Способ скрининга антигельминтных препаратов

Изобретение относится к области медицины и ветеринарии. Сущность изобретения состоит в том, что для оценки эффективности испытуемых агентов определяют содержание яиц гельминтов в фекалиях у подопытных животных до лечения, в процессе лечения и после его окончания и по раннему и выраженному увеличению содержания яиц после начала лечения в течение 1-4 дней по сравнению с исходным показателем и последующему исчезновению яиц в фекалиях леченых животных выявляют эффективные антигельминтные препараты. Способ позволяет использовать в опытах меньшее количество животных, способ надежен и быстр. 5 табл.

 

Изобретение относится к медицине и ветеринарии, а именно к медицинской и ветеринарной гельминтологии, и может быть использовано для первичного скрининга новых химических соединений, эффективных против гельминтов, паразитирующих в кишечнике или желчных путях человека, домашних и сельскохозяйственных животных.

Скрининг соединений, эффективных против просветных форм гельминтов, проводят на экспериментально зараженных или спонтанно инвазированных лабораторных животных, преимущественно на грызунах.

Известный способ первичного скрининга антигельминтных препаратов описан в работе Б.А.Астафьева и соавт. (2000), избранной в качестве прототипа. Для скрининга используют препараты с установленными показателями токситности при введении в возрастающих дозах в желудок мышам или животным других видов (ЛД₁₆, ЛД₅₀, ЛД₈₄, определенные по Керберу для белых мышей, крыс, иногда собак). Перед проведением скрининга у некоторых животных опытных и контрольной групп исследуют фекалии на наличие яиц гельминтов. Затем опытным животным вводят в желудок испытуемые препараты однократно или в течение нескольких дней. Через 1-2 недели после введения препаратов всех животных контрольной и опытных групп вскрывают и исследуют у них содержимое и стенку кишечника или желчных путей на наличие и количество гельминтов. Эффективность препарата оценивают по двум показателям: 1) учитывают количество и процент животных, полностью освободившихся от гельминтов - экстенс-эффективность (ЭЭ) и 2) число и процент отошедших паразитов - интенс-эффективность (ИЭ). При оценке эффективности препаратов ЭЭ часто не учитывают, так как для получения достоверных данных требуется значительное число животных. В связи с трудностью или невозможностью подсчета отошедших паразитов для вычисления ИЭ учитывают среднее число гельминтов у животных в опытной и контрольной группах и определяют ИЭ по формуле:

ИЭ=100(К-О)/К,

где К и О - среднее число гельминтов в контрольной и опытной группах соответственно. Для опытной и контрольной групп используют животных, содержащихся в одинаковых условиях, одного пола и возраста, близкой массы тела. При скрининге химических соединений, обладающих антигельминтными свойствами, большая часть испытуемых соединений сказывается неэффективной. В связи с этим при первичном скрининге рекомендуется вводить препараты в максимально переносимой дозе. При ИЭ ниже 50% препарат характеризуется как слабо эффективный. При значении ИЭ выше 50%, а особенно 80-100% препарат рекомендуется испытать повторно из-за возможной нестабильности результатов экспериментальной химиотерапии. Окончательную эффективность устанавливают при проверке нескольких серий препарата, каждой - не менее чем на трех различных партиях животных. Определяют среднюю эффективную дозу (ЕД₅₀), а также ЕД₁₆, ЕД₈₄. Достоверность результатов оценивают методами биологической статистики. Для получения достоверных данных в опытные и контрольную группы рекомендуется включать не менее 7-10 животных. С целью экономии экспериментальных животных отобранные для исследования препараты следует испытывать на партиях по 100-150 животных, имея для них одну контрольную группу.

Способ прототипа имеет следующие недостатки: высокая затратность (большинство испытуемых соединений оказывается неэффективным, что сопряжено с расходом на неэффективные препараты большей части лабораторных животных); необходимость в большом количестве животных в опытных и контрольной группах (не менее 7-10 голов в группе); необходимость в контрольных животных; стандартизация большого количества животных в сравниваемых группах (используются животные одинаковых пола, возраста, массы тела); необходимость в обязательном вскрытии всех животных опытных и контрольной групп в конце опыта (что исключает повторное использование дорогостоящей и трудоемкой модели инвазии в первичном скрининге); стандартный срок вскрытия животных, единый для опытных и контрольной групп (что исключает выявление возможного индивидуального у некоторых животных замедленного целевого эффекта препарата); отсутствие возможности оценки влияния препарата на паразитов в динамике в сроки от начала введения препарата до вскрытия животных; способ не исключает использования не заразившихся гельминтами животных (так как исследование фекалий на наличие яиц гельминтов проводится не у всех животных); копроовоскопическое исследование перед началом опыта носит качественный, но не количественный характер; ограниченная точность оценки эффективности препаратов (обусловленная широкой вариабельностью интенсивности инвазии у животных) и необходимость в связи с этим повторных уточняющих опытов на разных партиях животных; высокая трудоемкость скрининга на всех его этапах, связанная с использованием большого количества животных (исходное копроовоскопическое исследование, подбор животных с необходимыми стандартными параметрами, введение препаратов, содержание животных и уход за ними, вскрытие животных и подсчет гельминтов у каждого из них, математическая обработка полученных данных, повторные опыты для уточнения показателя ИЭ); отсутствие признака, тестирующего целевой эффект в процессе лечения и после его окончания до момента вскрытия животных.

Задачей изобретения является ускорение и повышение экономичности способа.

В основе заявляемого способа лежит впервые выявленный феномен раннего и выраженного повышения концентрации яиц гельминтов в фекалиях инвазированных животных под влиянием эффективных антигельминтных препаратов. Способ осуществляется следующим образом. У экспериментально зараженных или спонтанно инвазированных гельминтами животных определяют концентрацию яиц паразитов в фекалиях. Затем 2-5 животным вводят в желудок или парентерально испытуемое химическое соединение в течение 1-3 дней в суммарной дозе, близкой к максимально переносимой. В процессе лечения и в течение 1-1,5 недель после его окончания определяют у каждого животного концентрацию яиц гельминтов, а также наличие и количество целых гельминтов или их фрагментов в фекалиях.

Животные, в фекалиях которых в течение 1 недели после начала лечения не регистрировались выраженное повышение концентрации яиц паразитов и последующее их исчезновение или отмечалось заметное повышение концентрации яиц без последующего их исчезновения (отрицательный тестирующий признак) считались неизлечившимися, а испытуемый препарат рассматривался неэффективным или слабо эффективным. Животные, в фекалиях которых в течение этого срока выявлялись раннее и выраженное повышение концентрации яиц гельминтов по сравнению с исходным показателем и последующее исчезновение яиц паразитов (положительный тестирующий признак), считались излечившимися, а испытуемый препарат рассматривался эффективным. Животные, получавшие эффективные препараты, подлежат контрольному вскрытию для исследования на наличие гельминтов в кишечнике или желчных ходах. Животные, получавшие неэффективные или слабо эффективные препараты, не подлежат вскрытию и могут быть повторно использованы в опытах по первичному скринингу антигельминтных препаратов.

Благодаря отличительным признакам, представленным в таблице 1, предлагаемый способ скрининга имеет следующие преимущества перед способом прототипа: исследование фекалий всех животных на яйца гельминтов исключает использование в опытах не заразившихся гельминтами грызунов, что повышает надежность способа; количественное копроовоскопическое исследование в процессе скрининга позволяет сравнительно быстро выявлять эффективные препараты (через 2-4 дня после начала лечения) по резкому повышению концентрации яиц гельминтов по сравнению с исходным показателем, а также по появлению в фекалиях целых гельминтов или их фрагментов, что обеспечивает ускорение скрининга; способ обеспечивает возможность оценки влияния эффективных препаратов на паразита в динамике и специфики его антигельминтного действия в сроки от начала лечения до момента вскрытия животного, что повышает информативность эксперимента; способ позволяет четко дифференцировать эффективность испытуемых соединений по двум полярным тестирующим признакам: положительному (излечение - эффективный препарат) и отрицательному (излечения нет - слабо эффективный или неэффективный препарат), что сокращает сроки и объем дальнейших исследований по опенке терапевтической активности выявленных эффективных препаратов: высокая информативность и надежность способа позволяют его применение на меньшем количестве животных (2-5 животных на препарат) и исключают необходимость в контрольных животных, что снижает трудоемкость и затратность исследований; сохранение жизни животным с отрицательным тестирующим признаком дает возможность повторного использования дорогостоящих и трудоемких моделей гельминтозов в опытах по первичному скринингу антигельминтных препаратов, что повышает рентабельность способа; срок вскрытия животных с положительным тестирующим признаком может быть индивидуальным для каждого животного и определяется сроком регистрации этого признака, что позволяет выявлять возможный замедленный целевой эффект исследуемого препарата и повысить тем самым эффективность скрининга.

Эффективность предлагаемого способа иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. При экспериментальном описторхозе золотистых хомяков оценивали эффективность оригинальной полимерной формы мебендазола (ПФМ), разработанной в ИМПиТМ им. Е.И.Марциновского и представляющей собой вязкую суспензию с содержанием действующего вещества (ДВ) 2%. В качестве препаратов сравнения испытаны коммерческие нетаблетированные мебенлазол-субстанция (МС) и празиквантель (П) в виде суспензии в 1%-ном крахмальном геле при прочих равных условиях эксперимента. Препараты испытывали на 2-5 хомяках в каждой опытной группе. Для иллюстрации информативности способа использована группа контрольных (нелеченых) животных. В опыте использованы взрослые хомяки обоего пола, зараженные в возрасте 1-1,5 мес метацеркариями Opisthorchls felineus в желудок. Длительность инвазии к началу опыта составляла 32 дня. Каждое животное взвешивали с точностью до 1 г, метили индивидуальной меткой. Перед началом лечения у каждого животного исследовали фекалии методом Като на наличие и количество яиц паразитов в 1 пробе фекалий массой 40-50 мг. Затем животным опытных групп вводили в желудок исследуемые препараты с помощью шприца и канюли в суточной дозе ДВ 0,3 г/кг 1 раз в день в течение двух дней подряд. В течение 9-ти дней после начала лечения фекалии каждого животного подвергали количественному овоскопическому исследованию 1 раз в день в 1 пробе фекалий. Через 41-44 дня после заражения вскрывали всех хомяков опытных и контрольной групп и исследовали содержимое их желчных путей на наличие и жизнеспособность трематод с помощью бинокулярной лупы МБС-. Критерием жизнеспособности паразитов служили двигательная и присасывательная активность. Результаты эксперимента показали (табл.2), что у всех подопытных животных перед началом лечения в фекалиях выявлены яйца паразитов, что свидетельствовало наличие у них экспериментальной инвазии. Положительный тестирующий признак - раннее (через 1-5 дней после начала лечения) и выраженное повышение концентрации яиц паразитов в фекалиях по сравнению с исходным показателем (до 20-90 раз) и последующее прекращение манифестации инвазии (через 7-9 дней после начала лечения) отмечен у животных, получавших ПФМ и П. Надежность положительного тестирующего признака у животных этих групп подтверждена отсутствием трематод в желчных путях при вскрытии животных. Отрицательный тестирующий признак - слабо выраженное повышение концентрации яиц в фекалиях по сравнению с исходным показателем (до 6-10 раз) и последующая манифестация инвазии в течение всего срока наблюдения (0 дней после начала лечения), отмечен у хомяков, леченных МС. Полученный отрицательный показатель подтвердило выявление в желчных путях животных этой группы живых трематод. У контрольных хомяков существенные изменения в манифестации инвазии в течение всего эксперимента не выявлены. Таким образом, результаты скрининга выявили высокую эффективность ПФМ при экспериментальном описторхозе.

Пример 2. При экспериментальном описторхозе золотистых хомяков оценивали эффективность коммерческого нетаблетированного медамина. В опыте использованы два взрослых хомяка (самцы), зараженные в возрасте 1 мес 30 метацеркариями кошачьей двуустки. Продолжительность инвазии к началу опыта составляла 112 дней. Препарат в виде суспензии в физиологическом растворе вводили животным внутрибрюшинно однократно в дозе 0,5 г/кг. Хомяков вскрывали через 9-10 дней после введения препарата. Оценку эффективности лечения проводили так же, как в примере 1. Результаты эксперименте выявили положительный тестирующий признак у обоих леченных хомяков (табл.3). При вскрытии животных трематоды в желчных путях не выявлены, однако в печени грызунов обнаружены гранулемы, содержавшие множество яиц паразитов, что свидетельствовало об излечении интенсивной хронической инвазии. Полученные результаты показали высокую эффективность медамина при экспериментальном длительно протекавшем описторхозе.

Пример 3. При экспериментальном трихоцефалеэе белых мышей оценивали эффективность оригинальной полимерной формы медамина, разработанной в ИМПиТМ им. Е.И.Марциновского и содержавшей 2% ДВ. В опыте использованы 5 взрослых мышей обоего пола, зараженных в возрасте 1 мес зрелыми яйцами Trichocephalus trichiurus в желудок. Длительность инвазии к моменту начала опыта составляла 40 дней. Препарат вводили животным в желудок 3 раза в день в суточной дозе ДВ 0,3 г/кг в течение трех дней подряд. Всех животных вскрывали через 5-6 дней после начала лечения лечения и исследовали содержимое их толстого кишечника на наличие власоглавов под бинокулярной лупой МБС-9. Оценку эффективности лечения проводили так же, как в примере 1. В результате эксперимента (табл.4) положительный тестирующий признак выявлен у всех подопытных животных, что свидетельствовало о высокой эффективности препарата при экспериментальном трихоцефалезе.

Пример 4. На трех взрослых нелинейных мышах (самки) массой тела 22-28 г, спонтанно инвазированных цестодой Hymenolepis nаnа и нематодой Sурhасiа abvelata с копрологически подтвержденным диагнозом оценивали эффективность полимерной формы медамина, содержавшей 2% ДВ. Дозы и курс лечения препаратом, а также сроки копроовоскопического исследования и вскрытия мышей были такими же, как и в примере 3. В результате эксперимента (табл.5) положительный тестирующий признак выявлен у всех подвергнутых лечению подопытных животных. 100%-ная эффективность препарата при гименолепидозе и сифациозе мышей подтверждена отрицательными результатами исследования содержимого кишечника на наличие паразитов при вскрытии животных.

Таким образом, предлагаемый способ скрининга антигельминтных препаратов, основанный на количественной оценке манифестации инвазии у леченых животных, обеспечивает более раннее выявление эффективных средств, что ускоряет способ, а высокая его информативность позволяет использовать в опытах меньшее количество животных, исключить необходимость в контрольной группе нелеченых животных и сохранять жизнь животным с отрицательным показателем скрининга для повторного использования дорогостоящих и трудоемких моделей гельминтозов в опытах по первичному скринингу антигельминтиков, что снижает затратность способа.

Таблица 1 Отличительные признаки известного и предлагаемого способов скрининга антигельминтных препаратов
Отличительные признаки	Способы
Известный (прототип)	предлагаемый
Исследование фекалий лабораторных животных на наличие яиц паразитов	перед началом лечения	качественное, не у всех животных	количественное, у всех животных
в процессе лечения и после его окончания	не проводится	проводится, количественное, у всех животных
Возможность использования в опытах не заразившихся гельминтами животных	не исключена	исключена
Наличие в опытах группы контрольных (нелеченых) животных	необходимо	исключена
Число животных на 1 препарат, голов	не менее 7-10	2-5
Оценка характера антигельминтной активности препарата в динамике у каждого животного до момента его вскрытия	не проводится	проводится
Возможность выявления эффективных антигельминтных препаратов в процессе скрининга до вскрытия животных	не реализуется	реализуется по положительному тестирующему признаку (ПТП)
Минимальный срок начала выявления эффективных препаратов, дни после начала лечения	7-14	2-4
вскрытие животных в конце эксперимента	вскрывают всех животных опытных и контрольной групп	проводят контрольное вскрытие только животных с ПТП
Срок вскрытия животных после окончания лечения	через 1-2 недели, единый для всех животных опытных и контрольной групп	индивидуальный для каждого животного после выявления у него ПТП
Возможность сохранения жизни животным для повторного их использования в опытах по первичному скринингу антигельминтных препаратов	исключена	имеется, при наличии у животных отрицательного теститующего признака

Источники информации

1. Астафьев Б.А., Лебедева М.Н., Гуськова Т.А., Веретенникова Н.Л., Гицу Г.А., Джабарова В.И., Коваленко Ф.П., Федянина Л.В., Баяндина Д.Г., Самочатова Е.И. Методические указания по изучению антигельминтной активности фармакологических веществ. - Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. - М., 2000. - С.309-318 (прототип).

2. Кротов А.И., Коваленко Ф.П., Баяндина Д.Г., Джабарова В.И., Изосимова С.Б. Методические указания по моделированию экспериментальных гельминтозов для скрининга противогельминтных препаратов. - М. 1988. - С.10-30.

Способ скрининга антигельминтных препаратов путем введения испытуемых агентов инвазированным просветными формами гельминтов лабораторным животным и последующего тестирования наличия инвазии гельминтами у леченных животных, отличающийся тем, что определяют содержание яиц гельминтов в фекалиях у подопытных животных до лечения, в процессе лечения и после его окончания и по выраженному увеличению содержания яиц гельминтов в течение 1-4 дней после начала лечения по сравнению с исходным показателем и последующему исчезновению яиц в фекалиях леченных животных выявляют эффективные антигельминтные препараты.