Средство для защиты зерновых сельскохозяйственных культур, подсолнечника, винограда от фитопатогенных микроорганизмов, а овощных культур от фитопатогенных бактерий

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой штамм бактерий Bacillus subtilis Ч-13, который используют для защиты зерновых сельскохозяйственных культур, подсолнечника, винограда от фитопатогенных микроорганизмов, а овощных культур от фитопатогенных бактерий. Штамм Bacillus subtilis Ч-13 выделен из черноземной почвы Республики Молдова и депонирован под регистрационным номером ВНИИСХМ Д-606 от 10 сентября 1998 г. в группе эпифитных микроорганизмов. Способность штамма подавлять различную патогенную микрофлору приводит к увеличению урожайности разных видов сельскохозяйственных культур. 4 табл.

 

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой использование штамма бактерий Bacillus Subtilis Ч-13 в качестве средства для защиты зерновых сельскохозяйственных культур, подсолнечника, винограда от фитопатогенных микроорганизмов, а овощных культур от фитопатогенных бактерий.

В России для целей защиты сельскохозяйственных растений от фитопатогенной микрофлоры и увеличения урожайности нашли применение биопрепараты на основе штаммов бактерий из группы Pseudomonas. Препарат под коммерческим названием Ризоплан, действующим началом которого являются живые клетки бактерий Pseudomonas sp., отселектированные на способность подавлять фитопатогены - возбудители корневых гнилей, используются для предпосевной обработки семян преимущественно зерновых культур. Использование Ризоплана предохраняет растения от поражения возбудителями фитофтороза, ложной мучнистой росы, бактериозов (Сборник статей «Генетика хозяйственно-ценных признаков высших растений», отв. редакторы Щапова А.И., Колосова Л.Д., ИциГ СО АН СССР, СО ВОГиС им. H.И.Вавилова, Новосибирск, 1990 г., стр.194-198).

Известен «Способ обработки семян», описанный в заявке № 2170987 Великобритании с приоритетом от 14.02.85 г. МКИ 4 А 01 С 1/06, опубликованный в ИСМ № 10 за 1987 г. Указанный способ предусматривает обработку семян составом, состоящим из микроорганизмов, носителя, например отрубей, и клея, такого как смола гатти.

Наиболее благоприятные результаты получаются при обработке семян пшеницы. Микроорганизмы могут стимулировать их рост (Azospirillum), связывать азот (Rhizobium), предотвращать заболевания растений (Pseudomonas или Bacillus), или же уничтожать насекомых (Streptomyces).

Известен также «Способ защиты капусты от бактериальных болезней» по патенту № 1793878 с приоритетом от 10.12.90 г., опубликованному 07.02.93 г. в Бюллетене изобретений РФ № 5.

По названному способу для защиты капусты от бактериозов семена капусты после гидротермической обработки обрабатывают суспензией штамма бактерий «Pseudomonas sp. ВКПМ В-3481» в концентрации 10⁶-10⁹ клеток/мл из расчета 20 мл на 1 кг семян. Применение бактериальной суспензии «Pseudomonas sp. ВКПМ В-3481» снижает развитие сосудистого и слизистого бактериозов и увеличивает урожайность капусты.

Известен «Штамм бактерий Bacillus subtilis № 11 (ВНИИСХМ), обладающий антагонистическими и стимулирующими свойствами и способ его использования для защиты ячменя от гельминтоспориоза» по патенту РФ №93001490 с приоритетом от 01.11.93 г. автора Поповой Ж.П.

Штамм бактерий Bacillus subtilis № 11, выделенный из образца почвы, взятого из под хлопчатника в Египте, обладает антагонистическими свойствами в отношении почвенных фитопатогенных микроорганизмов, в частности Helminthosporium sativun, он также стимулирует рост растений ячменя. Предложенный способ использования штамма оптимизирует его действие благодаря одновременному с бактеризацией семян внесению в почву зеленых удобрений (сидератов).

Известна группа изобретений «Способ предпосевной обработки семян овощных культур и способ получения препарата для предпосевной обработки семян овощных культур» по патенту РФ № 2140138 с приоритетом от 13.11.98 г., авторы Чеботарь В.К., Быкова Н.В., Темнова О.В., Орлова Н.А. и Хотянович А.В.

Указанные способы осуществляются с помощью биофунгицидного препарата, содержащего штамм бактерий Bacillus subtilis Ч-13 (депонирован под регистрационным номером ВНИИСХМ Д-606 в группе эпифитных микроорганизмов). Изобретения позволяют повысить эффективность защиты овощных культур от фитопатогенных грибов путем предпосевной обработки семян (ближайший аналог).

Задачей заявляемого изобретения является выявление средства в виде бактериального штамма, пригодного для использования в сельском хозяйстве с целью защиты зерновых сельскохозяйственных культур, подсолнечника, винограда от фитопатогенных микроорганизмов, а овощных культур от фитопатогенных бактерий.

Указанная задача решается за счет того, что в качестве средства для защиты зерновых сельскохозяйственных культур, подсолнечника, винограда от фитопатогенных микроорганизмов, а овощных культур от фитопатогенных бактерий, применен бактериальный штамм Bacillus subtilis Ч-13, у которого выявлена и экспериментально подтверждена способность подавлять различную патогенную микрофлору (фитопатогенные микроорганизмы: фитопатогенные бактерии и фитопатогенные грибы), что приводит к увеличению урожайности разных видов сельскохозяйственных культур: зерновых сельскохозяйственных культур, овощных культур, подсолнечника, винограда.

Штамм ризосферных споровых бактерий «Bacillus subtilis Ч-13» был выделен из черноземной почвы Республики Молдова и депонирован под регистрационным номером ВНИИСХМ Д-606 от 10.09.1998 г. в группе эпифитных микроорганизмов.

Штамм характеризуется следующими морфолого-культуральными и физиолого-биохимическими признаками.

Клетки имеют форму правильных палочек с закругленными концами и монополярным перитрихиальным расположением жгутиков. Размер клеток 1,0×2,0 мкм. Штамм образует споры, расположенные в центре клетки, положительно окрашивается по Граму. Через 24 часа роста на жидкой питательной среде наблюдалось накопление поли-β-оксибутирата. Рост в жидкой и полужидкой питательной среде микроаэрофильный, метаболизм дыхательный и бродильный. На мясопептонном агаре образует сухие колонии кремового цвета, пастообразной консистенции с неровными изрезанными краями. Диаметр колоний 20-40 мм. Оптимальная температура для роста 37°С. При температуре более 45°С и менее 15°С рост замедленный. Оптимальное значение рН среды 6,8, рост происходит также при рН от 4,5 до 8,0.

Штамм Bacillus subtilis Ч-13 гидролизует казеин, желатин, крахмал и лакмусовое молоко. Лакмус при этом обесцвечивался. Штамм обладает сильной каталазной активностью и не обладает липазной активностью. Штамм способен расти при температуре 40°С, наличии 7% NaCl и 0,001% лизоцима.

В качестве единственного источника углерода штамм использует с образованием кислоты арабинозу, ксилозу, маннит, глюкозу, галактозу, фруктозу, мальтозу, сорбит, глицерин, декстрин, крахмал и с образованием щелочи рамнозу и дульцит.

Штамм бактерии «Bacillus subtilis Ч-13» выращивают на доступной питательной среде, состоящей из отрубей и мела, что является значительным преимуществом по сравнению, например, со способом культивирования псевдомонад, в котором используют дефицитные и дорогие питательные среды.

В соответствии с «Методическими указаниями Минздрава СССР» №2620-82 и №4263-87 экспериментально определено, что штамм Bacillus subtilis Ч-13 является невирулентным, нетоксичным и нетоксигенным, что характеризует его как непатогенный для теплокровных животных и он относится к 4-му классу опасности.

Выявлены и экспериментально установлены антагонистические свойства штамма Bacillus subtilis Ч-13 по отношению к возбудителям болезней сельскохозяйственных культур:

- для пшеницы озимой и яровой - штамм эффективен против мучнистой росы (Erysiphe graminis), бурой ржавчины (Puccinia recondita), фузариозной корневой гнили (Fusarium culmorum);

- для ячменя ярового - эффективен против плесневения семян (Penicillium, Alternaria), корневых гнилей (Bipolaris sorokiniana), темно-бурой пятнистости (Drechlera sorokiana);

- для капусты белокочанной и цветной - эффективен против сосудистого бактериоза Xanthomonas campestris), черной ножки (Rhizoctonia solani), питиозной корневой гнили (Pythium irregulare);

- для картофеля - эффективен против фигофтороза (Phytophtora infestans), ризоктониоза (Rhizoctonia solani), фузариозного увядания (Fusarium oxysporum);

- для подсолнечника - эффективен против белой гнили (Sclerotinia sclerotiorum), фомопсиса (Phomopsis helianthi);

- для сахарной свеклы - эффективен против корнееда (Pythium debarianum, Phoma betae), церкоспороза (Cercospora beticola);

- для винограда - штамм эффективен против милдью (Plasmopara viticola), оидиум (Uncinula necator), серой гнили (Botrytis cinerea).

Сравнительная антагонистическая активность ризосферных бактерий, продуцентов биопрепаратов Планриз (Pseudomonas fluorescens АР-33), Фитоспорин (Bacillus subtilis ВНИИСХМ 128) и Экстрасол (Bacillus subtilis Ч-13) по отношению к фитопатогенным бактериям представлена в таблице 1.

Таблица 1. Антагонистическая активность ризосферных бактерий, входящих в составы различных биопрепаратов по отношению к фитопатогенным бактериям.
Препарат (Штамм)	Зона ингибирования роста, мм
Erwinia carotovora А-1	Pseudomonas syringiae 8300	Pseudomonas syringiae 2314	Erwinia carotovora 3391	Clavibacter michiganense 17-1
Планриз (Pseudomonas fluorescens АР-33)	8,0±0,6	12,6±1,1	14,2±1,3	15,5±1,9	20,6±1,9
Фитоспорин (Bacillus subtilis ВНИИСХМ 128)	14,2±1,3	18,9±1,6	11,8±0,9	28,8±2,1	16,0±1,2
Экстрасол (Bacillus subtilis Ч-13)	28,4±2,0	32,0±2,6	48,0±3,3	49,5±4,1	36,0±2,7

Из данных, приведенных в таблице 1 видно, что изготовленный на основе штамма бактерий Bacillus subtilis Ч-13 препарат Экстрасол обладает наибольшей антагонистической активностью по отношению к фитопатогенным бактериям по сравнению с биопрепаратами на основе других известных штаммов бактерий.

Сравнительная антагонистическая активность ризосферных бактерий, продуцентов биопрепаратов Планриз (Pseudomonas fluorescens АР-33), Фитоспорин (Bacillus subtilis ВНИИСХМ 128) и Экстрасол (Bacillus subtilis Ч-13) по отношению к фитопатогенным грибам представлена в таблице 2.

Таблица 2. Антагонистическая активность ризосферных бактерий, входящих в составы различных биопрепаратов, по отношению к фитопатогенным грибам
Препарат (Штамм)	Зона ингибирования роста, мм
Phytophtora capsici	Rhizoctonia solani	Fusarium culmorum	Fusarium solani	Pythium spp.
Планриз (Pseudomonas fluorescens АР-33)	12.5±1.0	13.3±1.1	8.0±0.7	10.8±0.8	10.1±0.9
Фитоспорин (Bacillus subtilis ВНИИСХМ 128)	26.5±2.2	16.7±1.8	16.2±1.3	16.4±1,3	22.1±2.5
Экстрасол (Bacillus subtilis Ч-13)	48.1±3.2	29.6±1.9	33.0±2.4	23.8±1.9	38.1±2.9

Из приведенных в таблице 2 данных видно, что изготовленный на основе штамма бактерий Bacillus subtilis Ч-13 препарат Экстрасол обладает наибольшей антагонистической активностью по отношению к фитопатогенным грибам по сравнению с биопрепаратами на основе других известных штаммов бактерий.

Были проведены опыты по влиянию биопрепарата, содержащего бактериальный штамм Bacillus subtilis Ч-13, на урожайность яровых зерновых культур и картофеля. Результаты опытов приведены в таблице 3 и 4 соответственно.

Таблица 3. Влияние биопрепарата на основе штамма Bacillus subtilis Ч-13 на урожайность зерновых культур.
Хозяйство	Культурf, сорт	Площадь опыта, га	Урожай зерна, ц/га	Прибавка
Штамм Ч-13	Контроль	ц/га	%
ЗАО «Агробалт»	овес, с. Боррус	50	39.0	35.2	3.8	10.8
ЗАО «Торосово»	яровая пшеница, с. Иргина	50	28.0	21.0	7.0	33.3
ЗАО «Сумино»	яровой ячмень, с. Криничный	80	28.0	23.0	5.0	21.7
ЗАО «Котельское»	яровой ячмень, с. Суздалец	65	41.4	35.0	6.4	18.3
ЗАО «Котельское»	овес, с. Аргамак	22	42.0	30.0	12.0	40.0
ЗАО «Сельцо»	яровая пшеница, с. Крепыш	32	25.0	18.0	7.0	38.9
ЗАО «Гомонтово»	яровой ячмень, с. Ипари	64	29.0	22.0	7.0	31.8
Среднее по области	51,9	33,7	26,6	8,4	32,7

Таблица 4. Влияние биопрепарата на основе штамма Bacillus subtilis Ч-13 на урожайность картофеля.
Хозяйство	Сорт	Площадь опыта, га	Урожай клубней, ц/га	Прибавка
Экстрасол	Контроль	ц/га	%
ЗАО «Торосово»	Невский	28	241	211	30	14.2
ЗАО «Сельцо»	Невский	30	250	190	60	31.6
ЗАО «Гомонтово»	Невский	53	252	205	47	22.9
Среднее по области	37	247,7	202	45,7	28

Результаты опытов, приведенные в таблицах 3 и 4, показывают, что использование штамма бактерий Bacillus subtilis Ч-13, продуцента биопрепарата Экстрасол приводит к увеличению урожайности зерновых культур и картофеля в среднем на 30%.

Важным является также и то, что при использовании указанного штамма в составе биопрепаратов бактерии «Bacillus subtilis Ч-13» образуют споры, что позволяет сохранять эти препараты без потери жизнеспособности бактерий в течение длительного срока, не менее 6 месяцев с момента получения.

Концентрация (количество жизнеспособных клеток и спор) штамма бактерии «Bacillus sobtilis Ч-13» для его эффективного использования в составе различных биопрепаратов должна составлять 10⁶-10⁸ клеток на 1 мл культуральной жидкости. Экспериментально установлено, что использование штамма в концентрации менее 10⁶ кл/мл ведет к снижению антагонистического эффекта, а увеличение концентрации свыше 10⁹ кл/мл не приводит к увеличению эффективности защитного действия.

Ниже приведены примеры изготовления биопрепаратов на основе заявляемого штамма «Bacillus subtilis Ч-13».

Пример 1.

Выращивают культуру бактерий «Bacillus subtilis Ч-13» в жидкой стерильной питательной среде, содержащей 4% пшеничных отрубей и 0,3% мела, на качалке или в ферментере при 37±1°С в течение 24-36 часов. В культуральной жидкости накапливают 5·10⁸ клеток/мл. Затем получают биопрепарат следующим путем. Сначала смешивают:

70 мл - культуральной жидкости,

230 г - дефеката,

после чего полученную массу высушивают при 60°С в течение 12 часов и готовят из нее мелкодисперсный порошок путем размола (титр штамма - немного больше 10⁶ клеток/г).

Пример 2.

Выращивают культуру бактерий «Bacillus subtilis Ч-13» в жидкой стерильной питательной среде следующего состава:

пептон - 20 г/л

глицерин - 10 г/л

К₂НРО₄ - 1,5 г/л

MgSO₄ - 1,5 г/л

на качалке или в ферментере при 37°С в течение 24-36 часов до достижения в культуральной жидкости титра 10⁹ клеток/мл.

После чего получают жидкую форму биопрепарата, смешивая 20% культуральной жидкости и 80% воды (титр биопрепарата - 2·10⁸ клеток/мл).

Применение штамма бактерий Bacillus subtilis Ч-13 ВНИИСХМ Д-606 в качестве средства для защиты зерновых сельскохозяйственных культур, подсолнечника, винограда от фитопатогенных микроорганизмов, а овощных культур - от фитопатогенных бактерий.