Штамм bifidobacterium, способ получения иммуностимулирующего молочного продукта и продукт, полученный этим способом

Изобретение относится к молочной промышленности. Способ заключается в том, что молочный субстрат подвергают биоконверсии с помощью культуры Bifidobacterium breve CNCM I-2219, обладающей иммуностимулирующим действием, путем контакта молочного субстрата с этой культурой в условиях, при которых закисление среды указанной культурой не превышает 0,5 единицы РН за 8 часов инкубации при исходном засеве от 1×10⁷ до 5×10⁷ клеток в 1 мл. Конечная популяция Bifidobacterium breve по завершении биоконверсии составляет от 1×10³ до 1×10⁹ клеток в 1 мл продукта. Время контакта между молочным субстратом и штаммом составляет от 6 до 24 часов. Молочный продукт, получен заявленным способом. Изобретение позволяет уменьшить брожение и соответственно кислотность продукта, что дает возможность для использования его детьми. 4 н. и 6 з.п. ф-лы, 3 табл.

 

Настоящее изобретение относится к использованию бифидобактерий для получения иммуностимулирующих молочных продуктов питания, пригодных, в частности, в качестве детского питания: продуктов, которые могут иметь жидкую или порошковую форму.

Вид Bifidobacterium составляет часть семейства Actinomycetaceae. Он включает в себя строго анаэробные грам-положительные бациллы, сбраживающие глюкозу через промежуточное образование комплекса фруктоза-6-фосфат-фосфоацетолаза. Оптимальный для их роста рН варьирует от 6 до 7, а оптимальная для их роста температура от 37 до 40°С.

Бифидобактерии составляют часть нормальной кишечной флоры человека и им приписывают многочисленные благотворные для здоровья эффекты. Известно, в частности, что дети, которых кормят грудью и у которых в кишечной флоре преобладают бифидобактерии, более устойчивы к инфекциям и в меньшей степени рискуют заболеть диареей, чем грудные дети, получающие в пищу искусственные молочные препараты.

Роль бифидобактерий в такой повышенной устойчивости к инфекциям не в полной мере выяснена. Различные исследования указывают на то, что бифидобактерии обладают иммуностимулирующей способностью, в которой участвуют полисахариды, входящие в состав стенки бактерии или секретируемые бактериями при анаэробном брожении. GOMEZ et al. (FEMS Microbiol. Lett., 56, 47-52 (1982) описывают иммуномодулирующий эффект внеклеточных фракций, обогащенных полисахаридами, продуцируемыми Bifidobacterium adolescentis. В патенте Франции №2652590 (Лабораторий ОМ) описывается усиливающий иммунное действие экзополимер полисахаридной природы, продуцируемый Bifidobacterium infantis longum. HOSONO et al. [Biosci. Biotech. Biochem, 61, 312-316 (1997) и Bioscience Microflora, 17, 97-104 (1998)] описывают усиливающие иммунное действие полисахариды, продуцируемые различными видами Bifidobacterium. Иммуномодулирующее действие бифидобактерии проявляется также в регулировании кишечной микрофлоры, в частности путем подавления развития патогенных видов бактерий. Так, ROMOND et al. [Anaerobe, 3, 137-143 (1977) и J.Dairy Sci., 81, 1229-1235 (1998)] описывают обогащенные гликопротеинами фракции, продуцируемые Bifidobacterium breve в условиях анаэробного брожения и обеспечивающие in vivo регулирующий эффект кишечной микрофлоры.

В случае детского питания, однако, эти продукты обладают тем недостатком, что они являются слишком кислыми и имеют, в частности, когда они являются порошкообразными, неоднородный внешний вид после разбавления водой из-за свертывания белков молока под влиянием возникающей при брожении кислотности. Поэтому иногда такие продукты отвергаются ребенком и матерью.

Известен молочный продукт, полученный способом по патенту США 5711977 А, 27.01.1998, путем культивирования бифидобактерий в молочной среде в неблагоприятных (аэробных) условиях. Тем самым обеспечивается уменьшение брожения и соответственно кислотности продукта, что предпочитается детьми. При этом, однако, может ослабляться иммуностимулирующий эффект, обеспечиваемый бифидобактериями при их культивировании в обычных условиях.

Обнаружено, что культивирование штамма Bifidobacterium CNCM I-2219 в неблагоприятных условиях обеспечивает иммуностимулирующий продукт с уменьшенной кислотностью.

Таким образом, предметом настоящего изобретения является способ получения иммуностимулирующего молочного продукта, характеризующийся тем, что молочный субстрат подвергают биоконверсии с помощью штамма Bifidobacterium CNCM I-2219 путем осуществления контакта молочного субстрата с этой культурой в условиях, при которых закисление среды указанной культурой не превышает 0,5 единицы рН за 8 часов инкубации при исходном засеве от 1×10⁷ до 5×10⁷ клеток в 1 мл.

Конкретные параметры указанных условий могут быть легко определены специалистом с помощью простых экспериментов, в частности изменяя степень аэрации культуральной среды, ее осмотического давления и/или температуры культивирования, рН в начале и в конце культивирования.

Для многих штаммов Bifidobacterium такие условия могут быть, в частности, достигнуты путем:

- поддержания аэробных условий, например, при перемешивании;

- поддержания среды при осмотическом давлении, соответствующем 0,93-0,97 влагоактивности;

- поддержания температуры от 40 до 48°С;

а также комбинирования названных выше условий.

Контакт молочного субстрата и Bifidobacterium может осуществляться из расчета 1×10⁷-1×10⁹ клеток на 1 мл молочного субстрата и при этом конечная популяция Bifidobacterium по завершении реакции биоконверсии составляет от 1×10⁷ до 1×10⁹ клеток на 1 мл продукта.

рН молочного субстрата во время контакта с бактериями составляет предпочтительно от 6,3 до 7, а рН продукта по завершении реакции биоконверсии предпочтительно от 6 до 7.

В зависимости от условий реакции время контакта между молочным субстратом и бактериями варьирует от 6 до 24 час.

Молочным субстратом может быть молоко или любая другая молочная среда: например, молочный концентрат, основа для молочного питания для детей, основа для йогурта и т.п.

К молочной среде можно добавлять ингредиенты, необходимые для получения желаемого готового продукта. Если, например, хотят получить молочный продукт для грудных детей, то добавляют лактозу, мальтодекстрины, минеральные добавки, витамины, жировые материалы и ингредиенты, позволяющие воссоздать состав материнского молока. При желании вводят жировые материалы, которые затем гомогенизируют с помощью раствора с получением устойчивой эмульсии.

Один из штаммов Bifidobacterium breve, особенно подходящий для осуществления изобретения, был депонирован в соответствии с Будапештским соглашением от 31 мая 1999 года под номером I-2219 в CNCM (Национальной коллекции культур микроорганизмов при Институте Пастера в Париже).

Этот штамм обладает следующими характеристиками:

Морфология: короткие бациллы с редкими Y-и V-формами. Метаболизм: анаэробный; продукция уксусной и L(+)-молочной кислот.

Брожение сахаров: глюкоза, галактоза, фруктоза, мальтоза, сахароза, лактоза, эскулин, рибоза, маннит, сорбит, D-раффиноза, мелибиоза.

Предметом настоящего изобретения является также жидкий молочный продукт, полученный способом по изобретению.

По завершении реакции биоконверсии рН этого продукта составляет предпочтительно 6-7.

Для сравнения: продукты, получаемые в настоящее время с помощью Bifidobacterium, имеют в конце ферментации рН от 4 до 4,6.

Продукт по изобретению может употребляться как таковой или подвергаться различным обработкам, характер которых зависит от типа желаемого готового к употреблению продукта. Могут, например, добавляться структурирующие агенты, вкусовые добавки, витаминные или минеральные добавки, жировые материалы и т.п. (если они не были добавлены ранее к исходной среде). Продукт может быть также сконцентрирован или разбавлен.

Молочный продукт по изобретению может служить в качестве основы для получения свежих молочных продуктов.

Продукт может также. с успехом использоваться для получения, с помощью стерилизации и/или обезвоживания, долго сохраняющихся продуктов питания. Действительно, продукт сохраняет свои иммуностимулирующие свойства даже в отсутствие живых бактерий, например после высушивания и высокотемпературной стерилизации.

Настоящее изобретение распространяется также на свежие, стерилизованные или обезвоженные молочные продукты, получаемые из молочного продукта по изобретению.

Изобретение распространяется также на восстановленные молочные продукты, получаемые при добавлении воды к обезвоженным молочным продуктам по изобретению.

Молочные продукты (свежие, стерилизованные или восстановленные) по изобретению обычно имеют рН от 6 до 7,5, предпочтительно от 6,5 до 6,9.

В отличие от продуктов питания, образующихся при известном в настоящее время брожении Bifidobacterium, молочные продукты по изобретению не являются кислыми и содержат белки молока в растворимой, несвернутой форме. При добавлении воды к соответствующим изобретению обезвоженным молочным продуктам может быть получен гомогенный продукт, который не выделяет осадка и не разделяется на фазы.

Полученные по изобретению молочные продукты благодаря их иммуностимулирующему эффекту обеспечивают защиту от микробных и вирусных инфекций, сравнимую с защитой, обеспечиваемой известными продуктами, образующимися при сбраживании Bifidobacterium, не обладая при этом недостатками последних, выражающихся в изменении вкуса и внешнего вида продукта. Эти продукты особенно пригодны для детского питания и, более конкретно, для питания грудных детей, но могут также использоваться лицами всех возрастов.

Ниже настоящее изобретение поясняется примерами приготовления молочных продуктов в соответствии с изобретением.

ПРИМЕР 1: ПРОИЗВОДСТВО ДИЕТИЧЕСКОГО ПОРОШКООБРАЗНОГО МОЛОЧНОГО ПРОДУКТА ДЛЯ ГРУДНЫХ ДЕТЕЙ С ИММУНОСТИМУЛИРУЩЕЙ АКТИВНОСТЬЮ

Приготавливают молочный концентрат следующего состава, в г на 100 г сухого материала:

Молочный белок (80% казеина и 20% сывороточных белков)	13
Растительный жировой материал	25,5
Лактоза	42,25
Мальтодекстрины	16
Минералы	3
Витамины	0,25

Растительный жировой материал добавляют к нагретому до 75°С снятому коровьему молоку. Смесь гомогенизируют при той же температуре в два этапа: первый этап при давлении 200 кг/см² и второй - при 50 кг/см². После этого добавляют предварительно растворенные в воде лактозу и мальтодекстрины и затем растворы витаминов и минералов.

Конечную смесь пастеризуют при 115°С и затем концентрируют путем упаривания до 48% сухого материала.

Охлажденный до 37°С концентрат после этого засевают до 5% культурой В. breve I-2219, содержащей 10⁹ бактерий в 1 мл. Начальный рН равен 6,15, а осмотическое давление - 0,96.

После инкубирования в течение 8 часов при 37°С в резервуаре в атмосфере воздуха при периодическом перемешивании по 10 минут каждые 2 часа рН равен 6,1 и популяция В. breve составляет 10⁶ бактерий в 1 мл. Кислотность по Дорну равна 48°D.

Концентрат сушат распылением. Полученный порошок, будучи добавленным к воде в количестве 140 г на 1 л воды, позволяет получить восстановленное молоко, обладающее следующими характеристиками: рН 6,6, кислотность по Дорну 12°D, внешний вид молока - без зерен сгустка.

ПРИМЕР 2: ПРОИЗВОДСТВО ГОТОВОГО К УПОТРЕБЛЕНИЮ ДИЕТИЧЕСКОГО МОЛОЧНОГО ПРОДУКТА ДЛЯ ГРУДНЫХ ДЕТЕЙ С ИММУНОСТИМУЛИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТЬЮ, СТЕРИЛИЗОВАННОГО ПРИ ВЫСОКОЙ ТЕМПЕРАТУРЕ И АСЕПТИЧЕСКИ ЗАТАРЕННОГО

Приготовливают смесь следующего состава, в г/л:

Белки	21
Жировой материал	24
Глюциды	83
Минералы	5
Витамины	0,45

Эту смесь приготавливают из следующих ингредиентов, на 100 л конечного продукта:

- 58 л снятого молока

- 2,4 кг жирового материала

- 4,7 кг лактозы

- 0,7 кг мальтодекстринов

- 0,3 кг витаминов

- 0,05 кг комплекса минералов.

Молоко предварительно подвергают термообработке в пастеризаторе при температуре от 115 до 120°С.

В охлажденное до 70°С молоко вводят жировой материал и проводят гомогенизацию в два этапа: при давлении 200 кг/см² на первом этапе и 50 кг/см² на втором.

Смесь охлаждают до 37-38°С и затем засевают до 1,5% культурой CNCM I-2219, содержащей от 1×10⁹ до 5×10⁹ бактерий в 1 мл.

Смесь инкубируют при 37°С в течение 8 час в условиях, указанных в приведенном выше примере 1, и затем охлаждают до 5°С.

рН полученного продукта составил 6,3, популяция В.breve составила 3×10⁷ бактерий в 1 мл, а кислотность по Дорну - 23°D.

Остальную часть ингредиентов растворяют в приблизительно 50 л воды и затем добавляют к полученному продукту в конце инкубации.

Полученную таким образом смесь подвергают термообработке при 140°С в течение 6-7 с, после чего асептически затаривают.

ПРИМЕР 3: ИММУНОСТИМУЛИРУЮЩЕЕ ДЕЙСТВИЕ МОЛОЧНЫХ ПРОДУКТОВ ПО ИЗОБРЕТЕНИЮ

Иммуностимулирующее действие молочных продуктов по изобретению исследовали следующим образом:

- по выделению фекальной флоры на мышах с флорой человека;

- путем регулирования феномена транслокации на мышах с единственной монокультурой Clostridium perfringens.

Исследование фекальной флоры у мышей с флорой человека

Мыши с флорой взрослого человека принадлежат линии С3Н.

Конкретнее, речь идет о генерации G1, имея в виду, что GO обозначает бактериально-стерильных мышей, которым в зрелом возрасте введена флора человека.

- Количество мышей в одной партии: 6

- Число испытаний: 2 для каждого продукта

Мышей выдерживают 1 неделю в одной общей клетке и затем помещают по 6 мышей в отдельные клетки.

Возраст мышей в начале испытаний от минимум 8 до максимум 11 недель.

В фекальной флоре следят за содержанием:

- бифидобактерий

- бактероидов Fragilis

- спор Clostridia

- возможно, спор Cl. perfringens.

Микробиологические методы

Отбирают свежий образец фекалий, взвешивают в асептических условиях и разбавляют предварительно восстановленным и разбавленным в 4 раза раствором Рингера с добавкой цистеин-гидрохлорида в количестве 0,3 г/л.

Подсчет бифидобактерий и бактероидов Fragilis в предварительно восстановленных средах Рингера и ВВЕ, непосредственно засеянных и инкубируемых в анаэробных условиях.

Для исследования спор Clostridium:

- суспензии нагревают 10 мин при 75°С и высевают на гелозе Columbia с добавкой глюкозы (5 г/л) и цистеингидрохлорида (0,3 г/л), после чего инкубируют в течение 5 дней,

- колонии Clostridium определяют по их морфологии и отрицательной реакции на каталазу. Клеточную морфологию определяют после окрашивания Gram 3.

Результаты, полученные с контрольным молочным препаратом, засеянным CNCM I-2219 и немедленно использованным для кормления мышей, представлены в приведенной ниже Таблице I (время контакта=0).

Таблица I
	Т=0	Т=7 суток	Т=15 суток
Бифидобактерии	8,2±0,3	9,3±0,1	8,6±0,1
Бактероиды Fragilis	7,2±0,5	9,3±0,1	9,2±0,1
Clostridium	4,3±0,1	5,1±0,5	6,7±0,3

Результаты выражены в логарифмах и означают средние результаты на 6 мышах; отмечают значительное увеличение бактероидов Fragilis и Clostridium, откуда возникает риск инфицирования.

Результаты, полученные с молочным препаратом по изобретению, засеянным CNCM I-2219 и оставленным в контакте с ним в течение 8 час при 37°С, представлены в приведенной ниже Таблице II.

Таблица II
	Т=0	Т=7 суток	Т=15 суток
Бифидобактерии	7,1±0,1	11±0,5	10,3±0,8
Бактероиды Fragilis	8±0,2	7,9+0,3	но <4,7 дg
Clostridium	3,9±0,3	4,4±0,2	4 (1 мышь) у 5 других 0
C.Perfringens	3,7±0,9	но	но
но=не определено

Через 15 суток после введения препарата отмечают, по сравнению с контролем, увеличение бифидобактерий на 2,5 порядка и значительное уменьшение бактероидов и Clostridia.

Исследования на мышах с единственной монокультурой

Clostridium perfringens

Цель: проверить влияние соответствующих изобретению продуктов на распространение кишечных бактерий в разных органах.

Условие эксперимента: бактериально-стерильные мыши (возраст - 8 недель), содержащиеся в стерилизованном изоляторе, получающие стерилизованный облучением корм на основе RО3.

Протестированные продукты:

- стерилизованная автоклавированием сверхчистая вода,

- стерилизованная автоклавированием сверхчистая вода, к которой добавлен соответствующий изобретению препарат в количестве 14 г (порошка) на 100 мл воды.

Эти растворы приготовляют ежедневно в стерильных условиях и предлагают мышам ad libitum в течение 6 суток. В конце этого периода С.perfringens штамм LAB (из кишечника человека) засевают в количестве 10^3,5-10^4,5 клеток на мышь. Измеряют приживление и распространение Clostridium perfringens в лимфоидных органах, забивая по две мыши из каждой партии через 24 час, 48 час, 4 дня и 7 дней после посева. Подсчеты производят по методу наиболее достоверного значения на трех пробирках в среде LS (инкубация при 46°С в течение 24-28 час).

Результаты представлены в приведенной ниже Таблице III.

Таблица III
	День 1	День 2	День 4	День 7
	ппи	вода	ппи	вода	ппи	вода	ппи	вода
Подвздошная кишка проксимальная часть	2	2	0	1	0	2	2	2
Срединная часть	2	0	0	1	0	2	2	2
Дистальная часть	2	0	0	1	0	2	2	2
Слепая кишка	2	0	0	2	1	2	2	2
Ободочная кишка	2	2	0	2	2	2	2	2
Бляшка пееровая	1	1	0	0	1	2	2	2
Брыжеечный узел	0	2	0	0	1	2	1	2
Бактериемия	0	0	0	0	0	0	0	0
Селезенка	0	1	0	2	0	2	1	2
Печень	0	0	0	0	1	2	2	2
Почка	0	1	0	2	1	2	1	2
Легкое	0	0	0	0	0	0	0	0
ппи - продукт по изобретению

Пояснения к Таблице III:

0 - слабое внедрение/диссеминация

1 - среднее внедрение/диссеминация

2 - значительное внедрение/диссеминация

Отмечается:

- задержка внедрения С. perfringens на 24 часа после введения продукта по изобретению;

- слабое внедрение в лимфоидные органы у мышей, потреблявших продукт по изобретению.

Эти результаты показывают, что продукты по изобретению регулируют диссеминацию Crostridium perfringens в лимфоидных органах.

1. Штамм Bifidobacterium breve CNCM 1-2219, обладающий иммуностимулирующим действием.

2. Способ получения иммуностимулирующего молочного продукта, предусматривающий проведение биоконверсии молочного субстрата с помощью культуры штамма Bifidobacterium по п.1 путем осуществления контакта молочного субстрата с этой культурой в условиях, при которых закисление среды указанной культурой не превышает 0,5 единицы рН за 8 ч инкубации при исходном засеве от 1·10⁷ до 5·10⁷ клеток в 1 мл.

3. Способ по п.2, в котором молочный субстрат вводят в контакт с культурой штамма Bifidobacterium при концентрации от 1·10⁷ до 1·10⁹ клеток на 1 мл молочного субстрата, а конечная популяция Bifidobacterium по завершении биоконверсии составляет от 1·10⁵ до 1·10⁹ клеток на 1 мл продукта.

4. Способ по п.2 или 3, в котором рН молочного субстрата при введении его в контакт с культурой штамма Bifidobacterium составляет 6,3-7, а рН продукта по завершении биоконверсии составляет 6-7.

5. Способ по любому из пп.2-4, отличающийся тем, что время контакта между молочным субстратом и указанными бактериями составляет 6-24 часов.

6. Молочный продукт, полученный способом по любому из пп.2-5.

7. Молочный продукт по п.6, отличающийся тем, что его рН составляет 6-7.

8. Молочный продукт по п.6 или 7, отличающийся тем, что он дегидратирован и/или стерилизован.

9. Молочный продукт по п.8, отличающийся тем, что он восстановлен путем добавления воды.

10. Молочный продукт по п.8 или 9,отличающийся тем, что он имеет рН 6-7,5.