsky and Reich, 1993 Mol. Biol. Reports, 18: 217-221; Krieger and Herz, 1994, Ann. Rev. Biochem., 63: 601-637; Macaya et al., 1993, PNAS, 90: 3745-3749; Wyatt et al., 1994, PNAS, 91: 1356-1360; Rando and Hogan, 1998, In Applied Antisense Oligonucleotide Technology, ed. Kneg and Stein, p.335-352; and Kimura et al., 1994, J Biochem. 116, 991-994, также описаны иммуностимулирующие свойства поли-G нуклеиновых кислот.

Поли-G нуклеиновые кислоты предпочтительно представляют собой нуклеиновые кислоты, имеющие следующие формулы:

5’X₁X₂GGGX₃X₄3’

где Х₁X₂, Х₃ и Х₄ представляют собой нуклеотиды. В предпочтительных осуществлениях по меньшей мере один из Х₃ и Х₄ представляет собой G. В других осуществлениях оба Х₃ и Х₄ представляет собой G. Еще в одном осуществлении предпочтительная формула представляет собой 5’GGGNGGG3’ или 5’GGGNGGGNGGG3’, где N составляет между 0 и 20 нуклеотидами. В других осуществлениях поли-G-нуклеиновые кислоты свободны от неметилированных CG-динуклеотидов, такие, например, как нуклеиновые кислоты, перечисленные ниже как SEQ ID NO: 5, 6, 73, 215, 267-269, 276, 282, 288, 297-299, 355, 359, 386, 387, 444, 476, 531, 557-559, 733, 768, 795, 796, 914-925, 928-931, 933-936 и 938. В других осуществлениях поли-G нуклеиновые кислоты включают в себя по меньшей мере один неметилированный CG-динуклеотид, такие, например, как нуклеиновые кислоты, перечисленные выше как SEQ ID NO: 67, 80-82, 141, 147, 148, 173, 178, 183, 185, 214, 224, 264, 265, 315, 329, 434, 435, 475, 519, 521-524, 526, 527, 535, 554, 565, 609, 628, 660, 661, 662, 725, 767, 825, 856, 857, 876, 892, 909, 926, 927, 932 и 937.

Термины "нуклеиновая кислота" и "олигонуклеотид" применяются взаимозаменяемо для обозначения множественных нуклеотидов (т.е. молекул, включающих сахар (например, рибозу или дезоксирибозу), связанный с фосфатной группой и заменяемым органическим основанием, которое представляет собой либо замещенный пиримидин (например, цитозин (С), тимидин (Т) или урацил (U) или замещенный пурин (например, аденин (А) или гуанин (G)). Применяемые здесь термины относятся к олигорибонуклеотидам, так же как к олигодезоксинуклеотидам. Термины должны также включать в себя полинуклеозиды (т.е. полинуклеотид минус фосфат) и любое другое органическое основание, содержащее полимер. Молекулы нуклеиновых кислот могут быть получены из существующих источников нуклеиновых кислот (например, геномной или кДНК), но предпочтительны синтетические (например, получаемые путем синтеза нуклеиновых кислот).

Термины нуклеиновая кислота и олигонуклеотид охватывают также нуклеиновые кислоты или олигонуклеотиды с замещениями или модификациями, такими как в основаниях и/или сахарах. Например, они включают в себя нуклеиновые кислоты, имеющие остов сахаров, которые ковалентно присоединены к органическим группам с низкой молекулярной массой, отличным от гидроксильной группы в 3’ положении и отличающимся от фосфатной группы в 5’ положении. Модифицированные таким образом нуклеиновые кислоты могут включать в себя 2’-O-алкилированную рибозную группу. Кроме того, модифицированные нуклеиновые кислоты могут включать в себя сахара, такие как арабиноза, вместо рибозы. Таким образом, нуклеиновые кислоты могут быть гетерогенными по составу остова, включая в связи с этим любую возможную комбинацию полимерных единиц, соединенных вместе в виде пептид-нуклеиновых кислот (которые имеют аминокислотный остов с нуклеотидными основаниями). В некоторых осуществлениях нуклеиновые кислоты являются гомогенными по составу остова. Нуклеиновые кислоты также включают в себя замещенные пурины и пиримидины, такие как С-5 пропин-модифицированные основания (Wagner et al., Nature Biotechnology 14: 840-844, 1996). Пурины и пиримидины включают в себя, но не ограничиваются этим, аденин, цитозин, гуанин, тимидин, 5-метилцитозин, 2-аминопурин, 2-амино-6-хлорпурин, 2,6-диаминопурин, гипоксантин и другие существующие и не существующие в природе нуклеотидные основания, замещенные и незамещенные ароматические части. Другие такие модификации хорошо известны специалистам в данной области.

Для применения в настоящем изобретении нуклеиновые кислоты согласно изобретению могут быть синтезированы de novo с применением любого числа процедур, хорошо известных специалистам в данной области. Например, b-цианоэтилфосфорамидитный способ (Beaucage, S.L., and Caruthers, M.H., Tet. Let. 22: 1859, 1981); нуклеозид Н-фосфонатный способ (Garegg et al., Tet. Let. 27: 4051-4054, 1986; Froehler et al., Nucl. Acid. Res. 14: 5399-5407, 1986,; Garegg et al., Tet. Let. 27:4055-4058, 1986, Gaffney et al., Tet. Let. 29: 2619-2622, 1988). Данные химические способы могут быть выполнены с помощью множества автоматических синтезаторов нуклеиновых кислот, предлагаемых на рынке. Данные нуклеиновые кислоты обозначаются как синтетические нуклеиновые кислоты. В противоположном варианте Т-обогащенные и/или TG-динуклеотиды могут быть получены в большом масштабе в плазмидах (смотри Sambrook, Т., et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor laboratory Press, New York, 1989) и разделены на меньшие фрагменты или введены целиком. Нуклеиновые кислоты могу быть получены из существующих последовательностей нуклеиновых кислот (например, геномной или кДНК) с применением известных способов, таких как применение ферментов рестрикции, экзонуклеаз или эндонуклеаз. Нуклеиновые кислоты, полученные таким способом, обозначаются как выделенные нуклеиновые кислоты. Выделенная нуклеиновая кислота обычно означает нуклеиновую кислоту, которая отделена от компонентов, с которыми она обычно связана в природе. Например, выделенной нуклеиновой кислотой может быть кислота, которая выделена из клетки, из ядра, из митохондрий или хроматина. Термины Ру-обогащенные нуклеиновые кислоты и TG-нуклеиновые кислоты охватывают как синтетические, так и выделенные Ру-обогащенные нуклеиновые кислоты и TG-нуклеиновые кислоты.

Для применения in vivo Ру-обогащенные и TG-нуклеиновые кислоты могут необязательно быть относительно устойчивыми к деградации (например, стабилизированными). "Стабилизированная молекула нуклеиновой кислоты" должна означать молекулу нуклеиновой кислоты, которая относительно устойчива к деградации in vivo (например, под действием экзо- и эндонуклеаз). Стабилизация может быть функцией длины или вторичной структуры. Нуклеиновые кислоты, которые составляют в длину от десятков до тысяч т.п.о., являются относительно устойчивыми к деградации in vivo. В случае более коротких нуклеиновых кислот вторичную структуру можно стабилизировать и увеличить их эффективность. Например, если 3’-конец нуклеиновой кислоты комплементарен ее вышележащей области, так что он может загнуться назад и образовать тип стволовой петлевой структуры, то нуклеиновая кислота становится стабилизированной и, следовательно, проявляет большую активность.

В противоположном варианте стабилизация нуклеиновой кислоты может быть достигнута путем модификаций фосфатного остова. Предпочтительные стабилизированные нуклеиновые кислоты настоящего согласно изобретению имеют модифицированный остов. Показано, что модификация остова нуклеиновой кислоты обеспечивает увеличенную активность Ру-обогащенных и TG-нуклеиновых кислот при введении in vivo. Данные стабилизированные структуры являются предпочтительными, так как Ру-обогащенные и TG молекулы изобретения имеют по меньшей мере частично модифицированный остов. Ру-обогащенные и TG конструкты, имеющие фосфортиоатные связи, обеспечивают максимальную активность и защищают нуклеиновые кислоты от деградации под действием экзо- и эндонуклеаз. Другие модифицированные нуклеиновые кислоты включают в себя фосфодиэфир-модифицированные нуклеиновые кислоты, сочетания фосфодиэфирной и фосфортиоатной нуклеиновой кислоты, метилфосфонат, метилфосфортиоат, фосфордитиоат, п-этокси и их сочетания. Каждое из данных сочетаний и их конкретные эффекты на иммунные клетки обсуждаются более подробно в отношении CpG нуклеиновых кислот в опубликованных патентных заявках РСТ PCT/US 95/01570 (WO 96/02555) и PCT/US 97/19791 (WO 98/8810), заявляющих приоритет патентов США серийные Nos. 08/386063 и 08/960774, зарегистрированных 7 февраля 1995 г. и 30 октября 1997 г. соответственно, полное содержание которых включено здесь в качестве ссылки. Предполагается, что данные модифицированные нуклеиновые кислоты могут проявлять большую стимулирующую активность, обусловленную увеличенной устойчивостью к нуклеазам, увеличенным захватом клетками, увеличенным связыванием с белками и/или измененной внутриклеточной локализацией.

Композиции согласно изобретению могут необязательно быть химерными, олигонуклеотидами. Химерные олигонуклеотиды представляют собой олигонуклеотиды, имеющие формулу: 5’Y₁N₁ZN₂Y₂3’. Y₁ и Y₂ представляют собой молекулы нуклеиновой кислоты, имеющие от 1 до 10 нуклеотидов. Y₁ и Y₂ каждый включает в себя по меньшей мере одну модифицированную межнуклеотидную связь. Так как по меньшей мере 2 нуклеотида из химерных олигонуклеотидов включают модификации остова, данные нуклеиновые кислоты являются примером одного типа "стабилизированных иммуностимулирующих нуклеиновых кислот".

В отношении химерных олигонуклеотидов Y₁ и Y₂ рассматриваются как независимые один от другого. Это означает, что каждый из Y₁ и Y₂ может или не может иметь различные последовательности и отличные один от другого связи остова в той же самой молекуле. Последовательности варьируют, но в некоторых случаях Y₁ и Y₂ имеют поли-G-последовательность. Поли-С-последовательность означает имеющую по меньшей мере 3 G в ряду. В других осуществлениях поли-С-последовательность означает имеющую по меньшей мере 4, 5, 6, 7 или 8G в ряду. В других осуществлениях Y₁ и Y₂ могут представлять собой TCGTCG, TCGTCGT или TCGTCGTT (SEQ ID NO: 1145). Y₁ и Y₂ могут также иметь поли-С, поли-Т или поли-А-последовательность. В некоторых осуществлениях Y₁ и/или Y₂ имеют от 3 до 8 нуклеотидов.

N₁ и N₂ представляют собой молекулы нуклеиновых кислот, имеющие от 0 до 5 нуклеотидов, и имеют такую длину, чтобы N₁ZN₂ имел по меньшей мере 6 нуклеотидов в сумме. Нуклеотиды N₁ZN₂ имеют фосфодиэфирный остов и не включают в себя нуклеиновые кислоты, имеющие модифицированный остов.

Z представляет собой мотив иммуностимулирующей нуклеиновой кислоты, но не включает в себя CG. Например, Z может быть нуклеиновой кислотой с Т-обогащенной

последовательностью, например, включающей в себя ТТТТ мотив или последовательность, в которой по меньшей мере 50% оснований последовательности представляют собой Т или Z может быть TG-последовательностью.

Центральные нуклеотиды (N₁ZN₂) формулы Y₁N₁ZN₂Y₂ имеют фосфодиэфирные межнуклеотидные связи, а Y₁ и Y₂ имеют по меньшей мере одну, но могут иметь более одной или даже могут иметь все модифицированные межнуклеотидные связи. В предпочтительных осуществлениях Y₁ и/или Y₂ имеют по меньшей мере две или от двух до пяти модифицированных межнуклеотидных связей, или Y₁ имеет две модифицированные межнуклеотидные связи и Y₂ имеет пять модифицированных межнуклеотидных связей, или Y₁ имеет пять модифицированных межнуклеотидных связей и Y₂ имеет две модифицированные межнуклеотидные связи. Модифицированные межнуклеотидные связи в некоторых осуществлениях представляют собой фосфортиоатные модифицированные связи, фосфордитиоатные модифицированные связи или п-этокси модифицированные связи.

Модифицированные остовы, такие как фосфортиоаты, могут быть синтезированы с применением автоматических способов с использованием либо фосфорамидата или Н-фосфоната в качестве химических реагентов. Арил- и алкилфосфонаты могут быть получены, например, как описано в патенте США № 4469863; и алкилфосфотриэфиры (в которых заряженная кислородная часть алкилирована, как описано в патенте США № 5023243 и в европейском патенте №092574) могут быть получены с помощью автоматического твердофазного синтеза с применением имеющихся в продаже реактивов. Описаны способы для создания других модификаций остова ДНК и замещений (Uhlmann, E. and Peyman, A., Chem. Rev. 90: 544, 1990; Goodchild, J., Bioconjugate Chem. 1: 165, 1990).

Другие стабилизированные нуклеиновые кислоты включают в себя аналоги ДНК, такие как алкил- и арилфосфатные (в которых заряженный кислород фосфоната замещен алкильной или арильной группой), фосфодиэфирные и алкилфосфотриэфирные, в которых заряженная кислородная часть алкилирована. Нуклеиновые кислоты, которые содержат диол, такой как тетраэтиленгликоль или гексаэтиленгликоль, либо на одном, либо на обоих концах, так же, как показано, являются по существу устойчивыми к деградации под действием нуклеаз.

В случае, когда Ру-обогащенная или TG-нуклеиновая кислота вводится в сочетании с антигеном, который кодируется в векторе нуклеиновой кислоты, предпочтительно, чтобы остов Ру-обогащенной или TG-нуклеиновой кислоты представлял собой химерную комбинацию фосфодиэфира и фосфортиоата (или другую модификацию фосфата). Можно столкнуться с проблемой захвата клеткой плазмидного вектора в присутствии полностью фосфортиоатной нуклеиновой кислоты. Тогда, когда субъекту доставляются как вектор, так и нуклеиновая кислота, предпочтительно, чтобы нуклеиновая кислота имела химерный остов или имела фосфортиоатный остов, но чтобы плазмида была связана с носителем, который доставляет ее прямо в клетку, чтобы избежать в результате этого необходимости захвата клетками. Такие носители известны в данной области техники и включают в себя, например, липосомы и генные пушки.

Описанные здесь нуклеиновые кислоты, так же как контрольные нуклеиновые кислоты представлены в таблице А в конце описания.

В то время как эффекты CpG у мышей хорошо охарактеризованы, информация в отношении систем человека ограничена. CpG-фосфортиоатные олигонуклеотиды с сильной стимулирующей активностью в системах мыши проявляют меньшую активность на человеке и иммунных клетках других животных, не являющихся грызунами. В примерах описана разработка CpG-мотива человека с сильной активностью и характеристика его эффектов и механизмов действия на первичные В-клетки человека. ДНК, содержащие данный pG мотив, сильно стимулировали первичные В-клетки человека в отношении пролиферации, продукции МЛ-6 и экспрессии увеличенных уровней CD86, CD40, CD54 и МНС II. Они увеличивали ДНК-связывающую активность транскрипционных факторов NFkB и API, так же как фосфорилирование активируемых стрессом протеинкиназ JNK и р38 и транскрипционного фактора ATF-2. Пути передачи сигнала в В-клетках, активированных CpG-ДНК, отличались от тех, которые активируются через рецептор В-клеток, который активировал ERK и другую изоформу JNK, но не активировал р38 и ATF-2. В целом данные об инициированной CpG-ДНК передаче сигнала совпадают с таковыми, полученными на мышах (Hacker H., et al., 1998. Embo J 17:6230, Yi А. К., and Krieg A. M. 1998. J Immunol 161:4493).

Предпочтительный мотив для животных, не являющихся грызунами, представляет собой 5’-TCGTCGTT-3’. Замена оснований в наиболее сильном 8-членном CpG-мотиве (5’-TCGTCGTT-3’) снижало активность олигонуклеотида. Тимидины в 5’- и 3’- положениях данного мотива были более важными, чем тимидин в центральном положении. Аденин или гуанозин в центральном положении вызывали снижение активности.

Следует отметить, что исследования авторов показывают, что одного CpG-мотива в фосфодиэфирном олигонуклеотиде (2080) достаточно для получения максимального эффекта и что дополнительные CpG-мотивы (2059) дополнительно не увеличивают активность. Олигонуклеотид с 8-членным мотивом 5’TCGTCGTT3’ (2080), содержащий два CpG-динуклеотида, проявлял в исследованиях наибольшую активность. Замещение оснований, примыкающих к двум CpG-динуклеотидам (5’положение, центральное положение, 3’положение), снижало активность данной последовательности. Оба CpG-динуклеотида с 8-членным CpG-мотивом требовались для оптимальной активности (2108, 2106). Метилирование цитидина в CpG-динуклеотидах (2095) уничтожало активность 2080, в то время как метилирование не относящегося к этому цитидина (2094) не влияло. Добавление двух CpG-мотивов в последовательность 2080 приводило в 2059 к дополнительному увеличению активности фосфодиэфирного олигонуклеотида. Последовательность 2080 с фосфортиоатным остовом (2116) проявила меньшую активность, что предполагает, что дополнительные CpG-мотивы предпочтительны для сильного фосфортиоатного олигонуклеотида.

В соответствии с изобретением, было открыто, что иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты охватывают сильные иммуностимулирующие эффекты на клетки человека, такие как NK-клетки, В-клетки и DC in vitro. Показано, что применяемые здесь тесты in vitro предсказывают эффективность in vivo в виде адъюванта вакцины у позвоночных, не являющихся грызунами (пример 12), что предполагает, что иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты являются эффективными терапевтическими агентами для вакцинации человека, иммунотерапии рака, иммунотерапии астмы, общего увеличения иммунной функции, увеличения выявления клеток гематопоэза после облучения или химиотерапии и для других применений иммуномодуляции.

Таким образом, иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты полезны в некоторых вариантах изобретения в качестве профилактической вакцины для лечения субъекта при риске развития инфекции у инфицированного организма или рака, при котором идентифицирован специфический раковый антиген, или аллергии или астмы, при которых аллерген предрасположенности к астме известен. Иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты могут быть также использованы без антигена или аллергена для более короткой защиты от инфекции, аллергии или рака, и в данном случае повторные дозы должны создать более длительную защиту. Применяемый здесь термин - субъект, имеющий риск относится к субъекту, который имеет какой-либо риск соприкосновения с инфекцией, вызываемой патогеном или раком, или аллергеном, или риск развития рака. Например, субъект, имеющий риск, может быть субъектом, который планирует путешествие в зону, в которой найден конкретный тип инфекционного агента, или это может быть субъект, который в силу своего образа жизни или медицинских процедур контактирует с жидкостями тела, которые содержат инфекционные организмы, или прямо с организмом, или даже любой субъект, живущий в той области, где идентифицирован инфекционный организм или аллерген. "Субъект, имеющий риск развития инфекции", также означает общие популяции, для которых медицинское учреждение рекомендует вакцинацию антигеном конкретного инфекционного организма. Если антиген является аллергеном, у субъекта развивается аллергические ответы на данный конкретный антиген, и субъект может быть подвержен действию антигена, т.е. если настал сезон цветения, субъект имеет риск экспозиции с антигеном пыльцы. "Субъект, имеющий риск развития аллергии или астмы", относится также к субъектам, которые известны как имеющие аллергию или астму, но не имеющие активной формы болезни в течение лечения иммуностимулирующей нуклеиновой кислотой, так же как к субъектам, которые рассматриваются как имеющие риск развития данных заболеваний из-за генетических факторов или факторов окружающей среды.

Субъект, имеющий риск развития рака, является одним из тех, кто имеет высокую вероятность развития рака. Это понятие относится к субъектам, которые, например, имеют генетические дефекты, наличие которых, как показано, коррелирует с повышенной вероятностью развития рака, и к субъектам, которые сталкиваются с агентами, вызывающими рак, такими как табак, асбест или другие химические токсины, или к субъектам, которые ранее лечились от рака и находятся в состоянии несомненной ремиссии. Когда субъекта, имеющего риск развития рака, лечат антигеном, специфичным для типа рака, в отношении которого у субъекта есть риск развития, и иммуностимулирующей нуклеиновой кислотой, субъект может приобрести способность уничтожать раковые клетки по мере их возникновения. Если у субъекта начала образовываться опухоль, у субъекта должен развиться специфический иммунный ответ против антигена опухоли.

В дополнение к применению иммуностимулирующих нуклеиновых кислот для профилактического лечения изобретение также охватывает применение иммуностимулирующих нуклеиновых кислот для лечения субъекта, имеющего инфекцию, аллергию, астму или рак.

Субъект, имеющий инфекцию, представляет собой субъекта, который встречался с инфекционным патогеном и имеет острый или хронический определяемый уровень патогена в организме. Иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты могут быть использованы с антигеном для повышения антигенспецифического системного ответа или иммунного ответа слизистой, что способно снизить уровень или уничтожить инфекционный патоген. Применяемый здесь термин "инфекционное заболевание" представляет собой заболевание, возникающее в результате присутствия в организме чужеродного организма. Особенно важно разработать стратегии эффективной вакцинации и лечения для защиты слизистых поверхностей организма, которые являются первичными воротами инфекции.

Субъект, имеющий аллергию, представляет собой субъекта, который имеет аллергическую реакцию или риск ее развития в ответ на аллерген. Аллергия означает приобретенную гиперчувствительность к веществу (аллергену). Аллергические состояния включают в себя, но не ограничиваются этим, экзему, аллергический ринит или острый ринит, сенную лихорадку, конъюнктивит, бронхиальную астму, крапивницу (сыпь) и пищевые аллергии, а также другие атопические состояния.

В настоящее время аллергические заболевания обычно лечат путем введения малых доз антигена, за которыми следует последующая увеличивающаяся дозировка антигена. Считается, что данная процедура вызывает толерантность к аллергену, предотвращающую дальнейшие аллергические реакции. Данные способы, однако, могут занять несколько лет для достижения эффективности и связаны с риском побочных эффектов, таких как анафилактический шок. Способы согласно изобретению лишены таких проблем.

Аллергии обычно вызываются генерацией антител IgE против безвредных аллергенов. Цитокины, которые индуцируются в результате системного введения или введения в слизистые иммуностимулирующих нуклеиновых кислот, принадлежат

преимущественно к классу, называемому Th1 (примерами являются ИЛ-12 и IFN-γ), и они индуцируют как гуморальный, так и клеточный иммунные ответы. Типы антител, связанные с Th1-ответом, обычно обладают большей защитной активностью, так как они имеют высокую способность к нейтрализации и опсонизации. Другой основной тип иммунного ответа, который связан с продукцией цитокинов - ИЛ-4, ИЛ-5 и ИЛ-10, называют Тh2-типом иммунного ответа. Тh2-ответы вовлекают преимущественно антитела, и это имеет меньший защитный эффект против инфекций, и некоторые Тh2-изотипы (например, IgE) связаны с аллергией. В целом предполагается, что аллергические заболевания опосредуются Th2-типом иммунных ответов, в то время как Th1-ответы обеспечивают наилучшую защиту от инфекции, хотя избыточные Th1-ответы связаны с аутоиммунным заболеванием. Основываясь на способности иммуностимулирующих нуклеиновых кислот сдвигать иммунный ответ у субъекта с Th2 (который связан с продукцией IgE антител и аллергией) на Th1-ответ (который является защитным против аллергических реакций), субъекту для лечения или профилактики аллергии может быть введена эффективная доза иммуностимулирующей нуклеиновой кислоты для индукции иммунного ответа.

Таким образом, иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты имеют существенную терапевтическую применимость при лечении аллергических и неаллергических состояний, таких как астма. Уровень Th2-цитокинов, особенно ИЛ-4 и ИЛ-5, увеличен в дыхательных путях субъектов с астмой. Данные цитокины способствуют развитию основных вариантов астматического воспалительного ответа, включая переключение на IgE изотип, хемотаксис эозинофилов и активацию роста тучных клеток. Th1-цитокины, особенно ifn-γ и ИЛ-12, могут подавлять образование Тh2-клонов и продукцию Тh2-цитокинов. Астма относится к состоянию респираторной системы, характеризуемому воспалением, сужением дыхательных путей и увеличенной реакцией дыхательных путей на вдыхаемые агенты. Астма часто, хотя не исключительно, связана с атопическими или аллергическими синдромами.

Субъект, имеющий рак, представляет собой субъект, который имеет определяемые раковые клетки. Раки или опухоли включают в себя, но не ограничиваются этим, рак желчных путей; рак мозга; рак молочной железы; рак шейки матки; хориокарциному; рак толстой кишки; рак эндометрия; рак пищевода; рак желудка; внутриэпителиальные неоплазии; лимфомы; рак печени; рак легких (например, мелкоклеточный и немелкоклеточный); меланому; нейробластомы; рак рта; рак яичников; рак поджелудочной железы; рак простаты; рак прямой кишки; саркомы; рак кожи; рак семенников; рак щитовидной железы и рак почек, так же как другие карциномы и саркомы. В одном осуществлении рак представляет собой лейкемический ретикулез, хронический миелоидный лейкоз, лейкоз кожных Т-клеток, множественную миелому, фолликулярную лимфому, злокачественную меланому, сквамозноклеточную карциному, рак клеток почки, рак простаты, рак клеток мочевого пузыря или рак прямой кишки.

Субъект в соответствии с изобретением, представляет собой субъекта, не являющегося грызуном. Субъект, не являющийся грызуном, должен обозначать человека или позвоночного животного, например, может быть, но не ограничиваясь ими, собакой, кошкой, лошадью, коровой, свиньей, овцой, козой, цыпленком, приматом, например обезьяной, и рыбой (разводимые в воде виды), например лосось, но конкретно исключая грызунов, таких как крысы и мыши.

Таким образом, изобретение может быть также применено для лечения рака и опухолей у субъектов, не являющихся человеком. Рак является одной из лидирующих причин смерти домашних животных (т.е. кошек и собак). Рак обычно поражает старых животных, которые, в случае домашних животных, становятся интегрированными в семью. Сорок пять процентов собак старше 10 лет, вероятно, становятся жертвами болезни. Наиболее обычные возможности лечения включают в себя хирургию, химиотерапию и радиационную терапию. Другие возможности лечения, которые были применены с некоторым успехом, включают в себя лазерную терапию, криотерапию, гипертермию и иммунотерапию. Выбор терапии зависит от типа рака и степени распространения. Кроме случаев, когда малигниезированный рост ограничен дискретной областью организма, трудно удалить только опухолевую ткань без влияния также на нормальные клетки.

Злокачественные нарушения, обычно диагностирующиеся у собак и кошек, включают в себя, но не ограничиваются этим, лимфосаркому, остеосаркому, опухоли молочных желез, мастоцитому, опухоль мозга, меланому, аденосквамозную карциному, карциноидную опухоль мозга, опухоль бронхиальной железы, бронхиолярную аденокарциному, фиброму, миксохондрому, саркому легких, нейросаркому, остеому, папиллому, ретинобластому, саркому Эвинга, опухоль Вилма, лимфому Беркитта, микроглиому, нейробластому, остеокластому, неоплазии рта, фибросаркому, остеосаркому и рабдомиосаркому. Другие неоплазии у собак включают в себя сквамозноклеточную карциному гениталий, передающуюся венерически опухоль, опухоль семенников, семиному, опухоль клеток Сертоли, гемангиоперицитому, гистиоцитому, хлорому (гранулоцитную саркому), папиллому роговицы, сквамозноклеточную карциному роговицы, гемангиосаркому, плевральную мезотелиому, базальноклеточную опухоль, тимому, опухоль желудка, карциному надпочечников, папилломатоз рта, гемангиоэндотелиому и цистаденому. Дополнительные злокачественные образования, диагностируемые у собак, включают в себя фолликулярную лимфому, лимфосаркому кишечника, фибросаркому и сквамозноклеточную карциному легких. Известно, что у хорька, даже более популярного домашнего животного, развивается инсулинома, лимфома, саркома, нейрома, опухоль островкового аппарата поджелудочной железы, лимфома желудка MALT и аденокарцинома желудка.

Неоплазии, развивающиеся у сельскохозяйственного домашнего скота, включают в себя лейкозы, гемангиоперицитому и неоплазию глаза быков (у крупного рогатого скота); препуциальную фибросаркому, язвенную сквамозноклеточную карциному, препуциальную карциному, неоплазии соединительной ткани и мастоцитому (у лошадей); гепатоклеточную карциному (у свиньи); лимфому и аденоматоз легких (у овцы); саркому легких, лимфому, саркому Рауса, ретикулэндотелиоз, фибросаркому, нефробластому, В-клеточную лимфому и лимфоидный лейкоз (у видов овец); ретинобластому, неоплазию печени, лимфосаркому (лимфобластную саркому), плазмацитоидный лейкоз и саркому плавательного пузыря (у рыб), творожистый лимфаденит (CLA): хроническое инфекционное, заразное заболевание овец и коз, вызываемое бактерией Corynebacterium pseudotuberculosis, и заразную опухоль легких овец, вызываемую jaagsiekte.

Субъект подвергается воздействию антигена. Применяемый здесь термин "подвергается воздействию" относится либо к активной стадии контактирования субъекта с антигеном, либо пассивное экспонирование субъекту антигена in vivo. Способы активного экспонирования антигена субъекту хорошо известны специалистам в данной области техники. В целом антиген вводят прямо субъекту любым способом, таким как внутривенное, внутримышечное, пероральное, трансдермальное введение, введение в слизистую, интраназальное, внутритрахеальное или подкожное введение. Антиген может быть введен системно или местно. Способы введения антигена и иммуностимулирующей нуклеиновой кислоты описаны более подробно ниже. Субъект пассивно экспонируется с антигеном, например, при входе в организм чужеродного патогена или при развитии опухолевой клетки, экспрессирующей чужеродный антиген на своей поверхности.

Способы, в которых субъект пассивно экспонируется с антигеном, могут особенно зависеть от временного режима введения иммуностимулирующей нуклеиновой кислоты. Например, в случае субъекта с риском развития рака или инфекционного заболевания, или аллергического или астматического ответа, субъекту можно вводить иммуностимулирующую нуклеиновую кислоту регулярно, когда риск наибольший, т.е. в течение аллергенного сезона или после встречи с агентом, вызывающим рак. Дополнительно иммуностимулирующую нуклеиновую кислоту можно вводить путешественникам перед их путешествием заграницу, где они рискуют встретиться с инфекционными агентами. Таким же образом иммуностимулирующая нуклеиновая кислота может быть введена солдатам или гражданским при риске встречи с биологическим оружием для индукции системного иммунного ответа или ответа слизистой на антиген, когда и если субъект с ним встретится.

Применяемый здесь термин "антиген" представляет собой молекулу, вызывающую иммунный ответ. Антигены включают в себя, но не ограничиваются этим, клетки, клеточные экстракты, белки, полипептиды, пептиды, полисахариды, полисахаридные конъюгаты, пептидные и непептидные миметики полисахаридов и другие молекулы, небольшие молекулы, липиды, гликолипиды, углеводы, вирусы и экстракты вирусов, а также многоклеточные организмы, такие как паразиты и аллергены. Термин антиген в широком смысле включает в себя любой тип молекулы, который признается иммунной системой хозяина как чужеродный. Антигены включают в себя, но не ограничиваются этим, раковые антигены, микробные антигены и аллергены.

Применяемый здесь термин "раковый антиген" представляет собой соединение, такое как пептид или белок, которое связано с поверхностью опухолевой или раковой клетки и которое способно вызывать иммунный ответ при экспрессии на поверхности антиген-представляющей клетки совместно с молекулой МНС. Раковые антигены могут быть получены из раковых клеток либо путем получения сырых экстрактов опухолевых клеток, например, как описано Cohen, et al., 1994, Cancer Research, 54: 1055, путем частичной очистки антигенов, рекомбинантным способом, либо с помощью синтеза de novo известных антигенов. Раковые антигены включают в себя, но не ограничиваются этим, рекомбинантно экспрессируемые антигены, их иммуногенную часть или целую опухоль или раковую опухоль. Такие антигены могут быть выделены или получены с помощью рекомбинантных способов или любых других способов, известных в данной области техники.

Применяемый здесь термин "микробный антиген" представляет собой антиген микроорганизма и включает в себя, но не ограничивается этим, вирусы, бактерии, паразиты и грибы. Такие антигены включают в себя интактный микроорганизм, а также природные изоляты и их фрагменты или производные, а также синтетические соединения, которые идентичны или сходны с антигенами природного микроорганизма и индуцируют иммунный ответ, специфичный для данного микроорганизма. Соединение сходно с антигеном природного микроорганизма, если оно индуцирует иммунный ответ (гуморальный и/или клеточный) к антигену природного микроорганизма. Такие антигены обычно применяют в данной области техники и они хорошо известны специалистам в данной области.

Примеры вирусов, которые найдены у человека, включают в себя, но не ограничиваются этим, Retroviridae (например, вирусы иммунодефицита человека, такие как ВИЧ-1 (также обозначаемый как HTLV-III, LAV или HTLV-III/LAV, или HIV-III; и другие изоляты, такие как HIV-LP; Picornaviridae (например, полиовирусы, вирус гепатита А; энтеровирусы; вирусы Coxsackie человека, риновирусы, эховирусы); Calciviridae (например, штаммы, которые вызывают гастроэнтерит); Togaviridae (например, вирусы энцефалита лошадей, вирусы коревой краснухи); Flaviridae (например, вирусы денге, вирусы энцефалита, вирусы желтой лихорадки); Coronoviridae (например, коронавирусы); Rhabdoviradae (например, вирусы везикулярного стоматита, вирусы бешенства); Coronaviridae (например, коронавирусы); Rhabdoviradae (например, вирусы везикулярного стоматита, вирусы бешенства); Filoviridae (например, вирусы лихорадки эбола); Paramyxoviridae (например, вирусы парагриппа, вирусы свинки, вирус кори, вирус дыхательного синцития); Orthomyxoviridae (например, вирусы гриппа); Bungaviridae (например, вирусы Hantaan, вирусы bunga, флебовирусы и вирусы Nairo); Arena viridae (вирусы геморрагической лихорадки); Reoviridae (например, реовирусы, орбивирусы и ротавирусы); Birnaviridae;

Hepadnaviridae (вирус гепатита В); Parvoviridae (парвовирусы); Papovaviridae (вирусы папилломы, вирусы полиомы); Adenoviridae (большинство аденовирусов);

Herpesviridae (вирус простого герпеса (HSV) 1 и 2, вирус ветряной оспы, цитомегаловирус (CMV), вирус герпеса; Poxviridae (вирусы оспы, вирусы коровьей оспы, поксвирусы); и Iridoviridae (например, вирус африканской лихорадки свиней); и неклассифицированные вирусы (например, агенты, вызывающие губчатые энцефалиты, агент гепатита дельта (как предполагается, являющийся вирусом-сателлитом гепатита В), агенты гепатита не-А, не-В (класс 1 = передающийся через внутренние органы; класс 2 = передающийся парентерально (т.е. гепатита С); вирусы Norwalk и относящиеся к ним вирусы, а также астровирусы).

У позвоночных животных антигенами служат как грамположительные, так и грамотрицательные бактерии. Такие грамположительные бактерии включают в себя, но не ограничиваются этим, виды Pasteurella, виды Staphylococci и виды Streptococcus. Грамотрицательные бактерии включают в себя, но не ограничиваются этим, Escherichia coli, виды Pseudomonas и виды Salmonella. Конкретные примеры инфекционных бактерий включают в себя, но не ограничиваются этим, Helicobacter pyloris, Borelia burgdorferi, Legionella pneumophilia, Mycobacteria sps (например, M. tuberculosis, M. avium, M. intracellulare, M. kansaii, M. gordonae), Staphylococcus aureus, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Listeria monocytogenes. Streptococcus pyogenes (Streptococcus группы А), Streptococcus agalactiae (Streptococcus группы В), Streptococcus (группа viridans), Streptococcus faecalis, Streptococcus bovis, Streptococcus (анаэробные виды), Streptococcus pneumoniae, патогенная Campylobacter sp., Enterococcus sp., Haemophilus infiuenzae, Bacillus antracis, corynebacterium diphtheriae, corynebacterium sp., Erysipelothrix rhusiopathiae, Clostridium perfringers, Clostridium tetani, Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae, Pasturella multocida, Bacteroides sp., Fusobacterium nucleatum, Streptobacillus moniliformis, Treponema pallidium, Treponema pertenue, Leptospira, Rickettsia и Actinomyces israelli.

Примеры грибов включают в себя Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis, Blastomyces dermatitidis, Chlamydia trachomatis, Candida albicans.

Другие инфекционные организмы (т.е. простейшие) включают в себя Plasmodium spp., такие как Plasmodium falciparum, Plasmodium malariae, Plasmodium ovale и Plasmodium vivax, a также Toxoplasma gondii. Паразиты крови-костей и/или тканей включают в себя Plasmodium spp., Babesia microti, Babesia divergens, Leishmania tropica, Leishmania spp., Leishmania braziliensis, Leishmania donovani, Trypanosoma gambiense и Trypanosoma rhodesiense (африканская сонная болезнь), Trypanosoma cruzi (болезнь Chagas’) и Toxoplasma gondii.

Другие относящиеся к медицине микроорганизмы подробно описаны в литературе, например, смотри C.G.A Thomas, Medical Microbiology, Bailliere Tindall, Great Britain 1983, полное содержание которой включено здесь в качестве ссылки.

Хотя многие из микробных агентов, описанных выше, относятся к заболеваниям человека, изобретение также полезно для лечения других позвоночных, не являющихся человеком. Позвоночные, не являющиеся человеком, также могут подвергаться инфекции, которая может быть предотвращена или вылечена раскрытыми здесь иммуностимулирующими нуклеиновыми кислотами. Например, в дополнение к лечению инфекционных заболеваний человека способы изобретения полезны для лечения инфекций у животных.

Применяемые здесь термины "лечить", "подвергнутый лечению", "лечение" при применении в отношении инфекционного заболевания, означают профилактическое лечение, которое увеличивает устойчивость субъекта (субъекта, имеющего риск инфекции) к инфекции, вызываемой патогеном или, другими словами, снижает вероятность того, что субъект станет инфицированным патогеном, а также лечение после того, как субъект (субъект, который инфицирован) становится инфицированным, для того, чтобы бороться с инфекцией, например снижать или уничтожать инфекцию или предотвращать ее усиление.

Много вакцин для лечения позвоночных, не являющихся человеком, раскрыто Benett, К. Compendium of Veterinary Products, 3rd ed. North American Compendiums, Inc., 1995. Как обсуждалось выше, антигены включают в себя инфекционные микробы, такие как вирус, паразит, бактерии и грибы и их фрагменты, которые происходят из природных или синтетических источников. Инфекционные вирусы позвоночных, как являющихся, так и не являющихся человеком, включают в себя ретровирусы, РНК-овые вирусы и ДНК-овые вирусы. Данная группа ретровирусов включает в себя как простые ретровирусы, так и сложные ретровирусы. Простые ретровирусы включают в себя подгруппу ретровирусов типа В, ретровирусов типа С и ретровирусов типа D. Примером ретровируса типа В является вирус опухоли молочной железы мыши (MMTV). Ретровирусы типа С включают в себя подгруппы группы типа С (включая вирус саркомы Рауса (RVS), вирус лейкоза птиц (ALV) и вирус миелобластоза птиц (AMV)) и группу В типа С (включая вирус лейкоза кошачьих (FeLV), вирус лейкоза человекообразной обезьяны - гиббона (GALV), вирус некроза селезенки (SNV), вирус ретикулоэндотелиоза (RV) и вирус саркомы обезьяньих (SSV)). Ретровирусы типа D включают в себя вирус обезьяны Mason-Pfizer (MPMV) и ретровирус обезьяньих типа 1 (SRV-1). Сложные ретровирусы включают в себя подгруппы лентивирусов, вирусов лейкоза Т-клеток и пенящих вирусов. Лентивирусы включают в себя ВИЧ-1, но также включают в себя ВИЧ-2, SIV, вирус Visna, вирус иммунодефицита кошачьих (FIV) и вирус инфекционной анемии лошадиных (EIAV). Вирусы лейкоза Т-клеток включают в себя HTLV-1, HTLV-II, вирус Т-клеточного лейкоза обезьяньих (STLV) и вирус лейкоза коров (BLV). Пенящие вирусы включают в себя пенящий вирус человека (HFV), пенящий вирус обезьяньих (SFV) и пенящий вирус коров (BFV).

Примеры других РНК-овых вирусов, которые являются антигенами у позвоночных животных, включают в себя, но не ограничиваются этим, членов семейства Reoviridae, включая род Orthoreovirus (множественные серологические типы ретровирусов как млекопитающих, так и птиц), род Orbivirus (вирус Bluetongue, вирус Eugenangee, вирус Kemerovo, вирус болезни африканских лошадей и вирус колорадской клещевой лихорадки), род Rotavirus (ротавирус человека, вирус диарреи телят Небраски, ротавирус обезьяньих, ротавирус коров или овец, ротавирус птиц); семейство Picornaviridae, включая род Enterovirus (полиовирус, вирус А и В Коксаки, кишечные цитопатические сиротские вирусы человека (ECHO), вирус гепатита А, энтеровирусы обезьяньих, вирусы энцефаломиелита мышей, полиовирус muris, энтеровирусы коров, энтеровирусы свиней, род Cardiovirus (вирус энцефаломиокардита (ЕМС), менговирус), род Rhinovirus (риновирусы человека, включающие в себя по меньшей мере 113 подтипов, другие риновирусы), род Apthovirus (заболевание рта и ног (FMDV); семейство Calviviridae, включая вирус везикулярной экзантемы свиней, вирус морского льва San Miguel, пикорнавирус кошачьих и вирус Norwalk; семейство Togaviridae, включая род Alphavirus (вирус восточного лошадиного энцефалита, вирус лесов Semliki, вирус Sindbis, вирус Chikungunya, вирус О’Nyong-Nyong, вирус реки Ross, вирус венесуэльского лошадиного энцефалита, вирус западного лошадиного энцефалита), род Flavirjus (вирус переносимой москитами желтой лихорадки, вирус денге, вирус японского энцефалита, вирус энцефалита St. Louis, вирус энцефалита Murray Valley, вирус West Nile, вирус Kunjin, вирус, переносимый центрально-европейским клещем, вирус, переносимый дальневосточным клещем, вирус леса Kyasanur, вирус Louping III, вирус Powassan, вирус омской геморрагической лихорадки), род Rubivirus (вирус коревой краснухи), род Pestivirus (вирус болезни слизистых, вирус холеры свиней, вирус пограничного состояния), семейство Bunyaviridae, включая род Bunyvirus (Bunyamwera и относящиеся к нему вирусы, группа вирусов калифорнийского энцефалита), род Phlebovirus (сицилийский вирус лихорадки, переносимой песчаной мухой, вирус лихорадки рифтовой долины), род Nairovirus (вирус геморрагической лихорадки Crimean-Congo, вирус болезни овец в Найроби) и род Uukuvirus (Uukuniemi и относящиеся к этому вирусы); семейство Orthomyxoviridae, включая род вируса гриппа (вирус гриппа типа А, многие

подтипы человека); вирус гриппа свиней и вирусы гриппа овец и лошадей; вирус гриппа типа В (многие подтипы человека) и гриппа типа С (возможно отдельный род); семейство Paramyxoviridae, включая род Paramyxovirus (вирус парагриппа типа I, вирус Сендай, вирус гемадсорбции, вирусы парагриппа типов с 2 по 5, вирус болезни Ньюкасла, вирус свинки), род Morbillivirus (вирус кори, вирус подострого склерозирующего панэнцефалита, вирус собачьей чумы, вирус чумы рогатого скота), род Pneumovirus (вирус дыхательного синцития (RSV), вирус дыхательного синцития коров и вирус пневмонии); семейство Rhabdoviridae, включая род Vesiculovirus (VSV), вирус Chandipura, вирус Flanders-Hart Park), род Lyssavirus (вирус бешенства), рабдовирусы рыб и два вероятных рабдовируса (вирус Марбурга и вирус Эбола); семейство Arenaviridae, включая вирус лимфоцитного хориоменингита (LCM), комплекс вирусов Tacaribe и лассавирус; семейство Coronoviridae, включая вирус инфекционного бронхита (IBV), вирус гепатита, коронавирус кишечника человека и вирус инфекционного перитонита кошачьих (коронавирус кошачьих).

Примеры ДНК-овых вирусов, которые являются антигенами у позвоночных животных, включают в себя, но не ограничиваются этим, семейство Poxviridae, включая род Orthopoxvirus (оспа большая, оспа малая, pox Vaccinia обезьян, оспа коров, оспа буйволов, оспа кроликов, Ectomelia), род Leporipoxvirus (миксома, фиброма), род Avipoxvirus (оспа домашней птицы, другие поксвирусы птиц), род Capripoxvirus (оспа овец, оспа коз), род Suipoxvirus (оспа свиней), род Parapoxvirus (вирус инфекционного postular дерматита, псевдооспа коров, вирус папулезного стоматита коров); семейство Iridoviridae (вирус африканской лихорадки свиней, вирусы лягушек 2 и 3, вирус лимфоцисты рыб); семейство Herpesviridae, включая вирусы герпеса альфа (простого герпеса типов 1 и 2, опоясывающей ветряной оспы, вирус абортирования лошадей, вирус герпеса лошадей 2 и 3, вирус псевдобешенства, вирус инфекционного кератоконъюнктивита коров, вирус инфекционного ринотрахеита коров, вирус ринотрахеита кошачьих, вирус инфекционного ларинготрахеита), вирусы герпеса-бета (цитомегаловирус человека и цитомегаловирусы свиней и обезьян); вирусы герпеса-гамма (вирус Эпштейна-Барра (EBV), вирус болезни Marek'a, герпес saimiri, вирус герпеса ateles, вирус герпеса sylvilagus, вирус герпеса морских свинок, вирус опухоли Lucke); семейство Adenoviridae, включая род Mastadenovirrus (подгруппы человека А, В, С, D, Е и несгруппированные; аденовирусы обезьяньих (по меньшей мере, 23 серотипа), вирус инфекционного гепатита собачьих и аденовирусы крупного рогатого скота, свиней, овец, лягушек и многих других видов, род Aviadenovirus (аденовирусы птиц) и не поддающиеся культивированию аденовирусы; семейство Papoviridae, включая род Papillomavirus (вирусы папилломы человека, вирусы папилломы коров, вирус папилломы кроликов Shope и вирусы различных патогенных папиллом других видов), род Polyomavirus (вирус полиомы, вакуолизирующий агент обезьяньих (SV-40), вакуолизирующий агент кроличьих (RKV), К-вирус, ВК-вирус, JC-вирус и другие вирусы полиомы приматов, такие как вирус лимфотрофической папилломы); семейство Parvoviridae, включая род адено-ассоциированных вирусов, род Parvovirus (вирус панлейкопении кошачьих, парвовирус коров, парвовирус собачьих, вирус болезни алеутских норок и т.д.). Наконец, ДНК-овые вирусы могут включать в себя вирусы, которые не попадают в указанные выше семейства, такие как вирусы болезни Kuru и Creutzfeldt-Jacob и хронические инфекционные нейропатические агенты (Китайский вирус).

Каждый из указанных выше перечней является иллюстративным и не рассматривается как лимитирующий. В дополнение к применению иммуностимулирующих нуклеиновых кислот для индукции антиген-специфического иммунного ответа у человека способы предпочтительных осуществлении особенно хорошо подходят для лечения птиц, таких как куры, цыплята, индейки, утки, гуси, перепела и фазаны. Птицы являются первостепенными мишенями для многих типов инфекций.

Вылупившиеся птицы подвергаются воздействию патогенных организмов вскоре после рождения. Хотя данные птицы первоначально защищены от патогенов антителами, полученными от матери, данная защита является только временной, и собственная незрелая иммунная система птиц должна начать защищать птицу от патогенов. Часто является желательным предотвращение инфекции у молодых птиц, когда они наиболее восприимчивы. Желательным является также предотвращение инфекции у старых птиц. Особенно, когда птицы содержатся в закрытых помещениях, что ведет к быстрому распространению заболевания. Таким образом, желательно вводить иммуностимулирующую нуклеиновую кислоту и адъювант согласно изобретению, не являющийся нуклеиновой кислотой, птицам для увеличения антигенспецифического иммунного ответа, когда антиген присутствует.

Примером обычной инфекции у цыплят является вирус инфекционной анемии цыплят (CIAV). CIAV первым был выделен в Японии в 1979 году при исследовании перерывов вакцинации при болезни Marek’a (Yuasa et al., 1979, Avian Dis. 23:366-385). С этого времени CIAV был обнаружен в продающейся домашней птице во всех странах, главных производителей домашней птицы (van Bulow et al., 1991, pp.690-699) in Diseases of Poultry, 9th edition, Iowa State University Press).

Инфицирование CIAV приводит к клиническому заболеванию, характеризуемому анемией, геморрагией и иммуносуппрессией у молодых восприимчивых цыплят. Характерным для инфекции CIAV является также атрофия тимуса и костного мозга и сопутствующие повреждения у CIAV-инфицированных цыплят. Снижение лимфоцитов в тимусе и иногда в фабрициевой сумке ведет к иммуносуппрессии и увеличению восприимчивости к вторичным вирусным, бактериальным или грибковым инфекциям, которые затем осложняют течение болезни. Иммуносуппрессия может вызвать обострение заболевания после инфицирования одним или более вирусами болезни Marek’a (MDV), вирусом инфекционного бурсита, вирусом ретикулоэндотелиоза, аденовирусом или реовирусом. Было обнаружено, что патогенез MDV усиливается под действием CIAV (DeBoer et al., 1989, р.28 In Proceedings of the Western Poultry Diseases Conferece, Tempe, Ariz.). Более того, было показано, что CIAV усугубляет признаки инфекционного бурсита (Rosenberger et al., 1989, Avian Dis. 33:707-713). У цыплят развивается возрастная устойчивость к экспериментально индуцированному заболеванию, обусловленному САА. Она по существу заканчивается к 2-недельному возрасту, но старые птицы являются все еще чувствительными к инфекции (Yuasa, N. et al., 1979 выше; Yuasa, N. et al., Arian Diseases 24, 202-209, 1980). Однако если цыплят дважды инфицировать САА и иммуносупрессорным агентом (IBDV, MDV и т.п.), возрастная устойчивость против заболевания снижается (Yuasa, N. et al., 1979 и 1980 выше; Bulow von V. et al., J. Veterinary Medicine 33, 93-116, 1986). Характеристики CIAV, которые могут усилить передачу болезни, включают в себя высокую устойчивость к инактивации в окружающей среде и некоторым обычным дезинфицирующим агентам. Экономическое влияние инфекции CIAV на производство птицы ясно из того факта, что от 10 до 30% инфицированных птиц при вспышках заболевания умирает.

Вакцинация птиц, так же как других позвоночных животных, может быть осуществлена в любом возрасте. Обычно вакцинации проводят до возраста 12 недель в случае живых микроорганизмов и между 14-18 неделями в случае инактивированного

микроорганизма или другого типа вакцины. В случае вакцинации в яйцо вакцинацию можно проводить в последнюю четверть эмбрионального развития. Вакцина может быть введена подкожно, с помощью спрея, перорально, в окологлазное пространство, внутритрахеально, интраназально или с помощью описанных здесь способов доставки через другие слизистые. Таким образом, иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты согласно изобретению можно вводить птицам и другим позвоночным, не являющимися человеком, с применением обычных схем вакцинации, и антиген может быть введен после соответствующего периода времени, как здесь описано.

Крупный рогатый скот и домашний скот также подвержены инфекции. Заболевания, которые поражают данных животных, могут вызывать тяжелый экономический урон, особенно в случае крупного рогатого скота. Способы согласно изобретению могут быть применены для защиты от инфекции домашнего скота, такого как коровы, лошади, свиньи, овцы и козы.

Коровы могут инфицироваться вирусами коров. Вирус диареи коров (BVDV) представляет собой вирус с позитивной цепью РНК и небольшой оболочкой и классифицируется как относящийся вместе с вирусом холеры свиней (HOCV) и вирусом пограничного состояния овец (BDV) к роду пестивирусов. Хотя пестивирусы ранее классифицировались как относящиеся к семейству Togaviridae, в некоторых исследованиях предлагается изменить их классификацию и отнести к семейству Flaviviridae вместе с группами флавивируса и вируса гепатита С (HCV) (Francki, et al., 1991).

BVDV, который является важным патогеном крупного рогатого скота, может быть разделен на основе анализа клеточной культуры на цитопатогенный (СР) и нецитопатогенный (NCP) биотипы. Биотип NCP более широко распространен, хотя оба биотипа могут быть обнаружены у крупного рогатого скота. Если беременная корова становится инфицированной штаммом NCP, корова может родить постоянно инфицированного и специфически иммунотолерантного теленка, который будет распространять вирус в течение своей жизни. Постоянно инфицированный крупный рогатый скот может стать жертвой болезни слизистых и потом оба биотипа могут быть выделены у животного. Клинические проявления могут включать в себя выкидыш, тератогенез и проблемы с дыхательными путями, заболевание слизистых и легкую диарею. Кроме того, описана тяжелая тромбоцитопения, связанная с эпидемией стада, которая может приводить к смерти животного, и штаммы, связанные с данным заболеванием, очевидно, более вирулентны, чем классические BVDV.

Вирусы герпеса лошадей (EHV) включают в себя группу различных по антигенам биологических агентов, которые вызывают множество инфекций у лошадей от субклинических форм до смертельных заболеваний. Они включают в себя вирус герпеса-1 лошадей (EHV-1), повсеместный патоген у лошадей. EHV-1 связан с эпидемиями выкидышей, заболеванием дыхательных путей и нарушениями центральной нервной системы. Первичная инфекция верхних дыхательных путей молодых лошадей ведет к лихорадочному состоянию, которое продолжается в течение периода от 8 до 10 дней. Иммунологически зрелые кобылы могут повторно инфицироваться через дыхательные пути без явного проявления болезни, так что выкидыш обычно наступает без предостерегающих обстоятельств. Неврологический синдром связан с заболеванием дыхательных путей или выкидышем и может поражать животных любого пола в любом возрасте, что ведет к потере координации, слабости и параличу задней части тела (Telford, E. A. R. et al., Virology 189, 304-316, 1992). Другие EHV включают в себя EHV-2 или цитомегаловирус лошадей, EHV-3, вирус коитальной экзантемы, и EHV-4, ранее классифицированный как подтип 2 EHV-1.

Овцы и козы могут инфицироваться множеством опасных микроорганизмов, включая visna-maedi.

Приматы, такие как обезьяны, мартышки и макаки, могут инфицироваться вирусом иммунодефицита обезьяньих. Вакцины из инактивированных клеток с вирусом и бесклеточные вакцины вируса иммунодефицита обезьяньих, как обнаружено, в состоянии создать защиту у макак (Stott et al. (1990) Lancet 36: 1538-1541; Desrosiers et al. PNAS USA (1989) 86: 6353-6357; Murphey-Corb et al. (1989) Science 246: 1293-1297; and Carlson et al. (1990) AIDS Res. Human Retroviruses 6: 1239-1246). Вакцина рекомбинантного ВИЧ gp 120, как обнаружено, создает защиту у шимпанзе (Berman et al. (1990) Nature 345: 622-625).

Кошки, как домашние, так и дикие, восприимчивы к инфицированию множеством микроорганизмов. Например, инфекционный перитонит кошачьих представляет собой заболевание, которое возникает как у домашних, так и у диких кошек, таких как львы, леопарды, гепарды и ягуары. Когда желательно предотвратить инфекцию данным или другими типами патогенных организмов у кошек, могут быть применены способы изобретения для вакцинации кошек для защиты их от инфекции.

Домашние кошки могут инфицироваться несколькими ретровирусами, включая, но не ограничиваясь этим, вирус лейкоза кошачьих (FeLV), вирус саркомы кошачьих (FeSV), эндогенный тип конкорнавируса (RD-114) и синцитий-образующего вируса кошачьих (FeSFV). Среди них наиболее существенным патогеном является FeLV, вызывающий разнообразные симптомы, включая лимфоретикулярную и миелоидную неоплазию, анемии, нарушения, опосредуемые иммунной системой и синдром иммунодефицита, который сходен с синдромом приобретенного иммунодефицита человека (СПИД). Недавно обнаружено, что особый мутант FeLV с дефектом репликации, обозначаемый как FeLV-AIDS, более тесно связан с иммуносупрессивными свойствами.

Открытие Т-лимфотропного лентивируса кошачьих (обозначаемого так же как вирус иммунодефицита кошачьих) было впервые продемонстрировано Pedersen et al. (1987) Science 235: 790-793. Характеристики FIV описаны Yamamoto et al. (1988) Leukemia, December Supplement 2: 204S-215S; Yamamoto et al. (1988) Am. J. Vet. Res. 49: 1246-1258; и Ackley et al. (1990) J. Virol. 64: 5652-5655. Клонирование и анализ последовательностей FIV описан Olmsted et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2448-2452 и 86: 4355-4360.

Инфекционный перитонит кошачьих (FIP) представляет собой спорадическое заболевание, непредсказуемо поражающее домашних и диких Felidae. Несмотря на то, что FIP является в первую очередь заболеванием домашних кошек, он диагностирован у львов, леопардов, гепардов и ягуаров. Более мелкие дикие кошки, которые страдают от FIV, включают в себя рысь и степную рысь, песчаную кошку и манула. У домашних кошек заболевание возникает преимущественно у молодых животных, хотя восприимчивы кошки всех возрастов. Максимум случаев приходится на возраст от 6 до 12 месяцев. Снижение случаев замечено в возрасте от 5 до 13 лет, затем следует увеличение случаев у кошек в возрасте от 14 до 15 лет.

Вирусные, бактериальные и паразитарные заболевания у плавниковых рыб, моллюсков или других водных форм жизни составляют серьезную проблему для промышленности, перерабатывающей водные организмы. Из-за высокой плотности животных в садках-водоемах или отгороженных зонах морского фермерского хозяйства инфекционные заболевания могут поражать большую часть стада, например легко поражать плавниковых рыб, моллюсков или другие водные формы. Профилактика заболевания является более желательным средством лечения рыб, чем вмешательство в то время, когда болезнь уже началась. Вакцинация рыб является только способом профилактики, который может создать длительную иммунную защиту. Вакцинации на основе нуклеиновых кислот описываются, патенте США № 5780448, выданном на имя Davis.

Иммунная система рыб имеет много характеристик, сходных с иммунной системой млекопитающих, таких как присутствие В-клеток, Т-клеток, лимфокинов, комплемента и иммуноглобулинов. Рыбы имеют подклассы лимфоцитов, роль которых кажется во многих отношениях сходной с таковой В- и Т-клеток млекопитающих. Вакцины могут быть введены путем погружения (в них) или перорально.

Водные промышленные виды включают в себя, но не ограничиваются этим, плавниковых рыб, моллюсков и других водных животных. Плавниковые рыбы включают в себя рыб-позвоночных, которые могут быть костистыми или хрящевыми рыбами, таких, например, как лососевые, карп, сомовые, желтохвост, морской лещ и морской окунь. Лососевые являются семейством плавниковых рыб, которое включает в себя форель (включая радужную форель), лосося и арктическую ручьевую форель. Примеры моллюсков включают в себя, но не ограничиваются этим, морского моллюска, омара, креветку, краба и устрицу. Другие водные промышленные виды, но не ограничиваются этим, угря, кальмара и осьминогов.

Полипептиды вирусных патогенов водных промышленных видов включают в себя, но не ограничиваются этим, гликопротеин (G) или нуклеопротеин (N) вируса вирусного геморрагического сепсиса (VHSV); G или N белки вируса инфекционного геморрагического некроза (IHNV); VP1, VP2, VP3 или N структурные белки вируса инфекционного панкреатического некроза (IPNV); G белок весенней виремии карпа (SVC); и связанный с мембраной белок, белок оболочки или капсидный белок гликопротеина вируса канальных сомов (CCV).

Типичные паразиты, инфицирующие лошадей, представляют собой Gasterophilus spp.,; Eimeria leuckarti, Giardia spp.; Tritrichomonas equi; Babesia spp. (ВВС ), Theileria equi; Trypanosoma spp., Klossiella equi; Sarcocystis spp.

Главные паразиты, инфицирующие свиней, представляют собой Eimeria bebliecki, Eimeria scabra, Isospora suis, Giardia spp.; Balantidium coli; Entamoeba histolytica; Toxoplasma gondii и Sarcocystis spp., и Trichinella spiralis.

Главные паразиты молочного и мясного крупного рогатого скота включают в себя Eimeria spp., Cryptosporidium sp., Giardia spp.; Toxoplasma gondii; Babesia bovis (RBC), Babesia bigemina (RBC), Trypanosoma spp. (плазма), Theileria spp. (RBC); Theileria parva (лимфоциты); Tritrichomonas foetus; и Sarcocystis spp.

Главные паразиты хищников включают в себя Trichomonas gallinae; Coccidia (Eimeria spp.); Plasmodium relictum, Leucocytozoon danilewskyi (совы), Haemoproteus spp., Trypanosoma spp.; Histomonas; Cryptosporidium meleagridis, Cryptosporidium baileyi, Giardia, Eimeria; Toxoplasma.

Типичные паразиты, инфицирующие овец и коз, включают в себя Eimeria spp., Cryptosporidium sp., Giardia sp.; Toxoplasma gondii; Babesia spp. (RBC), Trypanosoma spp.

(плазма), Theileria spp. (RBC); и Sarcocystis spp.

Типичные паразитарные инфекции домашней птицы включают в себя кокцидиоз, вызываемый Eimeria acervulina, E. necatrix, Е. tenella, Isospora spp. и Eimeria truncata; гистомониаз, вызываемый Histomonas meleagridis и Histomonas gallinarum; трихомониаз, вызываемый Th1chomonas gallinae; и гексамитиаз, вызываемый Hexamita meleagridis. Домашняя птица может быть также инфицирована Emeria maxima, Emeria meieagridis, Eimeria adenoeides, Eimeria meleagrimitis, Cryptosporidium, Eimeria brunetti, Emeria adenoeides, Leucocytozoon spp., Plasmodium spp., Hemoproteus meleagridis, Toxoplasma gondii и Sarcocystis.

Способы согласно изобретению могут быть также применены к лечению и/или профилактике паразитарных инфекций у собак, кошек, птиц, рыб и хорьков. Типичные паразиты птиц включают в себя Trichomonas gallinae; Eimeria spp., Isospora spp., Giardia; Cryptosporidium; Sarcocystis spp., Toxoplasma gondii, Haemoproteus/Parahaemoproteus, Plasmodium spp., Leucocytozoon/Akiba, Atoxoplasma, Trypanosoma spp. Типичные паразиты, инфицирующие собак, включают в себя Trichinella spiralis; Isopora spp., Sarcocystis spp., Cryptosporidium spp., Hammondia spp., Giardia duodenalis (собачьи); Balantidium coli, Entamoeba histolytica; Hepatozoon canis; Toxoplasma gondii, Trypanosoma cruzi; Babesia canis; Leishmania amastigotes; Neospora caninum.

Типичные паразиты, инфицирующие виды кошачьих, включают в себя Isospora spp., Toxoplasma gondii, Sarcocystis spp., Hammondia hammondi; Besnoitia spp., Giardia spp.; Entamoeba histolytica; Hepatozoon canis, Cytauxzoon sp., Cytauxzoon sp., Cytauxzoon sp. (эритроциты, RE клетки).

Типичные паразиты, инфицирующие рыб, включают в себя Hexamita spp., Eimeria spp.; Cryptobia spp., Nosema spp., Myxosoma spp., Chilodonella spp., Trichodina spp.; Plistophora spp., Myxosoma Henneguya; Costia spp., IchthyophiTh1rius spp. и Oodinium spp.

Типичные паразиты диких млекопитающих включают в себя Giardia spp. (плотоядные, травоядные), Isospora spp. (плотоядные), Eimeria spp. (плотоядные, травоядные); Theileria spp. (травоядные), Babesia spp. (плотоядные, травоядные), Trypanosoma spp. (плотоядные, травоядные); Schistosoma spp. (травоядные); Fasciola hepatica (травоядные), Fascioloides magna (травоядные), Fasciola gigantica (травоядные), Trichinella spiralis (плотоядные, травоядные).

Паразитарные инфекции в зоопарках также могут составлять серьезные проблемы. Типичные паразиты семейства Bovidae (белолобый бубал, антилопа, бантенг, канна, гаур, антилопа пала, антилопа-прыгун, лесная антилопа, газель) включают в себя Eimeria spp. Типичные паразиты семейства Pinnipedae (тюлень, морской лев) включают в себя Eimeria phocae. Типичные паразиты семейства Camelidae (верблюды, ламы) включают в себя Eimeria spp. Типичные паразиты семейства Giraffidae (жирафы) включают в себя Fimeria spp. Типичные паразиты семейства Elephantidae (африканских и азиатских) включают в себя Fasciola spp. Типичные паразиты низших приматов (шимпанзе, орангутанга, мартышки, бабуины, макаки, обезьяны) включают в себя Giardia sp.; Balantidium coli, Entamoeba histolytica, Sarcocystis spp., Toxoplasma gondii; Plasmodim spp. (RBC), Babesia spp. (RBC), Tiypanosoma spp. (плазма), Leishmania spp. (макрофаги).

Полипептиды бактериальных патогенов включают в себя, но не ограничиваются этим, регулируемый железом белок внешней мембраны (IROMP), белок внешней мембраны (ОМР) и А-белок Aeromonis salmonicida, который вызывает фурункулез, белок р57 Renibacterium salmoninarum, который вызывает бактериальное заболевание почек (BKD), главный ассоциированный с поверхностью антиген (msa), экспрессирующийся на поверхности цитотоксин (mpr), экспрессирующийся на поверхности гемолизин (ish), и жгутиковый антиген Yersiniosis; внеклеточный белок (ЕСР), регулируемый железом белок внешней мембраны (IROMP), и структурный белок Pasteurellosis; ОМР и жгутиковый белок Vibrosis anguillarum и V. ordalii; жгутиковый белок, белок ОМР, аrоА и purA Edwardsiellosis ictaluri и Е. tarda; и антиген поверхности Ichthyophhirius; и структурный и регуляторный белок Cytophaga columnari; и структурный и регуляторный белок Rickettsia.

Полипептиды паразитарного антигена включают в себя, но не ограничиваются этим, антигены поверхности Ichthyophthirius.

Аллергеном называют вещество (антиген), которое может вызвать аллергический или астматический ответ у восприимчивого субъекта. Перечень аллергенов является огромным и может включать в себя пыльцу, яды насекомых, опасную животную пыль, споры грибов и лекарства (например, пенициллин). Примеры природных животных и растительных антигенов включают в себя, но не ограничиваются этим, белки, специфические для следующих родов: Canine (Canis familiaris); Dermatophagoides (например, Dermatophagoides farinae); Felis (Felis domesticus); Ambrosia (Ambrosia artemusfolia; Lolium (например, Lolium perenne или Lolium multiflorum); Cryptomeria (Cryptomeria japonica); Alternaria (Alternaria alternata); Alder; Alnus (Alnus gultinoasa); Betula (Betula verrucosa); Quercus (Quercus alba); Olea (Olea europa); Artemisia (Ariemisia vulgaris); Plantago (например, Plantago lanceolata); Parietaria (например, Parietaria officinalis или Parietaria judaica); Blattella (например, Blattella germanica); Apis (например. Apis multiflorum); Cupressus (например, Cupressus sempervirens, Cupressus arizonica и Cupressus macrocarpa); Juniperus (например, Juniperus sabinoides, Juniperus virginiana, Juniperus communis и Juniperus ashei); Thuya (например, Thuya orientalis); Chamaecyparis (например, Chamaecyparis obtusa); Periplaneta (например, Periplaneta americana); Agropyron (например, Agropyron repens); Secale (например, Secale cereale); Triticum (например, Triticum aestivum); Dactylis (например, Dactylis glomerata); Festuca (например, Festuca elatior); Poa (например, Poa pratensis или Poa compressa); Avena (например, Avena sativa); Holcus (например, Holcus lanatus); Anthoxanthum (например, Anthoxanthum odoratum); Arrhenatherum (например, Arrhenatherum elatius); Agrostis (например, Agrostis alba); Phleum (например, Phleum pratense); Phalaris (например, Phalaris arundinacea); Paspalum (например, Paspalum notatum); Sorghum (например, Sorghum halepensis); и Bromus (например, Bromus inermis).

Антиген может быть антигеном, который кодируется вектором нуклеиновой кислоты, или он может не кодироваться вектором нуклеиновой кислоты. В первом случае вектор нуклеиновой кислоты вводят субъекту, и антиген экспрессируется in vivo. Во втором случае антиген может быть введен прямо субъекту. Применяемый здесь термин "антиген, не кодируемый вектором нуклеиновой кислоты", относится к любому типу антигена, который не является нуклеиновой кислотой. Например, в некоторых вариантах изобретения антиген, не кодируемый вектором нуклеиновой кислоты, представляет собой полипептид. Минорные модификации первичных аминокислотных последовательностей полипептидных антигенов могут также давать полипептид, который по существу имеет эквивалентную антигенную активность по сравнению с немодифицированным исходным полипептидом. Такие модификации могут быть преднамеренными, как в случае сайт-направленного мутагенеза, или могут быть спонтанными. Все полипептиды, получаемые в результате данных модификаций, включены в данное изобретение, если все еще существует антигенность. Полипептид может быть, например, вирусным полипептидом.

Применяемый здесь термин "по существу очищенный" относится к полипептиду, который по существу свободен от других белков, липидов, углеводов или других материалов, с которыми он связан в природных условиях. Специалист в данной области техники может очистить вирусные или бактериальные полипептиды с применением стандартных способов очистки белка. По существу чистый полипептид часто дает выход в виде единственной главной полосы на невосстанавливающем полиакриламидном геле. В случае частично очищенных гликозилированнных полипептидов или тех, которые имеют несколько стартовых кодонов, может быть выявлено несколько полос на невосстанавливающем полиакриламидном геле, но они должны быть характерными для данного полипептида. Чистота вирусного или бактериального полипептида может также определяться с помощью анализа амино-концевой последовательности аминокислот. Другие типы антигенов, не кодируемые вектором нуклеиновой кислоты, такие как полисахариды, небольшие молекулы, миметики и т.п. описаны выше и включены в изобретение.

В изобретении также применяют полинуклеотиды, кодирующие антигенные полипептиды. Представляется, что антиген может быть доставлен субъекту в молекуле нуклеиновой кислоты, которая является кодирующей антиген, так что антиген может экспрессироваться in vivo. Такие антигены, доставляемые субъекту в векторе нуклеиновой кислоты, относится к антигенам, кодируемым вектором нуклеиновой кислоты. Нуклеиновая кислота, кодирующая антиген, оперативно связана с экспрессирующей ген последовательностью, которая управляет экспрессией нуклеиновой кислоты антигена в эукариотической клетке. Экспрессирующая ген последовательность представляет собой любую регулирующую нуклеотидную последовательность, такую как промоторная последовательность или сочетание промотора и энхансера, которая ускоряет эффективную транскрипцию и трансляцию нуклеиновой кислоты антигена, к которой она оперативно присоединена. Экспрессирующая ген последовательность может, например, быть промотором вируса или млекопитающего, таким как конститутивный или индуцибельный промотор. Конститутивные промоторы млекопитающих включают в себя, но не ограничиваются этим, промоторы следующих генов: гипоксантинфосфорибозилтрансферазы (HPTR), аденозиндезаминазы, пируваткиназы, промотор β-актина и другие конститутивные промоторы. Примеры вирусных промоторов, которые функционируют в эукариотических клетках как конститутивные, включают в себя, например, промоторы цитомегаловируса (CMV), вируса обезьяньих (например, SV40), вируса папилломы, аденовируса, вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), вируса саркомы Рауса, цитомегаловируса, длинные концевые повторы (LTR) вируса лейкоза Moloney и другие ретровирусы, а также промотор тимидинкиназы вируса простого герпеса. Другие конститутивные промоторы известны специалистам в данной области техники. Промоторы, пригодные в качестве экспрессирующих ген последовательностей, также включают в себя индуцибельные промоторы. Индуцибельные промоторы экспрессируются в присутствии индуцирующего агента. Например, металлотионеиновый промотор индуцируется для стимуляции транскрипции и трансляции в присутствии определенных ионов металла. Другие индуцибельные промоторы известны специалистам в данной области техники.

В целом экспрессирующая ген последовательность должна включать в себя в качестве необходимых элементов 5’-нетранскрибируемые и 5’-нетранслируемые последовательности, которые вовлечены в инициацию транскрипции и трансляции, соответственно, такие как ТАТА бокс, копирующая последовательность, СААТ последовательность и тому подобное. В частности, чтобы такие 5’-нетранскрибируемые последовательности включали промоторную область, которая содержит промоторную последовательность для транскрипционного контроля оперативно связанной нуклеиновой кислоты антигена. Последовательности, экспрессирующие ген, необязательно включают в себя, если необходимо, энхансерные последовательности или вышележащие активаторные последовательности.

Нуклеиновая кислота антигена оперативно связана с последовательностью, экспрессирующей ген. В изобретении говорится, что последовательность нуклеиновой кислоты антигена и последовательность, экспрессирующая ген, оперативно связаны, когда они ковалентно связаны таким образом, что экспрессия или транскрипция и/или трансляция последовательности, кодирующей антиген, помещена под влияние или контроль последовательности, экспрессирующей ген. Говорится, что две последовательности ДНК оперативно связаны, если индукция промотора в 5’-экспрессирующей ген последовательности ведет к транскрипции последовательности антигена и если природа связи между двумя последовательностями ДНК (1) не ведет к введению мутации сдвига рамки считывания, (2) не вмешивается в способность промоторной области управлять транскрипцией последовательности антигена или (3) не вмешивается в способность соответствующего транскрипта РНК транслироваться в белок. Таким образом, последовательность, экспрессирующая ген, должна быть оперативно связана с последовательностью нуклеиновой кислоты антигена, если последовательность, экспрессирующая ген, способна влиять на транскрипцию данной последовательности нуклеиновой кислоты антигена таким образом, что полученный транскрипт транслируется в желаемый белок или полипептид.

Нуклеиновая кислота антигена согласно изобретению может быть доставлена к иммунной системе одна или в ассоциации с вектором. В самом широком смысле вектор представляет собой любой носитель, способный ускорять перенос нуклеиновой кислоты антигена в клетки иммунной системы так, чтобы антиген мог экспрессироваться и был представлен на поверхности иммунной клетки. Вектор обычно транспортирует нуклеиновую кислоту к иммунным клеткам с пониженной деградацией по сравнению со степенью деградации, которая должна быть в отсутствие вектора. Вектор необязательно включает в себя описанную выше экспрессирующую ген последовательность для усиления экспрессии нуклеиновой кислоты антигена в иммунных клетках. В целом векторы, применяемые в изобретении, включают в себя, но не ограничиваются этим, плазмиды, фагемиды, вирусы, другие носители, происходящие из вирусных или бактериальных источников, которыми можно манипулировать с помощью вставки или включения последовательностей нуклеиновых кислот антигенов. Вирусные векторы являются предпочтительным типом векторов и включают в себя, но не ограничиваются этим, последовательности нуклеиновых кислот из следующих вирусов: ретровируса, такого как вирус лейкоза мышей Moloney, вирус саркомы мышей Harvey, вирус опухоли молочной железы мышей и вирус саркомы Рауса; аденовируса, адено-ассоциированного вируса; вирусов типа SV40; вирусов полиомы; вирусов Эпштейна-Барр; вирусов папилломы; вируса герпеса; вакцинационного вируса; вируса оспы коров; полиовируса; и РНК-овых вирусов, таких как ретровирус. Каждый с легкостью может применять другие векторы, не названные, но известные в данной области техники.

Предпочтительные вирусные векторы основаны на нецитопатических эукариотных вирусах, в которых несущественные гены заменены на интересующий ген. Нецитопатические вирусы включают в себя ретровирусы, жизненный цикл которых включает в себя обратную транскрипцию геномной вирусной РНК в ДНК с последующей провиральной интеграцией в клеточную ДНК хозяина. Ретровирусы одобрены для испытаний при генной терапии человека. Наиболее полезными являются те ретровирусы, которые являются дефицитными по репликации (т.е. способны управлять синтезом желаемых белков, но не способны производить инфекционные частицы). Такие генетически измененные ретровирусные экспрессионные векторы характеризуются общей применимостью для высокоэффективной трансдукции генов in vivo. Стандартные прописи получения дефицитных по репликации ретровирусов (включая стадии включения экзогенного генетического материала в плазмиду, трансфекции упаковывающей линии клеток плазмидой, продукции рекомбинантных ретровирусов упаковывающей линией клеток, отбора вирусных частиц из тканевой культуральной среды и инфицирования клеток-мишеней вирусными частицами) представлены в Kriegler, M., Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual W. H. Freeman C.O., New York (1990) и Murry, E.J.Methods in Molecular Biology, vol.7, Humana Press, Inc., Cliffton, New Jersey (1991).

Предпочтительным вирусом для определенных применений является адено-ассоциированный вирус, вирус с двуспиральной ДНК. Адено-ассоциированный вирус может быть сконструирован в виде дефицитного в отношении репликации и способного к инфицированию широкого диапазона клеточных типов и видов. Он имеет дополнительные преимущества, такие как стабильность в отношении нагревания и липидных растворителей; высокая частота трансдукции в клетках разнообразных линий, включая гемопоэтические клетки; и отсутствие торможения при суперинфицировании, что позволяет проводить множественные серии трансдукции. По сообщениям адено-ассоциированный вирус может интегрироваться в клеточную ДНК человека сайт-специфическим способом, что минимизирует возможность мутагенеза при вставках и вариабельность вставленных экспрессирующих ген характеристик ретровирусных инфекций. Кроме того, инфекции, адено-ассоциированным вирусом дикого типа, проводили в тканевых культурах более чем через 100 пассажей в отсутствие селекционного воздействия, что подразумевает, что геномная интеграция адено-ассоциированного вируса является относительно стабильной. Адено-ассоциированный вирус может также функционировать экстрахромосомным способом.

Другие векторы включают в себя плазмидные векторы. Плазмидные векторы широко описаны в данной области техники и хорошо известны специалистам. Смотри, например, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. В последние несколько лет было обнаружено, что плазмидные векторы особенно выгодны для доставки генов к клеткам in vivo из-за их способности в них реплицироваться и интегрироваться в геном хозяина. Данные плазмиды, однако, имея промотор, сравнимый с клеткой-хозяином, могут экспрессировать пептид с гена, оперативно кодируемого в плазмиде. Некоторые обычно применяемые плазмиды включают в себя pBR322, pUC18, pUC19, pRC/CMV, SV40 и pBlueScript. Другие плазмиды хорошо известны специалистам в данной области техники. Кроме того, плазмиды могут быть спроектированы по заказу с применением рестрикционных ферментов и реакций лигирования для удаления и добавления конкретных фрагментов ДНК.

Недавно было открыто, что плазмиды, несущие гены, могут быть доставлены в иммунную систему с применением бактерий. Модифицированные формы бактерий, таких как Salmonella, могут быть трансфицированы плазмидой и применены в качестве носителей для доставки. Бактериальные системы доставки можно вводить субъекту-хозяину перорально или с помощью других способов введения. Бактерии доставляют плазмиду к иммунным клеткам, например В-клеткам, дендритным клеткам, вероятно, проходя через барьер желудочно-кишечного тракта. При применении данной методологии выявлены высокие уровни иммунной защиты. Такие способы доставки полезны для вариантов изобретения, применяющих системную доставку антигена, иммуностимулирующей нуклеиновой кислоты и/или другого терапевтического агента.

Таким образом, иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты полезны в качестве адъювантов вакцин. Ранее было установлено, что CpG-олигонуклеотиды являются прекрасными адъювантами вакцин. Было также показано, однако, что CpG ОДН, которые являются великолепными адъювантами вакцин у мышей, не являются предпочтительными адъювантами у животных, не являющихся грызунами. Для того чтобы идентифицировать наилучшие иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты для применения в качестве адъюванта вакцин у человека и других животных, не являющихся грызунами, был проведен скрининг различных нуклеиновых кислот in vivo для данной цели. Было разработано несколько тестов in vitro для мышей для предсказания их ценности в качестве адъювантной активности у мышей in vivo. Во время проведения данного исследования был идентифицирован тест in vitro для предсказания их эффективности in vivo. Достаточно неожиданно было открыто, что активация как В-клеток, так и NK-клеток особенно хорошо коррелировала со способностью иммуностимулирующей нуклеиновой кислоты увеличивать иммунный ответ против антигена in vivo.

Хорошая степень предсказания активации В-клеток по активности адъюванта вакцины in vivo наиболее вероятно связана с центральной ролью В-клеток в организации специфического иммунного ответа. Поликлональная пролиферация В-клеток (индуцируемая иммуностимулирующими нуклеиновыми кислотами) увеличивает вероятность появления сочетания антиген-специфических В-клеток/Т-хелперных клеток. Более того, увеличенная экспрессия ко-стимулирующей молекулы CD86 на В-клетках, подвергшихся поликлональной экспансии, активирует антиген-специфические Т-хелперные клетки. В-клетки в ответ на иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты увеличивают также свою экспрессию CD40, улучшая способность активированных Т-хелперных клеток, экспрессирующих CD40L, стимулировать В-клетки. Увеличенный синтез ICAM-1 на В-клетках способствует межклеточным контактам. Таким образом, статус активности В-клеток играет решающую роль при инициации специфического ответа антител.

Вклад активности NK-клеток в образование специфических антител оказался, однако, неожиданным. NK-клетки являются частью природной иммунной системы и вовлечены как таковые в передовую линию защиты от патогенов. Наиболее вероятно, что паттерн цитокинов, продуцируемых NK-клетками при активации, тесно связан с инициацией специфического иммунного ответа. Таким образом, в одном варианте изобретение относится к способу идентификации адъюванта с помощью определения активации NK-клеток. Тестирование активации NK-клеток может быть проведено, как описано ниже в примерах или с применением других известных способов определения активности NK-клеток. Предпочтительно, однако, чтобы применялась смешанная популяция клеток, такая как РВМС, из-за вероятности того, что активация NK-клеток является непрямым эффектом. Тестирование полезно предпочтительно для идентификации иммуностимулирующих нуклеиновых кислот, которые пригодны в качестве адъювантов у человека и других животных, не являющихся грызунами.

Было также установлено, что важным в предсказании активности адъюванта in vivo является индукция цитокинов. Хотя чувствительность к эндотоксинам первичных моноцитов у человека на 2 порядка выше, чем у мыши, требуется, однако, некоторая осторожность для избежания загрязнения эндотоксинами иммуностимулирующих нуклеиновых кислот, применяемых для тестов в системах человека (Hartmann G., and Krieg A.M 1999. Gene Therapy 6:893). Так как TNF-α, ИЛ-6 и ИЛ-12 продуцируются моноцитами человека в ответ даже на низкое количество эндотоксина, их ценность для тестов высокоэффективного скрининга in vitro ограничена. С другой стороны, В-клетки и NK-клетки человека подвергаются только минорной активации эндотоксином и таким образом намного более полезны для тестирования иммуностимулирующей активности.

Стимуляция клеточной функции либо NK, либо В-клеток (т.е. литической активности, пролиферации) требует более сильной иммуностимулирующей нуклеиновой кислоты, чем индукция на их поверхности маркеров активации (CD69, CD86). Для обоих клеточных типов применение маркеров активации клеточной поверхности показало более высокий неспецифический фон, обусловленный фосфортиоатным остовом, по сравнению с функциональными тестами. Такая высокая чувствительность маркеров поверхности требует применения низких концентраций иммуностимулирующих нуклеиновых кислот для оптимальной дискриминации активности между иммуностимулирующими нуклеиновыми кислотами со сходной активностью. Таким образом, применение маркеров поверхности дает возможность сравнивать иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты со слабой активностью, в то время как функциональные тесты предпочтительны для сравнения иммуностимулирующих нуклеиновых кислот с высокой активностью. Следует отметить, что оптимальные концентрации иммуностимулирующих нуклеиновых кислот для стимуляции В-клеток и NK-клеток различаются. В то время как концентрация в 0,6 мкг/мл ОДН уже максимальна для стимуляции В-клеток, оптимальная активация NK-клеток может требовать 6 мкг/мл ОДН. Как активацию В-клеток, так и функциональную активность NK-клеток измеряли со свежевыделенными РВМС. Ранее было найдено, что высокоочищенные первичные В-клетки человека активируются с помощью CpG-ДНК. Существование прямого эффекта CpG-ДНК на NK-клетки менее очевидно и в CpG-индуцированную функциональную активность NK-клеток может вносить вклад вторичный механизм, опосредуемый другим типом клеток в пределах РВСМ.

Нуклеиновые кислоты согласно изобретению можно вводить субъекту с антимикробным агентом. Применяемый здесь термин "антимикробный агент" относится к существующему в природе или синтетическому соединению, которое способно уничтожать инфекционные микроорганизмы или ингибировать их действие. Тип антимикробного агента, полезного в соответствии с изобретением, должен зависеть от типа микроорганизма, которым субъект инфицирован или рискует инфицироваться. Антимикробные агенты включают в себя, но не ограничиваются этим, антибактериальные агенты, противовирусные агенты, противогрибковые агенты и антипаразитарные агенты. Такие выражения как "антиинфекционный агент", "антибактериальный агент", "противовирусный агент", "противогрибковый агент", "антипаразитарный агент" и "агент, разрушающий паразитов", являются хорошо известными для специалистов в данной области техники и определены в стандартных медицинских руководствах. Вкратце антимикробные агенты уничтожают бактерии или ингибируют их активность и включают в себя антибиотики, так же как и другие синтетические или природные соединения, имеющие сходные функции. Антибиотики представляют собой молекулы с низкой молекулярной массой, которые продуцируются как вторичные метаболиты такими клетками как микроорганизмы. В общем, антибиотики вмешиваются в одну или более бактериальных функций или структур, которые специфичны для микроорганизма и которые не присутствуют в клетках хозяина. Противовирусные агенты могут быть выделены из природных источников или синтезированы и являются полезными для уничтожения вирусов или ингибирования их активности. Противогрибковые агенты применяют для лечения поверхностных грибковых инфекций, а также инфекций, вызываемых условно-патогенными грибами, и первичных системных грибковых инфекций. Противопаразитарные агенты уничтожают паразитов или ингибируют их активность.

Примеры антипаразитарных агентов, также обозначаемых как агенты, разрушающие паразитов, применимых для введения человеку, включают в себя, но не ограничиваются этим, албендазол, амфотерицин В, бензнидазол, битионол, хлороквин НСl, хлороквин фосфат, клиндамицин, дегидроэметин, диэтилкарбамазин, дилоксанид фуранкарбоновой кислоты, эфлорнитин, фуразолидаон, глюкокортикоиды, галофантрин, иодогидрохинон, ивермектин, мебендазол, мефлохин, меглумин, антимониат, меларсопрол, метрифонат, метронидазол, никлозамид, нифуртимокс, оксамнихин, паромомицин, пентамидин изотионат, пиперазин, празихантел, примахин фосфат, прогуанил, пирантель памоат, пириметанмин-сульфонамиды, пириметанмин-сульфадоксины, хинакрин НСl, хинин сульфат, хинидин глюконат, спирамицин, стибоглюконат натрия (глюкуронат натрия-сурьмы), сурамин, тетрациклин, доксициклин, тиабендазол, тинидазол, триметроприм-сульфаметооксазол и трипарсамид, некоторые из которых применяются по отдельности или в сочетании с другими.

Агенты, разрушающие паразитов, применяемые у субъектов, не являющихся человеком, включают в себя пиперазин, диэтилкарбамазин, тиабендазол, фенбендазол, албендазол, оксфендазол, оксибендазл, фебантел, левамизол, пирантел тартрат, пирантел памоат, дихлорвоз, ивермектин, дорамектик, милбемицин оксим, иприномектин, моксидектин, хлорид н-бутила, толуол, тиацетарсемидная натриевая соль гигромицина В, меларсомин, празиквантел, эпсипрантел, бенимидазолы, такие как фенбендазол, албендазол, оксфендазол, клорсулон, албендзол, ампролиум; декохинат, ласалоид, сульфадиметоксин; сульфаметазин, сульфахиноксалин, метронидазол.

Агенты, разрушающие паразитов, применяемые у лошадей, включают в себя мебендазол, оксфендазол, фебантел, пирантел, дихлорвоз, трихлорфон, ивермектин, пиперазин; для S.westeri: ивермектин, бензимидазолы, такие как тиабендазол, камбендазол, оксибендазол и фенбендазол. Полезные агенты, разрушающие паразитов, применяемые у собак, включают в себя милбемицин оксин, ивермектин, пирантел памоат и сочетание ивермектина и пирантела. Лечение паразитов у свиней может включать в себя применение левамизола, пиперазина, пирантела, тиабендазола, дихлорвоза и фенбендазола. У овец и коз противогельминтные агенты включают в себя левамизол или ивермектин. Капарсолат продемонстрировал некоторую эффективность при лечении D. immitis (гельминта, паразитирующего в сердце) у кошек.

Антибактериальные агенты уничтожают или ингибируют рост или функции у бактерий. Большим классом антибактериальных агентов являются антибиотики. Антибиотики, которые эффективны в отношении уничтожения или ингибирования активности широкого диапазона бактерий, относятся к широкому спектру антибиотиков. Другие типы антибиотиков эффективны преимущественно против бактерий класса грамположительных или грамотрицательных. Данные типы антибиотиков относятся к узкому спектру антибиотиков. Другие типы антибиотиков, которые эффективны против одного организма или заболевания и не направлены против других типов бактерий, относятся к ограниченному спектру антибиотиков. Антибактериальные агенты иногда классифицируют на основе их первичного способа действия. В целом антибактериальные агенты являются ингибиторами синтеза клеточной стенки, ингибиторами клеточных мембран, ингибиторами синтеза белка, ингибиторами синтеза нуклеиновых кислот или ингибиторами функций и конкурентными ингибиторами.

Антибактериальные агенты, применяемые в изобретении, включают в себя, но не ограничиваются этим, природные пенициллины, полусинтетические пенициллины, клавулановую кислоту, цефалолспорины, бицитрацин, ампициллин, карбенициллин, оксациллин, азлоциллин, мезлоциллин, пиперациллин, метициллин, циклоксациллин, нафциллин, цефалотин, цефапирин, цефалексин, цефандол, цефаклор, цефазолин, цефуроксин, цефокситин, цефотаксим, цефсулодин, цефетамет, цефиксим, цефтриаксон, цефоперазон, цефтазидин, моксалактам, карбапенемы, имипенемы, монобактемы, эузтреонам, ванкомицин, полимиксин, амфотерицин В, нистатин, имидазолы, клотримазол, миконазол, кетоконазол, итраконазол, флуконазол, рифампины, этамбутол, тетрациклины, хлорамфеникол, макролиды, аминогликозиды, стрептомицин, канамицин, тобрамицин, амикацин, гентамицин, тетрациклин, миноциклин, доксициклин, хлортетрациклин, эритромицин, рокситромицин, кларитромицин, олеандомицин, азитромицин, хлорамифеникол, хинолоны, котримоксазол, норфлоксацин, ципрофлоксацин, эноксацин, налидиксиновая кислота, темафлоксацин, сульфонамиды, гантрисин, триметоприм; ацедапсон; ацетосульфон натрия; аламецин; алексидин; амдиноциллин; амидиноциллина пивоксил; амициклин; амифлоксацин; амифлоксацина мезилат, амикацин; амикацина сульфат; аминосалициловую кислоту; аминосалицилат натрия; амоксициллин; амфомицин; ампициллин; амипициллина натриевую соль; апалциллин; апалциллина натриевую соль; апрамицин; аспартоцин; астромицина сульфат; авиламицин; авопарцин; азитромицин; азлоциллин; азлоциллина натриевую соль; бакампициллина гидрохлорид; бацитрацин; метилендисалицилат бацитрацина; бацитрацин-цинк; бамбермицины; бензоилпас кальция; беритромицин; бетамицина сульфат; биапенем; бинирамицин; бифенамина гидрохлорид; биспиритиона максульфекс; бутикацин; бутиросина сульфат; капреомицина сульфат; карбадокс; карбенициллина двунатриевую соль; карбенициллина инданилнатрий; карбенициллина фенилнатрий; карбенициллина калиевую соль; карумонама натриевую соль; цефаклор; цефадроксил; цефамандол; цефамандола нитрат; цефамандола натриевую соль; цефапарол; цефатризин; цефазафлура натриевую соль; цефазолин; цефазолина натриевую соль; цефбуперазон; цефдирин; цефепим; цефепима гидрохлорид; цефетекол; цефиксим; цефменоксима гидрохлорид; цефметазол; цефметазола натриевую соль; цефоницида однозамещенная натриевую соль; цефоницида натриевую соль; цефоперазона натриевую соль; цефоранид; цефотаксима натриевую соль; цефотетан; цефотетана двунатриевую соль; цефотиама гидрохлорид; цефокситин; цефокситина натриевую соль; цефпимизол; цефпимизола натриевую соль; цефпирмид; цефпирамида натриевую соль; цефпирома сульфат; цефподоксима проксетил; цефпрозил; цефроксадин; цефсулодина натриевую соль; цефтазидим; цефтибутен; цефтизоксима натриевую соль; цефтриаксона натриевую соль; цефуроксим; цефуроксима окситил; цефуроксима пивоксетил; цефуроксима натриевую соль; цефацетрила натриевую соль; цефалексин; цефалексина гидрохлорид; цефалоглицин; цефалоридин; цефалотина натриевую соль; цефапирина натриевую соль; цефрадин; цетоциклина гидрохлорид; цетофеникол; хлорамфеникол; хлорамфеникола пальмитат; хлорамфеникол-пантотенатный комплекс; хлорамфеникол сукцинат натрия; хлоргексидина фосфанилат; хлороксиленол; хлортетрациклина бисульфат; хлортетрациклина гидрохлорид; циноксацин; ципрофлоксацин; ципрофлоксацина гидрохлорид; циролемицин; кларитромицин; клинафлоксацина гидрохлорид; клиндамицин; клиндамицина гидрохлорид; клиндамицина пальмитат гидрохлорид; клиндамицина фосфат; клофазимин; клоксациллина бензатин; клоксациллина натриевую соль; клоксихин; колистиметата натриевую соль; колиситина сульфат; коумермицин; коумермицина натриевую соль; циклациллин; циклосерин; далфопристин; дапсон; даптомицин; демеклоцилин; демеклоцилина гидрохлорид; демециклин; денофунгин; диаверидин; диклоксациллин; диклоксациллина натриевую соль; дигидрострептомицина сульфат; дипиритион; диритромицин; доксициклин; доксициклина кальциевая соль; доксициклин фосфатекс; доксициклин гиклат; дроксацина натриевую соль; еноксацин; эпициллин; эпитетрациклина

гидрохлорид; эритромицин; эритромицин ацистрат; эритромицин эстолат; эритромицин этилсукцинат; эритромицин глуцептат; эритромицин лактобионат; эритромицина пропионат; эритромицина стеарат; этамбутола гидрохлорид; этионамид; флероксацин; флоксациллин; флудаланин; флумехин; фосфомицин; фосфомицин трометамин; фумоксициллин; фуразолия хлорид; фуразолия тартрат; фусидата натриевую соль; фусидовая кислота; гентамицина сульфат; глоксимонам; грамицидин; галопрогин; гетациллин; гетациллина калиевою соль; гекседин; ибафлоксацин; имипенем; изоконазол; изепамицин; изониазид; жозамицин; канамицина сульфат; китазамицин; левофуралтадон; левопропилциллина натриевую соль; лекситромицин; линкомицин; линкомицина гидрохлорид; ломефлоксацин; ломефлоксацина гидрохлорид; ломефлоксацина мезилат; лоракарбеф; мафенид; меклоциклин; меклоциклина сульфосалицилат; мегаломицин фосфат калия; мехидокс; меропенем; метациклин; метациклина гидрохлорид; метенамин; метенамина гиппурат; метенамина манделат; метициллина натриевую соль; метиоприм; метронидазола гидрохлорид; метронидазола фосфат; мезлоциллин; мезлоциллина натриевую соль; миноциклин; миноциклина гидрохлорид; миринкамицина гидрохлорид; моненсин; моненсина натриевую соль; нафциллина натриевую соль; налидиксата натриевую соль; налидиксовую кислоту; натамицин; небрамицин; неомицина пальмитат; неомицина сульфат; неомицина ундециленат; нетилмицина сульфат; неутрамицин; нифураден; нифуралдезон; нифурател; нифуратрон; нифурдазил; нифуримид;

нифурпиринол; нифурхиназол; нифуртиазол; нитроциклин; нитрофурантоин; нитромид; норфлоксацин; новобиоцина натриевую соль; офлоксацин; орметоприм; оксациллина натриевую соль; оксимонам; оксимонама натриевую соль; оксолиновая кислота; окситетрациклин; окситетрациклина кальциевая соль; окситетрациклина гидрохлорид; палмидицин; парахлорфенол; пауломицин; пефлоксацин; пефлоксацина мезилат; пенамециллин; пенициллина G бензатин; пенициллина G калиевая соль; пенициллин G прокаин; пенициллин G натриевую соль; пенициллина V бензатин; пенициллина V гидрабамин; пенициллина V калиевая соль; пентизидона натриевую соль; фениламиносалицилат; пиперациллина натриевую соль; пирбенициллина натриевую соль; пиридициллина натриевую соль; пирлимицина гидрохлорид; пивамипициллина гидрохлорид; пивамипициллина памоат; пивамипициллина пробенат; полимиксина В сульфат; порфиромицин; пропикацин; пиразинамид; пиритион-цинк; хиндекамина ацетат; хинупристин; рацефеникол; рамопланин; ранимицин; реломицин; репромицин; рифабутин; рифаметан; рифамексил; рифамид; рифампин; рифапентин; рифаксимин; ролитетрациклин; ролитетрациклина нитрат; розарамицин; розарамицина бутират; розарамицина пропионат; розарамицин фосфат натрия; розарамицина стеарат; розоксацин; роксарзон; рокситромицин; санциклин; санфетринема натриевую соль; сармоксициллин; сарпициллин; скопафунгин; сизомицин; сизомицина сульфат; спарфлоксацин; спектиномицина гидрохлорид; спирамицин; сталлимицина гидрохлорид;

стеффимицин; стрептомицина сульфат; стрептоникозид; сульфабенз; сульфабензамид; сульфацетамид; сульфацетамида натриевую соль; сульфацитин; сульфадиазин; сульфадиазина натриевую соль; сульфодоксин; сульфален; сульфамеразин; сулфаметер; сульфаметазин; сульфаметизол; сульфаметоксазол; сульфамонометоксин; сульфамоксол; сульфанилат-цинк; сульфанитран; сульфасалазин; сульфазомизол; сульфатиазол; сульфазамет; сульфизоксазол; ацетилсульфизоксазол; сульфизоксазолдиоламин; сульфомиксин; сулопенем; султамициллин; сунциллина натриевую соль; талампициллина гидрохлорид; тейкопланин; темафлоксацина гидрохлорид; темоциллин; тетрациклин; тетрациклина гидрохлорид; тетрациклин-фосфатный комплекс; тетроксоприм; тиамфеникол; тифенциллина калиевую соль; тикарциллин крезилнатрий; тикарциллина двунатриевую соль; тикарциллина однозамещенная натриевую соль; тиклатон; тиодония хлорид; тобрамицин; тобрамицина сульфат; тосульфоксацин; триметоприм; триметоприма сульфат; трисульфапиримидины; тролеандомицин; троспектомицина сульфат; тиротрицин; ванкомицин; ванкомицина гидрохлорид; виргиниамицин и зорбамицин.

Противовирусные агенты представляют собой соединения, которые предотвращают инфицирование клеток вирусами или репликацию вирусов в клетке. Существует намного меньше противовирусных лекарств по сравнению с антибактериальными лекарствами, так как процесс репликации вирусов настолько тесно связан с репликацией ДНК в клетке хозяина, что неспецифические антивирусные агенты часто могут быть токсичными для хозяина. Существует несколько стадий процесса инфицирования вирусом, которые могут быть блокированы или ингибированы с помощью антивирусных агентов. Данные стадии включают в себя прикрепление вируса к клетке хозяина (иммуноглобулины или связывающие пептиды), декапсидацию вируса (например, амантадин), синтез или трансляцию вирусной мРНК (например, интерферон), репликацию вирусных РНК или ДНК (например, аналоги нуклеозидов), созревание новых вирусных белков (например, ингибиторы протеаз) и активную репликацию вируса и высвобождение вируса.

Нуклеотидные аналоги представляют собой синтетические соединения, которые сходны с нуклеотидами, но которые имеют неполную или необычную дезоксирибозную или рибозную группу. Как только нуклеотидные аналоги поступают в клетку, они фосфорилируются с получением трифосфатных форм, которые конкурируют с нормальными нуклеотидами за включение в вирусную ДНК или РНК. Как только трифосфатная форма нуклеотидного аналога включается в растущую цепь нуклеиновой кислоты, это вызывает необратимую ассоциацию с вирусной полимеразой и в результате этого удлинение цепи заканчивается. Нуклеотидные аналоги включают в себя, но не ограничиваются этим, ацикловир (применяемый для лечения инфекций вирусом простого герпеса и вирусом ветряной оспы), ганцикловир (применяемый для лечения инфекций цитомегаловирусом), идоксуридин, рибавирин (применяемый для лечения инфекций вирусом дыхательного синцития), дидезоксиинозин, дидезоксицитидин и зидовудин (азидотимидин).

Интерфероны представляют собой цитокины, которые секретируются клетками, инфицированными вирусом, а также иммунными клетками. Интерфероны действуют в результате связывания со специфическими рецепторами на клетках, примыкающих к инфицированным клеткам, вызывая изменения в клетке, которые защищают ее от инфицирования вирусом, α- и β-интерферон также индуцирует экспрессию молекул МНС класса I и класса II на поверхности инфицированных клеток, что ведет к увеличению презентации антигена для узнавания иммунными клетками хозяина, α- и β-интерфероны доступны в виде рекомбинантных форм и применяются для лечения инфекций при хронических гепатитах В и С. В дозировках, которые эффективны для противовирусной терапии, интерфероны имеют тяжелые побочные эффекты, такие как лихорадка, недомогание и потеря веса.

Терапию иммуноглобулинами используют для профилактики вирусной инфекции. Терапия иммуноглобулинами вирусных инфекций отличается от таковой для бактериальных инфекций, потому что, являясь скорее специфичной к антигену, терапия иммуноглобулинами действует путем связывания с внеклеточными вирионами и защищает их от связывания с клетками и проникновения в клетки, которые восприимчивы к вирусной инфекции. Терапия полезна для профилактики вирусной инфекции в течение периода времени, когда антитела присутствуют у хозяина. В целом существует два типа терапии иммуноглобулинами, терапия иммуноглобулинами, присутствующими в норме, и терапия гиперпродуцирующимися иммуноглобулинами. При терапии иммуноглобулинами, присутствующими в норме, используется антительный продукт, который получен из объединенной сыворотки крови нормальных доноров. Данный объединенный продукт содержит низкие титры антител к широкому спектру вирусов человека, таких как вирусы гепатита А, парвовирус, энтеровирус (особенно у новорожденных). При терапии гиперпродуцирующимися иммуноглобулинами используют антитела, которые получают из сыворотки индивидуумов, которые имеют высокие титры антитела к конкретному вирусу. Данные антитела затем используют против конкретного вируса. Примеры гиперпродуцирующихся иммуноглобулинов включают в себя иммуноглобулин опоясывающего лишая (применяемый для профилактики ветряной оспы у детей и новорожденных с иммунодефицитом), иммуноглобулин бешенства человека (применяемый при постконтактной профилактике субъекта, атакованного бешенным животным), иммуноглобулин гепатита В (применяемый при профилактике заражения вирусом гепатита В, особенно у субъекта, контактировавшего с вирусом) и иммуноглобулин RSV (применяемый при лечении инфекций, вызванных вирусом дыхательного синцития).

Другим типом терапии иммуноглобулинами является активная иммунизация. Она включает в себя введение антител или фрагментов антител против белков поверхности вируса. Два типа вакцин, которые доступны для активной иммунизации в отношении гепатита В, включают в себя происходящие из сыворотки антитела гепатита В и рекомбинантные антитела гепатита В. Оба получают из HbsAg. Антитела вводят в виде трех доз субъектам с высоким риском инфицирования вирусом гепатита В, таким как работники здравоохранения, половые партнеры хронических носителей и дети.

Таким образом, противовирусные агенты, применимые в изобретении, включают в себя, но не ограничиваются этим, иммуноглобулины, амантадин, интерферон, аналоги нуклеозидов и ингибиторы протеаз. Конкретные примеры противовирусных средств включают в себя, но не ограничиваются этим, ацеманнан; ацикловир; ацикловир натрий; адефовир; аловудин; алвирсепт судотокс; амантадин гидрохлорид; аранотин; арилдон; атевирдин; атевирдин мезилат; авридин; цидофовир; ципамфиллин; цитарабин гидрохлорид; делавирдин мезилат; десцикловир; диданозин; дисоксарил; эдоксудин; энвираден; энвироксим; фамцикловир; фамотин гидрохлорид; фиацитабин; фиалуридин; фосарилат; фоскарнет натрий; фосфонет натрий; ганцикловир; ганцикловир натрий; идоксуридин; кетоксал; ламивудин; лобукавир; мемотин гидрохлорид; метисазон; невирапин; пенцикловир; пиродавир; рибавирин; римантадин гидрохлорид; сахинавир мезилат; сомантадин гидрохлорид; соривудин; статолон; ставудин; тилорон гидрохлорид; трифлуридин; валацикловир гидрохлорид; видарабин фосфат; видарабин фосфат натрия; вироксим; залцитабин; зидовудин и зинвироксим.

Противогрибковые агенты полезны для лечения и профилактики инфицирования грибами. Противогрибковые агенты иногда классифицируют по механизму их действия. Некоторые противогрибковые агенты действуют как ингибиторы клеточной стенки с помощью торможения глюкозосинтазы. Они включают в себя, но не ограничиваются этим, базиунгин/ЕСВ. Другие противогрибковые агенты действуют путем дестабилизации целостности мембраны. Они включают в себя, но не ограничиваются этим, иммидазолы, такие как клотримазол, сертаконзол, флуконазол, итраконазол, кетоконазол, миконазол и вориконасол, а также FK 463, амфотерицин В, BAY 38-9502, МК 991, прадимицин, UK 292, бутенафин и тербинафин. Другие Противогрибковые агенты действуют путем разрушения хитина (например, хитиназы) или иммуносуппрессии (мазь 501). Некоторые примеры имеющихся в продаже агентов представлены в таблице В.

Таблица В
Компания	Торговая марка	Родовое наименование	Показания	Механизм действия
PHARMACIA & UP JOHN	PNU 196443	PNU 196443	противогрибковый	Не изв.
Lilly	LY 303366	Basiungin/ECB	Грибковые инфекции	Противогрибковый/ингибитор клеточной стенки, ингибитор синтазы глюкозы
Bayer	Канестен	Клотримазол	Грибковые инфекции	Дестабилизатор целостности мембран
Fujisawa	FK 463	FK 463	Грибковые инфекции	Дестабилизатор целостности мембран
Mylan	Сертаконзаол	Сертаконзол	Грибковые инфекции	Дестабилизатор целостности мембран
Genzyme	Хитиназа	Хитиназа	Грибковые инфекции, системные	Разрушение хитина
Liposome	Абельцет	Амфотерицин В, липосомный	Грибковые инфекции, системные	Дестабилизатор целостности мембран
Sequus	Амфотек	Амфотерицин В, липосомный	Грибковые инфекции, системные	Дестабилизатор целостности мембран

Bayer	BAY 38-9502	BAY 38-9502	Грибковые инфекции, системные	Дестабилизатор целостности мембран
Phizer	Дифлукан	Флуконазол	Грибковые инфекции, системные	Дестабилизатор целостности мембран
Johnson & Johnson	Споранокс	Итраконазол	Грибковые инфекции, системные	Дестабилизатор целостности мембран
Sepracor	Итраконзол (2R, 4S)	Итраконзол (2R, 4S)	Грибковые инфекции, системные	Дестабилизатор целостности мембран
Johnson & Johnson	Низорал	Кетоконазол	Грибковые инфекции, системные	Дестабилизатор целостности мембран
Johnson & Johnson	Монистат	Миконазол	Грибковые инфекции, системные	Дестабилизатор целостности мембран
Merck	МК 991	МК 991	Грибковые инфекции, системные	Дестабилизатор целостности мембран
Bristol Myers Sq’b	Пр адимицин	Прадимицин	Грибковые инфекции, системные	Дестабилизатор целостности мембран

Pfizer	UK-292,663	UK-292, 663	Грибковые инфекции, системные	Дестабилизатор целостности мембран
Pfizer	Вориконазол	Вориконазол	Грибковые инфекции, системные	Дестабилизатор целостности мембран
Mylan	Крем 501	Крем 501	Воспалительные грибковые состояния	Иммуносупрессия
Mylan	Ментакс	Бутенафин	Грибок ногтей	Дестабилизатор целостности мембран
Schering Plough	Противогрибковый	Противогрибковый	Условно-патогенные инфекции	Дестабилизатор целостности мембран
Alza	Таблетка мицелекс	Клотримазол	Молочница рта	Стабилизатор целостности мембран
Novartis	Ламизил	Тербинафин	Системные грибковые инфекции, онихомикоз	Дестабилизатор целостности мембран

Таким образом, противогрибковые агенты, пригодные в данном изобретении, включают в себя, но не ограничиваются этим, имидазолы, FK 463, амфотерицин В, BAY 38-9502, МК 991, прадимицин, UK 292, бутенафин, хитиназу, крем 501, Акрисорцин, Амбрутицин, Аморолфин, Амфотерицин В; Азаконазол; Азасерин; Базифунгин; Бифоназол; Бифенамина гидрохлорид; Биспиритионин магсуфлекс; Бутоконазола нитрат; Ундециленат кальция; Кандицидин; Карбол-фучсин; Хлордантоин; Циклопирокс; Циклопирокс оламин; Циклофунгин; Цисконазол; Клотримазол; Купримиксин; Денофунгин; Дипиритион; Доконазол; Эконазол; Эконазола нитрат; Енилконазол; Этонама нитрат; Фентиконазола нитрат; Филипин; Флуконазол; Флуцитозин; Фунгимицин; Гризеофульвин; Гамицин; Изоконазол; Утраконазол; Калафунгин; Кетоконазол; Ломофунгин; Лидимицин; Мепатрицин; Миконазол; Миконазола нитрат; Моненсин; Моненсин натрия; Нафтифина гидрохлорид; Неомицина ундециленат; Нифурател; Нифурмерон; Нитраламина гидрохлорид; Нистатин; Каприловую кислоту; Орконазола нитрат; Оксиконазола нитрат; Оксифунгина гидрохлорид; Парконазола гидрохлорид; Партрицин; Йодистый калий; Проклонол; Пиритион-цинк; Пирролнитрин; Рутамицин; Сангинарий хлористый; Суперконазол; Скопафунгин; Сернистый селен; Синефунгин; Сульконазола нитрат; Тербинафин; Терконазол; Тирам; Тиклатон; Тиоконазол; Толциклат; Толиндат; Толнафтат; Триацетин; Триафунгин; Ундециленовую кислоту; Виридофульвин; Ундециленат цинка и Зиноконазола гидрохлорид.

Иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты могут быть объединены с другими терапевтическими агентами, такими как адъюванты, для усиления иммунных ответов. Иммуностимулирующую нуклеиновую кислоту и другой терапевтический агент можно вводить одновременно или раздельно. Когда другие терапевтические агенты вводят одновременно, их можно вводить в тех же или отдельных составах, но они вводятся в то же время. Другие терапевтические агенты вводят последовательно один за другим и с иммуностимулирующей нуклеиновой кислотой, когда введение других терапевтических агентов и иммуностимулирующей нуклеиновой кислоты разделено во времени. Разделение во времени между введением данных соединений может измеряться минутами или большим сроком. Другие терапевтические агенты включают в себя, но не ограничиваются этим, адъюванты, цитокины, антитела, антигены и т.д.

Иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты пригодны в качестве адъювантов для индукции системного иммунного ответа. Поэтому любая из них может быть введена субъекту, экспонированному с антигеном, для стимуляции усиленного иммунного ответа на антиген.

В дополнение к иммуностимулирующим нуклеиновым кислотам композиции настоящего изобретения могут вводиться также с адъювантами, отличными от нуклеиновых кислот. Отличный от нуклеиновой кислоты адъювант представляет собой любую молекулу или соединение, исключая описанные здесь иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты, которое может стимулировать гуморальный и/или клеточный иммунный ответ.

Отличные от нуклеиновой кислоты адъюванты включают в себя, например, адъюванты, создающие эффект депо, иммуностимулирующие адъюванты, адъюванты, создающие эффект депо и стимулирующие иммунную систему.

Адъювант, создающий эффект депо, применяют здесь в качестве адъюванта, обеспечивающего медленное высвобождение антигена в организм, тем самым пролонгирующего экспозицию иммунных клеток с антигеном. Данный класс адъювантов включает в себя, но не ограничивается этим, квасцы (например, гидроксид алюминия, фосфат алюминия); или составы на основе эмульсии, включая минеральное масло, неминеральное масло, эмульсию воды в масле и эмульсию масла в воде в масле, эмульсии масла в воде, такие как ряд адъювантов Montanide Seppic ISA (например, Montanide ISA 720, AirLiquide, Paris, Франция); MF-59 (эмульсия сквалена в воде, стабилизированная Span 85 и твин 80; Chiron Corporation, Emeryville, CA; и PROVAX (эмульсия масла в воде, содержащая стабилизирующее поверхностно-активное вещество и образующий мицеллы агент; IDEC, Pharmaceuticals Corporation, San Diego, CA).

Иммуностимулирующий адъювант представляет собой адъювант, вызывающий активацию клетки иммунной системы. Он может, например, вызывать продукцию и секрецию клеткой цитокинов. Данный класс адъювантов включает в себя, но не ограничивается этим, сапонины, очищенные из коры дерева Q. Saponaria, такие как QS21 (гликолипид, который элюируется в 21-м пике при фракционировании ВЭЖХ; Aquila Biopharmaceuticals, Inc., Worcester, MA); поли[ди(карбоксилатофенокси)фосфазен (РСРР полимер; Virus Research Institute, США); производные липополисахаридов, такие как монофосфориллипид A (MPL; Ribi ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, Mt), мурамилдипептид (MDP; Ribi) и треонилмурамилдипептид (t-MDP; Ribi); ОМ-174 (глюкозаминдисахарид, связанный с липидом А; ОМ Pharma SA, Meyrin, Швейцария); и фактор элонгации Leishmania (очищенный белок Leishmania); Corixa Corporation, Seattle, WA).

Адъюванты, создающие эффект депо и стимулирующие иммунную систему, представляют собой такие соединения, которые обладают обеими определенными выше функциями. Данный класс адъювантов включает в себя, но не ограничивается этим, ISCOMS (иммуностимулирующие комплексы, которые содержат смешанные сапонины, липиды и образуют частицы размера вирусов с порами, которые могут удерживать антиген; CSL, Melbourne, Австралия); SB-AS2 (SmithKline Beecham адъювантная система #2, представляющая собой эмульсию масла в воде, содержащую MPL и QS21: SmithKline Beecham Biologicals [SBB], Rixensart, Бельгия); SB-AS4 (SmithKline Beecham адъювантная система #4, содержащая квасцы и MPL; SBB, Бельгия); неионные блок-сополимеры, образующие мицеллы, такие как CRL 1005 (который содержит линейную цепь гидрофобного полиокспропилена, фланкируемую цепями полиоксиэтилена; Vaxcel, Inc., Norcross, GA); и Syntex Adjuvant Formulation (SAF, эмульсия масла в воде, содержащая твин 80 и неионный блок-сополимер; Syntex Chemicals, Inc., Boulder, CO).

Иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты пригодны также в качестве мукозных адъювантов. Ранее было обнаружено, что при мукозной доставке CpG нуклеиновых кислот индуцируется как системный, так и мукозный иммунитет. Индуцированный в ответ на CpG нуклеиновые кислоты системный иммунитет включал как гуморальный, так и опосредованный клетками ответ на специфичные антигены, которые сами по себе при нанесении на слизистую были не способны индуцировать системный иммунитет. Более того, CTL индуцировали как CpG нуклеиновые кислоты, так и холерный токсин (СТ, мукозный адъювант, индуцирующий Th2-подобный ответ). Это было удивительно, поскольку при системной иммунизации присутствие Th2-подобных антител обычно связано с отсутствием CTL (Schirmbeck et al., 1995). На основании представленных здесь результатов ожидается, что иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты должны действовать сходным образом.

Кроме того, иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты индуцируют ответ слизистой как локально (например, в легких), так и дистантно (например, в нижней части пищеварительного тракта). Иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты индуцируют значительный уровень антител IgA в дистантно расположенных участках слизистой. СТ обычно рассматривают в качестве высокоэффективного мукозного адъюванта. Как сообщалось ранее (Snider 1995), СТ индуцирует преимущественно антитела изотипа IgGI, которые служат индикатором ответа Тh2-типа. Напротив, иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты в большей степени адресуются к Th1 с преобладающими антителами IgG2a, особенно после поддерживающей иммунизации или при сочетании двух адъювантов. Антитела Th1-типа в целом обладают лучшей нейтрализующей активностью, и, следовательно, ответ Th2 в легких крайне нежелателен, поскольку он ассоциирован с астмой (Кау, 1996, Hogg, 1997). Таким образом, применение иммуностимулирующих нуклеиновых кислот имеет преимущества, которые недостижимы для других мукозных адъювантов. Иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты согласно изобретению пригодны также в качестве мукозных адъювантов для индукции как системного, так и мукозного иммунного ответа.

Мукозные адъюванты, обозначаемые как мукозные адъюванты, отличные от нуклеиновых кислот, могут также вводиться вместе с иммуностимулирующими нуклеиновыми кислотами. Применяемый здесь отличный от нуклеиновых кислот мукозный адъювант представляет собой адъювант, отличный от иммуностимулирующей нуклеиновой кислоты, который способен индуцировать мукозный иммунный ответ у субъекта при нанесении на поверхность слизистой вместе с антигеном. Мукозные адъюванты включают в себя, но не ограничиваются этим, бактериальные токсины, например холерный токсин (СТ), производные СТ, включающие в себя, но не ограниченные этим, субъединицу В СТ (СТВ) (Wu et al., 1998, Tochikubo et al., 1998); CTD53 (Val на Asp) (Fontana et al., 1995); CTK97 (Val на Lys) (Fontana et al., 1995); CTK104 (Туг на Lys) (Fontana et al., 1995); CTD53/K63 (Val на Asp, Ser на Lys) (Fontana et al., 1995); CTH54 (Arg на His) (Fontana et al., 1995); CTN107 (His на Asn) (Fontana et al., 1995); CTE114 (Ser на Glu) (Fontana et al., 1995); CTE112K (Glu на Lys) (Yamamoto et al., 1997a); CTS61F (Ser на Phe) (Yamamoto et al., 1997a, 1997b); CTS106 (Pro на Lys) (Douce et al., 1997, Fontana et al., 1995); и СТК63 (Ser на Lys) (Douce et al., 1997, Fontana et al., 1995), токсин Zonula occludens, zot, термолабильный энтеротоксин Escherichia coli, лабильный токсин (LT), производные LT, включая, но не ограничиваясь этим, субъединицу В LT (LTB) (Verweij et al., 1998); LT7K (Arg на Lys) (Komase et al., 1998, Douce et al., 1995); LT61F (Ser на Phe) (Komase et al., 1998); LT112K (Glu на Lys) (Komase et al., 1998); LT118E (Gly на Glu) (Komase et al., 1998); LT146E (Arg на Glu) (Komase et al., 1998); LT192G (Arg на Gly) (Komase et al., 1998); LTK63 (Ser на Lys) (Marchetti et al., 1998, Douce et al., 1997, 1998, Di Tommaso et al., 1996); и LTR72 (Ala на Arg) (Giuliani et al., 1998), коклюшный токсин, РТ. (Lycke et al., 1992, Spangler BD, 1992, Freytag and Clemments, 1999, Roberts et al., 1995, Wilson et al., 1995), включая PT-9K/129G (Roberts et al., 1995, Cropley et al., 1995); производные токсина (смотри ниже) (Holmgren et al., 1993, Verweij et al., 1998, Rappuoli et al., 1995, Freytag and Clements, 1999); производные липида А (например, монофосфорилированный липид A, MPL) (Sasaki et al., 1998, Vancott et al., 1998; производные мурамилдипептида (MDP) (Fukushima et al., 1996, Ogawa et al., 1989, Michaiek et al., 1983, Morisaki et al., 1983); белки наружной мембраны бактерий (например, белок А внешней поверхности (OspA) липопротеин Borrelia burgdorferi, белок наружной мембраны Neisseria meningitidis)(Marinaro et al., 1999, Van de Verg et al., 1996); эмульсии масла в воде (например, MF59) (Barchfield et al., 1999, Versehoor et al., 1999, O’Hagan, 1998); соли алюминия (Isaka et al., 1998, 1999); и сапонины (например, QS21) Aquiia Biopharmaceuticals, Inc., Worster, MA) (Sasaki et al., 1998, MacNeal et al., 1998), ISCOMS, MF-59 (эмульсия сквалена в воде, стабилизированная Span 85 и твин 80; Chiron Corporation, Emeryville, CA); серия Seppic ISA адъювантов Montanide (например, Montanide ISA 720; AirLiquide, Paris, Франция); PROVAX (эмульсия масла в воде, содержащая стабилизирующее поверхностно-активное вещество и образующий мицеллы агент; IDEC Pharmaceuticais Corporation, San Diego, CA); адъювантный состав Syntext (SAF; Syntex Chemicals, Inc., Boulder, CO); поли[ди(карбоксилатфенокси)фосфазен (РСРР полимер; Virus Research Institute, USA) и фактор элонгации Leishmania (Corixa Corporation, Seattle, WA).

Иммунные ответы также могут быть индуцированы или усилены путем совместного с иммуностимулирующими нуклеиновыми кислотами введения или параллельной экспрессии цитокинов (Bueler & Mulligan, 1996; Chow et al, 1997; Geissler et al., 1997; Iwasaki et al., 1997; Kirn et al., 1997) или костимулирующих молекул В-7 (Iwasaki et al., 1997; Tsuji et

al., 1997). Цитокины можно вводить прямо с иммуностимулирующими нуклеиновыми кислотами или в виде вектора нуклеиновой кислоты, кодирующего цитокин, в результате чего цитокин может быть экспрессирован in vivo. В одном осуществлении цитокин вводят в форме плазмидного экспрессионного вектора. Термин "цитокин" применяется здесь в качестве родового наименования для неоднородной группы растворимых белков и пептидов, действующих в качестве гуморальных регуляторов в концентрациях от нано- до пикомолярных, и которые в нормальных или патологических ситуациях модулируют функциональную активность отдельных клеток и тканей. Данные белки также прямо опосредуют взаимодействия между клетками и регулируют процессы, происходящие во внеклеточном окружении. Примеры цитокинов включают в себя, но не ограничиваются этим, ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-7, ИЛ-10, ИЛ-12, ИЛ-15, ИЛ-18, колониестимулирующий фактор гранулоцитов-макрофагов (GM-CSF), колониестимулирующий фактор гранулоцитов (G-CSF), интерферон-γ (γ-IFN), IFN-α: фактор некроза опухолей (TNF), TGF-(3, лиганд FLT-3 и лиганд CD40.

Цитокины играют важную роль в направленности Т-клеточного ответа. Хелперные Т-клетки (CD4+) организуют иммунный ответ млекопитающих посредством образования растворимых факторов, которые действуют на другие клетки иммунной системы, включая другие Т-клетки. Большая часть зрелых CD4+ хелперных Т-клеток экспрессирует один из двух профилей цитокинов: Th1 или Th2. Подгруппа Th1 стимулирует гиперчувствительность замедленного типа, клеточный иммунитет и переключение на иммуноглобулины класса IgG_2a. Подгруппа Th2 индуцирует гуморальный иммунитет путем активации В-клеток, стимуляции образования антител и индукции переключения на образование IgG₁ и IgE. В некоторых осуществлениях предпочтительно, чтобы цитокин представлял собой цитокин Th1.

Нуклеиновые кислоты пригодны также для переключения направленности иммунного ответа с Th2 иммунного ответа на Th1 иммунный ответ. Переориентацию иммунного ответа с Th2 на Th1 иммунный ответ можно определить путем измерения уровня цитокинов, продуцируемых в ответ на нуклеиновую кислоту (например, путем индукции продукции цитокинов Th1, включая ИЛ-12, ifn-γ и GM-CSF, моноцитами и другими клетками). Переключение направленности или изменение баланса иммунного ответа с Th2 на Th1 ответ особенно полезно для лечения или профилактики астмы. Например, эффективное для лечения астмы количество может быть таким количеством, которое пригодно для переключения Тh2-иммунного ответа, который ассоциирован с астмой, на Th1-тип ответа. Уровень цитокинов Th2, в особенности ИЛ-4 и ИЛ-5 повышен в дыхательных путях субъектов, страдающих астмой. Данные цитокины вызывают основные элементы астматического воспалительного ответа, включая индукцию изотипа IgE, хемотаксис эозинофилов и активацию и рост тучных клеток. Цитокины Th1, в особенности IFN-γ и ИЛ-12 могут подавлять образование клонов Th2 и продукцию цитокинов Тh2. Иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты согласно изобретению вызывают повышение цитокинов Тh1, которые способствуют изменению баланса иммунной системы, предотвращая или снижая неблагоприятные эффекты, связанные с доминированием Тh2-иммунного ответа.

Нуклеиновые кислоты пригодны также для улучшения выживаемости, дифференцировки, активации и созревания дендритных клеток. Иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты обладают уникальной способностью стимулировать выживаемость, дифференцировку, активацию и созревание дендритных клеток. Предшественники дендритных клеток, выделенные из крови с помощью иммуномагнитного сортинга клеток, проявляют морфологические и функциональные свойства дендритных клеток во время двухдневной инкубации с GM-CSF. Без GM-CSF данные клетки подвергаются апоптозу. Иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты превосходят GM-CSF в стимуляции выживания и дифференцировки дендритных клеток (экспрессия МСН II, размер клеток, гранулярность). Иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты также индуцируют созревание дендритных клеток. Поскольку дендритные клетки формируют связь между врожденной и приобретенной иммунной системой путем презентации антигенов, а также посредством экспрессии ими рецепторов, узнающих паттерн, которые определяют микробные молекулы типа LPS в их локальном окружении, способность иммуностимулирующих нуклеиновых кислот активировать дендритные клетки, способствует применению данной, основанной на применении иммуностимулирующих нуклеиновых кислот, стратегии для иммунотерапии in vivo и ex vivo таких заболеваний, как рак и аллергические или инфекционные заболевания. Иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты также пригодны для активации и индукции созревания дендритных клеток.

Иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты также повышают литическую активность клеток - естественных киллеров и зависимую от антитела клеточную цитотоксичность (ADCC). ADCC может быть достигнута с применением иммуностимулирующей нуклеиновой кислоты в сочетании с антителом, специфичным в отношении клетки-мишени, такой как раковая клетка. Когда иммуностимулирующую нуклеиновую кислоту вводят субъекту вместе с антителом, происходит стимуляция иммунной системы субъекта для уничтожения опухолевой клетки. Антитела, пригодные для процедуры ADCC, включают в себя антитела, которые взаимодействуют с клеткой в организме. Многие из таких антител, специфичных в отношении клеток-мишеней, были описаны в данной области техники и многие из них имеются в продаже. Примеры таких антител перечислены ниже в перечне средств иммунотерапии рака.

Иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты можно также вводить совместно с противораковой терапией. Средства противораковой терапии включают в себя противораковые лекарства, облучение и хирургические процедуры. Применяемый здесь термин “противораковое лекарство” относится к агенту, который вводят субъекту с целью лечения рака. Применяемый здесь термин “лечение рака” включает в себя профилактику развития рака, подавление симптомов рака и/или торможение роста уже имеющегося рака. В других вариантах противораковое лекарство вводят субъекту, имеющему риск развития рака, с целью снижения опасности развития рака. Ниже описаны различные типы лекарств для лечения рака. Для целей данного описания противораковые лекарства классифицируют как химиотерапевтические агенты, иммунотерапевтические агенты, раковые вакцины, гормональную терапию и модуляторы биологического ответа.

Применяемый здесь термин “противораковое лекарство” относится к агенту, который вводят субъекту с целью лечения рака. Применяемый здесь термин “лечение рака” включает в себя профилактику развития рака, подавление симптомов рака и/или торможение роста уже имеющегося рака. В других вариантах противораковое лекарство вводят субъекту, имеющему риск развития рака, с целью снижения опасности развития рака. Ниже описаны различные типы лекарств для лечения рака. Для целей данного описания противораковые лекарства классифицируют как химиотерапевтические агенты, иммунотерапевтические агенты, раковые вакцины, гормональную терапию и модуляторы биологического ответа. Кроме того, способы изобретения предназначены для включения применения более одного противоракового лекарства наряду с иммуностимулирующими нуклеиновыми кислотами. Например, когда это показано, иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты можно вводить как с химиотерапевтическим агентом, так и с иммунотерапевтическим агентом. В другом варианте противораковое лекарство может включать в себя иммунотерапевтический агент и раковую вакцину или химиотерапевтический агент и раковую вакцину или химиотерапевтический агент, иммунотерапевтический агент и раковую вакцину, которые все вместе вводят одному субъекту с целью лечения субъекта, страдающего раком или имеющего риск развития рака.

Противораковые лекарства действуют многими путями. Некоторые противораковые лекарства направлены на физиологические механизмы, специфичные для опухолевых клеток. Примеры включают в себя направленное действие на специфические гены и продукты данных генов (т.е. главным образом, белки), которые мутируют при раке. Такие гены включают в себя, но не ограничиваются этим, онкогены (например, Ras, Her2, bcl-2), гены супрессоров опухолей (например, EGF, p53, Rb) и мишени клеточного цикла (например, CDK4, р21, теломераза). В другом варианте противораковые лекарства могут быть направлены на пути проведения сигнала и молекулярные механизмы, которые изменяются в раковых клетках. Применение моноклональных антител обеспечивает направленность на раковые клетки посредством эпитопов, экспрессируемых на поверхности таких клеток. Последний тип противоракового лекарства обычно упоминается здесь как иммунотерапия.

Другие противораковые лекарства предназначены для клеток, отличных от раковых. Например, некоторые лекарства примируют иммунную систему для атаки опухолевых клеток (т.е. раковые вакцины). Еще один тип лекарств, называемый ингибиторами ангиогенеза, действует путем повреждения снабжения кровью солидных опухолей. Поскольку большинство злокачественных раков способно к метастазированию (т.е. существованию в месте первичной опухоли и рассеиванию в отдаленные ткани, с формированием тем самым вторичной опухоли), лекарства, препятствующие такому метастазированию, также пригодны для лечения рака. Посредники ангиогенеза включают в себя основной FGF, VEGF, ангиопоэтины, ангиостатин, эндостатин, TNFα, TNP-470, тромбосподин-1, фактор тромбоцитов 4, CAI и некоторые члены семейства интегриновых белков. Одной из категорий данного типа лекарств является ингибитор металлопротеиназ, который ингибирует ферменты, применяемые опухолевыми клетками для поддержания существования первичной опухоли и перехода в другую ткань.

Некоторые раковые клетки являются антигенными и таким образом могут быть объектом действия иммунной системы. В одном варианте совместное введение иммуностимулирующих нуклеиновых кислот и противораковых лекарств, в особенности тех, которые классифицируют как противораковые иммунотерапевтические средства, пригодно для стимуляции специфичного иммунного ответа против антигена рака. Применяемый здесь термин “раковый антиген” относится к соединению, такому как пептид, ассоциированному с поверхностью опухолевой или раковой клетки, и которое способно провоцировать иммунный ответ при экспрессии на поверхности антиген-презентирующей клетки в контексте молекулы МНС. Раковые антигены, такие как представленные в раковых вакцинах, или те, которые применяют для получения противораковых иммунотерапевтических средств, можно получить из сырых экстрактов раковых клеток, как описано Cochen, et al., 1994, Cancer Research, 54:1055, или путем частичной очистки антигенов с применением рекомбинантной технологии или синтеза de novo известных антигенов. Раковые антигены могут быть применены в форме иммуногенных частей конкретного антигена или в некоторых случаях в качестве антигена может быть применена целая клетка или опухолевая масса. Такие антигены могут быть выделены или получены рекомбинантным способом или любыми другими способами, известными в данной области техники.

Теория иммунного надзора заключается в том, что первичной функцией иммунной системы является выявление и уничтожение неопластических клеток до образования опухоли. Основополагающий принцип данной теории заключается в том, что раковые клетки антигенно отличаются от нормальных клеток и таким образом вызывают иммунные реакции, сходные с теми, которые вызывают отторжение иммунологически несовместимых аллотрансплантатов. Исследования подтвердили то, что опухолевые клетки отличаются качественно или количественно по экспрессии антигенов. Например, “специфичные для опухоли антигены” являются антигенами, специфично ассоциированными с опухолевыми клетками, но не с нормальными клетками. Примерами специфичных для опухолей антигенов являются вирусные антигены в опухолях, индуцированные ДНК- или РНК-вирусами. “Ассоциированные с опухолями” антигены имеются как в опухолевых, так и в нормальных клетках, но в опухолевых клетках представлены в ином количестве или в другой форме. Примерами таких антигенов являются онкофетальные антигены (например, карциноэмбриональный антиген), антигены дифференцировки (например, антигены Т и Тn) и продукты онкогенов (например, HER/neu).

Были идентифицированы различные типы клеток, способных вызывать гибель опухолей-мишеней in vitro и in vivo: клетки - естественные киллеры (NK-клетки), цитолитические Т-лимфоциты (CTL), активируемые лимфокинами клетки-киллеры (LAK) и активированные макрофаги. NK-клетки способны вызывать гибель опухолевых клеток без предварительной сенситизации к специфичным антигенам, и для этой активности не требуется присутствие антигенов класса I, кодируемых главным комплексом гистосовместимости (МНС), на клетках-мишенях. Полагают, что NK-клетки участвуют в контроле зарождающихся опухолей и контроле метастатического роста. В отличие от NK-клеток CTL могут вызывать гибель опухолевых клеток только после их сенсибилизации к опухолевым антигенам тогда, когда антиген-мишень экспрессируется на опухолевой клетке, которая экспрессирует и МНС класса I. Полагают, что CTL служат эффекторными клетками при отторжении трансплантированных опухолей и опухолей, вызванных ДНК-вирусами. Клетки LAK представляют собой подгруппу лимфоцитов ноль, отличную от популяций NK и CTL. Активированные макрофаги способны вызывать гибель клеток таким образом, что после активации это не зависит ни от антигена, ни от МНС. Считается, что активированные макрофаги снижают скорость роста опухолей, в которые они инфильтруются. В анализах in vitro выявлены и другие иммунные механизмы, такие как зависимые от антитела опосредуемые клетками цитотоксические реакции и лизис под действием антитела плюс комплемент. Однако, как полагают, данные иммунные эффекторные механизмы менее важны in vivo no сравнению с функциями NK, CTL, LAK и макрофагов in vivo (в качестве обзора смотри Piessens, W.F., and David, J., "Tumor Immunology", in: Scientific American Medicine, Vol.2, Scientific American Books, N.Y., pp.1-13, 1996.

Целью иммунотерапии является повышение иммунного ответа больного на уже имеющийся рак. Один из способов иммунотерапии включает в себя применение адъювантов. Адъювантные вещества, полученные из микроорганизмов, таких как бацилла Calmette-Guerin, усиливают иммунный ответ и повышают устойчивость к опухолям у животных.

Иммунотерапевтические агенты представляют собой лекарства, берущие начало от антител или фрагментов антител, которые специфически связывают или узнают раковый антиген. Применяемый здесь термин "раковый антиген" в широком смысле слова определяется как антиген, экспрессируемый раковой клеткой. Предпочтительно, чтобы антиген экспрессировался на клеточной поверхности раковой клетки. Еще более предпочтительно, чтобы антиген был таким, который не экспрессируется нормальными клетками или по меньшей мере не экспрессируется на том же уровне, что и в раковых клетках. Основанные на антителах иммунотерапевтические средства могут действовать путем связывания с клеточной поверхностью раковой клетки, стимулируя тем самым атаку эндогенной иммунной системы против раковой клетки. Другим путем, которым действует основанное на антителах терапевтическое средство, является система специфичной направленной доставки токсичных веществ к раковым клеткам. Антитела обычно конъюгируют с токсинами, такими как рицин (например, из касторовых бобов), калихеамицин и майтансиноиды, радиоактивными изотопами, такими как иод-131 и иттрий-90, с химиотерапевтическими агентами (как описано здесь) или с модуляторами биологического ответа. При данном способе токсичные вещества могут быть сконцентрированы в области рака, а неспецифичная токсичность по отношению к нормальным клеткам может быть сведена к минимуму. Кроме применения антител, которые специфичны в отношении раковых антигенов, в изобретении пригодны также антитела, которые связываются с сосудистой сетью, такие как антитела, связывающиеся с эндотелиальными клетками. Это оправдано, поскольку обычно выживание солидных опухолей зависит от заново формирующихся кровеносных сосудов, и поэтому большинство опухолей способно рекрутировать и стимулировать рост новых кровеносных сосудов. В результате одной из стратегий многих противораковых лекарств служит атака на снабжение опухоли кровеносными сосудами и/или соединительные ткани (или строму), поддерживающие такие кровеносные сосуды.

Применение иммуностимулирующих нуклеиновых кислот в сочетании иммунотерапевтическими агентами, такими как моноклональные антитела, способно повышать долговременное выживание посредством ряда механизмов, включая значительное усиление ADCC (как обсуждалось выше), активацию клеток-естественных киллеров (NK) и повышение уровня IFNa. Нуклеиновые кислоты при их применении в сочетании с моноклональными антителами служат для снижения дозы антитела, необходимой для достижения биологического результата.

Примеры противораковых иммунотерапевтических средств, которые применяются в настоящее время или которые находятся в стадии разработки, перечислены в таблице С.

Таблица С
Противораковые иммунотерапевтические средства на стадии разработки или имеющиеся в продаже
Продавец	Торговая марка (родовое наименование)	Показание
IDEC/Genentech, Inc./Hoffmann-LaRoche (первое моноклональное антитело, лицензированное для лечения рака в США)	Ритуксан™ (ритуксимаб, мабтера) (IDEC-С2В8, гибридное мышиное/человеческое анти-СD20 Mab)	Не-ходжкинская лимфома
Genentech/Hoffmann-La Roche	Герцептин, анти-Нег2 hMAb	Рак молочной железы/яичников
Cytogen Corp.	Квадрамет (CYT-424) радиотерапевтический агент	Костные метастазы
Centocor/Glaxo/Ajinomoto	Панорекс ® (17-1А) (мышиное моноклональное антитело)	Адъювантная терапия колоректального рака (Dukes-C)
Centocor/Ajinomoto	Панорекс ® (17-1А) (гибридное мышиное моноклональное антитело)	Рак поджелудочной железы, легких,

		молочной железы, яичников
I DEC	IDEC-Y2B8 (мышиное анти-СD20 Mab, меченное иттрием-90)	Не-ходжкинская лимфома
ImClone Systems	ВЕС2 (анти-идиотипичное Mab, имитирует эпитоп GD3) (с BCG)	Мелкоклеточный рак легкого
ImClone Systems	С225 (гибридное моноклональное антитело против рецептора эпидермального фактора роста (EGFr))	Рак клеток почек
Techniclone International/Alpha Therapeutics	Онколим (Lym-1 моноклональное антитело, соединенное с иодом-131)	Не-ходжкинская лимфома
Protein Design Labs	SMART M1 95 Ab, приближенное к человеческому	Острый миелоидный лейкоз
Techniclone Corporation/Cambridge Antibody Technology	131I! LYM-1 (онколим™)	Не-ходжкинская лимфома

Aronex Pharmaceuticals, Inc.	ATRAGEN®	Острый промиелоцитный лейкоз
ImClone Systems	C225 (гибридное моноклональное антитело против EGFr) + цисплатин или облучение	Рак головы и шеи, не-мелкоклеточный рак легкого
Altarex, Канада	Оварекс (В43.13, анти-идиотипичное СА125, мышиное Mab)	Рак яичников
Coulter Pharma (клинические результаты были положительными, но была установлена связанная с лекарством значительная токсичность в отношении костного мозга)	Бексксар (анти-СD20 Mab, меченное 131I)	Не-ходжкинская лимфома
Aronex Pharmaceuticals, Inc.	ATRAGEN®	Саркома Капоши
IDEC Pharmaceuticals Corp./Genetech	Ритуксан™ (Mab против CD20) pan-B Ab в упаковке с химиотерапией	В-клеточная лимфома

LeukoSite/Ilex Oncology	LDP-03, huMAb против лейкоцитного антигена САМРАТН	Хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL)
Center of Molecular Immunology	ior t6 (анти-СD6, мышиное Mab) CTCL	Рак
Medarex/Novartis	MDX-210 (приближенное к человеческому анти-НЕК-2 биспецифическое антитело)	Рак молочной железы, яичников
Medarex/Novartis	MDX-210 (приближенное к человеческому анти-НЕК.-2 биспецифическое антитело)	Рак предстательной железы, не-мелкоклеточный рак легкого, рак поджелудочной железы, молочной железы
Medarex	MDX-11 (комплемент-активирующий рецептор (CAR) моноклональное антитело)	Острый миелогенный лейкоз (AML)
Medarex/Novartis	MDX-210 (приближенное к человеческому анти-НЕВ.-2 биспецифическое антитело)	Рак почек и толстой кишки

Medarex	MDX-11 (комплемент-активирующий рецептор (CAR) моноклональное антитело)	Очистка костного мозга ex vivo при остром миелогенном лейкозе (AML)
Medarex	MDX-22 (приближенное к человеческому биспецифическое антитело, конъюгаты Mab) (активаторы каскада комплемента)	Острый миелоидный лейкоз
Cytogen	OV103 (меченное иттрием-90 антитело)	Рак яичников
Cytogen	OV103 (меченное иттрием-90 антитело)	Рак простаты
Aronex Pharmaceuticals, Inc.	ATRAGEN®	Не-ходжкинская лимфома
Glaxo Wellcome pie	3622W94 Mab, которое связывается с EGP40 (17-1А) антигеном панкарциномы на аденокарциномах	Не-мелкоклеточный рак легкого, рак простаты (адъювант)
Genentech	Анти-VEGF, RhuMAb (тормозит ангиогенез)	Рак легкого, молочной железы, предстательной железы, колоректальный

		рак
Protein Design Labs	Зенапакс (SMART анти-Тас (рецептор ИЛ-2) Ab, приближенное к человеческому)	Лейкоз, лимфома
Protein Design Labs	SMART M1 95 Ab, приближенное к человеческому	Острый промиелоцитный лейкоз
ImClone Systems	С225 (гибридное анти-EGFr моноклональное антитело) + таксол	Рак молочной железы
ImClone Systems (лицензия от RPR)	С225 (гибридное анти-EGFr моноклональное антитело) + доксорубицин	Рак предстательной железы
ImClone Systems	С225 (гибридное анти-EGFr моноклональное антитело) + адриамицин	Рак предстательной железы
ImClone Systems	ВЕС2 (анти-идиотипичное Mab, имитирует эпитоп GD3)	Меланома
Medarex	MDX-210 (приближенное к человеческому анти-НЕР-2 биспецифическое антитело)	Рак
Medarex	MDX-220 (биспецифическое для опухолей,	Рак легкого, толстой

	которые экспрессируют TAG-72)	кишки, предстательной железы, яичников, эндометрия, поджелудочной железы и желудка
Medarex/Novartis	MDX-210 (приближенное к человеческому анти-НЕР-2 биспецифическое, антитело)	Рак предстательной железы
Medarex/Merck KgaA	MDX-447 (приближенное к человеческому биспецифическое, антитело против рецептора EGF)	Раки, ассоциированные с рецептором EGF (головы и шеи, предстательной железы, легкого, мочевого пузыря, шейки матки, яичников)
Medarex/Novartis	MDX-210 (приближенное к человеческому анти-НЕК-2 биспецифическое антитело)	Комбинированная с G-CSF терапия различных раков, в особ. -

		молочной железы
IDEC	MELIMMUNE-2 (терапевтическая вакцина мышиного моноклонального антитела)	Меланома
I DEC	MELIMMUNE-1 (терапевтическая вакцина мышиного моноклонального антитела)	Меланома
Immunomedics, Inc.	CEACIDE™ (1-131)	Колоректальный рак и другие
NeoRx	Претаргет™ радиоактивные антитела	Не-ходжкинская В-клеточная лимфома
Novopharm Biotech, Inc.	NovoMAb-G2 (Ab, специфичное для панкарциномы)	Рак
Techniclone Corporation/Cambridge Antibody Technology	TNT (гибридное Mab против гистоновых антигенов)	Рак мозга
Techniclone International/Cambridge	TNT (гибридное Mab против гистоновых антигенов)	Рак мозга

Antibody Technology
Novopharm	Глиомаб-Н (моноклональные - приближенные к человеческим Abs)	Рак мозга, меланомы, нейробластомы
Genetics Institute/AHP	GNI-250 MAb	Колоректальный рак
Merck KgaA	EMD-72000 (гибридное - антагонист EGF)	Рак
Immunomedics	ЛимфоЦид (приближенное к человеческому антитело LL2)	Не-ходжкинская В-клеточная лимфома
Immunex/AHP	СМА 676 (конъюгат моноклонального антитела)	Острый миелогенный лейкоз
Novopharm Biotech, Inc.	Монофарм-С	Рак толстой кишки, легкого, поджелудочной железы
Novopharm Biotech, Inc.	4В5 анти-идиотипичное АЬ	Меланома, мелкоклеточный рак легкого
Center of Molecular Immunology	ior egf/r3 (анти-EGF-R приближенное к	Радиоиммунотерапия

	человеческому Ab)
Center of Molecular Immunology	ior c5 (мышиное колоректальное Mab) для радиоиммунотерапии	Колоректальный рак
Creative BioMolecules/Chiron	BABS (сайт связывания биосинтетического антитела) белки	Рак молочной железы
IbClone Systems/Chugai	FLK-2 (моноклональное антитело против фетальной печеночной киназы-2 (FLK-2))	Связанный с опухолью ангиогенез
ImmunoGen, Inc.	Конъюгат приближенного к человеческому МаЬ/малого лекарства	Мелкоклеточный рак легкого
Medarex, Inc.	MDX-260 биспецифическое, направляет GD-2	Меланома, глиома, нейробластома
Procyon Biopharma, Inc.	ANA Ab	Рак
Protein Design Labs	SMART 1D10 Ab	В-клеточная лимфома
Protein Design Labs/Novartis	SMART ABL 364 Ab	Рак молочной железы, легкого, толстой кишки
Immunomedics, Inc.	ImmuRAIT-CEA	Колоректальный рак

Другие типы химиотерапевтических агентов, которые могут быть применены в соответствии с изобретением, включают в себя аминоглутетимид, аспарагиназу, бусульфан, карбоплатин, хлоромбуцил, цитарабин НСl, дактиномицин, даунорубицин НСl, эстрамустинфосфат натрия, этопосид (VP16-213), флоксуридин, фторурацил (5-FU), флутамид, гидроксимочевину (гидроксикарбамид), ифосфамид, интерферон альфа-2а, альфа-2b, леупролида ацетат (аналог ЛГРГ-рилизинг-фактора), ломустин (CCNU), мехлорэтамин НСl (горчичный азот), меркаптопурин, месна, митотан (о.п’-ДДД), митоксантрон НСl, октреолид, пликамицин, прокарбазин НС1, стрептозоцин, тамоксифена цитрат, тиогуанин, тиотепа, винбластина сульфат, амсакрин (т-AMSA), азацитидин, эртропоэтин, гексаметилмеламин (НММ), интерлейкин 2, митогуазон (метил-GAG; метилглиоксальбисгуанилгидразон; MGBG), пентостатин (2’дезоксикоформицин), семустин (метил-CCNU), тенипосид (VM-26) и виндесина сульфат.

Раковые вакцины представляют собой лекарственные средства, предназначенные для стимуляции эндогенного иммунного ответа против раковых клеток. Производимые в настоящее время вакцины преимущественно активируют гуморальную иммунную систему (т.е. зависимый от антител иммунный ответ). Другие вакцины, находящиеся в настоящее время в стадии разработки, направлены на активацию опосредуемой клетками иммунной системы, включая цитотоксичные Т-лимфоциты, которые способны вызывать гибель опухолевых клеток. Раковые вакцины обычно повышают презентацию раковых антигенов как для антиген-презентирующих клеток (например, макрофагов и дендритных клеток) так и/или для других иммунных клеток, таких как Т-клетки, В-клетки и NK-клетки.

Хотя раковые вакцины могут принимать одну из нескольких форм, как обсуждается ниже, их назначение состоит в доставке раковых антигенов и/или антигенов, ассоциированных с раком, к антиген-презентирующим клеткам (АРС) для облегчения эндогенного процессинга таких антигенов АРС и окончательной презентации антигенной презентации на клеточной поверхности в контексте молекул МНС класса I. Одной из форм раковой вакцины является вакцина из целых клеток, которая представляет собой препарат раковых клеток, которые были выделены из субъекта, обработаны ex vivo и затем вновь введены субъекту в виде целых клеток. В качестве раковых вакцин для вызова иммунного ответа могут быть также применены лизаты опухолевых клеток. Другой формой раковой вакцины является пептидная вакцина, в которой для активации Т-клеток применяют специфичные для рака или ассоциированные с раком малые белки. Ассоциированные с раком белки представляют собой белки, которые экспрессируются не только раковыми клетками (т.е. другие нормальные клетки также могут экспрессировать данные антигены). Однако экспрессия ассоциированных с раком антигенов обычно стойко повышается при раках определенного типа. Еще одной формой раковой вакцины является вакцина из дендритных клеток, которая включает в себя целые дендритные клетки, которые были экспонированы с раковым антигеном или ассоциированным с раком

антигеном in vitro. В качестве раковых вакцин также могут быть применены лизаты мембранных фракций дендритных клеток. Вакцины из дендритных клеток способны прямо активировать антиген-презентирующие клетки. Другие раковые вакцины включают в себя ганглиозидные вакцины, вакцины белков теплового шока, вирусные и бактериальные вакцины и вакцины нуклеиновых кислот.

Применение иммуностимулирующих нуклеиновых кислот в сочетании с раковыми вакцинами обеспечивает улучшенный специфичный для антигена гуморальный и опосредуемый клетками иммунный ответ в дополнение к активации NK-клеток и эндогенных дендритных клеток и повышению уровня IFNα. Данное повышение позволяет применять вакцину со сниженной дозой антигена для достижения такого же благоприятного действия. В некоторых случаях раковые вакцины можно применять вместе с адъювантами, такими как описанные выше.

Применяемые здесь термины “раковый антиген” и “опухолевый антиген” используются взаимозаменяемо для обозначения антигенов, которые дифференциально экспрессируются раковыми клетками и благодаря этому могут быть применены для направленного воздействия на раковые клетки. Раковые антигены представляют собой антигены, потенциально способные стимулировать очевидно специфичные в отношении опухоли иммунные ответы. Некоторые из данных антигенов кодируются, хотя не обязательно экспрессируются, нормальными клетками. Данные антигены могут быть охарактеризованы как такие, которые обычно молчат (т.е. не экспрессируются) в нормальных клетках, которые экспрессируются лишь на определенных стадиях дифференцировки и которые временно экспрессируются, такие как эмбриональные и фетальные антигены. Другие раковые антигены кодируются мутантными клеточными генами, такими как онкогены (например, активированный онкоген ras), супрессорные гены (например, мутантный р53), генами гибридных белков, возникающих из-за внутренних делеций или хромосомных транслокаций. Еще одни раковые антигены кодируются вирусными генами, такими, которые переносятся РНК- и ДНК-опухолевыми вирусами.

Другие вакцины принимают форму дендритных клеток, которые были экспонированы с раковыми антигенами in vitro, подвергли антигены процессингу и способны экспрессировать раковые антигены на своей клеточной поверхности в контексте молекул МНС для эффективной презентации антигена другим клеткам иммунной системы.

В одном варианте изобретения иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты применяют в сочетании с раковыми вакцинами, основанными на дендритных клетках. Дендритная клетка представляет собой специализированную на презентации антигена клетку. Дендритные клетки образуют связь между врожденной и приобретенной иммунной системой путем презентации антигенов и посредством экспрессии ими рецепторов узнавания паттерна, которые определяют микробные молекулы, подобные LPS, в их местном окружении. Дендритные клетки эффективно интернализуют, подвергают процессингу и презентируют растворимый специфический антиген, с которым они экспонируются. Процесс интернализации и презентации антигена вызывает быстрое повышение экспрессии главного комплекса гистосовместимости (МНС) и ко стимулирующих молекул, образования цитокинов и миграцию в направлении лимфатических органов, где они, как полагают, участвуют в активации Т-клеток.

В таблице D перечислено множество раковых вакцин, которые либо применяются в настоящее время, либо находятся в стадии разработки.

Таблица D
Разрабатываемые или имеющиеся в продаже раковые вакцины
Продавец	Торговая марка (родовое наименование)	Показание
Center of Molecular Immunology	EGF	Рак
Center of Molecular Immunology		Ганглиозидная раковая вакцина
Center of Molecular Immunology	Анти-идиотипическая	Раковая вакцина
ImClone Systems/Memorial Sloan-Kettering Cancer Center	Антиген Gp75	Меланома
ImClone Systems/Memorial Sloan-Kettering Cancer Center	Анти-идиотипические Abs	Раковые вакцины
Progenies Pharmaceuticals, Inc.	GMK меланомная вакцина	Меланома
Progenies Pharmaceuticals, Inc.	MGV вакцина конъюгата ганглиозида	Лимфома, колоректальный рак, рак легкого
Corixa	Her2/neu	Рак молочной железы,

		яичников
AltaRex	Оварекс	Рак яичников
AVAX Technologies Inc.	M-Vax, аутологичные целые клетки	Меланома
AVAX Technologies Inc.	O-Vax, аутологичные целые клетки	Рак яичников
AVAX Technologies Inc.	L-Vax, аутологичные целые клетки	Лейкоз-AML
Biomira Inc./Chiron	Тератоп, STn-KLH	Рак молочной железы, колоректальный рак
Biomira Inc.	BLP25, MUC-1 пептидная вакцина, инкапсулированная в липосомную систему доставки	Рак легкого
Biomira Inc.	BLP25, MUC-1 пептидная вакцина, инкапсулированная в липосомную систему доставки + липосомальный ИЛ-2	Рак легкого
Biomira Inc.	Липосомальная идиотипическая вакцина	Лимф ома злокачественное перерождение В-клеток

Ribi Immunochem	Мелацин, клеточный лизат	Меланома
Corixa	Пептидные антигены, микросферная система доставки и адъювант LeIF	Рак молочной железы
Corixa	Пептидные антигены, микросферная система доставки и адъювант LeIF	Рак предстательной железы
Corixa	Пептидные антигены, микросферная система доставки и адъювант LeIF	Рак яичников
Corixa	Пептидные антигены, микросферная система доставки и адъювант LeIF	Лимфома
Corixa	Пептидные антигены, микросферная система доставки и адъювант LeIF	Рак легкого
Virus Research Institute	Токсин/антиген рекомбинантная система доставки	Все виды рака
Apollon Inc.	Геневакс-TCR	Т-клеточная лимфома
Bavarian Nordic Research Institute A/S	Вакцина на основе MVA (вируса коровьей оспы)	Меланома

BioChem Pharma/BioChem Vaccine	РАС IS, BCG вакцина	Рак мочевого пузыря
Cantab Pharmaceuticals	TA-HPV	Рак шейки матки
Cantab Pharmaceuticals	TA-CIN	Рак шейки матки
Cantab Pharmaceuticals	DISC-вирус, иммунотерапия	Рак
Pasteur Merieux Connaught	ИммуЦист®/ТераЦис®-ВСе иммунотерапевтическая (Baccilus Calmette-Guerin/Connaught), для внутрипузырного лечения поверхностного рака мочевого пузыря	Рак мочевого пузыря

Применяемые здесь химиотерапевтические агенты охватывают все другие формы противораковых лекарств, которые не подпадают под категории иммунотерапевтических агентов или раковых вакцин. Применяемые здесь химиотерапевтические агенты включают в себя как химические, так и биологические агенты. Действие данных агентов направлено на торможение клеточной активности, от которой зависит продолжительное выживание раковой клетки. Категории химиотерапевтических агентов включают в себя алкилирующие/алкалоидные агенты, антиметаболиты, гормоны или гормональные аналоги и разнообразные антинеопластические лекарства. Большинство, если не все, из данных агентов являются прямо токсичными в отношении раковых клеток и не нуждаются в иммунной стимуляции. Сочетание химиотерапии с введением иммуностимулирующей нуклеиновой кислоты повышает максимальную переносимую дозу химиотерапии.

Химиотерапевтические агенты, которые в настоящее время разрабатываются или применяются в клинических условиях, представлены в таблице Е.

Таблица Е
Разрабатываемые или имеющиеся в продаже противораковые лекарства
Продавец	Торговая марка	Родовое наименование	Показание
Abbott	TNP 470/AGM 1470	Фрагилин	Анти-ангиогенез в раковой опухоли
Takeda	TNP 470/AGM 1470	Фрагилин	Анти-ангиогенез в раковой опухоли
Scotia	Мегламин GLA	Мегламин GLA	Рак мочевого пузыря
Medeva	Валстар	Валрубицин	Рак мочевого пузыря - устойчивая in situ карцинома
Medeva	Валстар	Валрубицин	Рак мочевого пузыря - папиллирный рак
Rhone Poulenc	Глиадель облатка	Кармустаин + полифепросан	Опухоль мозга
Warner Lambert	Неизвестный рак (b)	Неизвестный рак (b)	Рак
Bristol Myers Squib	Ингибитор фарнезилтрансферазы RAS	Ингибитор фарнезилтрансферазы RAS	Рак

Novartis	MMI 270	MMI 270	Рак
Bayer	BAY 12-9566	BAY 12-9566	Рак
Merck	Ингибитор фарнезилтрансферазы	Ингибитор фарнезилтрансферазы	Рак (солидные опухоли -поджелудочной железы, толстой кишки, легкого, молочной железы)
Pfizer	PFE	ММР	Рак, ангиогенез
Pfizer	PFE	Тирозинкиназа	Рак, ангиогенез
Lilly	MTA/LY 231514	MTA/LY 231514	Раковые солидные опухоли
Lilly	LY 264618/лометексол	Лометексол	Раковые солидные опухоли
Scotia	Гламолек	LiGLA (литий-гамма линоленат)	Рак панкреатический, молочной железы, толстой кишки
Warner Lambert	CI-994	CI-994	Рак, солидные опухоли/лейкоз
Schering AG	Ингибитор ангиогенеза	Ингибитор ангиогенеза	Рак/сердце
Takeda	TNP-470	Не изв.	Злокачественная опухоль
Smithkline Beecham	Хикамтин	Топотекан	Метастатический рак яичников

Novartis	PCK 412	PCK 412	Рак, устойчивый ко многим лекарствам
Novartis	Валсподар	PSC 833	Миелоидный лейкоз/рак яичников
Immunex	Новантрон	Митоксантрон	Боль, связанная с устойчивым к гормону раком предстательной железы
Warner Lambert	Метарет	Сур амин	Рак предстательной железы
Genentech	Анти-VEGF	Анти-VEGF	Рак предстательной железы/ молочной железы, колоректальный рак/ рак NSCL
British Biotech	Батимастат	Батимастат (ВВ94)	Птеригий
Eisai	Е 7070	Е 7070	Солидные опухоли
Biochem Pharma	ВСН-4556	ВСН-4556	Солидные опухоли
Sankyo	CS-682	CS-682	Солидные опухоли
Agouron	AG2037	AG2037	Солидные опухоли
IDEC Pharma	9-АС	9-АС	Солидные опухоли

Agouron	Ингибиторы VEGF/b-FGF	Ингибиторы VEGF/b-FGF	Солидные опухоли
Agouron	AG3340	AG3340	Солидные опухоли/макулярная деген.
Vertex	Инцел	VX-710	Солидные опухоли - IV
Vertex	VX-853	VX-853	Солидные опухоли - пероральный
Zeneca	ZD 0101 (inj)	ZD 0101	Солидные опухоли
Novartis	ISI 641	ISI 641	Солидные опухоли
Novartis	ОДН 698	ОДН 698	Солидные опухоли
Tanube Seiyaku	ТА 2516	Маримистат	Солидные опухоли
British Biotech	Маримистат	Маримистат(ВВ 2516)	Солидные опухоли
Celltech	CDP 845	Ингибитор агреканазы	Солидные опухоли/рак молочной железы
Chiroscience	D2163	D2163	Солидные опухоли/метастазы
Warner Lambert	PD 183805	PD 183805
Daiichi	DX8951f	DX8951f	Противораковый
Daiichi	Лемонал DP 2202	Лемонал DP 2202	Противораковый

Fujisawa	FK 317	FK 317	Противораковый антибиотик
Chugai	Пицибанил	ОК-432	Против злокачественной опухоли
Nycomed Amersham	AD 32/валрубицин	валрубицин	Рак мочевого пузыря- устойчивая in situ карцинома
Nycomed Amersham	Метастрон	Производное стронция	Рак кости (адъювантная терапия, боль)
Schering Plough	Темодал	Темозоломид	Опухоли мозга
Schering Plough	Темодал	Темозолонид	Опухоли мозга
Liposome	Эвацет	Доксорубицин, липосомальный	Рак молочной железы
Nycomed Amersham	Ютаксан	Паклитаксел	Рак молочной железы поздней стадии, рак яичников поздней стадии
Brisyol Myers Squib	Таксол	Паклитаксел	Рак молочной железы поздней стадии, рак яичников поздней стадии, NSCLC
Roche	Кселода	Капецитабин	Рак молочной железы,

			колоректальный рак
Roche	Фуртулон	Доксифлуридин	Рак молочной железы, колоректальный рак, рак желудка
Pharmacia & Upj ohn	Адриамицин	Доксорубицин	Рак молочной железы, лейкоз
Ivax	Циклопакс	Паклитаксел, пероральный	Рак молочной железы/яичников
Rhone Poulenc	Пероральный таксоид	Пероральный таксоид	Широкий спектр раков
AHP	Новантрон	Митоксантрон	Рак
Sequus	SPI-077	Цисплатин, скрытный	Рак
Hoechst	HMR 1275	Флавопиридол	Рак
Pfizer	СР-358,774	EGFR	Рак
Pfizer	СР-609,754	Ингибитор онкогена RAS	Рак
Brisyol Myers Squib	BMS-182751	Пероральная платина	Рак (легкого, яичников)

Brisyol Myers Squib	UTF (тегафур/урацил)	UTF (тегафур/урацил)	Рак, пероральный
Johnson & Johnson	Эргамисол	Левамисол	Терапия рака
Glaxo We 11 come	Енилурацил/776С85	5FU энхансер	Рак, устойчивый солидный и колоректальный рак
Johnson & Johnson	Эргамисол	Левамисол	Рак толстой кишки
Rhone Poulenc	Кампто	Иринотекан	Колоректальный рак, рак шейки матки
Pharmacia & Up John	Камптосар	Иринотекан	Колоректальный рак, рак шейки матки
Zeneca	Тому деке	Ралитрексед	Колоректальный рак, рак легкого, рак молочной железы
Johnson & Johnson	Леустаин	Кладрибин	Волосатоклеточный лейкоз (лейкемический ретикулез)
Ivax	Паксен	Паклитаксел	Саркома Капоши

Sequus	Доксил	Доксорубицин, липосомальный	KS/рак
Sequus	Целике	Доксорубицин, липосомальный	KS/рак
Sobering AG	Флудара	Флударабин	Лейкоз
Pharmacia & Up John	Фарморубицин	Эпирубицин	Рак легкого/молочной железы
Chiron	ДепоЦит	ДепоЦит	Неопластический менингит
Zeneca	ZD1839	ZD1839	Не-мелкоклеточный рак легкого, рак поджелудочной железы
BASF	LU 79553	Бис-нафталимид	Онкология.
BASF	LU 103793	Доластаин	Онкология
Schering Plough	Цетикс	Доксорубицин-липосома	Рак яичников/молочной железы
Lilly	Гемзар	Гемцитабин	Рак поджелудочной железы, не-мелкоклеточный рак легкого, рак молочной железы, мочевого пузыря и яичников

Zeneca	ZD 0473/анормед	ZD 0473/анормед	NSCL на основе платины, рак яичников и т.д.
Yamanouchi	YM 116	YM 116	Рак предстательной железы
Nycomed Amersham	Зерна/1-125 быстрый St	Зерна иода	Рак предстательной железы
Agouron	Ингибиторы cdk4/cdk2	Ингибиторы cdk4/cdk2	Солидные опухоли
Agouron	Ингибиторы PARP	Ингибиторы PARP	Солидные опухоли
Chiroscience	D4809	Дексифосамид	Солидные опухоли
Brisyol Myers Squib	UFT (тегафур/урацил)	UFT (тегафур/урацил)	Солидные опухоли
Sankyo	Крестин	Крестин	Солидные опухоли
Asta Medica	Ифекс/меснекс	Ифосамид	Солидные опухоли
Brisyol Myers Squib	Ифекс/меснекс	Ифосамид	Солидные опухоли
Brisyol Myers Squib	Вумон	Тенипосид	Солидные опухоли
Brisyol Myers Squib	Параплатин	Карбоплатин	Солидные опухоли

Brisyol Myers Squib	Плантинол	Цисплатин, скрытный	Солидные опухоли
Brisyol Myers Squib	Плантинол	Цисплатин	Солидные опухоли
Brisyol Myers Squib	Вепесид	Этопосид	Солидные опухоли, меланома
Zeneca	ZD 9331	ZD 9331	Солидные опухоли, колоректальный рак поздней стадии
Chugai	Таксотер	Доцетаксел	Солидные опухоли, рак молочной железы
Rhone Poulenc	Таксотер	Доцетаксел	Солидные опухоли, рак молочной железы
Glaxo Wellcome	Пролекарство гуанинарабинсида	Пролекарство арабинсида	Т-клеточный лейкоз/лимфома и В-клеточная неоплазма
Brisyol Myers Squib	Аналог таксана	Аналог таксана	Завершается таксолом

В одном осуществлении в способах согласно изобретению применяют иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты в качестве замены применения терапии IFNα в лечении рака. В настоящее время некоторые схемы лечения предусматривают применение IFNα. Поскольку IFNα образуется после введения некоторых иммуностимулирующих нуклеиновых кислот, данные нуклеиновые кислоты могут быть применены для эндогенного образования IFNα.

Изобретение также включает в себя способ индукции неспецифичной в отношении антигена врожденной иммунной активации и вызова устойчивости широкого спектра к инфекциям с применением иммуностимулирующих нуклеиновых кислот. Применяемый здесь термин неспецифичная в отношении антигена врожденная иммунная активация относится к активации иммунных клеток, отличных от В-клеток, и может, например, включать в себя активацию NK-клеток, Т-клеток или других иммунных клеток, которые могут отвечать независимо от антигена, или некоторые сочетания данных клеток. Вызов устойчивости широкого спектра к инфекциям индуцируется благодаря тому, что иммунные клетки находятся в активной форме и примированы к ответу на любое неправильное соединение или микроорганизм. Клетки не должны быть специфически примированы против конкретного антигена. Это особенно ценно при биологической войне и других описанных выше обстоятельствах, таких как путешествия.

Индекс стимуляции конкретной иммуностимулирующей нуклеиновой кислоты может быть определен с помощью различных тестов с иммунными клетками. Предпочтительно, чтобы индекс стимуляции иммуностимулирующей нуклеиновой кислоты в отношении пролиферации В-клеток равнялся по меньшей мере приблизительно 5, предпочтительно по меньшей мере приблизительно 10, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 15, и наиболее предпочтительно по меньшей мере приблизительно 20, при определении по включению ³H уридина в мышиные В-клетки в культуре, которые контактировали с 20 мкМ нуклеиновой кислоты в течение 20 час при 37°С, затем получали пульсовую метку 1 мкКи ³H уридина; собирались и использовались для счета радиоактивности через 4 час, как подробно описано в РСТ Опубликованных патентных заявках PCT/US 95/01570 (WO 96/02555) и PCT/US 97/19791 (WO 98/18810) с приоритетом заявок США, порядковые Nos. 08/386063 и 08/960774, зарегистрированных 7 февраля 1995 г. и 30 октября 1997 г., соответственно. Для применения in vivo, например, важно, чтобы иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты были способны эффективно индуцировать иммунный ответ, такой как, например, образование антитела.

Иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты эффективны у позвоночных, отличных от грызунов. Различные иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты могут вызывать оптимальную иммунную стимуляцию в зависимости от типа субъекта и последовательности иммуностимулирующий нуклеиновой кислоты. Было обнаружено, что многие позвоночные согласно изобретению чувствительны к одному и тому же классу иммуностимулирующих нуклеиновых кислот, иногда упоминаемых как специфичные для человека иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты. Грызуны, однако, отвечают на другие нуклеиновые кислоты. Как показано здесь, иммуностимулирующая нуклеиновая кислота, вызывающая оптимальной стимуляции у человека, обычно может не вызывать оптимальную стимуляцию у мыши, и наоборот. Иммуностимулирующая нуклеиновая кислота, вызывающая оптимальную стимуляцию у человека, однако, часто вызывает оптимальную стимуляцию у других животных, таких как корова, лошадь, овца и др. Специалист в данной области техники может определить оптимальные последовательности нуклеиновой кислоты, пригодные для конкретных интересующих видов, с помощью обычных анализов, описанных здесь и/или известных в технике, с применением предлагаемого здесь руководства.

Иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты можно прямо вводить субъекту или можно вводить вместе с комплексом доставки нуклеиновой кислоты. Комплекс доставки нуклеиновой кислоты будет обозначить молекулу нуклеиновой кислоты, ассоциированную (например, связанную неионно или ковалентно; или инкапсулированную внутри) со средствами направленной доставки (например, молекулой, обеспечивающей связывание с клеткой-мишенью с более высоким сродством (например, поверхностями В-клеток) и/или повышенный захват клетками-мишенями). Примеры комплексов доставки нуклеиновой кислоты включают в себя нуклеиновые кислоты, ассоциированные со стерином (например, холестерином), липидом (например, катионным липидом, виросомой или липосомой) или специфически связывающимся с клеткой-мишенью агентом (например, лигандом, узнаваемым специфическим рецептором клетки-мишени). Предпочтительные комплексы могут быть в значительной мере стабильными in vivo для предотвращения значительного распада до интернализации клеткой-мишенью. Однако комплекс может быть расщепляемым при подходящих условиях в клетке, в результате чего нуклеиновая кислота выделяется в функциональной форме.

Средства доставки или устройства доставки антигена и нуклеиновых кислот к поверхностям были описаны. Иммуностимулирующая нуклеиновая кислота и/или антиген и/или другие терапевтические агенты могут вводиться отдельно (например, в солевом растворе или буфере) или с применением любых средств доставки, известных в технике. Например, были описаны следующие средства доставки: кохлеаты (Gould-Fogerite et al., 1994, 1996); эмульсомы (Vancott et al., 1998, Lowell et al., 1997); ISCOMs (Mowat et al., 1993, Carlsson et al., 1991, Hu et., 1998, Morein et al., 1999); липосомы (Childers et al., 1999, Michaiek et al., 1989, 1992, de Haan 1995a, 1995b); живые бактериальные векторы (например, Salmonella, Escherichia coli, Bacillus calmatte-guerin, Shigella, Lacto bacillus) (Hone et al., 1996, Pouwels et al., 1998, Chatfield et al., 1993, Stover et al., 1991, Nugent et al., 1998); живые вирусные векторы (например, вирус коровьей оспы, аденовирус. Herpes Simplex) (Gallichan et al., 1993, 1995, Moss et al., 1996, Nugent et al., 1998, Flexner et al., 1988, Morrow et al., 1999); микросферы (Gupta et al., 1998, Jones et al., 1996, Maloy et al., 1994, Moore et al., 1995, O’Hagan et al., 1994, Eldridge et al., 1989); вакцины нуклеиновых кислот (Fynan et al., 1993, Kukin et al., 1997, Sasaki et al., 1998, Okada et al., 1997, Ishii et al., 1997); полимеры (например, карбоксиметилцеллюлоза, хитозан) (Hamajima et al., 1998, Jabbal-Gill et al., 1998); полимерные кольца (Wyatt et al., 1998); протеосомы (Vancott et al., 1998, Lowell et al., 1988, 1996, 1997); фтористый натрий (Hashi et al., 1998); трансгенные растения (Tacket et al., 1998, Mason et al., 1998, Haq et al., 1995); виросомы (Gluck et al., 1992, Mengiardi et al., 1995, Cryz et al., 1998); вирусоподобные частицы (Jiang et al., 1999, Leibi et al., 1998). В технике известны и другие средства доставки и ниже при обсуждении векторов предлагаются дополнительные примеры.

Термин "эффективное количество иммуностимулирующей нуклеиновой кислоты" относится к количеству, необходимому или достаточному для реализации желаемого биологического эффекта. Например, эффективное количество иммуностимулирующей нуклеиновой кислоты для индукции мукозного иммунитета представляет собой количество, необходимое для индукции появления IgA в ответ на антиген после экспозиции с антигеном, тогда как количество, необходимое для индукции системного иммунитета, представляет собой количество, требующееся для индукции появления IgG в ответ на антиген

после экспозиции с антигеном. На основе сочетания предлагаемых здесь указаний, выбора из различных активных соединений и взвешивания таких факторов, как эффективность, биологическая доступность, масса тела больного, серьезность неблагоприятных побочных эффектов и предпочтительный способ введения, может быть спланирован эффективный режим профилактики или терапевтического лечения, который не вызывает существенной токсичности и в то же время полностью эффективен для лечения конкретного больного. Эффективное количество любого конкретного применения может варьировать в зависимости от таких факторов как подлежащее лечению заболевание или состояние, подлежащая введению конкретная иммуностимулирующая нуклеиновая кислота, антиген, размеры субъекта, тяжесть заболевания или состояния. Обычный специалист в данной области техники может эмпирически определить эффективное количество конкретной иммуностимулирующей нуклеиновой кислоты и/или антигена и/или терапевтического агента без необходимости неуместного экспериментирования.

Дозы описанных здесь соединений для мукозной или локальной доставки субъекту обычно варьируют приблизительно от 0,1 мкг до 10 мг на введение, в зависимости от нанесения, которое можно давать ежедневно, еженедельно или ежемесячно и любого другого промежутка времени между введениями. Более типично мукозные или локальные дозы варьируют приблизительно от 10 мкг до 5 мг на введение, и наиболее типично

приблизительно от 100 мкг до 1 мг при 2-4 введениях, отделенных друг от друга днями или неделями. Более типичными являются дозы стимулятора в диапазоне от 1 мкг до 10 мг на введение, и наиболее типично - от 10 мкг до 1 мг при ежедневном или еженедельном введении. Дозы описанных здесь соединений для парентеральной доставки субъекту с целью индукции специфичного в отношении антигена иммунного ответа, когда соединения вводятся вместе с антигеном, но без другого терапевтического агента, обычно в 5-10000 раз выше вводимой эффективной мукозной дозы вакцинного адъюванта или стимулятора иммунитета, более типично - от 10 до 1000 раз выше, и наиболее типично - от 20 до 100 раз выше. Дозы описанных здесь соединений для парентеральной доставки с целью индукции врожденного иммунного ответа или для повышения ADCC или для индукции специфичного в отношении антигена иммунного ответа, когда иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты вводят в сочетании с другими терапевтическими агентами или в специальных средствах доставки, обычно варьируют приблизительно от 0,1 мкг до 10 мг на введение, в зависимости от возможности ежедневного, еженедельного или ежемесячного нанесения и любого другого промежутка времени между введениями. Более типично, когда парентеральные дозы для данных целей варьируют приблизительно от 10 мкг до 5 мг на введение, и наиболее типично -приблизительно от 100 мкг до 1 мг при 2-4 введениях, отделенных друг от друга днями или неделями. В некоторых осуществлениях, однако, парентеральные дозы для данных целей могут применяться в диапазоне от 5 до 10000 раз превышающих описанные выше обычные дозы.

Для любого описанного здесь соединения терапевтически эффективное количество может быть исходно определено исходя из моделей на животных. Терапевтически эффективная доза может быть также определена на основании данных, полученных на человеке для CpG-олигонуклеотидов, которые тестировали на людях (были начаты клинические испытания на человеке), и для соединений, для которых известно, что они обладают сходной фармакологической активностью, таких как мукозные адъюванты, например LT и другие антигены для целей вакцинации, для мукозного или местного введения. Для парентерального введения требуются большие дозы. Вводимая доза может быть подобрана на основе относительной биологической доступности и эффективности вводимого соединения. Подбор дозы для достижения максимальной эффективности на основе описанных выше способов и других способов, таких как хорошо известные в данной области техники, в действительности находится в компетенции обычного опытного специалиста.

Составы изобретения вводят в фармацевтически приемлемых растворах, которые обычно могут содержать фармацевтически приемлемые концентрации соли, забуферивающих агентов, консервантов, совместимых носителей, адъювантов и необязательно других терапевтических ингредиентов.

Для применения в терапии эффективное количество иммуностимулирующей нуклеиновой кислоты может быть введено субъекту любым способом, который обеспечивает доставку нуклеиновой кислоты к желаемой поверхности, например мукозным, системным. Введение фармацевтической композиции настоящего изобретения может быть осуществлено способами, известными опытному специалисту. Предпочтительные пути введения включают в себя, но не ограничиваются этим, пероральное, парентеральное, внутримышечное, интраназальное, интратрахеальное, ингаляционное, глазное, вагинальное и ректальное.

Для перорального введения соединения (т.е. иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты, антигены и другие терапевтические агенты) могут быть легко составлены путем сочетания активного соединения(соединений) с фармацевтически приемлемыми носителями, хорошо известными в технике. Такие носители обеспечивают возможность составления соединений изобретения в виде таблеток, пилюль, драже, капсул, жидкостей, гелей, сиропов, теста, суспензий и тому подобное для перорального потребления подлежащим лечению субъектом. Фармацевтические препараты для перорального применения могут быть получены в виде твердого наполнителя с необязательным перемалыванием полученной смеси и обработки смеси гранул после добавления подходящих вспомогательных веществ, если это желательно, для получения таблеток или содержимого драже. Подходящими наполнителями являются, в частности, такие наполнители как сахара, включая лактозу, сахарозу, маннит или сорбит; препараты целлюлозы, такие как, например, кукурузный крахмал, пшеничный крахмал, рисовый крахмал, картофельный крахмал, желатин, трагакантовая камедь, метилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, карбоксиметилцеллюлоза натрия и/или поливинилпирролидон (PVP). Если это желательно, могут быть добавлены разрыхляющие агенты, такие как поперечносшитый поливинилпирролидон, агар или альгиновая кислота, или их соли, такие как альгинат натрия. Пероральные составы могут быть необязательно составлены в солевом растворе или буферах для нейтрализации внутренних кислых условий или могут вводиться без каких-либо носителей.

Содержимое драже предлагается с подходящими покрытиями. Для данной цели могут быть применены концентрированные растворы сахара, которые необязательно могут содержать аравийскую камедь, тальк, поливинилпирролидон, карбополовый гель, полиэтиленгликоль и/или двуокись титана, растворы глазури и подходящие органические растворители или смеси растворителей. К таблеткам или оболочкам драже могут быть добавлены красители или пигменты для узнавания или для характеристики различных сочетаний доз активного соединения.

Фармацевтические препараты, которые могут применяться перорально, включают в себя приспособленные для проталкивания капсулы, сделанные из желатина, а также мягкие запаянные капсулы, сделанные из желатина или пластификатора, такого как глицерин или сорбит. Проталкиваемые капсулы могут содержать активные ингредиенты в смеси с наполнителем, таким как лактоза, связующими, такими как крахмалы, и/или смазывающими агентами, такими как тальк или стеарат магния, и необязательно стабилизаторами. В мягких капсулах активные соединения могут быть растворены или суспендированы в подходящих жидкостях, таких как жирные масла, жидкий парафин или жидкие полиэтиленгликоли. Кроме того, могут быть добавлены стабилизаторы. Могут быть также применены микросферы, составленные для перорального введения. Такие микросферы были хорошо охарактеризованы в технике. Все составы для перорального введения должны находиться в формах доз, пригодных для такого введения.

Для защечного введения композиции могут быть составлены в виде таблеток или лепешек, составленных традиционным способом.

Для введения путем ингаляции соединения, подлежащие применению согласно настоящему изобретению, могут быть традиционно доставлены в форме подачи аэрозольного спрея из упаковки под давлением или распылителя с применением подходящего газа-вытеснителя, например дихлордифторметана, трихлорфторметана, дихлортетрафторэтана, двуокиси углерода или другого подходящего газа. В случае аэрозоля под давлением единица дозы может быть определена обеспечением клапаном для выделения определенного количества. Капсулы и ампулы, например, из желатина для применения в ингаляторе или вдувателе могут быть составлены в виде порошковой смеси соединения и подходящей порошковой основы, такой как лактоза или крахмал.

Когда желательна системная доставка соединений, они могут быть составлены для парентерального введения путем инъекции, например болюсной инъекции или продолжительной инфузии. Составы для инъекции могут быть представлены в форме единицы дозы, например в ампулах или контейнерах с множеством доз, с добавленным консервантом. Композиции могут могут быть представлены в виде суспензий, растворов или эмульсиий в масляных или водных растворителях и могут содержать составляющие агенты, такие как суспендирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие агенты.

Фармацевтические составы для парентерального введения включают в себя водные растворы активных соединений в водорастворимой форме. Кроме того, суспензии активных соединений могут быть получены в виде подходящих для инъекции масляных суспензий. Подходящие липофильные растворители или носители включают в себя жирные масла, такие как кунжутное масло, или синтетические сложные эфиры жирных кислот, такие как этилолеат или триглицериды, или липосомы. Водные суспензии для инъекции могут содержать вещества, которые повышают вязкость суспензии, такие как карбоксиметилцеллюлоза натрия, сорбит или декстран. Суспензия также может необязательно содержать подходящие стабилизаторы или агенты, которые повышают растворимость соединений для обеспечения получения высококонцентрированных растворов.

В другом варианте активные соединения могут находиться в форме порошка для соединения с подходящим носителем, например стерильной, свободной от пирогена водой, перед применением.

Соединения могут быть также составлены в ректальных или вагинальных композициях, таких как суппозитории или удерживаемые клизмы, например, содержащие традиционные основы суппозиториев, такие как масло какао или другие глицериды.

Кроме описанных выше составов соединения могут быть также составлены в виде депонируемого препарата. Такие долгодействующие составы могут быть составлены с применением подходящих полимерных или гидрофобных материалов (например, в виде эмульсии в приемлемом масле) или ионообменных смол или плохорастворимых производных, например в виде плохорастворимой соли.

Фармацевтические композиции могут также включать в себя подходящие твердофазные или гелевые носители или наполнители. Примеры таких носителей или наполнителей включают в себя, но не ограничиваются этим, карбонат кальция, фосфат кальция, различные сахара, крахмалы, производные целлюлозы, желатин и полимеры, такие как полиэтиленгликоли.

Подходящими жидкими или твердыми формами фармацевтического препарата являются, например, водные или солевые растворы для ингаляции, заключенные в микрокапсулы, микроспирали, нанесенные на микроскопические частицы золота, содержащиеся в липосомах, распыленные в виде аэрозоля, катышей для имплантации в кожу или высушенные на остром предмете для вчесывания в кожу. Фармацевтические композиции также включают в себя гранулы, порошки, таблетки, таблетки в оболочке, (микро)капсулы, суппозитории, сиропы, эмульсии, суспензии, кремы, капли или препараты с длительным выделением активных соединений, в которых обычно применяют наполнители и добавки и/или вспомогательные компоненты, такие как разрыхлители, связующие, покрывающие агенты, агенты набухания, смазочные материалы, отдушки, подсластители или солюбилизаторы, как описано выше. Фармацевтические композиции пригодны для применения во множестве систем доставки лекарства. Для краткого обзора способов доставки лекарств смотри Langer, Science 249: 1527-1533, 1990, статью, которая включена здесь в качестве ссылки.

Иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты и необязательно другие лекарственные средства и/или антигены могут вводиться как таковые (в чистом виде) или в виде фармацевтически приемлемой соли. Применяемые в медицине соли должны быть фармацевтически приемлемыми, но для получения их фармацевтически приемлемых солей могут применяться подходящие фармацевтически неприемлемые соли. Такие соли включают в себя, но не ограничиваются этим, такие, которые получают из следующих кислот: соляной, бромистоводородной, серной азотной, фосфорной, малеиновой, уксусной, салициловой, пара-толуолсульфокислоты, винной, лимонной, метансульфокислоты, муравьиной, малоновой, янтарной, нафталин-2-сульфокислоты и бензолсульфокислоты. Кроме того, такие соли могут быть получены в виде солей щелочных или щелочноземельных металлов, кислоты.

Подходящие буферные агенты включают: уксусную кислоту и соль (1-2% мас./об); лимонную кислоту и соль (1-3% мас./об); борную кислоту и соль (0,5-2,5% мас./об); и фосфорную кислоту и соль (0,8-2% мас./об). Подходящие консерванты включают хлорид бензалкония (0,003-0,03% мас./об); хлорбутанол (0,3-0,9% мас./об); парабены (0,01-0,25 мас./об) и тимеросал (0,004-0,02% мас./об).

Фармацевтические композиции согласно изобретению содержат эффективное количество иммуностимулирующей нуклеиновой кислоты и необязательно антигены и/или другие терапевтические агенты, необязательно включенные в фармацевтически приемлемый носитель. Термин "фармацевтически приемлемый носитель" означает один или более твердых или жидких наполнителей, разбавителей или инкапсулирующих веществ, которые пригодны для введения человеку или другому позвоночному животному. Термин носитель означает органический или неорганический ингредиент, природный или синтетический, с которым соединяют активный ингредиент для облегчения нанесения. Компоненты фармацевтических композиций способны также смешиваться с соединениями согласно изобретению и друг с другом таким образом, что не происходит взаимодействия, которое могло бы существенно снизить желаемую фармацевтическую эффективность.

Пригодные в изобретении иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты могут быть доставлены в смесях с другим(и) дополнительным(и) адъювантом(адъювантами), другими терапевтическими средствами или антигеном(антигенами). Смесь может состоять из нескольких адъювантов в дополнение к иммуностимулирующе и нуклеиновой кислоте или нескольких антигенов или других терапевтических средств.

Для введения пригодно множество путей. Выбор конкретного способа должен зависеть, конечно, от конкретных выбранных адъювантов или антигена, конкретного состояния, подлежащего лечению, и дозировки, необходимой для эффективности терапии. Способы данного изобретения, вообще говоря, могут осуществляться с применением любого способа введения, который приемлем с позиций медицины, что означает, что любой способ, который вызывает эффективный уровень иммунного ответа без индукции клинически неприемлемых побочных эффектов. Предпочтительные способы введения обсуждаются выше.

Композиции могут быть традиционно представлены в дозированной лекарственной форме и могут быть получены любыми способами, известными в технике фармации. Все способы включают в себя стадию введения соединений в контакт с носителем, который включает в себя один или более вспомогательных ингредиентов. В целом композиции получают путем равномерного и тесного введения соединений в связь с жидким носителем, тонкоизмельченным твердым носителем или обоими с последующей, если это необходимо, формовкой продукта. Жидкие единицы дозы представляют собой пузырьки или ампулы. Твердые единицы дозы представляют собой таблетки, капсулы или суппозитории. Для лечения больного могут требоваться разные дозы в зависимости от активности соединения, способа введения, цели иммунизации (профилактической или лечебной), природы и тяжести заболевания, возраста и массы тела больного. Введение данной дозы может производиться как путем однократного введения в виде индивидуальной единицы дозы, так и в виде нескольких меньших дозировок. Множественное введение доз, разделенное определенными интервалами времени, составляющими недели или месяцы, является обычным для поддержания специфичных ответов на антиген.

Другие системы доставки могут включать в себя системы доставки с высвобождением по времени, задержанным высвобождением или постоянным высвобождением. Такие системы могут позволить избежание повторных введений соединений, повышая удобство для субъекта и врача. Доступны и известны специалистам в данной области техники многие типы систем доставки с высвобождением. Они включают в себя системы на полимерной основе, такие как поли(лактид-гликолид), сополиоксалаты, поликапролактоны, полиэфирамиды, полиортоэфиры, полигидроксимасляную кислоту и полиангидриды. Микрокапсулы указанных выше полимеров, содержащие лекарства, описаны, например, в патенте США 5075109. Системы доставки включают в себя также неполимерные системы, которыми являются липиды, включая стерины, такие как холестерин, сложные эфиры холестерина и жирных кислот и нейтральные жиры, такие как моно-, ди- и триглицериды; гидрогелевые системы высвобождения; силастиковые системы; системы на основе пептидов; восковые покрытия; прессованные таблетки с применением традиционных связующих и наполнителей; имплантаты с ограниченной растворимостью; и тому подобное. Конкретные примеры включают в себя, но не ограничиваются этим, (а) эрозионные системы, в которых агент изобретения содержится в форме, находящейся в матриксе, таком как описанные в патентах США Nos. 4452775, 4675189 и 5736152, и (b) диффузионные системы, в которых активный компонент проникает с контролируемой скоростью из полимера, такого как описанные в патентах США Nos. 3854480, 5133974 и 5407686. Кроме того, могут быть применены основанные на насосах технические системы доставки, некоторые из которых приспособлены для имплантации.

Настоящее изобретение далее иллюстрируется следующими примерами, которые никаким образом не должны толковаться как дополнительное ограничение. Полное содержание всех ссылок (включая литературные ссылки, опубликованные патенты, опубликованные патентные заявки и патентные заявки в стадии рассмотрения), цитированных в данной заявке, таким образом, четко включено в качестве ссылки.

ПРИМЕРЫ

Материалы и способы:

Олигодеэоксинуклеотиды: природные фосфодиэфирные и фосфотиолатные производные ОДН были получены от Ореrон Technologies (Alameda, CA) и Hybridon Speciality Products (Milford, MA). ОДН тестировали на эндотоксин с помощью теста LAL (LAL-assay BioWhittaker, Walkersville, MD; нижний предел определения 0,1 EU/мл). Для анализов in vitro ОДН разводили в буфере ТЕ (10 мМ трис, рН 7,0, 1 мМ ЭДТА) и хранили при -20°С. Для применения in vivo ОДН разводили в забуференном фосфатом физиологическом растворе (0,1 М ЗФР, рН 7,3) и хранили при 4°С. Все разведения производили с применением реагентов, лишенных пирогенной активности.

Выделение РВМС человека и клеточная культура:

Мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) выделяли из периферической крови здоровых добровольцев с помощью центрифугирования в градиенте Ficoll-Paque (Histopaque-1077, Sigma Chemical Co., St. Louis, МО), как было описано (Hartmann et al., 1999 Proc. Natl. Acad. Sci USA 96:9305-10). Клетки суспендировали в культуральной среде RPMI 1640 с добавкой 10% (об/об) инактивированной нагреванием (56°С, 1 час) FCS (фетальной телячьей сыворотки) (HyClone, Logan, UT), 1,5 мМ L-глутамина, 100 ед./мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина (все от Gibco BRL, Grand Island, NY) (полная среда). Клетки (конечная концентрация 1×10⁶ клеток/мл) культивировали в полной среде в увлажняемом СO₂ инкубаторе при 37°С. В качестве стимулов применяли ОДН и ЛПС (липополисахарид) (из Salmonella typhimurium, Sigma Chemical Co., St. Louis, МО) или анти-IgM. Для измерения литической активности NK (естественных киллеров) человека РВМС инкубировали в количестве 5×10⁶/лунку в 24-луночных планшетах. Культуры собирали через 24 часа, и клетки применяли в качестве эффекторов в стандартном 4-часовом тесте выделения ⁵¹Сr против клеток мишеней К562, как описано ранее (Ballas et al., 1996 J. Immunol. 157:1840-1845). Для оценки пролиферации В-клеток за 18 часов до сбора добавляли 1 мкКи ³Н-тимидина, и количество включенного ³H-тимидина измеряли с помощью сцинтилляционного счета на день 5. Стандартные отклонения в трех лунках составляли <5%.

Проточная цитометрия РВМС человека: антигены поверхности РВМС приматов окрашивали, как описано ранее (Hartmann et al., 1998 J. Pharmacol. Exp. Ther. 285:920-928). Моноклональные антитела против CD3 (UCHT1), CD14 (М5Е2), CD19 (В43), CD56 (В159), CD69 (FN50) и CD86 (2331 [FUN-1]) были получены от Pharmingen, San Diego, CA. Для контроля неспецифической окраски применяли IgG_1,к (МОРС-21) и IgG_2b,к (Hartmann et al., 1999 Proc. Natl. Acad. Sci USA 96:9305-10). Клетки NK идентифицировали по экспрессии CD56 на негативных по CD3, CD14 и CD19 клетках, а В-клетки идентифицировали по экспрессии CD19. Данные проточной цитометрии для 10000 клеток на образец получали с помощью FACScan (Beckton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA). Жизнеспособность клеток в селекторе FSC/SSC, применяемом для анализа, оцененная с помощью окраски йодистым пропидием (2 мкг/мл), оказалась выше 98%. Результаты анализировали с помощью компьютерной программы FlowJo (версия 2.5.1, Tree Star, Inc., Stanford, CA).

Результаты:

Пример 1: Зависимая от CpG стимуляция В-клеток человека зависит от метилирования и длины ОДН

РВМС человека получали от здоровых доноров и культивировали в течение пяти дней в количестве 2×10⁵ клеток/лунку с указанными концентрациями указанных ОДН последовательностей. Как показано в таблице F, пролиферация РВМС человека превышает базальный уровень при культивировании со многими содержащими CpG ОДН, а также некоторую пролиферацию даже в присутствии ОДН, не содержащих никаких мотивов CpG. Важность неметилированных мотивов CpG для обеспечения оптимальной иммунной стимуляции данными ОДН демонстрируется тем, что ОДН 1840 (SEQ ID NO. 83) индуцирует включение 56603 импульсов ³H-тимидина, в то время как столь же обогащенная Т ОДН с метилированными мотивами CpG (не-CpG), 1979 (SEQ ID NO. 222), индуцирует меньшую, хотя все еще превышающую базальный уровень, активность (лишь 18618 импульсов) при той же концентрации, равной 0,6 мкг/мл). Сниженная пролиферация при больших концентрациях ОДН может быть артефактом клеток, истощенных при данных экспериментальных условиях, или может отражать некоторую цитотоксичность больших концентраций ОДН. Интересно, что более короткие ОДН, содержащие мотивы CpG, такие как 13-14-членные 2015 и 2016, оказывают меньшее стимулирующее действие, несмотря на то, что их молярная концентрация в действительности была выше, поскольку ОДН добавляли на основе массы, а не молярности. Это свидетельствует о том, что длина ОДН может быть важной детерминантой в иммунных эффектах ОДН. Не-CpG ОДН, за исключением обогащенного Т ОДН (приблизительно 30% Т) 1982 (SEQ ID NO. 225), вызывали лишь слабое повышение пролиферации клеток над базальным уровнем.

Таблица F
Концентрация олигонуклеотида
ОДН#	0,15 мкг/мл	0,6 мкг/мл	2 мкг/мл
Базальный уровень сигнала	648	837	799
1840 (SEQ ID NO. 83)	5744	56603	31787
2016 (SEQ ID NO. 256)	768	4607	20497
1979 (SEQ ID NO. 222)	971	18618	29246
1892 (SEQ ID NO. 135)	787	10078	22850
2010 (SEQ ID NO. 250)	849	20741	8054
2012 (SEQ ID NO. 252)	2586	62955	52462
2013 (SEQ ID NO. 253)	1043	47960	47231
2014 (SEQ ID NO. 254)	2700	50708	46625
2015 (SEQ ID NO. 255)	1059	23239	36119

Числа представляют количество имп/мин включения ^ЗH-тимидина для культур РВМС человека, которые вели, как описано выше.

Пример 2. Зависимая от концентрации стимуляция активности NK клеток человека обогащенными тимидином ОДН

PBMCs человека культивировали в течение 24 часов с набором различных CpG- и не-СрG-ОДН в двух концентрациях, после чего тестировали на их способность вызывать гибель клеток-мишеней для NK, как описано ранее (Ballas et al., 1996

J. Iminunol. 157:1840-1845). Гибель выражали в единицах лизиса или L.U. У донора, использованного в данном эксперименте, базальный уровень составлял 3,69 L.U., который возрастал до 180,36 L.U. при применении положительного контроля, ИЛ-2. CpG-олигонуклеотид 2006 (SEQ ID NO. 246) индуцировал наибольший рост лизисной функции NK при низкой концентрации, равной 0,6, и в меньшей степени - при концентрации 6,0. Неожиданно оказалось, что обогащенный Т ОДН, в котором мотивы CpG 2006 были метилированы (ОДН 2117 (SEQ ID NO. 358) или обращены в GpC (ОДН 2137 (SEQ ID NO. 886)), сохраняет сильную иммуностимулирующую функцию при более высоких концентрациях ОДН, как показано в таблице G. Данные зависимые от концентрации иммуностимулирующие эффекты не являются общим свойством фосфортиоатного остова, поскольку описанные ниже эксперименты показывают, что поли-А ОДН не вызывает стимуляции, превышающей базальный уровень. Некоторая стимуляция наблюдается с ОДН длиной в 24 основания, в котором все положения оснований рандомизированы таким образом, что А, С, G и Т оказываются с частотой 25% в каждом из положений оснований (ОДН 2182 (SEQ ID NO. 432)). Вместе с тем, стимулирующее действие такого 24-членного ОДН значительно возрастает, если он является чистым поли-Т, причем в последнем случае стимуляция наблюдается также при наименьшей концентрации 0,6 мкг/мл (ОДН 2183 (SEQ ID NO. 433)). Действительно, стимулирующая активность ОДН SEQ ID NO. 433 при такой низкой концентрации является более высокой, чем активность любого другого ОДН, тестированного при данной низкой концентрации, исключая оптимальный в отношении человека иммуностимулирующий ОДН SEQ ID NO. 246. Действительно, при более высокой концентрации ОДН SEQ ID NO. 433 стимулировал большую активность NK, чем любой другой фосфортиоатный ОДН, за исключением сильного CpG-ОДН 2142 (SEQ ID NO. 890), активность которого была слегка выше. Если содержание G ОДН SEQ ID NO. 246 возрастает относительно содержания Т за счет введения дополнительных G, то это приводит к снижению иммуностимулирующего действия ОДН, соответствующему снижению доли Т-нуклеотидов (смотри ОДН 2132 (SEQ ID NO. 373)). Таким образом, содержание Т в ОДН является важной детерминантой иммуностимулирующего действия. Хотя из не-СрС-ОДН поли-Т ОДН является наиболее сильным стимулятором, другие основания также важны для иммуностимулирующего действия He-CpG-ОДН. ОДН 2131 (SEQ ID NO. 372), в котором чуть больше половины оснований представлены Т и в котором отсутствуют G, является иммуностимулятором при концентрации 6 мкг/мл, но его активность значительно ниже, чем активность обогащенного Т ОДН. Если заменить 6 А в ОДН 2131 (SEQ ID NO. 372) 6-ю G, то иммуностимулирующее действие ОДН может возрасти (смотри ОДН 2130 (SEQ ID NO. 371)).

Таблица G
PBL человека, культивированные в течение ночи с олигонуклеотидами
MR	3605
SR	256
%SR	7.11
ЭФФЕКТОР	0.63	1.25	2.50	5.00	10.00	20.00
КОНТРОЛЬ [RM]							L.U.
БЕЗ ДОБАВОК	2.65	5.45	10.15	17.65	29.92	39.98	3.69
+ ИЛ2(100 ед./мл)	35.95	57.66	86.26	100.39	99.71	93,64	180.36
+ 1585(0.6 мнг/мл)	3.75	6.10	12.14	23.70	36.06	43.98	5.48
+ 1585(6.0 мкг/мл)	15.42	31.09	47.07	73.34	94.29	97.73	35.85
+ 2006(0.6 мкг/мл)	6.71	15.99	26.92	44.75	64.12	68.83	16.96
+ 2006 (6.0 мкг/мл)	6.19	8.18	16.13	24.35	39.35	56.07	8.04
+ 2117(0.6 мкг/мл)	4.54	4.73	9.56	18.04	28.57	39.85	3.49
+ 2117(6.0 мкг/мл)	7.03	10.76	16.90	30.59	52.14	59.46	10.96
+ 2137(0.6 мкг/мл)	4.61	5.35	10.04	15.16	23.79	37.86	2.57
+ 2137(6.0 мкг/мл)	7.99	10.37	16.55	32.32	49.78	60.30	11.01
+ 2178(0.6 мкг/мл)	2.88	4.52	11.47	16.05	24.85	34.27	2.37
+ 2178(6.0 мкг/мл)	4.21	5.03	11.16	16.39	28.22	36.45	2.94
+ 2182(0.6 мкг/мл)	2.42	6.57	10.49	19.73	26.55	35.30	2.89
+ 2182(6.0 мкг/мл)	4.11	7.98	14.60	26.56	40.40	51.98	7.59

+ 2183 (0.6 мкг/мл)	3.73	8.46	15.52	24.48	37.78	56.77	7.80
+ 2183(0.6 мкг/мл)	8.86	12.89	23.08	41.49	66.26	75.85	16.57
+ 2140(0.6 мкг/мл)	3.78	5.27	12.30	20.79	35.75	45.62	5.40
+ 2140(6.0 мкг/мл)	6.56	13.24	21.26	37.96	60.80	73.05	14.82
+ 2141 (0.6 мкг/мл)	2.63	6.34	10.21	17.73	30.93	43.57	4.29
+ 2141 (6.0 мкг/мл)	4.98	15.30	25.22	37.88	58.47	69.12	14.83
+ 2142(0.6 мкг/мл) + 2142(6.0 мкг/мл)	3.18 7.08	3.66 15.80	6.99 25.65	14.62 41.72	19.68 68.09	32.52 73.14	1.56 17.11
+ 2143 (0.6 мкг/мл)	4.12	6.90	10.77	22.96	35.78	42.94	5.19
+ 2143 (6.0 мкг/мл)	3.16	8.40	12.38	21.69	34.80	54.21	6.64
+ 2159(6.0 мкг/мл)	5.05	11.76	21.67	41.12	51.68	65.47	13.19
+ 2132(6.0 мкг/мл)	4.23	6.06	10.50	18.74	32.68	44.06	4.61
+ 2179(6.0 мкг/мл)	6.14	9.49	21.06	42.48	60.12	71.87	14.54
+ 2180(6.0 мкг/мл)	2.37	8.57	15.44	29.66	44.35	61.31	9.47
+ 2133 (6.0 мкг/мл)	6.53	12.58	23.10	38.03	61.16	68.36	14.62
+ 2134(6.0 мкг/мл)	7.51	12.14	21.14	32.46	54.47	67.12	12.98
+ 2184(6.0 мкг/мл)	5.22	9.19	17.54	30.76	45.35	63.55	10.42
+ 2185(6.0 мкг/мл)	8.11	14.77	26.27	40.31	55.61	70.65	15.60
+ 2116(6.0 мкг/мл)	5.58	10.54	16.77	37.82	59.80	66.33	13.07
+ 2181 (6.0 мкг/мл)	4.43	9.85	17.55	27.05	53.16	69.16	11.43
+ 2130 (6.0 мкг/мл)	3.81	8.07	17.11	27.17	42.04	53.73	8.27

+ 2131 (6.0	2.29	6.73	7.30	18.02	32.73	49.06	5.08
мкг/мл)
4- 2156(0.3	2.50	5.26	8.20	15.95	26.64	33.07	2.31
мкг/мл)
+ 2156(1.0	5.91	10.99	17.31	26.97	50.64	63.78	10.84
мкг/мл)
+ 2157 (0.3	2.36	4.00	6.65	12.94	24.13	38.86	2.58
мкг/мл)
+ 2157(1.0	3.72	9.55	17.15	34.55	52.27	65.33	11.58
мкг/мл)
+ 2158 (0.3	1.25	2.36	6.90	16.39	15.63	29.82	1.17
мкг/мл)
+ 2158(1.0	4.73	7.26	11.07	15.55	30.80	43.71	4.16
мкг/мл)
+ 2118(0.6	1.55	3.38	6.85	13.36	20.15	27.71	1.13
мкг/мл)
+ 2118(6.0	2.65	3.88	9.29	12.19	22.47	28.99	1.34
мкг/мл)

Пример 3: Индукция пролиферации В-клеток обогащенным Т не-СрС-ОДН.

Для оценки способности обогащенных Т ОДН активировать пролиферацию В-клеток РВМС человека окрашивали красителем цитоплазмы CSFE, инкубировали в течение пяти дней с указанным ОДН в концентрации 0,15 или 0,3 мкг/мл, и затем анализировали с помощью проточной цитометрии. В-клетки идентифицировали селекцией клеток, позитивных в отношении маркера линии CD19. CpG-ОДН 2006 был сильным индуктором пролиферации В-клеток, и данное действие снижалось при метилировании мотивов CpG или при их обращении в GpC, как показано на фигурах 1А, В, С и D при концентрации ОДН 0,3 мкг/мл. Состав оснований ОДН, по-видимому, важен для определения иммуностимулирующего действия. Снижение содержания Т в ОДН существенно снижает иммуностимулирующее действие, как это иллюстрировано на примере ОДН 2177 (SEQ ID NO. 427), в котором 6 Т, имеющихся в ОДН 2137 (SEQ ID NO. 886), были заменены на А, в результате чего иммуностимулирующее действие было значительно снижено. Важность Т для иммуностимулирующего действия ОДН проявляется также при сравнении ОДН 2116 (SEQ ID NO. 357) и ОДН 2181 (SEQ ID NO. 431), которые различаются по 3’-концу ОДН. ОДН 2181, в котором 3’-конец представляет собой поли-Т, является более сильным стимулятором по сравнению с ОДН 2116, в котором 3’-конец представляет собой поли-С, несмотря на то, что оба ОДН содержат TCGTCG на 5’-конце.

Пример 4: Пролиферация В-клеток, индуцированная олигонуклеотидами TG

Стимулирующее действие мотивов TG показано на фигуре 2. ОДН 2137 обладает идентичным с ОДН 2006 составом оснований, но мотивы CG были инвертированы в GC, что дало не содержащую CG нуклеиновую кислоту. Тем не менее, ОДН содержит 6-динуклеотидов TG. В ОДН 2177 все динуклеотиды TG ОДН 2137 были заменены на AG. Хотя ОДН 2177 содержит лишь 6 аденинов, он практически не оказывает стимулирующего действия в концентрации 0,2 мкг/мл. Для сравнения ОДН длиной в 24 основания, в котором каждое положение рандомизировано в отношении любого из четырех оснований (ОДН 2182) индуцирует пролиферацию >12% В-клеток при концентрации 0,2 мкг/мл. Данные результаты указывают на то, что стимулирующие эффекты ОДН 2137 не являются просто эффектами фосфортиоатного остова, а связаны с наличием динуклеотидов TG.

Для того чтобы определить влияние изменения количества динуклеотидных мотивов TG, сравнивали ОДН 2200 и ОДН 2202, как показано на фигуре 2. Оба ОДН содержат 18 Т и 6 G, но в ОДН 2200 все G расположены последовательно, так что имеется лишь один динуклеотид TG, тогда как в ОДН 2202 G разделены в виде динуклеотидов GG по всему ОДН, в результате чего имеется три динуклеотида TG. ОДН 2202 оказывает значительно большее стимулирующее действие по сравнению с ОДН 2200, что соответствует модели, согласно которой для оптимальной стимулирующей активности необходимы по меньшей мере три мотива TG в ОДН. Вероятно, даже еще больший уровень стимуляции мог бы быть получен, если бы мотивы TG были оптимизированы таким образом, как этому обучают здесь.

Пример 5: Сравнение действия TTG и мотивов TTG.

На фигуре 3 показаны результаты экспериментов, проведенных для изучения связи между содержанием TG в плане отношения уровня Т к уровню G и стимулирующим действием ОДН. На фигуре показано, что ОДН, в котором все основания рандомизированы между Т и G (ОДН 2188 (SEQ ID NO. 905)), не оказывает стимулирующего действия при концентрации 0,2 мкг/мл, как и ОДН, в котором все основания рандомизированы между А и G (ОДН 2189 (SEQ ID NO. 906)). Однако при большей концентрации, равной 2 мкг/мл, рандомизированный T/G ОДН 2188 оказывает значительно большее стимулирующее действие. Уровень стимуляции последним все еще ниже, чем тот, который имеет место с полностью рандомизированным ОДН (ОДН 2182 (SEQ ID NO. 432)). Наибольшая стимуляция при низких концентрациях наблюдается с ОДН, в котором половина оснований фиксирована как Т, а вторая половина оснований рандомизирована между Т и G (ОДН 2190 (SEQ ID NO. 907)). Поскольку каждое второе основание фиксировано как Т, никаких мотивов TG возникать не может. Данные фигуры 3 показывают, что повышение содержания TG в ОДН улучшает стимулирующую активность.

В других экспериментах, результаты которых не представлены здесь в виде графиков, ОДН 2190 (SEQ ID NO. 907) проявлял стимулирующую NK активность, сопоставимую с таковой ОДН 2188 (SEQ ID NO.905) или ОДН 2189 (SEQ ID NO.906).

Примеры 6-8

Введение:

Выше заявители показали, что последовательности поли-Т способны повышать стимуляцию В- и NK-клеток. Здесь заявители исследуют действие множества не-CpG, обогащенных Т ОДН, а также поли-С ОДН на предмет их способности стимулировать В-клетки, NK-клетки и моноциты человека.

Материалы и способы:

Олигонуклеотиды: Модифицированные фосфортиоатом ОДН были получены от ARK Scientific GmbH (Darmstadt, Германия). Применяли последовательности: 1982: 5’-tccaggacttctctcaggtt-3’ (SEQ ID NO.: 225), 2006: 5’-tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt-3’ (SEQ ID NO.: 246), 2041: 5’-ctggtctttctggtttttttctgg-3’ (SEQ ID NO.: 282), 2117: 5’-tzgtzgttttgtgtzgttttgtzgtt-3’ (SEQ ID

NO.: 358), 2137: 5’-tgctgcttttgtgcttttgtgctt-3’ (SEQ ID NO.: 886), 2183: 5’-ttttttttttttttttttttt-3’ (SEQ ID NO.: 433), 2194: 5’-ttttttttttttttttttttttttttt-3’ (SEQ ID NO.: 911), 2196: 5’-tttttttttttttttttt-3’ (SEQ ID NO.: 913), 5126: 5’-ggttcttttggtccttgtct-3’ (SEQ ID NO.: 1058), 5162: 5’-tttttttttttttttttttttttttttttt-3’ (SEQ ID NO.: 1094), 5163: 5’-aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa-3’ (SEQ ID NO.: 1095), 5168: 5’-cccccccccccccccccccccccccccccc-3’ (SEQ ID NO.: 1096) и 5169: 5’-cgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcg-3’ (SEQ ID NO.: 1097). Большинство ОДН тестировали на содержание LPS с помощью анализа LAL (BioWhittaker, Бельгия) (нижний предел детекции 0,1 EU/мл), как здесь описано. Для всех анализов ОДН разводили в буфере ТЕ и хранили при -20°С. Все разведения проводили с применением лишенных пирогена реагентов.

Пролиферация клеток и клеточная культура: РВМС человека выделяли из периферической крови здоровых добровольцев, полученной Германским Красным Крестом (Ratingen, Германия), как описано в примере 1, но все материалы были получены от Life Technologies, Германия, и были проверены на эндотоксин. Для анализа активации В-клеток, NK-клеток и моноцитов, РВМС культивировали в полной среде при концентрации 2×10⁶ клеток/мл в 200 мкл в 96-луночных круглодонных планшетах в увлажняемом инкубаторе при 37°С. В качестве стимулов добавляли различные ОДН, LPS (Sigma) или ИЛ-2 (R&D Systems, США). В указанные моменты времени клетки собирали для проточной цитометрии.

Проточная цитометрия: для окраски поверхностных антигенов применяли MAbs против: CD3, CD14, CD19, CD56, CD69, CD80 и CD86 (все получены от Pharmingen/Becton Dickinson, Германия). В случае моноцитов рецепторы Fc блокировали с помощью IgG человека (Myltenyi, Германия), как описано ранее (Bauer, M et al 1999 Immunology 97:699). Результаты проточной цитометрии для по меньшей мере 1000 клеток заданной популяции (В-клеток, моноцитов, NK-клеток, NKT-клеток или Т-клеток) получали с помощью FACSCalibur (Becton Dickinson). Данные анализировали с помощью программы CellQuest (Becton Dickinson).

Опосредуемая NK цитотоксичность: РВМС культивировали в течение ночи в отсутствие или в присутствии 6 мкг/мл ОДН или 100 ед./мл ИЛ-2 при 37°С, 5% СO₂. На следующее утро клетки-мишени К-562 метили флуоресцентным красителем CFSE, как описано ранее для В-клеток человека (Hartmann, G., and A. M. Krieg. 2000 J. Immunol. 164:944). РВМС добавляли в различных соотношениях (50:1, 25:1 и 12,5:1) к 2×10⁵ клеток-мишеней и инкубировали в течение 4 час при 37°С. Клетки собирали и инкубировали со специфичным в отношении ДНК красителем 7-AAD (Pharmingen) для определения апоптотических клеток. Результаты измеряли с помощью проточной цитометрии.

ТИФА: РВМС (3×10⁶ клеток/мл) культивировали с указанными концентрациями ОДН или LPS в течение 24 час (ИЛ-6, IFNγ и TNFα) или 8 час (ИЛ-1β) в 48-луночных планшетах в увлажняемой атмосфере при 37°С. Собирали супернатанты, и цитокины измеряли с помощью OPTeia наборов ТИФА (Pharmingen) для ИЛ-6, IFNγ и TNFα, или Eli-pair ТИФА (Hoelzel, Германия) для ИЛ-1β в соответствии с протоколами производителя.

Пример 6: активация В-клеток, индуцированная ОДН, не содержащими мотивов CpG.

В описанных выше экспериментах примера 3 заявители продемонстрировали, что обогащенные Т ОДН способны активировать В-клетки. Здесь данные эксперименты были расширены с применением дополнительных ОДН и различных источников клеток и реагентов. В первой серии экспериментов заявители сравнили активирующий потенциал различных не-CpG, обогащенных Т ОДН с известным очень сильным CpG ОДН 2006 (SEQ ID NO.: 246). РВМС (2×10⁶ клеток/мл) донора крови (n=2) инкубировали с указанными концентрациями ОДН 2006 (SEQ ID NO.: 246), 2117 (SEQ ID NO.: 358), 2137 (SEQ ID NO.: 886), 5126 (SEQ ID NO.: 1058) и 5162 (SEQ ID NO.: 1094). Клетки инкубировали в течение 48 час при 37°С, как описано выше, и окрашивали mAb против CD19 (маркера В-клеток) и CD86 (маркера активации В-клеток, В7-2). Экспрессию измеряли с помощью проточной цитометрии.

Применяя различные концентрации ОДН, авторы изобретения показали (фиг.4), что обогащенные Т ОДН, не содержащие мотива CpG, могут индуцировать стимуляцию В-клеток человека. ОДН 5126 (SEQ ID NO.: 1058), который содержит лишь одну последовательность поли-Т, но в котором содержание Т выше 50%, вызывал высокий уровень активации В-клеток человека. Хотя данный ОДН имеет некоторое сходство с SEQ ID NO.: 246

(например, более 80% содержание T/G), он точно не содержит любой из известных иммуностимулирующих мотивов CpG. Неожиданно оказалось, что для всех тестированных обогащенных Т ОДН наибольший показатель стимуляции обнаруживается при концентрациях между 3 и 10 мкг/мл. Из тестированных ОДН наибольший индекс стимуляции достигался с CpG/-обогащенным Т ОДН SEQ ID NO.: 246 при 0,4 мкг/мл. Интересно, что активность снижалась при высоких концентрациях.

Были синтезированы и тестированы на биологическую активность последовательности поли-А, поли-С и поли-Т. РВМС (2×10⁶ клеток/мл) от одного типичного донора (n=3) стимулировали, как описано выше, 0,4 мкг/мл, 1,0 мкг/мл или 10,0 мкг/мл следующих ОДН: 2006 (SEQ ID NO.: 246), 2196 (SEQ ID NO.: 913) (поли-Т, 18 оснований), 2194 (SEQ ID NO.: 911) (поли-Т, 27 оснований), 5162 (SEQ ID NO.: 1094) (поли-Т, 30 оснований), 5163 (SEQ ID NO.: 1095) (поли-А, 30 оснований), 5168 (SEQ ID NO.: 1096) (поли-С, 30 оснований) и 5169 (SEQ ID NO.: 1097) (поли-CG, 30 оснований). Экспрессию маркера активации CD86 (В7-2) на CD19-позитивных В-клетках измеряли проточной цитометрией.

На фиг.5 показано, что длина последовательности по меньшей мере для ОДН поли-Т вносит существенный вклад в их активность. Последовательность поли-Т, содержащая лишь 18 оснований (SEQ ID NO.: 913), как было показано, оказывает меньшее стимулирующее действие по сравнению с последовательностью из 27 оснований (SEQ ID NO.: 911) или из 30 оснований (SEQ ID NO.: 1094) при четком ранжировании стимуляции; SEQ ID NO.: 1094> SEQ ID NO.: 911> SEQ ID NO.: 913. Последовательности поли-А (SEQ ID NO.: 1095) или поли-CG (SEQ ID NO.: 1097), напротив, не индуцируют активацию В-клеток человека. Неожиданно было также обнаружено, что последовательности поли-С (SEQ ID NO.: 1096) могут активировать В-клетки человека при высоких концентрациях (10 мкг/мл) (фиг.5).

Два других обогащенных Т ОДН, а именно 1982 (SEQ ID NO.: 225) и 2041 (SEQ ID NO.: 282), не содержащих мотивов CpG, тестировали на предмет их влияния на В-клетки человека. РВМС (n=2) инкубировали с указанными концентрациями ОДН 2006 (SEQ ID NO.: 246), 1982 (SEQ ID NO.: 225) и 2041 (SEQ ID NO.: 282), как описано выше. Активацию В-клеток (экспрессию маркера активации CD86) измеряли проточной цитометрией.

На фиг.6 продемонстрировано, что обогащенные Т не-CpG ОДН являются иммуностимуляторами при концентрациях выше 1 мкг/мл. Включение мотива CpG в 1982 повышало иммуностимулирующую активность. Удлинение с помощью поли-Т не увеличивало иммуностимулирующую активность данного, уже обогащенного Т ОДН, и, напротив, слегка снижало активирующий потенциал.

Пример 7: Иммуностимуляция не-CpG ОДН отражается в повышении активации NK, цитотоксичности NK и активации моноцитов

NK-клетки, а также моноциты тестировали на их ответ на не-CpG ОДН. РВМС (2х10⁶ клеток/мл) инкубировали с 6 мкг/мл следующих ОДН (n=4): 2006 (SEQ ID NO.: 246), 2117 (SEQ ID NO.: 358), 2137 (SEQ ID NO.: 886), 2183 (SEQ ID NO.: 433), 2194 (SEQ ID NO.: 911) и 5126 (SEQ ID NO.: 1058). Через 24 час культивирования при 37°С клетки собирали и окрашивали mAb против CD3 (маркера Т-клеток), CD56 (маркера NK-клеток) и CD69 (маркера ранней активации), как описано выше. Экспрессию CD69 на CD56-позитивных NK-клетках измеряли проточной цитометрией.

На фиг.7 показано, что для поли-Т могут быть получены эффекты, сходные с описанными на фиг.5. На стимуляцию NK-клеток, как и В-клеток, может оказывать влияние длина ОДН. По результатам измерения повышения экспрессии маркера ранней активации CD69, ОДН 2183 (SEQ ID NO.: 433) (21 основание) индуцировал активацию NK-клеток, но в меньшей степени, чем более длинный ОДН 2194 (SEQ ID NO.: 911) (27 оснований). ОДН 5126 (SEQ ID NO.: 1058), как было показано, также активирует NK-клетки человека (фиг.7).

Полагают, что противоопухолевая активность CpG ОДН может быть оценена по способности ОДН повышать опосредуемую NK цитотоксичность in vitro. Было показано, что ОДН, содержащие на 5’- и 3’-концах участки поли-G, вызывают наибольшую индукцию цитотоксичности (Ballas, Z. К., et al. 1996 J. Immunol. 157:1840). Для исследования влияния не-CpG, обогащенных Т ОДН на цитотоксичность NK, заявители анализировали действие ОДН 2194 (SEQ ID NO.: 911) и 5126 (SEQ ID NO.: 1058) на опосредуемый NK лизис (фиг.8). Опосредуемый NK лизис клеток-мишеней К-562 измеряли после инкубации в течение ночи РВМС с 6 мкг/мл ОДН 2006 (SEQ ID NO.: 246), SEQ ID NO.: 911 (SEQ ID NO.: 911) (поли-Т, 27 оснований) and 5126 (SEQ ID NO.: 1058), как описано выше. SEQ ID NO.: 1058 вызывал небольшое увеличение лизиса под действием NK-клеток человека по сравнению с наблюдаемым в отсутствие ОДН. SEQ ID NO.: 911 и SEQ ID NO.: 246 повышали цитотоксичность NK-клеток человека даже в большей степени.

В предшествующих сообщениях было показано, что не только NK-клетки, но и NKT-клетки служат проводниками цитотоксических ответов на опухолевые клетки (14). Поэтому заявители проверили усиление активации NKT-клеток человека под действием обогащенных Т, не-CpG ОДН. РВМС от одного типичного донора (n=2) инкубировали с 6 мкг/мл ОДН 2006 (SEQ ID NO.: 246), 2117 (SEQ ID NO.: 358), 2137 (SEQ ID NO.: 886), 2183 (SEQ ID NO.: 433), 2194 (SEQ ID NO.: 913) и 5126 (SEQ ID NO.: 1058) в течение 24 час, как описано выше. Активацию NKT-клеток измеряли проточной цитометрией после окрашивания клеток mAb против CD3 (маркера Т-клеток), CD56 (маркера NK-клеток) и CD69 (маркера ранней активации). Показания представляют собой экспрессию CD69 на CD3- и CD 56-дважды позитивных клетках (NKT-клетках).

Как показано на фиг.9, SEQ ID NO.: 911, как и SEQ ID NO.: 1058 стимулировали NKT-клетки. Как и в случае NK-клеток, SEQ ID NO.: 911 (поли-Т) был активнее, чем SEQ ID NO.1058.

Кроме того, так же, как это было описано выше для В-клеток и NK-клеток, длина ОДН оказывает определенное влияние на иммуностимулирующий потенциал, причем более длинный ОДН оказывает более сильное действие на NKT-клетки. Сходные результаты наблюдались для Т-клеток человека.

Другим типом клеток иммунной системы, участвующих в борьбе с инфекциями, являются моноциты. Данные клетки после активации выделяют множество цитокинов и могут развиваться в дендритные клетки (DC), специализирующиеся в качестве антиген-представляющих клеток (Roitt, I., J. Brostoff, and D. Male. 1998. Immunology. Mosby, London). На фиг.10 показана активация моноцитов человека после культивирования РВМС с различными ОДН. РВМС (2х10⁶ клеток/мл) инкубировали с 6 мкг/мл 2006 (SEQ ID NO.: 246), 2117 (SEQ ID NO.: 358), 2137 (SEQ 30 ID NO.: 886), 2178 (SEQ ID N0.:1096), 2183 (SEQ ID NO.: 433), 2194 (SEQ ID NO.: 911), 5126 (SEQ ID NO.: 1058) и 5163 (SEQ ID NO.: 1095) в течение ночи при 37°С, как описано выше (n=3). Клетки собирали и окрашивали на CD14 (маркер моноцитов) и CD80 (В7-1, маркер активации). Экспрессию измеряли проточной цитометрией.

Как и в показанных выше случаях NK- и В-клеток, обогащенные Т-последовательности (например SEQ ID NO.: 433, SEQ ID NO.: 911) разной длины индуцируют стимуляцию моноцитов, но обладают иными уровнями активности, например, SEQ ID NO.: 433> SEQ ID NO.: 911. Последовательности поли-А (SEQ ID NO.: 1095), как и поли-С (SEQ ID NO.: 1096 (2178), напротив, не вызывали активации моноцитов (измеренной по стимуляции CD80 при концентрации ОДН 6 мкг/мл).

Пример 8: Индукция выделения цитокинов под действием не-CpG ОДН

После этого исследовали способность различных обогащенных Т ОДН влиять на цитокиновое окружение. РВМС (3×10⁶ клеток/мл) культивировали в течение 24 час в отсутствие или в присутствии 6 мкг/мл указанных ОДН или 1 мкг/мл LPS в качестве положительного контроля (n=2). После инкубации собирали супернатанты, и TNFα измеряли с помощью ТИФА, как описано выше, и результаты показаны на фиг.11. РВМС культивировали с указанными ОДН (1,0 мкг/мл), как описано на фиг.11, и ИЛ-6 измеряли в супернатантах с помощью ТИФА, как описано выше, и результаты показаны на фиг.12.

На фиг.11 и 12 показано, что обогащенные Т, не-CpG и обогащенные T/CpG ОДН могут индуцировать секрецию провоспалительных цитокинов TNFα и ИЛ-6. В большинстве анализов было обнаружено, что в отношении обоих цитокинов ОДН 5126 (SEQ ID NO.: 1058) является столь же эффективным, как и ОДН 2194 (SEQ ID NO.: 911). Известно, что CpG ОДН влияют на соотношение Th1/Th2 за счет предпочтительной индукции цитокинов Th1 (Krieg, А. М. 1999 Biochemica et Biophysica Acta 93321:1). Для определения того, вызывают ли обогащенные Т ОДН сходное смещение в сторону Th1 цитокинов, измеряли продукцию РВМС IFNγ. В первой серии экспериментов было показано, что, как и в случаях, описанных для ИЛ-6 и TNFα, ОДН SEQ ID NO.: 1058 и SEQ ID NO.: 911 индуцируют выделение сходных количеств данного Th1 цитокина IFNγ. Кроме того, было показано, что другой провоспалительный цитокин, ИЛ-1β, выделяется при культивировании РВМС с данными двумя ОДН. Хотя количество данных цитокинов, индуцированных обогащенными Т ОДН, не содержащими мотивов CpG, было ниже, чем при применении CpG ОДН SEQ ID NO.: 246, индуцированные обогащенными Т ОДН количества были значительно выше, чем в контроле.

Примеры 9-11

Введение:

Здесь описывается мотив CpG, оптимальный для активации иммунной системы у позвоночных, отличных от грызунов. Было обнаружено, что фосфодиэфирный олигонуклеотид, содержащий данный мотив, сильно стимулирует экспрессию CD86, CD40, CD54 и МНС II, синтез ИЛ-6 и пролиферацию первичных В-клеток человека. Для данных эффектов необходима интернализация олигонуклеотида и созревание в эндосомах. Данный мотив CpG связан с продолжительной индукцией гетеродимера NFkB р50/р65 и белком-1, активирующим комплекс транскрипционных факторов (АР-1). Активации транскрипционных факторов под действием CpG-ДНК предшествует повышенное фосфорилирование стрессорных киназ c-jun, NH₂ концевой киназы (JNK) и р38 и активирующего транскрипционного фактора-2 (ATF-2). В отличие от CpG сигнализация через рецептор В-клеток ведет к активации киназы внеклеточного рецептора (ERK) и фосфорилированию другой изоформы JNK.

Материалы и способы:

Олигонуклеотиды: немодифицированные (фосфодиэфирные, РЕ) и модифицированные, устойчивые к нуклеазам (фосфортиоатные, PS) ОДН были получены от Operon Technologies (Alameda, CA) и Hybridon Specialty Products (Milford, MA). Примененные последовательности представлены в таблице Н. ДНК Е. coli и ДНК тимуса телят получены от Sigma Chemical Co., St. Louis, МО. Образцы геномной ДНК очищали экстракцией смесью фенол-хлороформ-изоамиловый спирт (25/24/1) и осаждением этанолом. ДНК очищали от эндотоксина повторной экстракцией тритоном X-114 (Sigma Chemical Co., St. Louis, МО) и тестировали на эндотоксин с помощью анализа LAL (LAL-assay BioWhittaker, Walkersville, MD; нижний предел детекции 0,1 EU/мл) и высокочувствительного анализа эндотоксина, описанного ранее (нижний предел детекции 0,0014 EU/мл) (Hartmann G., and Krieg A. M. 1999. CpG DNA and LPS induce distinct patterns of activation in human monocytes. Gene Therapy 6:893). Содержание эндотоксина в образцах ДНК было ниже 0,0014 ед/мл. ДНК Е. coli и тимуса телят перед применением делали одноцепочечными путем кипячения в течение 10 минут с последующим охлаждением на льду в течение 5 минут. Образцы ДНК разводили в буфере ТЕ с применением лишенных пирогена реагентов.

Получение клеток и клеточная культура: мононуклеарные клетки периферической крови человека (РВМС) выделяли из периферической крови здоровых добровольцев путем центрифугирования в градиенте плотности Ficoll-Paque (Histopaque-1077, Sigma Chemical Co., St. Louis, МО), как было описано (Hartmann G., et al 1996 Antisense Nucleic Acid Drug Dev 6:291)). Клетки суспендировали в культуральной среде RPMI 1640 с добавкой 10% (об/об) инактивированной нагреванием (56°С, 1 час) FCS (HyClone, Logan, UT), 1,5 мМ L-глутамина, 100 U/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина (все от Gibco BRL, Grand Island, NY) (полная среда). Все соединения получали проверенными на эндотоксин. Жизнеспособность определяли до и после инкубации с ОДН по исключению трипанового синего (традиционная микроскопия) или исключению йодистого пропидия (анализ проточной цитометрией). Во всех экспериментах от 96% до 99% РВМС были жизнеспособными. Клетки (конечная концентрация 1×10⁶ клеток/мл) культивировали в полной среде в 5% СO₂ в увлажняемом инкубаторе при 37°С. В качестве стимулов применяли различные олигонуклеотиды (смотри таблицу I, при концентрации, указанной в подписях к фигурам), ЛПС (из salmonella typhimurium, Sigma Chemical Co., St. Louis, МО) или анти-IgM. Для блокирования эндосомального созревания/закисления применяли хлорокин (5 мкг/мл; Sigma Chemical Co., St. Louis, МО). В указанные моменты времени клетки собирали для проточной цитометрии, как описано ниже.

Для изучения проведения сигнала первичные В-клетки человека выделяли с помощью иммуномагнитной сортировки клеток с применением аппарата VARIOMACS (Miltenyi Biotec Inc., Auburn, CA), как описано производителем. Вкратце РВМС, полученные из светлого слоя кровяных сгустков крови здоровых доноров (Elmer L. DeGowin Blood Center, University of Iowa), инкубировали микросферами, конъюгированными с антителом против CD19, и пропускали через колонку позитивной селекции. Чистота В-клеток превышала 95%. После стимуляции получали экстракты цельных клеток (для иммуноблоттинга) и ядерные экстракты (для EMSA) для исследования проведения сигнала.

Для изучения связывания CpG белками клетки Ramos (линия клеток В-клеточной лимфомы человека Burkitt, ATCC CRL-1923 или CRL-1596; Intervirology 5: 319-334, 1975) выращивали в полной среде. Собирали необработанные клетки, получали экстракты цитозольного белка и анализировали на наличие белков, связывающих CpG, с помощью EMSA и поперечной сшивки УФ, как описано ниже.

Проточная цитометрия: антигены определяли, как описано ранее (Hartmann G. et al. 1998 J Pharmacol Exp Ther 285:920). Моноклональные антитела против HLA-DR были получены от Immunotech, Marseille, Франция. Все остальные антитела получали от Pharmingen, San Diego, CA: mAB против CD19 (B43), CD40 (5C3), CD54 (HA58), CD86 (2331 (FUN-1)). IgG_1,к (MOPC-21) и IgG_2b,к применяли для контроля специфичности окрашивания. Окрашивание внутриклеточного цитокина для ИЛ-6 проводили, как описано (Hartmann G., and Krieg A. M. 1999. CpG DNA and LPS

induce distinct patterns of activation in human monocytes. Gene Therapy 6:893). Вкратце РВМС (конечная концентрация 1×10⁶ клеток/мл) инкубировали в присутствии брефелдина А (конечная концентрация 1 мкг/мл, Sigma Chemical Co., St. Louis, МО). После инкубации клетки собирали и окрашивали с помощью меченого FITC mAB против CD19 (В43), меченного РЕ тАВ крысы против ИЛ-6 человека (MQ2-6A3, Pharmingen) и набора Fix and Perm Kit (Caltag Laboratories, Burlingame, CA). Результаты проточной цитометрии для 5000 клеток на образец оценивали на FACScan (Beckton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA). Нежизнеспособные клетки исключали из анализа окраской йодистым пропидием (2 мкг/мл). Данные анализировали с помощью компьютерной программы FlowJo (версия 2.5.1, Tree Star, Inc., Stanford, CA).

Анализ пролиферации: CFSE (5-(и 6-) карбоксифлуоресцеина диацетата сукцинимидильный эфир. Molecular Probes, США) представляет собой внутриклеточную флуоресцентную метку - производное флуоресцеина, которая равномерно распределяется между дочерними клетками при клеточном делении. Окраска клеток CFSE обеспечивает как количественную оценку, так и иммунофенотипирование (меченные фикоэритрином антитела) пролиферирующих клеток в смешанной клеточной суспензии. Вкратце РВМС дважды промывали в ЗФР, ресуспендировали в ЗФР, содержащем CFSE в конечной концентрации 5 мкМ, и инкубировали при 37°С в течение 10 минут. Клетки промывали трижды ЗФР и инкубировали в течение пяти дней, как указано в подписях к фигурам. Пролиферировавшие СD19-позитивные В-клетки идентифицировали по сниженному содержанию CFSE проточной цитометрией.

Получение белковых экстрактов целых клеток, ядер и цитозоля: для Иммуноблоттинга получали экстракты целых клеток. Первичные В-клетки обрабатывали средой, фосфодиэфирными олигонуклеотидами 2080 (SEQ ID NO.: 321) или 2078 (SEQ ID NO.: 319) в концентрации 30 мкг/мл или анти-IgM (10 мкг/мл). Клетки собирали, дважды промывали охлажденным на льду ЗФР, содержащим 1 мМ Na₃VO₄, ресуспендировали в буфере для лизиса (150 мМ NaCl, 10 мМ трис рН 7.4, 1% NP40, 1 мМ Na₃VO₄, 50 мМ NaF, 30 мг/мл леупептина, 50 мг/мл апротинина, 5 мг/мл антипаина, 5 мг/мл пепстатина, 50 мкг/мл фенилметилсульфонилфторида (PMSF)), инкубировали в течение 15 мин на льду и центрифугировали при 14000 об/мин в течение 10 мин. Супернатант замораживали при -80°С. Для получения ядерных экстрактов первичные В-клетки ресуспендировали в гипотоническом буфере (10 мМ HEPES/KOH (рН 7.9), 10 мМ КСl, 0,5% NP40, 1,5 мМ MgCl₂, 0,5 мМ дитиотреитол (DTT), 0,5 мМ PMSF, 30 мг/мл леупептина, 50 мг/мл апротинина, 5 мг/мл антипаина, 5 мг/мл пепстатина). Через 15 минут инкубации на льду суспензию центрифугировали при 1000×g в течение 5 минут. Осажденные ядра ресуспендировали в буфере для экстракции (20 мМ HEPES (рН 7.9), 450 мМ NaCl, 50 мМ NaF, 20% глицерина, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ ЭГТА, 1 мМ дитиотреитол (DTT), 1 мМ PMSF, 30 мг/мл леупептина, 50 мг/мл апротинина, 5 мг/мл антипаина, 5 мг/мл пепстатина) и инкубировали на льду в течение одного часа. Ядерную суспензию центрифугировали в течение 10 минут при 16000 g при 4°С. Супернатант собирали и хранили при -80°С. Цитозольные экстракты для исследований связывающих CpG белков получали из нестимулированных клеток Ramos, которые лизировали с помощью гипотонического буфера, как описано для получения ядерного экстракта. После центрифугирования супернатант отделяли в качестве цитоплазматической фракции и хранили при -80°С. Концентрацию белка измеряли с помощью анализа белка по Bradford (Bio-Rad, Hercules, CA) в соответствии с инструкцией производителя.

Иммуноблоттинг: белковые экстракты целых клеток с равной концентрацией (25 мкг/дорожку) кипятили в буфере для образца в ДДС-Na (50 мМ трис-HCl, рН 6,8; 1% (β-меркаптоэтанола; 2% ДДС-Na; 0,1% бромфенолового синего; 10% глицерина) в течение 4 мин перед проведением электрофореза в 10% полиакриламидном геле, содержащем 0,1% ДДС-Na (ДДС-Na-IIAAr). После электрофореза белки переносили на Immobilion-P переносящие мембраны (Millipore Corp. Bedford, MA). Отпечатки блокировали 5% обезжиренным сухим молоком. Применяли специфические антитела против фосфорилированной формы киназы внеклеточных рецепторов (ERK), NН₂-концевой киназы c-jun (JNK), р38 и активирующего транскрипционного фактора-2 (ATF-2) (New England BioLabs, Beverly, MA). Отпечатки проявляли в усиленном хемолюминесцентном реагенте (ECL; Amersham International, Aylesbury, Великобритания) в соответствии с рекомендованной производителем процедурой.

Анализ изменения электрофоретической подвижности (EMSA):

Для определения ДНК-связывающей активности транскрипционного фактора активирующего белка-1 (АР-1) и NFkB ядерные экстракты (1 мкг/дорожку) анализировали с помощью EMSA с применением дОДН 5’ GAT СТА GTG ATG AGT CAG CCG GAT С 3’ (SEQ ID NO.: 838), содержащим связывающую АР-1 последовательность, и NFKB URE из промоторной области с-mус 5’ TGC AGG AAG TCC GGG ТТТ ТСС ССА АСС ССС С 3’ (SEQ ID NO.: 1142) в качестве зондов. ОДН метили с помощью Т4-полинуклеотидкиназы (New England Biolabs) и (γ-³²P) АТФ (Amersham, Arlington Heights, IL). Реакции связывания проводили с 1 мкг белка ядерного экстракта в буфере для связывания ДНК (10 мМ трис-НСl рН 7,5), 40 мМ MgCl₂, 20 мМ ЭДТА, 1 мМ дитиотрейтола, 8% глицерина и 100-400 нг поли (dI-dC) с 20000-40000 имп/мин меченого ОДН в суммарном объеме 10 мкл. Специфичность полос NFkB подтверждали исследованиями конкуренции с немечеными олигонуклеотидами, соответствующими сайтам связывания неродственного транскрипционного фактора (10-100 нг). Для анализа суперсдвига в реакционную смесь добавляли 2 мкг специфичных антител против c-Rel, p50 и р65 (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA) за 30 мин до добавления радиоактивно меченого зонда. После инкубации в течение 30 минут при комнатной температуре добавляли буфер для нанесения, и образцы подвергали электрофорезу в 6% полиакриламидном геле в трис-борат-ЭДТА буфере для разделения (90 мМ трис, 90 мМ борная кислота, 2 мМ ЭДТА, рН 8,0). Гели сушили и затем подвергали авторадиографии.

Поперечная сшивка УФ и денатурирующий электрофорез

белка: ядерные экстракты инкубировали с меченым фосфодиэфирным олигонуклеотидом, как описано для EMSA. Комплексы ДНК-белок поперечно сшивали с помощью УФ облучения в аппарате Stratalinker (Stratagene) в течение 10 минут. Образцы смешивали с ДДС-Nа-буфером для образцов, кипятили в течение 10 минут и наносили на 7,5% ДДС-Ка-ПААГ для электрофореза. Гель сушили на бумаге Whatman и авторадиографировали. Путем откладывания расстояния против молекулярной массы маркерных белков получали стандартную кривую, которую применяли для расчета приблизительной молекулярной массы поперечно сшитых комплексов белок-ОДН. Для получения размера из данной величины вычитали молекулярную массу олигонуклеотида.

Пример 9: Определение оптимального CpG-мотива для применения в отдельности или в сочетании с обогащенным Т ОДН

На иммунных клетках человека фосфортиоатные олигонуклеотиды, содержащие специфичный для мыши мотив CpG GACGTT (SEQ ID NO.: 1143) (например, 1826 (SEQ ID NO.: 69)) и примененные в концентрациях, активных в отношении В-клеток мыши (Yi А. К., Chang М., Peckham D. W., Krieg А. М., and Ashman R. F. 1998. CpG oligodeoxyribonucleotides rescue mature spleen В cells from spontaneous apoptosis and promote cell cycle entry. J Immunol 160:5898), показали слабую иммуностимупирующую активность или отсутствие таковой. При больших концентрациях данный олигонуклеотид проявлял некоторое стимулирующее действие на В-клетки человека.

В предшествующих работах по активации В-клеток мыши было обнаружено, что CpG-динуклеотид, фланкируемый двумя 5’ пуринами и двумя 3’ пиримидинами, и предпочтительно 6-членный мотив 5’ GACGTT 3’ (SEQ ID NO: 1 143) является оптимальным для активности фосфодиэфирного олигонуклеотида (Krieg A.M., et аl. 1995 Nature 374: 546, Yi А. К., Chang M., et al.. 1998 J Immunol 160: 5898).

Для выявления оптимального мотива для стимуляции иммунного ответа у человека и позвоночных, отличных от грызунов, заявители создали ряд ОДН и провели тестирование их активности. Во-первых, заявители создали 20-членный фосфодиэфирный олигонуклеотид с динуклеотидом ТС с 5’-конца оптимального мотива CpG мыши GACGTT 3’ (SEQ ID NO.: 1143) и последующим поли-С-хвостом (2079: 5’ TCG ACG TTC ССС ССС ССС СС 3’ (SEQ ID NO.: 320)). Если данный олигонуклеотид добавляли к первичным В-клеткам человека при тех же условиях, которые, как было обнаружено, являются оптимальными для ДНК Е.coli (повторное добавление через 0 часов, 4 часа и 18 часов; 30 мкг/мл для каждой временной точки), то он стимулировал высокий уровень экспрессии CD86 на первичных В-клетках человека через два дня. Для определения связи между структурой и функцией мотивов CpG заявители заменяли основания, смежные с CpG-динуклеотидами при сохранении в последовательности двух CpG-динуклеотидов. Замена аденина, расположенного между двумя CpG-динуклеотидами, на тимидин (2080 (SEQ ID NO.: 321)), приводила к небольшому повышению активности. Замена гуанозином (2100 (SEQ ID NO.: 341)) или цитидином (2082 (SEQ ID NO.: 323)) в данном положении не вызвала заметных изменений по сравнению с 2079 (SEQ ID NO.: 320). В то же время замена тимидина с 3'-конца от второго CpG-динуклеотида пуринами гуанозином (2099 (SEQ ID NO.: 340)) или аденином (2083 (SEQ ID NO.: 324)) приводила к существенному падению активности олигонуклеотида, тогда как пиримидин цитидин вызывал лишь небольшое снижение. Важен был также тимидин, непосредственно примыкающий к 5’-концу первого CpG-динуклеотида. Замена тимидина на любое другое основание (2105 (SEQ ID NO.: 346), гуанозин; 2107 (SEQ ID NO.: 348), аденин; 2104 (SEQ ID NO.: 345), цитидин) приводила к значительному снижению активности олигонуклеотида. Удаление первого (2108 (SEQ ID NO.: 349)) или второго (2106 (SEQ ID NO.: 347)) CpG-динуклеотида также частично снижало активность.

Добавление дополнительных 5’GTCGTT3’ (SEQ ID NO.: 1144) мотивов CpG к фосфодиэфирному олигонуклеотиду, содержащему 8-членный дуплексный CpG-мотив (5’TCGTCGTT 3’ (SEQ ID NO:1 145), 2080 (SEQ ID NO.: 321)), не вызывало дополнительного повышения экспрессии CD86 на В-клетках (2059 (SEQ ID NO.: 300)). Олигонуклеотид с той же последовательностью, что и 2080 (SEQ ID NO.: 321), но с фосфортиоатным остовом, не проявлял активности, превышающей фоновую (2116 (SEQ ID NO.: 357)). Это было неожиданным, поскольку, как сообщалось, фосфортиоатный остов значительно стабилизирует олигонуклеотиды и повышает индуцируемую CpG стимуляцию (Krieg A.M., Yi А.К., Matson S., Waldschmidt T.J., Bishop G.A., Teasdale R., Koretzky G.A., and Klinman D.M. 1995. CpG motifs in bacterial DNA trigger direct B-cell activation. Nature 374:546). Поэтому заявители провели дополнительный структурно-функциональный анализ фосфортиоатных олигонуклеотидов, содержащих 5’GTCGTT3’ (SEQ ID NO: 1 144) и 5’TCGTCGTT3’ (SEQ ID NO:1145) мотивы, который показал что дополнительные мотивы CpG (2006 (SEQ ID NO.: 246)) способствуют повышению активности фосфортиоатных олигонуклеотидов.

Очищенные В-клетки, выделенные из периферической крови с помощью иммуномагнитной сортировки клеток, активировали CpG-ДНК до такой же степени, как и неочищенные В-клетки в РВМС. Таким образом, активация В-клеток является первичным ответом, а не вторичным ответом, вызванным цитокинами, секретированными другими клетками.

Кроме ко-стимулирующей молекулы CD86 функциональную стадию В-клеток характеризуют и другие поверхностные маркеры. Например, активированные хелперные Т-клетки стимулируют В-клетки лигированием CD40, молекула 1 межклеточной адгезии (ICAM-1, CD54) опосредует связывание с другими иммунными клетками, а главный комплекс II гистосовместимости (МНС II) ответственен за презентацию антигена. Заявители обнаружили, что экспрессия CD40, CD54 и МНС II В-клетками стимулируется CpG-олигонуклеотидом 2080 (SEQ ID NO.: 321). He-CpG-контрольный олигонуклеотид 2078 (SEQ ID NO.: 319) не проявлял активности по сравнению с активностью одной среды.

Когда РВМС инкубировали в течение 5 дней в присутствии 2080 (SEQ ID NO.: 321) (добавляемого через 0 часов, 4 часа, 18 часов и каждое последующее утро), на удивление оказалось, что субпопуляция лимфоцитов увеличивается в размере клеток (FSC) и становится более гранулярной (SSC). Для изучения вопроса о том, не представляет ли собой данная популяция пролиферирующие клетки, заявители окрашивали свежевыделенные РВМС с помощью CFSE (5-(и 6-) карбоксифлуоресцеина диацетата сукцинимидильным эфиром) в день 0 и инкубировали их в течение 5 дней с 2080 (SEQ ID NO.: 321), как описано выше. CFSE представляет собой флуоресцентную молекулу, которая необратимо связывается с клеточными белками. Каждое клеточное деление снижает окраску CFSE на 50%. Было обнаружено, что слабоокрашенные CFSE клетки (пролиферирующие клетки) представляют собой главным образом CD19-позитивные В-клетки. Олигонуклеотид 2080 (SEQ ID NO.: 321) индуцировал пролиферацию от 60 до 70% CD19-позитивных В-клеток в пределах 5 дней. Контрольный олигонуклеотид 2078 (SEQ ID NO.: 319) индуцировал пролиферацию менее 5% В-клеток. Пролиферирующие В-клетки (с низким уровнем CFSE) обладали большим размером клеток (FSC) и большей гранулярностью.

Пролиферирующие В-клетки экспрессировали CD86 на более высоком уровне по сравнению с непролиферирующими клетками (не показано). В соответствии с данным наблюдением набор олигонуклеотидов, тестированный выше на предмет индукции экспрессии CD86, вызывал почти идентичный паттерн пролиферации В-клеток. Замена 3’ тимидина снижала активность в большей степени, чем замена тимидина в среднем положении.

Пример 10: Для активации В-клеток необходимо созревание/закисление эндосом

Ранее было показано, что хлорохин, ингибитор закисления эндосом, блокирует опосредуемую CpG стимуляцию мышиных антиген-представляющих клеток и В-клеток, но не влияет на опосредуемые LPS эффекты (Hacker H., et al 1998 Embo J 17:6230, Yi А. К. et al 1998 J Immunol 160:4755, Macfarlane D.E., and Manzel L. 1998 J Immunol 160: 1122). Заявители обнаружили, что добавление 5 мкг/мл хлорохина полностью блокирует опосредуемую CpG-индукцию экспрессии CD86 на первичных В-клетках (MFI CD86: 2006 (SEQ ID NO.: 246), 4,7 против 1,4; ДНК Е. coli, 3.4 против 1,4; одна среда, 0,9; n=4). Более того, хлорохин полностью ингибировал индукцию пролиферации В-клеток под действием фосфортиоатного олигонуклеотида (SEQ ID NO.: 246), измеренную с помощью анализа пролиферации с применением CFSE, а также стандартным способом. Данные результаты позволяют предполагать, что, как и в случае мышиных клеток, для активации В-клеток человека под действием CpG-ДНК необходимы захват ДНК в эндосомы и последующее закисление эндосом.

Пример 11: Анализ субклеточных событий, происходящих после стимуляции В-клеток человека оптимальньм ОДН человека

Поскольку требования к CpG-мотиву для максимальной активации В-клеток существенно различаются для мыши (GACGTT) (SEQ ID NO: 1143) и человека (TCGTCGTT) (SEQ ID NO: 1145), заявителей заинтересовало, сравнимы ли основные внутриклеточные события проведения сигнала. Ранее в мышиных В-клетках и макрофагах была обнаружена быстрая индукция связывающей активности HFkB (Stacey К. J., et al 1996 J Immunol 157:2116, Yi А. К et al 1998 J Immunol 160: 4755). Для исследования ответа HFkB на CpG-ДНК у человека первичные В-клетки человека выделяли из периферической крови с помощью иммуномагнитной сортировки клеток и инкубировали с CpG-олигонуклеотидом 2080 (SEQ ID NO.: 321), не-СрС-контрольным олигонуклеотидом 2078 (SEQ ID NO.: 319) или средой. В указанные моменты времени клетки собирали и получали ядерные экстракты. В присутствии CpG-олигонуклеотида связывающая активность HFkB возрастала в течение одного часа и оставалась повышенной до 18 часов (наиболее удаленный исследованный момент времени). He-CpG-контрольный олигонуклеотид 2078 (SEQ ID NO.: 319) не показал повышения активности NFKB по сравнению с клетками, инкубированными с одной средой. Полосу NFkB идентифицировали с помощью конкуренции немеченого зонда,

и с помощью суперсдвига было показано, что она состоит из субъединиц р50 и р65.

Транскрипционный фактор, активирующий белок-1 (АР-1), участвует в регуляции немедленных ранних генов и экспрессии цитокинов (Karin М. 1995. The regulation of AP-1 activity by mitogen-activated protein kinases. J Biol Chem 270:16483). В мышиных В-клетках связывающая активность АР-1 индуцируется в ответ на CpG-ДНК (Yi А. К., and Krieg A. M. 1998. Rapid induction of mitogen-activated protein kinases by immune stimulatory CpG DNA. J Immunol 161:4493). Для определения того, индуцируется ли данный транскрипционный фактор под действием CpG-ДНК также и у человека, заявители проверили ДНК-связывающую активность АР-1 в первичных В-клетках человека. Клетки инкубировали с CpG-олигонуклеотидом 2080 (SEQ ID NO.: 321) или с контрольным олигонуклеотидом 2078 (SEQ ID NO.: 319). Получали ядерные экстракты, и связывающую активность АР-1 анализировали с помощью EMSA. Связывающая активность АР-1 возрастала в пределах одного часа и повышалась до 18 часов (наиболее удаленный исследованный момент времени), что свидетельствует о продолжительном ответе.

Поскольку активность АР-1 индуцируется многими стимулами (Angel P., and Karin М. 1991. The role of Jun, Fos and the AP-1 complex in cell-proliferation and transformation. Biochim Biophys Acta 1072:129), заявители заинтересовались путями проведения сигнала, расположенными выше АР-1.

Транскрипционный фактор АР-1 интегрирует различные пути активируемой митогеном протеинкиназы (МАРК) (Karin M. 1995. The regulation of AP-1 activity by mitogen-activated protein kinases. J Biol Chem 270:16483). Иммуноблоттинг проводили с применением экстрактов цельных клеток из первичных В-клеток, инкубированных с CpG-олигонуклеотидом 2080 (SEQ ID NO.: 321), контролем 2078 (SEQ ID NO.: 319), или одной средой. Применяли специфические антитела против фосфорилированной формы JNK, р38, ATF-2 и ERK. Через 30 мин и 60 мин экспозиции с CpG-ДНК обнаружена сильная индукция фосфорилирования JNK, тогда как не-СрG-олигонуклеотид не проявил активности, превышающей фоновую. Протеинкиназа р38, другая активируемая стрессом протеинкиназа (SAPK), также фосфорилировалась в ответ на CpG-ДНК в пределах 60 мин. ATF-2, субстрат как для р38, так и для JNK (Gupta S., Campbell D., Derijard В., and Davis R.J. 1995. Transcription factor ATF2 regulation by the JNK signal transduction pathway. Science 267:389) и компонент комплекса АР-1, проявил слабое фосфорилирование через 30 мин и повышение фосфорилирования через 60 мин. CpG-ДНК не индуцировала существенного фосфорилирования ERK. Напротив, анти-IgM, стимулирующее рецептор В-клеток, запускало фосфорилирование ERK. Анти-IgM активировало изоформы JNK, отличные от активируемых CpG-ДНК.

Пример 12: Анализ адъювантной активности in vivo

Был разработан скрининговый анализ in vitro для выявления ОДН, пригодного в качестве адъюванта in vivo у человека и других, отличных от грызунов животных. Поскольку заявители наблюдали не только количественные, но и качественные различия в активности различных CpG ОДН у мыши, заявители сначала подвергли скринингу набор CpG и не-CpG-контрольных ОДН на мышиных клетках для обнаружения способов анализа in vitro с явной и сильной корреляцией с адъювантной активностью in vivo с применением поверхностного антигена гепатита В (HbsAg). После этого заявители систематически тестировали набор из более чем 250 ОДН в соответствующих анализах для человека для выявления последовательностей с иммуностимулирующей активностью in vitro. Затем заявители проверяли, активируют ли ОДН, обладающие наибольшей активностью в данных тестах на человеке, пролиферацию В-клеток у шимпанзе и обезьян, и, наконец, проявляют ли они активность в качестве адъювантов с HbsAg у шимпанзе и беличьей обезьяны in vivo. Данные исследования показали, что на иммуностимулирующую активность CpG фосфортиоатных ОДН влияют последовательность, количество и спейсинг отдельных мотивов CpG. ОДН с динуклеотидом ТС на 5’-конце и последующими тремя 6-членными мотивами CpG (5’GTCGTT3’), разделенными динуклеотидами ТТ, постоянно демонстрировали наибольшую активность в отношении лейкоцитов человека, шимпанзе и макаки резус. У шимпанзе или обезьян, однажды вакцинированных против гепатита В адъювантом CpG ОДН, развивались титры антител против НВ, в 15 раз более высокие, чем у тех, которые получали только вакцину.

Материалы и методы

Олигонуклеотиды: модифицированные фосфортиоатом ОДН получали от Operon Technologies (Alameda, СА) и Hybridon Specialty Products (Milford, MA). ОДН тестировали на эндотоксин с помощью анализа LAL (LAL-assay BioWhittaker, Walkersville, MD; нижняя граница определения 0,1 EU/мл). Для анализов in vitro ОДН разводили в буфере ТЕ (10 мМ трис, рН 7,0, 1 мМ ЭДТА) и хранили при -20°С. Для применения in vivo ОДН разводили в солевом растворе, забуференном фосфатом (0,1 М ЗФР, рН7,3) и хранили при 4°С. Все разведения проводили с применением свободных от пирогенов реагентов.

Культуры клеток селезенки мыши: селезенки удаляли у 6-12-недельных самок BALB/c (The Jackson Laboratory), 2×10⁶ спленоцитов культивировали с 0,2 мкМ ОДН в течение 4 часов (TNFα) или 24 часов (ИЛ-6, IFN-γ, ИЛ-12), и цитокины определяли с помощью ТИФА, как описано ранее (Yi А.К., Klinman D.М., Martin Т.L., Matson S., and Krieg A.M. 1996. Rapid immune activation by CpG motifs in bacterial DNA. Systemic induction of IL-6 transcription through an antioxidant-sensitive pathway. J Immunol 157:5394). Для оценки индуцированной CpG пролиферации В-клеток из клеток селезенки удаляли Т-клетки с помощью анти-Тhy-1,2 и комплемента и центрифугирования на lympholyte M^® (Cedariane Laboratories, Homby, ON, Canada), культивировали в течение 44 часов с указанными ОДН, после чего промечивали пульсовой меткой 1 мкКи ³H тимидина в течение 4 часов, как описано ранее (Krieg A.M., Yi А.К., Matson S., Waidschmidt T.J., Bishop G.A., Teasdale R., Koretzky G.A., and Klinman D.M. 1995. CpG motifs in bacterial DNA trigger direct B-cell activation. Nature 374: 546). Для оценки литической активности NK-клеток из клеток селезенки мыши удаляли В-клетки с помощью магнитных шариков, покрытых козьими антителами против Ig мыши, как подробно описано ранее (Ballas Z. К., and Rasmussen W. 1993. Lymphokine-activated killer cells. VII. IL-4 induces an NK1.1⁺CD8 α⁺β^- TCR-αβ B220⁺ lymphokine-activated killer subset. J Immunol 150:17). Клетки культивировали в количестве 5×10⁶/лунку в 24-луночных планшетах и собирали через 18 часов для применения в качестве эффекторных клеток в стандартном 4-часовом тесте выделения ⁵¹Сr против клеток мишеней YAC-1. За одну единицу (LU) принимали количество клеток, необходимых для индукции 30% специфического лизиса.

Иммунизация мышей против HbsAg и оценка гуморального ответа: группы 6-8-недельных самок мышей BALB/c (n=5 или 10, Charles River, Montreal, QC) иммунизировали против HbsAg, как описано ранее (Davis H. L., et al 1998 J Immunol 160:870). Вкратце каждая мышь получала однократную инъекцию 50 мкл ЗФР, содержащего 1 мкг рекомбинантного HbsAg (Medix Biotech, Foster City, CA) и 10 мкг CpG ОДН или не-CpG ОДН в качестве единственного адъюванта или в сочетании с квасцами (Alhydrogel "85", Superfos Biosector, Vedbaek, Дания; 25 мг Al³⁺/мг HBsAg). Контрольных мышей иммунизировали HbsAg без адъюванта или квасцов. Через разные периоды времени после иммунизации от мышей получали плазму, и AT, специфичные к HbsAg (анти-HBs), количественно определяли по конечному разведению с помощью ТИФА (в трех параллелях), как описано ранее (Davis H.L et al 1998 J Immunol 160:870). Конечные титры определяли как наибольшее разведение плазмы, обеспечивающее величину поглощения (ОП450), в два раза превышающую таковую неиммунной плазмы, при отсекаемой величине 0,05.

Выделение РВМС приматов и клеточная культура:

Мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) выделяли из периферической крови здоровых добровольцев, шимпанзе и беличьих обезьян с помощью центрифугирования в градиенте плотности Filoll-hypaque (Histopaque-1077, Sigma Chemical Co., St. Louis, МО), как описано (Hartmann G., et al 1996 Antisense Nucleic Acid Drug Dev 6:291). Клетки суспендировали в культуральной среде RPMI 1640 с добавкой 10% (об/об) инактивированной нагреванием (56°С, 1 час) FCS (HyClone, Logan, UT), 1,5 мМ L-глутамина, 100 ед./мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина (все - от Gibco BRL, Grand Island, NY) (полная среда). Клетки (конечная концентрация 1×10⁶ клеток/мл) культивировали в полной среде в увлажняемом инкубаторе при 5% СО₂ и 37°С. В качестве стимулов применяли ОДН и LPS (из Salmonella typhimurium, Sigma Chemical Co., St. Louis, МО) или анти-IgM. Для измерения литической активности NK человека РВМС инкубировали в количестве 5×10⁶ /лунку в 24-луночных планшетах. Культуры собирали через 24 часа, и клетки использовали в качестве эффекторов в стандартном 4-часовом тесте выделения ⁵¹Сr против клеток мишеней К562, как описано ранее (Ballas Z. К., Rasmussen W. L., and Krieg A. M. 1996. Induction of NK activity in murine and human cells by CpG motifs in oligodeoxynucleotides and bacterial DNA. J Immunol 157:1840; Ballas Z. K., and Rasmussen W. 1993. Lymphokine-activated killer cells. VII. IL-4 induces an NKl.1⁺CDS α⁺β^-TCR-α,β B220⁺ lymphokine-activated killer subset. J Immunol 150:17). Для пролиферации В-клеток за 18 часов до сбора добавляли 1 мкКи ³H-тимидина, и количество включенного ³Н тимидина определяли с помощью сцинтилляционного счета на день 5. Стандартные отклонения в трех параллельных лунках составляли <5%.

Проточная цитометрия РВМС приматов: Поверхностные антигены РВМС приматов окрашивали, как описано ранее (Hartmann G et al 1998 J Pharmacol Exp Ther 285:920). Моноклональные антитела против CD3 (UCHT1), CD14 (М5Е2), CD19 (В43), CD56 (В159), CD69 (FN50) и CD86 (2331 (FUN-1)) были получены от Phariningen, San Diego, CA. IgG_1,к (МОРС-21) и IgG_2b,к (Hartrnann G et al 1999 PNAS 96:9305) применяли для контроля неспецифического окрашивания. NK-клетки идентифицировали по экспрессии CD56 на негативных по CD3, CD14 и CD19 клетках, а В-клетки идентифицировали по экспрессии CD19. Данные проточной цитометрии для 10000 клеток на образец получали с помощью FACScan (Beckton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA). Жизнеспособность клеток в примененном для анализа сортере FSC/SSC определяли окраской йодистым пропидием (2 мкг/мл), и она оказалась выше 98%. Результаты анализировали с применением компьютерной программы FlowJo (version 2.5.1, Tree Star, Inc., Stanford, CA).

Иммунизация шимпанзе и беличьих обезьян против HbsAg и оценка гуморального ответа: четырнадцать беличьих обезьян (2,0-3,5 кг) иммунизировали детской дозой Engerix-B (SmithKline Beecham Biologicals, Rixensart, BE), содержащей 10 мкг HbsAg, адсорбированного на квасцах (25 мг Al³⁺/мг HBsAg). Полученное вводили самостоятельно (n=5), или в сочетании с CpG ОДН 1968 (n=5, 500 мкг) или CpG ОДН 2006 (SEQ ID NO.: 246) (n=4, 150 мкг). Четырех шимпанзе (10-20 кг) иммунизировали таким же образом, причем двое получали контрольную вакцину (только Engerix-B), а двое получали экспериментальную вакцину (Engerix-B плюс 1 мг CpG ОДН 2006). Все вакцины вводили в/м в правое переднее бедро в суммарном объеме 1 мл. Обезьян содержали в условиях для животных Primate Research Center (Bogor, Индонезия), а шимпанзе содержались в Bioqual (Rockville, MD). Животных ежедневно контролировали специалисты по содержанию животных. Не было обнаружено симптомов общего ухудшения здоровья или местных побочных реакций в месте инъекции. Плазму получали в/в пункцией до и через разные промежутки времени после иммунизации и хранили замороженной (-20°С) до проведения анализа на антитела. Антитела против Hbs определяли с помощью имеющегося в продаже набора ТИФА (Monolisa Anti-HBs; Sanofi-Pasteur, Montreal, QC), и титры выражали в mIU/мл на основе сравнения со стандартами, определенными ВОЗ (Monolisa Anti-HBs Standards; Sanofi-30 Pasteur).

Результаты

Идентификация CpG ОДН с различными профилями иммунной активности in vitro: исследования заявителей показали, что конкретные основания на 5’- и 3’-концах динуклеотида CpG в мотиве CpG могут оказывать существенное влияние на уровень иммунной активации синтетического ОДН, но оставалось неясным, могут ли различные мотивы CpG вызывать различные иммунные эффекты. Для изучения этого вопроса заявители тестировали набор мотивов CpG ОДН на предмет их способности индуцировать литическую активность NK, пролиферацию В-клеток и стимулировать синтез TNFα, ИЛ-6, IFN-γ и ИЛ-12 в клетках селезенки мыши. Иммуностимулирующая активность ОДН, не содержащих мотивов CpG (ОДН 1982 (SEQ ID NO.: 225), ОДН 1983 (SEQ ID NO.: 226)) была негативной или слабой по сравнению с CpG ОДН. ОДН с неоптимальными мотивами CpG (ОДН 1628 (SEQ ID NO.: 767), ОДН 1758 (SEQ ID NO.: 1)) были менее активны, чем ОДН, содержащие мотивы CpG, фланкируемые двумя 5’-пуринами и двумя 3’-пиримидинами (ОДН 1760 (SEQ ID NO.: 3), ОДН 1826 (SEQ ID NO.: 69), ОДН 1841 (SEQ ID NO.: 84)). ОДН 1826, содержащий два оптимальных мышиных мотива CpG (5’ GACGTT 3’) (SEQ ID NO: 1143), обладал наибольшей активностью в отношении 5 из 6 измерявшихся конечных параметров. За исключением ОДН 1628, все ОДН проявляли в целом сходный профиль активности (опосредуемый NK-клетками лизис, пролиферация В-клеток, ИЛ-12, ИЛ-6, TNFα, IFN-γ). Следует отметить, что ОДН 1628, являющийся уникальным в данном наборе по наличию двух обогащенных G областей, проявлял предпочтительную индукцию синтеза IFN-γ и относительно низкую стимуляцию других активностей.

Выявление анализов in vitro, которые коррелируют с адъювантной активностью in vivo: поскольку адъювантная активность является конечным эффектом in vivo, заявители были заинтересованы в выявлении тестов in vitro, которые предсказывали бы адъювантную активность CpG ОДН in vivo. Поэтому те же самые ОДН, которые применяли для конечных эффектов in vitro, тестировали на предмет их адъювантной активности для иммунизации против HbsAg. Данный анализ проводили как с одним ОДН, так и с ОДН в сочетании с квасцами, поскольку в предшествующих работах был показан выраженный синергизм для CpG ОДН и квасцовыми адъювантами (опубликованная патентная заявка РСТ WO 98/40100).

Мыши BALB/c, иммунизированные HbsAg без адъюванта, давали лишь низкие титры анти-НВs к 4 неделям, и контрольный ОДН не влиял на данный показатель. Напротив, добавление CpG ОДН повышало титры анти-НВs в 5-40 раз, в зависимости от использованной последовательности. При добавлении квасцов титры анти-НВs были приблизительно в 6 раз выше, чем при применении только HbsAg. Существенно, что данные титры не изменялись в присутствии контрольного ОДН и повышались в 2-36 раз различными CpG ОДН. Результаты, полученные с различными ОДН, взятыми отдельно, очень хорошо коррелировали (r=0,96) с результатами, полученными с теми же ОДН плюс квасцы. Когда была проведена линейная регрессия, была обнаружена очень высокая степень корреляции между определенными анализами in vitro и повышением анти-HBs титров in vivo. Из всех анализированных конечных эффектов in vitro наибольшую корреляцию с адъювантной активностью in vivo показала индукция литической активности NK (без квасцов, r=0,98; с квасцами, r=0,95; р<0.0001). Хорошая корреляция в отношении адъювантной активности была получена также для стимуляции В-клеток (r=0,84 и 0,7), а также секреции TNF-α (r=0,9 и 0,88), ИЛ-12 (r=0,88 и 0,86) и ИЛ-6 (r=0,85 и 0,91). Единственный анализ in vitro, который не коррелировал хорошо с результатами in vivo, представлял собой секрецию IFN-γ (r=0,57 и 0,68). Данные результаты показывают, что анализы in vitro литической активности NK, активации В-клеток и продукции TNF-α, ИЛ-6 и ИЛ-12 дают ценную информацию in vitro для предсказания адъювантной активности данного ОДН in vivo.

Скрининг набора фосфортиоатных ОДН в отношении активации NK-клеток человека: в предшествующих исследованиях заявители обнаружили, что синтез воспалительных цитокинов РВМС человека индуцируется чрезвычайно низкими количествами эндотоксина (индуцируемая секреция TNF-α выявляется уже при 6 пг/мл эндотоксина, чувствительность на 2 порядка более высокая, чем чувствительность иммунных клеток мыши). В то же время активация В-клеток человека и индукция литической активности NK-клеток человека эндотоксином низка даже при высоких концентрациях эндотоксина. Основываясь на данных результатах, заявители выбрали активацию NK-клеток (литическая активность и экспрессия CD69) и В-клеток (пролиферация и экспрессия CD86) в качестве наиболее высокоспецифичных и воспроизводимых анализов с низкой межсубъектной вариабельностью и применили данные анализы для скрининга in vitro набора ОДН.

Прежде всего заявители исследовали действие фосфортиоатных ОДН, содержащих различные сочетания и перестановки мотивов CpG, на опосредуемый NK-клетками лизис клеток-мишеней. Для ясности и простоты представления показаны лишь данные с отдельными типичными CpG и контрольньми ОДН. РВМС человека инкубировали с различными фосфортиоатными ОДН (6 мкг/мл) в течение 24 часов и тестировали на их способность лизировать меченые ⁵¹Сr клетки К562. ОДН с двумя 6-членными мотивами CpG (либо 5’GACGTT3’ (SEQ ID NO.: 1143), либо 5’GTCGTT3’ (SEQ ID NO.; 1144)) в сочетании с ТрС на 5’-конце ОДН (ОДН 1840 5’TCCATGTCGTTCCTGTCGTT3’ (SEQ ID NO.: 83), ОДН 1851 5’TCCTGACGTTCCTGACGTT3’ (SEQ ID NO.: 94) или с по меньшей мере тремя 6-членными мотивами без ТрС на 5’-конце (ОДН 2013 (SEQ ID NO.: 253)) показали умеренную активность. Высокая активность была обнаружена, когда 5’ ТрС непосредственно предшествовал 6-членному мотиву CpG человека (5’TCGTCGTT 3’ (SEQ ID NO.: 1145)) и сопровождался двумя 6-членными мотивами (ОДН 2005 (SEQ ID NO.: 245), ОДН 2006 (SEQ ID NO.: 246) и ОДН 2007 (SEQ ID NO.: 247)). Наилучшие результаты были получены, когда 6-членные мотивы CpG были отделены друг от друга и от 5’ 8-членного мотива CpG с помощью ТрТ (ОДН 2006 (SEQ ID NO.: 246)).

Экспрессия маркера активации CD69 быстро повышается на поверхности NK-клеток после стимуляции. Для получения результатов, полученных на основании анализа лизиса NK-клетками, РВМС инкубировали в течение 18 часов с ОДН (2 мкг/мл). Экспрессию CD69 определяли на позитивных по CD56 NK-клетках (негативных по CD3, CD14 и CD19). Хотя индукция экспрессии CD69 была в меньшей степени ограничена последовательностью по сравнению со стимуляцией функциональной активности NK-клеток, контрольные ОДН (ОДН 1982, ОДН 2116, ОДН 2117, ОДН 2010) проявляли лишь низкую активность, сходную с фоновыми значениями. ОДН с двумя мотивами CpG человека, разделенными 5’-TTTT-3’ (ОДН 1965 (SEQ ID NO.: 208)), или четырьмя мотивами CpG человека без спейсинга (ОДН 2013 (SEQ ID NO.: 253)) были относительно активнее в индукции экспрессии CD69 по сравнению со стимуляцией литической активности NK-клеток. Оптимальная функциональная активность NK-клеток, а также экспрессия CD69 была получена с ОДН, содержащими динуклеотид ТрС, предшествующий мотиву CpG человека, и дополнительные мотивы человека в последовательности (ОДН 2006 (SEQ ID NO.: 246), ОДН 2007 (SEQ ID NO.: 247)).

Активность фосфортиоатных ОДН в отношении стимуляции В-клеток человека: в предварительных экспериментах заявители обнаружили, что процент пролиферирующих В-клеток (анализ CFSE, смотри раздел способов) коррелирует с поверхностной экспрессией костимулирующего CD86 на В-клетках, измеренной проточной цитометрией. Поэтому заявители применили экспрессию CD86 на В-клетках для скрининга набора ОДН в отношении их иммуностимулирующей активности. РВМС инкубировали с 0,6 мкг/мл ОДН. Экспрессию CD86 (средняя интенсивность флуоресценции, MFI) определяли на позитивных по CD19 В-клетках. Поли-С ОДН (ОДН 2017 (SEQ ID NO.: 257)) или ОДН без динуклеотидов CpG (ОДН 1982 (SEQ ID NO.: 225)) были неспособны стимулировать В-клетки человека при данных экспериментальных условиях. Фосфортиоатный ОДН (ОДН 2116 (SEQ ID NO.: 256)) с одним оптимальным мотивом CpG человека, предшествуемым ТрС (5¹-TCGTCGTT-3' (SEQ ID NO.: 1145)), обладал низкой активностью. Наличие одного 6-членного мотива CpG человека (5’-GTCGTT-3’(SEQ ID NO.: 1144)) не оказывало активирующего действия. Два таких мотива CpG в последовательности не проявляли (ОДН 1960 (SEQ ID NO.: 203), ОДН 2016 (SEQ ID NO.: 256)) или проявляли умеренную (ОДН 1965 (SEQ ID NO.: 208)) активность в зависимости от контекста последовательности. Если ОДН был построен из трех или четырех копий данного мотива (ОДН 2012 (SEQ ID NO.: 252), ОДН 2013 (SEQ ID NO.: 253), ОДН 2014 (SEQ ID NO.: 254)), можно было обнаружить умеренную активность на В-клетках. Сочетание 8-членного мотива CpG человека на 5’-конце ОДН с двумя 6-членными мотивами CpG (ОДН 2005 (SEQ ID NO.: 245), ОДН 2006 (SEQ ID NO.: 246), ОДН 2007 (SEQ ID NO.: 247)) ОДН 2102 (SEQ ID NO.: 343), ОДН 2103 (SEQ ID NO.: 344)) вело к значительному повышению способности ОДН стимулировать В-клетки. Важен был спейсинг между отдельными мотивами. Разделение мотивов CpG с помощью ТрТ было предпочтительным (ОДН 2006 (SEQ ID NO.: 246)) по сравнению с неразделенными мотивами CpG (ОДН 2005 (SEQ ID NO.:); сравни также ОДН 1965 (SEQ ID NO.: 208) с ОДН 1960 (SEQ ID NO.: 203)). 6-членный мотив CpG человека (5’-GTCGTT-3’) был лучше оптимального 6-членного мотива CpG мыши (5’-GACGTT-3’(SEQ ID NO.: 246)) при сочетании с 8-членным мотивом CpG человека на 5’-конце (ОДН 2006 против ОДН 2102 (SEQ ID NO.: 343) и ОДН 2103 (SEQ ID NO.: 344)). ОДН (ТСС)поли был неактивен или лишь малоактивен, как и ОДН, содержащие динуклеотиды CpG, фланкированные гуанинами или другими динуклеотидами CpG (ОДН 2010 (SEQ ID NO.: 250)). Взятые вместе результаты для NK-клеток и В-клеток четко показали, что из тестированных ОДН наибольшей иммуностимулирующей активностью на иммунных клетках человека обладает ОДН 2006 (SEQ ID NO.: 246).

Сравнительный анализ эффективности CpG фосфортиоатных ОДН у различных приматов: различные мотивы CpG являются оптимальными для активации иммунных клеток мыши и человека. Более того, у мыши и человека различны количество и локализация мотивов CpG в активном фосфортиоатном ОДН.

Заявители заинтересовались вопросом о том, проявляют ли CpG фосфортиоатные ОДН сходную активность у различных видов приматов. Заявители сравнили набор CpG ОДН по их способности индуцировать пролиферацию В-клеток у человека, шимпанзе и резуса или беличьей обезьяны. Способность ОДН стимулировать пролиферацию В-клеток (таблица J) хорошо коррелировала с их способностью индуцировать экспрессию CD86 на В-клетках. ОДН 2006 (SEQ ID NO.: 246), который проявлял наибольшую активность на В-клетках и NK-клетках человека, был также наиболее активным в стимуляции пролиферации В-клеток шимпанзе и макаки-резус (таблица J). ОДН 1968 (SEQ ID NO.: 211) и ОДН 2006 (SEQ ID NO.: 246) вызывали наибольшую активацию В-клеток беличьей обезьяны in vitro (SI 25 и 29, соответственно, при 6 мкг ОДН/мл). Неожиданно оказалось, CpG ОДН 2007 (SEQ ID NO.: 247), который проявлял сходную с оптимальным ОДН 2006 (SEQ ID NO.: 246) высокую активность в клетках человека, не стимулирует пролиферацию В-клеток макак-резус или шимпанзе, а ОДН 1968 (SEQ ID NO.: 211) проявляет низкую активность. CpG ОДН, исходно выявленные по высокой активности у мыши (ОДН 1760 (SEQ ID NO.: 3), ОДН 1826 (SEQ ID NO.: 69)), проявляли низкую активность у обезьян (таблица J).

Таблица J Пролиферативный ответ РВМС на фосфортиоатные CpG ОДН у приматов
	Человек	Шимпанзе	Макак-резус
Без добавки	0,5+-0,1	0,5+-0,1	0,5+-0,0
ODN 1760	23+-7	0,3+-0,1	0,5+-0,3
(SEQ ID NO.:3)
ODN 1826	0,8+-0,1	0,4+-0,1	0,6+-0,1
(SEQ ID NO.:69)
ODN 1968	35+-9	20,0+-3,8	1,9+-0,7
(SEQ ID NO.:221)
ODN 1982	9,7+-1,1	2,5+-1,1	0,7+-0,1
(SEQ ID NO.:225)
ODN 2006	58+-8	27,4+-8,9	6,3+-3,3
(SEQ ID NO.:246)
ODN 2007	47+-11	0,5+-0,1	0,4+-0,2
(SEQ ID NO.:247)

РВМС получали из периферической крови и инкубировали с ОДН (0,6 мкг/мл), как указано, в течение пяти дней. Пролиферацию измеряли по включению ³H/тимидина (имп/мин/1000) в течение последних 18 часов. По данным, полученным с помощью анализа CFSE, более 95% пролиферировавших клеток представляли собой В-клетки. Тестировали четырех пробандов человека, шестерых шимпанзе и двух макак-резус.

Адъювантная активность CpG ОДН in vivo у шимпанзе и беличьих обезьян: для оценки того, обладают ли CpG ОДН с высоким стимулирующим действием in vitro на клетки приматов измеримой адъювантной активностью in vivo, беличьих обезьян и шимпанзе, иммунизировали Engerix В, который включает в себя HBsAg, адсорбированные на квасцах, в отдельности или с добавленным ОДН 1968 (500 мкг) или ОДН 2006 (SEQ ID NO.: 246) (1 мг) соответственно. По сравнению с контрольными животными, не получавшими CpG ОДН, анти-НВs-титры через 4 недели после примирования и 2 недели после повторной иммунизации были соответственно в 66 и 16 раз выше у обезьян и в 15 и 3 раза выше у шимпанзе (таблица К). Таким образом, наблюдался четкий адъювантный эффект CpG ОДН, и это было особенно выражено после однократной иммунизации.

1. Способ стимуляции иммунного ответа, включающий в себя введение иммуностимулирующей нуклеиновой кислоты отличному от грызунов субъекту в количестве, эффективном для индукции иммунного ответа у субъекта, отличного от грызунов, где нуклеиновая кислота представляет собой обогащенную тимидином (Т) нуклеиновую кислоту, которая содержит более 60% Т.

2. Способ по п.1, где Т-обогащенная иммуностимулирующая нуклеиновая кислота представляет собой поли-Т-нуклеиновую кислоту, содержащую 5’ТТТТ3’.

3. Способ по п.2, где поли-Т-нуклеиновая кислота содержит 5’Х₁Х₂ТТТТХ₃Х₄3’, где X₁, Х₂, Х₃ и Х₄ представляют собой нуклеотиды.

4. Способ по п.2, где Т-обогащенная иммуностимулирующая нуклеиновая кислота содержит множество мотивов поли-Т-нуклеиновой кислоты.

5. Способ по п.3, где X₁X₂ представляет собой ТТ.

6. Способ по п.3, где Х₃Х₄ представляет собой ТТ.

7. Способ по п.3, где Х₁Х₂ выбран из группы, состоящей из ТА, TG, TC, AT, АА, AG, АС, СТ, СС, СА, CG, GT, GG, GA и GC, где А соответствует аденину, С соответствует цитозину, G соответствует гуанину, а Т соответствует тимидину.

8. Способ по п.3, где Х₃Х₄ выбран из группы, состоящей из ТА, TG, ТС, AT, АА, AG, АС, СТ, СС, СА, CG, GT, GG, GA и GC.

9. Способ по п.1, где Т-обогащенная иммуностимулирующая нуклеиновая кислота имеет нуклеотидный состав, более чем на 80% состоящий из Т.

10. Способ по п.1, где иммуностимулирующая нуклеиновая кислота включает в себя по меньшей мере 20 нуклеотидов.

11. Способ по п.1, где иммуностимулирующая нуклеиновая кислота содержит по меньшей мере 24 нуклеотида.

12. Способ по п.1, где иммуностимулирующая нуклеиновая кислота имеет нуклеотидный остов, который включает в себя по меньшей мере одну модификацию остова.

13. Способ по п.12, где модификация остова представляет собой фосфортиоатную модификацию.

14. Способ по п.1, где иммуностимулирующая нуклеиновая кислота содержит цитозин-гуаниновые динуклеотиды (CpG).

15. Способ по п.14, где иммуностимулирующая нуклеиновая кислота содержит динуклеотиды CpG только в метилированном состоянии.

16. Способ по п.1, где иммуностимулирующая нуклеиновая кислота свободна от CpG.

17. Способ по п.1, где иммуностимулирующая нуклеиновая кислота имеет нуклеотидный состав, более чем на 25% состоящий из цитозина (С).

18. Способ по п.1, где иммуностимулирующая нуклеиновая кислота имеет нуклеотидный состав, более чем на 25% состоящий из аденина. (А).

19. Способ по п.1, где субъекта дополнительно подвергают действию антигена и где иммунный ответ представляет собой специфичный в отношении антигена иммунный ответ.

20. Способ по п.1, дополнительно включающий в себя выделение иммунной клетки из субъекта, контактирование иммунной клетки с эффективным для активации иммунной клетки количеством иммуностимулирующей нуклеиновой кислоты и введение активированной иммунной клетки обратно субъекту.

21. Способ по п.1, где у субъекта имеется астма или существует опасность развития астмы и способ представляет собой способ лечения или профилактики астмы у субъекта.

22. Способ по п.1, где у субъекта имеется аллергия или существует опасность развития аллергии и способ представляет собой способ лечения или профилактики аллергии.

23. Способ по п.1, где у субъекта имеется рак и способ представляет собой способ лечения рака.

24. Способ по п.1, где иммуностимулирующая нуклеиновая кислота дополнительно включает в себя TG-мотив.

25. Способ по п.1, где TG-нуклеиновая кислота содержит 5’N₁X₁TGX₂N₂3’, где N означает последовательность нуклеиновой кислоты, а Х означает любой нуклеотид, включая урацил.

26. Композиция, содержащая олигонуклеотид, имеющий нуклеиновую кислоту с последовательностью TCG TCG TTT TGA CGT TTT GTC GTT (SEQ ID NO: 343).

27. Способ лечения или профилактики аллергии или астмы, включающий в себя введение композиции по п.26 нуждающемуся в этом субъекту, отличному от грызунов, в количестве, эффективном для лечения или профилактики аллергии или астмы.

Разноска приоритетов:

25.09.1999 по пп.1-21, 24-27;

23.08.2000 по пп.22 и 23.