Антитела к антигену эпителиальных опухолей желудочно-кишечного тракта человека, родственному альфа 6 бета 4 интегрину
Изобретение относится к области иммунобиотехнологии и может быть использовано в медицинской практике. Описано антитело или его производное, или его фрагмент, имеющие структуру, связывающую структуру мишени. Антитело расположено внутри и на поверхности опухолевых эпителиальных клеток желудочно-кишечного тракта человека и в субпопуляции нормальных эпителиальных клеток желудочно-кишечного тракта. Указанные связывающие структуры включают в себя последовательности определяющей комплементарность области (CDR) в легкой цепи, содержащие в основном аминокислоты под номером 23-33 (CDR1), 49-55 (CDR2), 88-98 (CDR3) аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:2, и последовательности CDR в тяжелых цепях, содержащие в основном аминокислоты под номером 158-162 (CDR1), 177-193 (CDR2), 226-238 (CDR3) аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:2, или другие связывающие структуры с подобными уникальными связывающими свойствами. Также описана структура-мишень, расположенная внутри или на поверхности опухолевых клеток: вакцинная композиция, предназначенная для лечения злокачественного заболевания у человека, содержащая вышеупомянутое антитело. Описаны также способы лечения и диагностики злокачественного заболевания. Использование изобретения позволяет получать антитела, которые облегчают идентификацию новых фенотипспецифических антигенов, связанных с опухолью, и прогнозировать и лечить метастатические заболеваний человека. 12 н. и 25 з.п. ф-лы, 8 ил., 4 табл.
Настоящее изобретение относится к антителу или его производному, или его фрагменту, имеющему структуру, связывающую структуру мишени, находящейся на клеточной поверхности и в клетках эпителиальных опухолей желудочно-кишечного тракта человека и в субпопуляции нормальных эпителиальных клеток желудочно-кишечного тракта; и к структурам-мишеням, находящимся в опухолевых клетках или на их поверхности; к вакцинным композициям; к фармацевтическим композициям; а также к способам, относящимся к злокачественным заболеваниям человека.
ОСНОВА ИЗОБРЕТЕНИЯ
Хирургия является основным способом лечения колоректального рака, приводящим к выживанию в течение пяти лет в 90-40 процентах случаев в зависимости от стадии развития опухоли от А до С по [классификации] Dukes. Традиционная дополнительная терапия, которая включает в себя радиационную и химиотерапию, способна снизить скорость наступления смерти еще приблизительно на 30% (1). Несмотря на эти достижения, рак ободочной кишки является основной причиной смерти среди раковых заболеваний человека. Широко предпринимались попытки иммунологического лечения. Однако рак ободочной кишки обычно устойчив к иммунотерапии и, как полагают, обладает низкой иммуногенностью. Больные с раком ободочной кишки не поддаются ни IL-2 лечению, ни лечению, связанному с адоптивным переносом культивируемых in vitro лимфоцитов, инфильтрирующих опухоль, которые в других случаях обладают другой активностью у больных с иммуногенными злокачественными заболеваниями, такими как меланома. Тем не менее наиболее обнадеживающими являются сообщения Riethmuller и др. о 32-процентном снижении скорости наступления смерти в течение семи лет для колоректального рака Dukes на стадии С при лечении после резекции первичной опухоли чистыми мышиными mAb, направленными против опухоли и против связанного с нормальным эпителием антигена (Ер-САМ)(2), показывающие, что другие иммунотерапевтические методики могут быть эффективны.
Значительное усовершенствование методов дополнительной иммунотерапии и лечения более поздних стадий рака требует более сильных эффекторных механизмов, чем обеспечивают чистые mAb. В принципе, повышенная эффективность должна быть связана с повышенной избирательностью антитела в отношении опухоли-мишени.
Ограниченное количество антигенов, связанных с раком ободочной кишки, обнаружено с использованием гибридомы, продуцирующей мышиные mAb в результате ксеногенной иммунизации опухолями человека (3).
Можно ожидать, что использование обширной библиотеки распределения фагов для идентификации новых связанных с опухолью антигенов, значительно убыстрит процесс обнаружения молекул-мишеней, пригодных для опухолевой иммунотерапии и диагностики. Такая идентификация молекул-мишеней может быть осуществлена путем отбора и скрининга библиотеки фаговых антител на культивируемых опухолевых клетках и тканевых срезах для получения специфических реагентов, определяющих in vitro и in vivo экспрессируемые антигены (4). Создана технология размещения фагов, как эффективный инструмент для производства моноклональных антительных реагентов для различных очищенных антигенов, и в нескольких исследованиях описаны конструкция и успешная селекция, полученная на основе иммунных, интактных и синтетических библиотек фаговых антител (5).
Неиммунные библиотеки удобны с точки зрения возможности их обычного использования, что снимает необходимость в уникальных библиотеках для каждой отдельной мишени. С другой стороны, достаточно большие и высококачественные неиммунные библиотеки создают трудности для конструирования, и процесс обнаружения мишени с использованием этих библиотек должен требовать эффективных способов исключающего отбора на основе комплексных антигенов.
В настоящее время создана библиотека фагов более умеренного размера от человекообразных приматов, иммунизированных комплексными человеческими антигенами. Такой подход создает преимущества предварительной селекции репертуара in-vivo. Подобные библиотеки должны обогащаться с позиций специфичности в отношении опухолеспецифических эпитопов в сниженной фоновой реактивности в отношении ксеногенных антигенов (6). Кроме того, в отличие от мышиных, антитела приматов с последовательностью, в высокой степени гомологичной человеческим антителам, не должны быть иммуногенны для человека (7).
В настоящее время определены новые антитела приматов из библиотеки фагов, которые определяют избирательно экспрессируемые антигены, связанные с раком ободочной кишки. Терапевтический потенциал, продемонстрированный путем опосредованного Т-клетками уничтожения культивированных клеток рака ободочной кишки, покрытых двумя из этих конденсированных антител, слитых со сконструированными суперантигенами, сравним с таковым суперантигенов, слитых с мышиными Fab фрагментами, специфичными в отношении антигенов, связанных с раком ободочной кишки, таких как ЕР-САМ, для которых ранее было установлено наличие терапевтических свойств в экспериментальных системах (8).
Также предлагается способ эффективного положительного и исключающего клеточного отбора фаговых антител, которые должны облегчить в будущем идентификацию новых фенотипспецифических антигенов, включая антигены, связанные с опухолью, с использованием антител из обширных фаговых библиотек.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится в первом аспекте к антителу или к его производному, или к его фрагменту, имеющим структуру, связывающую структуру мишеней, расположенных на поверхности или внутри клеток гастроинтестинальной эпителиальной опухоли желудочно-кишечного тракта человека и в субпопуляции нормальных эпителиальных клеток желудочно-кишечного тракта человека, причем указанная связывающая структура включает в себя последовательность определяющей комплементарность области (CDR) в легкой цепи, содержащие в основном аминокислоты 23-33 (CDR1), 49-55 (CDR2), 88-98 (CDR3) аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:2, и последовательности CDR в тяжелой цепи, содержащие в основном аминокислоты 158-162 (CDR1), 177-193 (CDR2), 226-238 (CDR3) последовательности аминокислот, показанных в SEQ ID NO:2, или другие связывающие структуры с подобными уникальными связывающими свойствами.
В одном воплощении антитело представляет собой отобранный фаг. В другом воплощении последовательности происходят от Масаса fascicularis. Еще один аспект изобретения связан с производным указанного антитела человеческого происхождения. Последовательность предпочтительно по меньшей мере на 84% идентична соответствующим последовательностям человеческого происхождения. Предпочтительно антитело имеет низкую иммуногенность или отсутствие имуногенности для человека.
Еще в одном воплощении антитело дериватизировано в результате генетического связывания с другими полипептидами и/или путем химической конъюгации с органическими или неорганическими химическими молекулами, и/или путем ди-, олиго- или мультимеризации.
Еще в одном воплощении указанное антитело является генетически связанным или химически конъюгированным с цитотоксическими полипептидами или с цитотоксическими органическими или неорганическими полипептидами или с цитотоксическими органическими или неорганическими химическими молекулами.
Еще в одном воплощении указанное антитело является генетически связанным или химически конъюгированным с биологически активными молекулами.
Еще в одном воплощении указанное антитело является генетически связанным или химически конъюгированным с иммуноактивирующими молекулами.
В другом воплощении указанное антитело изменено для повышения или снижения его авидности и/или сродства.
Еще в одном воплощении указанное антитело изменено для повышения выхода при его продукции.
Еще в одном воплощении указанное антитело изменено для воздействия на его фармакокинетические свойства.
Еще в одном воплощении указанное антитело изменено для получения новых фармакокинетических свойств.
Еще в одном воплощении указанное антитело является меченным, и его связывание подавляется немеченной формой указанного антитела, а не другими связывающими структурами, при этом не подавляя связывания других связывающих структур, имеющих другую специфичность.
Еще одно воплощение представляет собой антитело, связывающая структура которого распознает невосстановленную форму α6β4-интегрина.
В другом аспекте изобретение относится к структурам-мишеням, расположенным в опухолевых клетках или на их поверхности, причем указанные структуры мишени
a) обладают способностью специфически блокироваться и специфически блокировать связывающую структуру антитела, как определено в любом из пунктов 1-14, и другие связывающие структуры со сходной специфичностью связывания,
b) расположены в эпителиальных клетках желудочно-кишечного тракта человека или на их поверхности,
c) имеют существенную степень гомологии с α6- и/или β4-интегриновыми цепями или их вариантами, представляющими собой широко распространенный или уникальный эпитоп,
d) являются высоко экспрессируемыми в высокой степени на поверхности опухолевых клеток, и
е) являются мишенью для цитотоксических эффекторных механизмов.
В данном контексте выражение "существенная гомология" означает гомологию в тех частях структуры-мишени, которые являются подходящими для связывания антитела.
В одном воплощении указанной структуры-мишени связывающая структура является меченной, и ее связывание ингибируется немеченой формой указанной связывающей структуры, а не другими связывающими структурами, и не подавляет связывание других связывающих структур, имеющих другую специфичность связывания.
Еще в одном воплощении указанной структуры-мишени указанная связывающая структура содержит одну или более из последовательностей области, определяющей комплементарность (CDR), включающих в себя в основном аминокислоты номер 23-33, 49-55, 88-98, 158-162, 177-193, 226-238 последовательности аминокислот SEQ ID NO: 2, или другие связывающие структуры со сходными уникальными связывающими свойствами.
Еще в одном воплощении указанной структуры-мишени указанной связывающей структурой является антитело, которое еще в одном воплощении содержит вариабельную область легкой цепи, включающую в себя в основном аминокислоты номер 1-109 последовательности аминокислот SEQ ID NO: 2, и вариабельную область тяжелой цепи, включающую в себя в основном аминокислоты номер 128-249 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2.
Указанная структура-мишень еще в одном воплощении экспрессируется гомогенно в эпителиальных клетках ободочной кишки человека и в меньшей степени - в клетках протока поджелудочной железы и желчного протока.
Еще в одном воплощении экспрессия указанной структуры-мишени коррелирует с дифференцировкой желудочно-кишечного эпителия.
В другом воплощении указанная структура-мишень включает в себя последовательность аминокислот α6β4-интегрина, α6-часть которой показана в SEQ ID NO: 3, а β4-часть приведена в SEQ ID NO: 4. Другое воплощение структуры-мишени включает в себя гомо- или гетеромономеры или гомо- или гетеромультимеры указанного α6β4-интегрина и/или указанных одного или более фрагментов и/или субъединиц. Предпочтительно указанные структуры-мишени имеют кажущийся молекулярный вес в своей невосстановленной форме от 90 до 140 кДа, более предпочтительно - от 80 до 160 кДа.
Еще в одном воплощении структура-мишень включает в себя пептид или полипептид(ы), содержащие в основном последовательности аминокислот, приведенные в SEQ ID NO: 5-51, или содержит молекулу, образующую комплекс с указанным(и) полипептидом(ами).
В том случае, когда структура-мишень включает в себя последовательность аминокислот из α6β4-интегрина, еще в одном воплощении указанная структура-мишень может кроме того распознаваться, исключительно или нет, в своей не восстановленной форме с помощью связывающей структуры, включенной антителом, как определено выше.
Еще в одном аспекте изобретение относится к субстанции, которая связывается со структурой-мишенью, как определено выше, которая представляет собой органическую химическую молекулу или пептид. В одном воплощении указанная субстанция является анти-идиотипом указанной структуры-мишени. Указанный анти-идиотип может быть специфически блокирован и может специфически блокировать связывающую структуру, имеющую сходную специфичность связывания указанной структуры-мишени.
Еще в одном аспекте изобретение относится к субстанции, которая блокирует функцию структуры-мишени, как определено выше, являющейся органической молекулой или пептидом.
В другом аспекте изобретение относится к связывающей структуре, которая распознает структуру-мишень, как определено выше, и которая имеет органическую химическую природу.
Еще в одном аспекте изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей в качестве активного начала антитело, как определено выше, или структуру-мишень, как определено выше, или субстанцию, как определено выше.
Еще в одном аспекте изобретение относится к вакцинной композиции, содержащей в качестве активного начала abn антитело, как определено выше, или структуру-мишень, как определено выше, или субстанцию, как определено выше.
Еще в одном аспекте изобретение относится к способу терапии для лечения состояний, в основе которых лежит анти-ангиогенный механизм, где человеку вводится антитело, определяемое выше, или структура-мишень, определяемая выше, или субстанция, определяемая выше.
В другом аспекте изобретение относится к способу лечения метастатических заболеваний человека, где человеку вводится определяемое выше антитело.
Еще в одном аспекте изобретение относится к способу проведения in vitro гистопатологической диагностики и определения прогноза злокачественного заболевания человека, где образец контактирует с антителом, определяемым выше, и с индикатором.
Воплощения указанного способа включают в себя определение типа опухоли, скрининг опухоли, диагноз и прогноз, а также контроль предраковых состояний.
Еще в одном аспекте изобретение относится к способу проведения in vitro диагностики и определения прогноза злокачественных заболеваний человека, где исследуется концентрация антигена в жидкостях организма, включая структуру-мишень, определяемую выше, или анти-идиотип указанной структуры-мишени, определяемой выше.
Еще в одном воплощении изобретение относится к способу проведения in vitro диагностики и определения прогноза злокачественных заболеваний человека, где исследуются концентрации определяемых выше антител в жидкостях организма.
Еще в одном аспекте изобретение относится к способу проведения in vitro диагностики и определения прогноза злокачественных заболеваний человека, где исследуется концентрация в жидкостях организма комплекса а) антигена, включающего в себя структуру-мишень, определяемую выше, или анти-идиотип указанной структуры-мишени, определяемой выше, и b) антитела, определяемого выше.
Еще в одном аспекте изобретение относится к способу проведения in vitro диагностики и определения прогноза злокачественных заболеваний человека, где определяется локализация антитела, определяемого выше, относительно расположения опухоли у человека. Указанное антитело предпочтительно вводится субъекту перед определением. В одном воплощении указанное антитело накапливается в опухолевой ткани. Еще в одном воплощении указанный способ является количественным.
Другой аспект изобретения относится к способу лечения злокачественных заболеваний человека, где человеку вводится антитело, определяемое выше. В одном воплощении этого способа названое антитело модифицируется путем генетического связывания с молекулой, что дает измененные фармакокинетические свойства комбинированной молекулы. В другом воплощении указанное антитело заменено на его производное.
Подробное описание изобретения
Идентификация новых связанных с опухолью антигенов (ТАА) является основным моментом для развития в области иммунотерапии и диагностики опухолей. В связи с настоящим изобретением были впервые разработаны на основе проточной цитометрической оценки и использовании мини-библиотеки, состоящей из клонов специфических антител, связанных с различными маркерами устойчивости к антибиотикам, способы положительного и исключающего отбора фаговых антител, с использованием интактных клеток в качестве источника антигенов. scFv библиотека фагов (2,7×107) сконструирована у приматов (Масаса fascicularis), иммунизированных пулом карцином ободочной кишки человека. Эта библиотека выбрана путем трехкратного проведения связывания с Соlо205 клетками аденокарциномы ободочной кишки, и протеолитической элюции, с последующей амплификацией фагов.
Несколько антител, взаимодействующих с карциномой ободочной кишки и с ограниченной реакционной способностью в отношении нескольких типов нормальных эпителиальных тканей, идентифицировали с помощью иммуногистохимиии. Один клон, A3 scFv, распознавал эпитоп, который был гомогенно экспрессирован в 11 из 11 исследованных карцином ободочной кишки и в 4 из 4 исследованных карцином поджелудочной железы, при этом его экспрессия в нормальных тканях ограничивалась подтипами эпителия желудочно-кишечного тракта. A3 scFv обладал кажущейся общей аффинностью, примерно в 100 раз более высокой, чем A3 Fab, что указывает на связывание scFv гомодимеров. Плотность A3 эпитопов на клеточной поверхности, подсчитанная на основании Fab связывания, была исключительно высокой, приблизительно 3 миллиона на клетку.
Также описано эффективное опосредованное Т-клетками уничтожение раковых клеток ободочной кишки, покрытых As scFv, слитых с суперантигеном мутантной SEA (D227A) с низким сродством к МНС класса II. Идентифицированная A3 молекула, таким образом, представляет собой ТАА-молекулу со свойствами, которые позволяют предложить использование в иммунотерапии рака ободочной кишки и поджелудочной железы.
ОБСУЖДЕНИЕ
В связи с настоящим изобретением разработана эффективная схема отбора фагов из обширной библиотеки фагов для использования в идентификации фрагментов антител, специфичных для определяемого фенотипа клеток. Мишеневая специфичность для представленного в примерах использования была представлена для антигенов, связанных с опухолью ободочной кишки.
Сначала анализировали частоту поверхностного слитого протеина распределения pIII-scFv в популяции фагов, используя присутствующую здесь фагмидную конструкцию для распространения фага. Достигается более высокий уровень расположения С215 scFv по сравнению с предыдущими сообщениями. Это должно благоприятно сказываться на эффективности исключающего отбора, а также повышать вероятность авидного отбора из библиотек антител с низким аффинитетом.
С очевидностью продемонстрирована специфичность связывания С215 scFv фага с клетками Соlо205 аденокарциномы ободочной кишки. Связанный фаг может быть эффективно элюирован с использованием протеазы Genenase, которая специфически расщепляет последовательность-мишень между фаговым протеином III и scFv антителом, оставляя после элюации клетки интактными. Этот способ нехимической элюции должен с одинаковой эффективностью элюировать как фаговые антитела независимо от их связывающего сродства, так и только фаг, связанный scFv связями, добавляя к специфичности процесса.
Обогащение, достигаемое после трех кругов отбора на Сlоn205-клетках (500 000х) с использованием этой схемы отбора, подобно обогащению, описанному другими авторами для отбора комплексных антигенов.
После подтверждения выполнения различных методологических шагов к отбору библиотеки применялась комбинированная методика с использованием Соlо205 клеток.
Библиотеку конструировали из видов человекообразных, иммунизированных опухолями человека. Пул антител, полученный таким путем, возможно включает в себя аффинно зрелые антитела к опухолеспецифичным антигенам с ограниченным фоном ксено реактивности к широко распространенным нормальным антигенам тканей человека (6). Идентифицированные антитела распознавали антигены опухоли и тканевой дифференцировки с ограниченным распределением нормальных тканей. Все отобранные антитела, идентифицированные как реактивные при первичном скрининге в отношении ткани рака ободочной кишки, также взаимодействуют с жизнеспособными клетками Соlо205 в проточной цитометрии. Это ограничение специфичности клеточной поверхности должно отражать процесс отбора, а не состав библиотеки, если для иммунизации используется суспензия смеси компонентов опухолевой ткани.
В подобном предыдущем исследовании вне- и внутриклеточную специфичность идентифицировали в антимеланомной библиотеке, полученной таким же путем и отобранной с использованием тканевых срезов в качестве источника антигена (4). Тканевые срезы резецированных колоректальных опухолей и нормальной ободочной кишки человека (помещенных в одну и ту же лунку) использовали для первичного скрининга, используя иммуногистохимию, чтобы гарантировать клиническое соответствие выбранных специфичностей для повышения эффективности и для получения более качественной информации по сравнению со скринингом методом проточной цитометрии.
Отобранные антитела можно было классифицировать в четыре антителоспецифические группы, отличающиеся по характеру реактивности к эпителию различных органов (смотри пример 1, таблица 1). Среди этих групп специфичности A3scFv определяла большинство из отобранных опухолевых антигенов. Такой A3 ТАА был в высокой степени гомогенно и часто экспрессирован в образцах первичного и метастатического рака ободочной кишки и рака поджелудочной железы. Более того, уровень его экспрессии на клеточной поверхности, определяемый с помощью слитого протеина A3 Fab (3 миллиона эпитопов/клетку), был исключительно высоким и доступным для опосредованных клеточной поверхностью цитотоксических эффектов.
Немногие, если вообще таковые есть, из определяемых часто экспрессируемых опухолевых антигенов человека являются опухолеспецифичными, они обычно относятся к тканевой дифференцировке, как например A3 и Ер-САМ. Однако повышенная экспрессия этих антигенов в опухолях должна обеспечить основу для терапевтически активного интервала доз. Доступность поступления из циркуляции нормальных тканевых компартментов, экспрессирующих антиген, может также быть более ограниченной в результате ограниченной капиллярной проницаемости и локализации их экспрессии в организме (например, экспозиция апикальной стороны эпителиальных клеток кишки для циркулирующих антител должна быть очень ограничена).
Клинический опыт с пан-эпителиальными Ер-САМ-реактивным 17-1A-mAb подтверждает возможность идентификации эффективной нетоксичной дозы антител. Ограниченная экспрессия в эпителии всех отобранных в этой работе клонов scFv указывает на то, что эти клоны можно принципиально расценивать как кандидаты для иммунотерапевтического применения, аналогично 17-1А, например, как полномерные mAb. Однако особое преимущество A3 ТАА по сравнению с Ер-САМ состоит в отсутствии экспрессии в большинстве видов нормального эпителия, такого как эпителий легких и почек, хотя экспрессия в ободочной кишке такая же.
Тканевое распределение подтипов нормального эпителия поддерживается избирательной экспрессией в подтипах карцином, происходящих из желудочно-кишечного тракта (смотри пример 2, таблица 2).
Несколько из ранее хорошо известных антигенов, ассоциированных с раком ободочной кишки (СЕА, СА50, СА19-9, СА242, Tag-72) (3), по сравнению с А3-эпитопом, равным образом или несколько ограниченно экспрессируются в нормальных тканях. Однако в отличие от A3 и С213 Ер-САМ они более гетерогенно экспрессированы в опухолях.
Использование антител к Ер-САМ давало хорошие клинические результаты, включая преимущество в выживании у больных с раком ободочной кишки, при проведении адъювантной терапии. Чтобы вызвать опухолевый ответ даже у больных с более поздней стадией, можно ввести сильные эффекторные молекулы в сочетании с этим антителом, что вызовет "устойчивость нормальной ткани", наблюдаемую при лечении чистым 17-1А mAb. В доклинических исследованиях это можно было изучить на модельных системах, используя токсин-конъюгированные антитела, специфичные в отношении мышиной версии этого антигена, или на животных, трансгенных для антигенов, связанных с раком ободочной кишки человека.
Ранее иммунотоксины антител успешно использовались для лечения мышей в моделях с метастатически растущими опухолями, экспрессирующими ксено (человеческие) опухолевые антигены не экспрессируемые в тканях мышей (10). Однако использованные ТАА являются действительно опухолеспецифичными, и модели не отражают потенциальной токсичности в отношении нормальной ткани-мишени.
В предыдущих исследованиях авторы сообщали о возможных суперантигенах в качестве иммуностимуляторных токсинов для опухолевой иммунотерапии (8). Опосредованное антителом нацеливание суперантигенов привлекало большое число цитотоксичных и цитокин-продуцирующих Т клеток к участку расположения опухоли. Суперантиген SEA (D227A), мутированный с целью приобретения низкой аффинности связывания МНС класса II был генетически связан с нацеленными на опухоль антителами. Этот "опухолеселективный" агент применяли к молодым Т-клеткам, независимо от экспрессии МНС в опухоли, таким образом уменьшая проблемы, связанные с МНС регулирования и полиморфизмом, которые являются значительным препятствием для других активных иммунотерапевтических подходов.
Мини-библиотека полученных клонов антител "опухолеселективного", 1F scFv-фага, "широкореактивного" С215-фага, и неспецифического D1.3-фага явилась существенной основой для разработки схемы эффективного исключающего отбора. Требование этого исключающего правила состоит в том, что за отрицательным выбором следует "спасение" фага и амплификация, благодаря высокой частоте не распределенных фаговых частиц. Альтернативно, не распределенный фаг можно сделать незаразным путем избирательного протеолиза (G. Winter, pers. Comm.). Подобная методика дает возможность создания "инертных библиотек", то есть библиотек, которые предварительно отобраны путем экстенсивно отрицательной селекции (например, по отношению к клетке в состоянии покоя или способной к трансфекции родительской клетке).
В заключение, "нежелательная" модель фаговой специфичности может быть избирательно исключена из популяции фагов приблизительно с коэффициентом 100 в каждом цикле отбора. Дальнейший исключающий отбор с помощью разработанной схемы в сочетании с использованием большой неиммунной библиотеки фагов для идентификации антигенов, дифференциально экспрессируемых на клеточной поверхности, покажет, окажется ли такой подход лучше стратегии, которую использовали авторы изобретения в этом исследовании, то есть положительный отбор с использованием in vivo пре-селективного иммунного репертуара, включая ограничения и смещения, такие как иммунодоминирование (4). Низкое сродство и высокая плотность эпитопов, показанные в случае связывания A3 Fab с опухолевыми клетками, по сравнению со слитым протеином A3 scFv, предполагает образование scFv-мультимеров, которые взаимодействуют с эпитопами, которые образуют кластеры на поверхности клеток. Следует разработать одновалентные варианты A3 Fab с более высоким сродством или - альтернативно стабильные двухвалентные конструкции, такие как полноразмерные привитые mAb A3 Fv, сравнимые с A3 с предполагаемой низкой иммуногенностью. Такие конструкции будут подходящими для нацеливания соответствующих эффекторных молекул на эти экспрессируемые в большом количестве антигены, ассоциированные с опухолями желудочно-кишечного тракта.
Далее изобретение иллюстрируется следующей неограничивающей экспериментальной частью описания.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Материалы и методы
Животные
Обезьян cynomolgus Macaque (Macaca fascicularis) содержали и иммунизировали в шведском Институте Контроля Инфекционных Заболеваний (SIIDC), Стокгольм. Воду и питье животные всегда получали ad libitum. Четырех обезьян иммунизировали подкожно 2 мл неочищенной суспензии тканей рака ободочной кишки в 10% нормальной сыворотке в PBS. Усиливающие дозы вводили на 21, 35 и 49 дни. Антительные ответы были получены у двух обезьян, где антиген смешивали с адъювантом, содержащим квасцы. Всех животных содержали в соответствии со шведским законодательством, и эксперименты были одобрены местным этическим комитетом.
Ткани и клетки
Образцы опухолей и нормальных тканей человека получали из Национального университетского госпиталя Главного госпиталя Malmö, Швеция. Колоректальные клетки человека линии Соlо205, В клетки лимфомы человека линии Raji и мышиную клеточную линию В16 меланомы получали из американской коллекции культур тканей (АТСС, Rockville, MD). Клетки меланомы мыши В16-С215+ подвергают трансфекции вектором экспрессии pKGE839, содержащим ген Ер-САМ-1 (С215), описанный ранее (9).
Клетки человека культивировали в среде RPMI1640 (Gibco, Middlesex, UK), снабженной 10% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сывороткой (Gibco) и 0,1% мг/мл гентамицинсульфата (Biological Industries, Kibbutz Beit Haemek, Israel). Мышиные клетки культивировали в среде, дополненной 1 мМ глутамина (HyClone, Cramlington, UK), 5×10-5 M β-меркаптоэтанола (ICN, Costa Mesa, CA), 0,2% NaHCO3 (Seromed Biochrome, Berlin, Germany), 1 × 10-2 M HEPES (HyClone, UT) и 1 × 10-3 M пирувата натрия (HyClone). Клетки повторно тестировали на загрязнение микоплазмой с помощью теста генной пробы Mycoplasma Т.С. (San Diego, CA).
Фагмидный вектор и конструирование библиотеки фагов
Общую РНК селезенки экстрагировали у одной из отвечающих обезьян, используя набор для выделения РНК из Promega (Mannheim, Germany), и кДНК амплифицировали, используя набор для ПЦР РНК от РЕ Biosystems (Стокгольм, Швеция). Праймеры для синтеза кДНК генов легких цепей лямбда и тяжелых цепей и для объединения этих генов в scFv-гены были опубликованы ранее (4). scFv-кДНК лигировали в фагмидный вектор (4) при слиянии с остатками 249-406 М13 гена III. scFv-gIII-ген экспрессировали из промотора phoA, и полученный в результате протеин направлялся теплостабильным сигнальным пептидом токсина II Е. Coli.
Повторная электропорация 7 мкг библиотеки векторов со вставками гена scFv приводит к первичному росту в количестве 2,7×107 трасформированных Е. Coli TG-1 в виде колоний на минимальных агаровых плашках. Колонии снимали с плашек и растили в 2×YT при 150 об/мин и 37°С в течение 1 часа.
Культуру суперинфицировали хелперным фагом М13К07 (Promega) в 50-кратном избытке. Добавляли ампициллин до концентрации 100 мг/л и культуру растили еще в течение часа. После добавления канамицина до концентрации 70 мг/л культуру растили в течение 15 часов при 30°С и 250 об/мин. Фаговые частицы собирали из культурального супернатанта путем двух повторных PEG/NaCl осаждений. Осажденный фаг растворяли в PBS с 1% БСА.
Вестерн-блоттинг
Серии двукратного разведения scFv-С215-частиц фага (из неразведенного исходного ПЭГ-осажденного/концентрированного фага) наносили для разделения на восстанавливающий 12% полиакриламидный гель с 1% и 2% β-меркаптоэтанолом. Затем протеин с помощью электрофореза переносили на нитроцеллюлозную мембрану (Bio-Rad, Hercules, CA). Мембрану блокировали 5% молоком с низкой жирностью (Semper АВ, Стокгольм, Швеция) а затем инкубировали с кроличьей антисывороткой против пептидной последовательности AEGDDPAKAAFNSLQASATEC, полученной из протеина III, конъюгированной с гемоцианином молюска блюдечко. Вторичные конъюгированные с пероксидазой хрена (HRP) козьи антикроличьи антитела (Bio-Rad) инкубировали в течение 30 минут. Между любыми этапами мембрану промывали 3 раза в течение 5 минут в PBS/0,5% Твин 20. Мембрану инкубировали в субстрате (Amersham Pharmacia Biotech, Little Chalfon Buckinghamshire, UK) в течение 1 минуты. Светочувствительную пленку (ECL hyperfilm, Amersham) экспонировали на мембране и выдерживали в течение 0,5-5 мин.
Таким же образом, для анализа целостности очищенного Fab (A3, включая cynomolgus CH1 и С-лямбда домены), scFv- и Fab (включая мышиный CH1 м С-каппа) -SEA (D227A) слитых протеинов (полученных, как описано ранее (9)), предпринимали 12% SDS-PAGE. Мембраны с перенесенными протеинами инкубировали с очищенными поликлональными кроличьими анти-SEA-антителами с последующими стадиями обработки, описанными выше.
Выбор модели и библиотеки фагов на клетках
Суспензии фагов библиотеки легкой цепи лямбда (или модели фага), 1012 в 100 мкл PBS/1% БСА инкубировали с 3 миллионами Соlо205 клеток в течение 1 часа на льду. Клетки промывали 3 раза, включая 10-минутную инкубацию с использованием 2 мл PBS/1% БСА для каждого промывания. Фаг элюировали, добавляя 50 мкл 33 мкг/мл гененазы (Genenase) к клеточному осадку, и инкубовали в течение 15 минут. Гененаза, которая представляет собой мутант BPN- субтилизина, S24C/H64A/E156S/G169A/Y217L, была любезно предоставлена Dr. Paul Carter (Сан-Франциско, СА). После центрифугирования супернатант переносили в новую пробирку и добавляли 250 мкл 1% БСА в PBS. Для "спасения" и амплификации отобранной библиотеки (и модели частиц фага в многоразовом эксперименте) элюированным фаговым частицам позволяли заражать 1 мл Е. coli DH5αF' (OD600нм=1,0). Зараженную бактериальную культуру разбавляли в 100 раз средой 2×YT, обогащенной подходящим антибиотиком, и культивировали до OD>1,0 (вплоть до 2 дней).
Наконец, для получения растворимого scFv амбер-супрессорный штам НВ2151 Е coli инфицировали библиотекой, отобранной из второго и третьего цикла. После роста на агаровых планшетах, содержащих ампициллин, единичные колонии культивировали в 96-луночном микропланшете в 2×YT среде, дополненной ампициллином, при 30°С в течение 17 часов. После центрифугирования, удаления супернатанта, к которому добавляли равный объем PBS/1% БСА, отдельные scFv анализировали на иммунореактивность по отношению к срезам опухолевых и нормальных тканей человека. Вкратце, С-концевую метку ATPAKSE определяли, используя кроличью антисыворотку, а затем биотинилированные козьи антикроличьи антитела (DAKO A/S, Копенгаген, Дания) и СтрептАВкомплекс HRP (DAKO A/S) (смотри "Иммуногистохимия").
Иммуногистохимия
Замороженные криосрезы (8 мкм) сушили воздухом на предметных стеклах, фиксировали ацетоном при -20°С в течение 10 минут и регидрировали в 20% фетальной бычьей сыворотке в PBS (FBS). Эндогенный биотин блокировали авидином (разведенным 1/6) в течение 15 минут, и затем биотином (разведенным 1/6) в течение 15 минут (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Аффинно очищенные и биотинилированные кроличьи анти-SEA-антитела, 5 мкг/мл, инкубировали в течение 30 минут с последующим добавлением СтрептАВкомплекса HRP (DAKO A/S, Копенгаген, Дания), разведенного 1/110 50 мМ Трис рН 7,6 в течение 30 минут. Между всеми стадиями срезы промывали 3 раза в TBS. Окрашивание проводили в течение 8 минут в 0,5 мг/мл 3,3'-диаминобензидинтетрагидрохлорида (Sigma), растворенного в Трис, рН 7,6 с 0,01% Н2O2. После 10 минут окрашивания в 0,5% метиловом зеленом предметные стекла промывали в течение 10 минут водопроводной водой и постепенно дегидрировали в 70-99% этаноле и ксилоле перед помещением в среду DPX (Sigma).
Проточная цитометрия
Клетки Соlо205 рака ободочной кишки человека разъединяли с помощью 0,02% вес/объем EDTA и промывали PBS. Чтобы получить развитие антительного ответа у обезьян, клетки инкубировали последовательно с разведенной сывороткой в течение 1 часа при 4°С, биотинилированными кроличьими античеловеческими IgG-антителами (Southern Biotechnology Ass. Inc., A1, USA) в течение 30 минут и, наконец, с авидином-РЕ (Becton Dickinson, Mountain View, CA) в течение 30 минут.
Связывание модельного фага с клетками анализировали с использованием кроличьих анти-М13-антител (полученных путем иммунизации кроликов частицами М13) и FITC-конъюгированных ослиных антикроличьих антител (Amersham Pharmacia Biotech). Связывание антител, слитых с SEA (D227A), определяли, используя биотинилированные кроличьи анти-SEA-антитела и авидин РЕ. Все реагенты разводили в PBS/1% БСА. Клетки промывали дважды PBS/1% БСА после инкубаций с реагентами и трижды, включая 10-минутные инкубации после связывания частиц фага.
Проточный цитометрический анализ проводили с использованием проточного цитометра FACSort (Becton Dickinson).
Определение сродства на культивированных клетках
Слитые протеины A3 scFv-SEA(D227A), A3 Fab-SEA(D227A) и 1F scFv SEA(D227A), по 80 мкл каждого протеина, метили йодом, как описано у Bolton and Hunter до удельной активности 10-15 мкКи/мкг. Клетки Соlо205 и Raji клетки, 30000/образец, инкубировали с йодированным слитым протеином, 100 мкл/пробирку, в серии двукратных разведений 1% БСА в течение 1 часа, и затем промывали три раза PBS перед измерением связывающей активности. Концентрацию добавленного и связанного слитого протеина использовали для Scatchard анализа. Для подсчета специфического связывания с Соlо205-клетками вычитали фоновое связывание с Raji-клетками.
Анализ цитотоксичности
Зависимую от Т-клеток цитотоксичность суперантигенного слитого протеина (клеточная цитотоксичность, зависящая от суперантигенного антитела) измеряли в стандартном 4-часовом анализе с высвобождением хрома, используя 51Cr-меченные Соlо205 клетки в качестве клеток-мишеней, и Е-клетки человека в качестве эффекторных клеток (9). Процент специфического лизиса подсчитывали следующим образом:
[cpm - число импульсов в минуту].
Пример 1
Выработка связывающихся с опухолью моноклональных антител cynomolgus
Обезьян cynomolgus, Macaca fascicularis (четыре особи) повторно иммунизировали суспензией карциномы ободочной кишки человека четыре раза каждую следующую неделю. После постепенного развития антительного ответа у обезьян проводили проточное цитометрическое окрашивание культивированных колоректальных клеток, Соlо205, используя серию разведений преиммунной и иммунной сыворотки. Антительный IgG-ответ выявлялся только при использовании суспензии осажденных квасцами опухолевых тканей (две особи).
Обезьяну с самым высоким уровнем связывания иммунных с преимунными сывороточными антителами использовали для конструирования большой комбинаторной библиотеки фагов scFv, приблизительно 2,7×107 (оценены по количеству первичных трансформантов). Библиотека фагов приматов выбрана с помощью клетки Соlо205. Общий выход фага (количество элюированного/добавленного фага, подсчитанного как колониообразующие единицы, CFU) из трех последовательных циклов отбора повышался постепенно от 1,9×10-7, 1,4×10-5, до 1,2×10-3. Проточная цитометрия показала, что пять процентов (12/246) моноклональных растворимых scFv:s, полученных из библиотеки фага после трех циклов отбора, связываются со срезом ткани колоректальной опухоли и с интактными клетками Соlо205. У всех отобранных антител обнаружены индивидуальные уникальные последовательности нуклеиновых кислот, соответствующие картине Hinf I-рестрикции при анализе с помощью гель-электрофореза на 1% агарозе.
Гены антител амплифицировали с помощью полимеразной цепной реакции, используя 5 мкл бактериальной культуры и праймеров, комплементарных областям 5'- и 3'- гена scFv, в фагмидном векторе (области промотора phoA в М13 гене III).
Отобранный scFv обладает индивидуальной уникальной реактивностью в отношении эпителия нормальных тканей.
Реактивные scFv колоректального рака классифицированы на специфические группы, на основе характера их иммунохимической реактивности с нормальными тканями (таблица 1). Антителами, исследованными в деталях, являются A3 scFv (и A3 scFv-SEA(D227A), A10 scFv, 3D scFv и ID scFv. Характерные антитела могли отличаться друг от друга по их исключительной специфичности в отношении эпителия различных органов и по их связыванию с лейкоцитами. 1D scFv сильно взаимодействует с кишечным эпителием и является единственным антителом, которое взаимодействует с клетками с морфологией полиморфноядерных гранулоцитов. 1D scFv также отличается от других антител окрашиванием люминальной поверхности почечных клубочков и собирающих протоков, где A10 scFv реагирует гомогенно (неполярно) с этими эпителиальными клетками, и 3D scFv и A3 scFv являются негативными. 1D, A10 и 3D, но не A3 scFv, также реагируют с макрофагоподобными клетками в легких.
Пятая группа антител, не оцененная экстенсивно и поэтому не включенная в Таблицу 1, взаимодействовала с эпителием ободочной кишки, лейкоцитами и купферовскими клетками в печени. A3 scFv отличается тем, что демонстрирует наиболее ограниченную реактивность с использованным набором нормальных тканей. Среди нормальных тканей наиболее заметна реактивность A3 в отношении нормального эпителия ободочной кишки. Слабое окрашивание также определяется в небольших протоках поджелудочной железы и желчных протоках печени и субструктурах эпителия тонкого кишечника. Поверхностный эпителий одного из двух образцов желудка сильно окрашивался A3 антителами.
Картина реактивности A3 scFv подтверждалась с использованием слитого протеина A3 scFv-SEA (D227A). Этот формат позволял использовать поликлональные кроличьи анти-SEA-антитела для иммуногистохимического детектирования, которое является более чувствительной системой определения, для которой характерен более низкий фон и перекрестная тканевая реактивность по сравнению с использованием вторичных антител к пептидной метке ATPAKSE на С-конце scFvs.
ПРИМЕР 2
Ассоциированный с опухолью антиген A3 гомогенно и часто экспрессирован в колоректальных опухолях и опухоли поджелудочной железы
Слитый протеин A3 scFv-SEA (D227A) используют для иммуногистохимического окрашивания различных опухолей эпителиального происхождения (таблица 2 и фигура 1). Слитый белок гомогенно и сильно окрашивает 11/11 образцов тканей первичного рака ободочной кишки и 4/4 образцов при метастатическом раке ободочной кишки, резецированных из яичника, лимфатического узла и печени. Опухоли рака поджелудочной железы, образцов 4/4, одинаково сильно положительны. И наоборот, образцы ткани карциномы желудка, простаты, груди и немелкоклеточного рака легких были отрицательными.
ПРИМЕР 3
A3 ТАА высоко экспрессировано на поверхности раковых клеток ободочной кишки
Результаты нескольких кривых Scatchard для определения сродства, основанных на связывании слитого протеина A3 scFv-SEA(D227A), A3 Fab и 1F scFv-SEA(D227A) (1F был классифицирован на группы A3 специфичности) с клетками Соlо205, суммированы в таблице 3. Специфическое связывание подсчитывалось вычитанием неспецифического связывания с клетками Raji В-клеточной лимфомы человека, не экспрессирующими A3 и 1F ТАА, из связывания с клетками Соlо205. Использовали линейную регрессию для расчета наклона и прерывистости экстраполированной кривой Scatchard. Слитый протеин A3 scFv-SEA(D227A) насыщал примерно в 10 раз меньше связывающих сайтов на клетку по сравнению со слитым протеином A3 Fab (приблизительно 3 миллиона сайтов на клетку), показывая, что двухвалентное (многовалентное) связывание имело место в случае scFv. Это подтверждается более чем 100-кратным увеличением общего сродства (3,6-5,5 нМ) в отношении слитого протеина A3 scFv по сравнению с A3 Fab (580-780 нМ).
Единственный эксперимент, проведенный с использованием слитого протеина 1F scFv-SEA(D227A), показал такое же связывающее сродство и насыщение связывающих сайтов, как и слитый протеин A3 scFv-SEA (D227A).
| Таблица 3 | |||
| Scatchard анализ связывания йодированного слитого протеина с Соlо205 клетками | |||
| Слитый протеин | n* | Kd (нМ) | миллион сайтов/клетку |
| A3 Fab-SEA(D227A) | 2 | 580-780 | 3,0-3,9 |
| A3 scFv-SEA(D227A) | 3 | 3,6-5,5 | 0,11-0,39 |
| 1FscFv-SEA(D227A) | 1 | 4,2 | 0,18 |
| * Число проведенных экспериментов |
ПРИМЕР 4
Опосредованный A3 и 1F scFv-SEA(D227A) Т-клеточный лизис клеток Соlо205
Способность опосредования двумя слитыми белками A3 и 1F scFv-SEA(D227A) антитело-сурперантиген-зависимой клеточной токсичности (SADCC) в отношении клеток Соlо205 исследовали и сравнивали с положительным контролем слитого протеина С215 Fab-SEA(D227А) и отрицательным контролем слитого протеина D1.3 scFv-SEA(D227A). Титрование слитого протеина A3 scFv-SEA (D227A) достигало плато по максимальному лизису, который был подобен приблизительно 50 процентам такового в 4-часовом анализе, проведенном для слитого протеина С215 Fab-SEA(D227A), хотя концентрация была в 10 раз выше (фигура 2). 1F scFv-SEA(D227A) опосредовал подобный уровень цитотоксичности при несколько более высокой концентрации по сравнению с A3 scFv-SEA(D227A). Отрицательный контроль слитого протеина D1,3 scFv-SEA(D227A) не вызывал никакой цитотоксичности.
ПРИМЕР 5
Очищение ассоциированного с опухолью антигена, который распознается реактивным антителом A3 рака ободочной кишки
Опухолевый экстракт получали из клеток ксенопривитой опухоли линии Соlо205. Экстракт наносили на преколонку, объединенную с C215Fab-SEAm9, и колонку, объединенную с A3scFv-SEAm9. Колонки были соединены последовательно во время нанесения образца, но разделены перед элюцией в щелочных условиях.
Единственный пик определялся во время элюирования методом УФ-спектроскопии (фигура 3). Эту элюированную фракцию из последней А3-колонки собирали, нейтрализовали, концентрировали и затем анализировали с помощью SDS-PAGE в невосстанавливающих условиях (фигура 4). Две полосы, видные при окрашивании серебром (метки I и II на фигуре 4) с кажущейся молекулярной массой приблизительно 90-140 кДа, вырезали и исследовали стандартными методами пептидного картирования. Эти две полосы соответствуют полосам, определяемым с помощью A3 в вестерн-блоттинге, см. пример 8. Из полосы I получали 47 различных масс триптических пептидов (см. SEQ ID NO:3, таблица 4, и фигура 5 для последовательностей и соответствующих весов масс), которые полностью соответствовали различным массам триптических пептидов, определяемым по MALDI-TOF человеческого α6-интегрина и β4-интегрина (см. SEQ ID No: 5-51 и 3-4 соответственно и фигуры 3А и В соответственно, где на фигуре 3А подчеркивание соответствует пептидам, появляющимся на фигуре 3В/SEQ ID No:5-51). Из полосы II получили 22 отдельные массы триптических пептидов, которые полностью соответствовали различным массам триптических пептидов β4-интегрина (данные не показаны). Данные показывают, что гетеродимер α6β4-интегрина специфически выделен с помощью А3-аффинной колонки.
| Таблица 4 | |||
| Пептидные/полипептидные производные из человеческого α6β4-интегрина и их массы | |||
| Пос-сть № | Последовательность | Измеренная масса | Подсчитанная масса |
| 5 | LLLVGAPR | 838.568 | 838.551 |
| 6 | ANRTGGLYSCDITARGPCTR | 2226.131 | 2226.050 |
| 7 | VVTCAHRYEK | 1262.637 | 1262.631 |
| 8 | RQHVNTK | 882.524 | 882.490 |
| 9 | CYVLSQNLR | 1152.618 | 1152.583 |
| 10 | FGSCQQGVAATFTK | 1501.706 | 1501.710 |
| 11 | DFHYIVFGAPGTYNWK | 1914.881 | 1914.917 |
| 12 | DEITFVSGAPR | 1191.625 | 1191.600 |
| 13 | ANHSGAVVLLK | 1108.600 | 1108.647 |
| 14 | DGWQDIVIGAPQYFDR | 1879.865 | 1879.897 |
| 15 | DGEVGGAVYVYMNQQGR | 1842.811 | 1842.844 |
| 16 | WNNVKPIR | 1026.608 | 1026.584 |
| 17 | NIGDINQDGYPDIAVGAPYDDLGK | 2520.213 | 2520.189 |
| 18 | GISPYFGYSIAGNMDLDR | 1975.913 | 1975.922 |
| 19 | NSYPDVAVGSLSDSVTIFR | 2026.992 | 2027.008 |
| 20 | SRPVINIQK | 1054.644 | 1054.637 |
| 21 | LRPIPITASVEIQEPSSR | 1993.066 | 1993.108 |
| 22 | VNSLPEVLPIINSDEPK | 1863.920 | 1864.006 |
| 23 | TAHIDVHFLK | 1180.665 | 1180.647 |
| 24 | FSYLPIQK | 995.601 | 995.556 |
| 25 | DIALEITVTNSPSNPR | 1726.866 | 1726.897 |
| 26 | SEDEVGSLIEYEFR | 1672.764 | 1672.770 |
| 27 | VESKGLEKVTCEPQK | 1731.866 | 1731.895 |
| 28 | REITEKQIDDNRK | 1644.792 | 1644.866 |
| 29 | FSLFAER | 869.476 | 869.452 |
| 30 | YQTLNCSVNVNCVNIR | 1954.003 | 1953.927 |
| 31 | LNYLDILMR | 1150.644 | 1150.629 |
| 32 | AFIDVTAAAENIR | 1390.739 | 1390.733 |
| 33 | LPNAGTQVR | 955.523 | 955.532 |
| 34 | VSVPQTDMRPEK | 1386.727 | 1386.705 |
| 35 | EPWPNSDPPFSFK | 1547.730 | 1547.717 |
| 36 | NVISLTEDVDEFR | 1536.744 | 1536.754 |
| 37 | TQDYPSVPTLVR | 1375.718 | 1375.722 |
| 38 | RGEVGIYQVQLR | 1417.801 | 1417.791 |
| 39 | ALEHVDGTHVCQLPEDQK | 2075.965 | 2075.981 |
| 40 | GNIHLKPSFSDGLK | 1512.749 | 1512.817 |
| 41 | MDAGIICDVCTCELQK | 1928.901 | 1928.822 |
| 42 | YEGQFCEYDNFQCPR | 2012.795 | 2012.790 |
| 43 | SCVQCQAWGTGEKKGR | 1879.865 | 1879.890 |
| 44 | DEDDDCTYSYTMEGDGAPGPNSTVL VHK | 3103.229 | 3103.278 |
| 45 | QEVEENLNEVYR | 1521.779 | 1521.718 |
| 46 | VAPGYYTLTADQDAR | 1640.779 | 1640.791 |
| 47 | VPLFIRPEDDDEK | 1572.778 | 1572.790 |
| 48 | DVVSFEQPEFSVSR | 1625.758 | 1625.781 |
| 49 | LLELQEVDSLLR | 1427.760 | 1427.810 |
| 50 | VCAYGAQGEGPYSSLVSCR | 2060.883 | 2060.916 |
| 51 | VLVDNPKNR | 1054.644 | 1054.600 |
Материалы и методы
Солюбилизация опухолевой ткани
Ткань рака ободочной кишки человека, экспрессирующая A3 антиген, обеспечивалась госпиталями Швеции и хранилась в замороженном виде при -70°С в банке тканей при ABR. С замороженных тканей рака ободочной кишки скальпелем делали срезы и переносили в пробирку, содержащую холодный изотонический сахарозный буфер (0,25 М сахарозы, 10 мМ KCl, 1,5М MgCl2, 50 мМ Трис-HCl рН 7,4 при 25°С), содержащий 1% (об/об) Nonidet P-40 (NP-40) и ингибиторы протеаз (Completet™ Protease Inhibitor Coctail Tablet, Boehringer Mannheim). Ткань гомогенизировали в гомогенизаторе Ultra-Turrax и оставляли для солюбилизации при 0°С. Солюбилизированный препарат центрифугировали при 11000 об/мин (универсальная центрифуга Hettich ротор 30 RF) для удаления клеточных обломков. Супернатант продолжали центрифугировать при 108000 g при 4°С. (Ультрацентрифуга Backman ротор Ti-60), и в конце фильтровали через фильтр 0,2 мкм Minisart plus (Sartoriuis AG Gottingen Germany).
Аффинная очистка тканевых антигенов
A3scFv-SEAm9 объединяли с NHS-активированной колонкой HiTrap (Pharmacia Biotech Uppsala, Швеция), в соответствии с рекомендациями по эксплуатации. Контрольную и преколонку объединяли с C215Fab-SEAm9, и контрольную и преколонку соединяли последовательно. Все колонки промывали буфером для предварительной промывки (20 мМ Трис HCl рН 7,5 при 4°С, содержащий 0,2% NP 40). Экстракт наносили на колонку при 0,1 мл/мин, и протекающий поток рециркулировали. Затем колонку промывали стартовым буфером. Связанный антиген элюировали градиентом рН диэтиламина, начиная с рН 7,5 до 11,0. 2,5 мл элюента собирали и концентрировали до 75 мкл. Очистку проводили при 4°С, используя систему АКТА FPLC (Amersham Pharmacia Biotrch Uppsala, Швеция). Элюированный протеин анализировали с помощью SDS PAGE и окрашивания серебром. Отдельные полосы иссекали, подвергали перевариванию трипсином и массу пептида определяли, используя инструмент Maldi-TOF производства Protana A/S (Odense, Дания). Затем пептидную массу сравнивали в компьютерном исследовании со всеми массами триптических пептидов для каждого протеина в базе данных SWISSPROT - сервис, представленный Protana A/S (Odense, Дания).
ПРИМЕР 6
A3scFv-SEAm9 определяет новый эпитоп α6β4-интегрина
Коммерческие антитела человеческого α6-интегрина и β4-интегрина сравнивали с A3 на срезах нормальной и малигнизированной ободочной кишки. Реактивность, показанная на фигуре 6, свидетельствует о том, что A3 ограничивается эпителием ободочной кишки (фиг.6 [i]) и злокачественными клетками опухоли (фиг.6 [ii]). Коммерческое антитело NKI-GoH3 против α6-интегрина также реагировало с нормальной ободочной кишкой (фиг.6 [iii]) и раком ободочной кишки (фиг.6 [iv]). Реакция видна в эпителиальных клетках и злокачественных клетках (стрелки), а также в кровеносных сосудах (BV), некоторых компонентах стромы (s) и в слизистой оболочке мыши (mm). Реакция, наблюдаемая с помощью коммерческого антитела ASC-3 против β4-интегрина, была подобна таковой, полученной с применением анти-α6-антител, но слабее ее, как в нормальной ободочной кишке (v), так и в раковой ткани ободочной кишки (vi).
Материалы и методы
Антитела
A3 и scFv отбирали из библиотеки М fascicularis. Гены VH и VL выделяли путем переваривания рестриктазами и сливали с химерным мутантом стафилококкового энтеротоксина АЕ (D227A) с получением A3scFv-SEAm9. Оно имело очень низкие уровни неспецифического связывания и было чувствительно к детектрованию вторичными антителами. Антитело ASC-3 против человеческого β4-интегрина и антитело NKI-GoH3 против человеческого α6-интегрина были приобретены Becton Dickinson (Copenhagen, Дания).
Иммуногистохимия
Образцы опухоли и нормальной ткани получали в хирургическом отделении Национального госпиталя. Их подвергали быстрой заморозке в изопентане, предварительно охлаждая в жидком азоте. Образцы хранили при - 70°С до иссекания. После криоиссекания срезы сушили воздухом в течение ночи, фиксировали в холодном ацетоне и блокировали авидином/биотином (Vector Burlingam CA). Затем к срезу в течение одного часа добавляли первичные антитела.
Вторичные антитела инкубировали в течение 30 минут с последующей обработкой стрептавидин-биотином/HRP (Dakopatts Copenhagen, Дания) в течение 30 минут. Между всеми этими стадиями проводили экстенсивное промывание 50 мМ Трис рН 7,6 0,15 NaCl. Диаминобензидин (DAB) использовали в качестве хромогена и срезы окрашивали в 0,5% метиловом зеленом. Контроли включали в себя нетканевый реактивный Fab и SEA-D227A или в них отсутствовали первичные антитела. Все антитела использовали в конечной концентрации 5 мкг/мл. Результаты классифицировали как отрицательные, средние и сильные.
ПРИМЕР 7
Ассоциированный с опухолью антиген A3 взаимодействует с α6- и β4-интегриновыми антителами в анализе связывания ELISA.
Неочищенный опухолевый экстракт или А3-антиген, очищенный путем A3-аффинной хроматографии (см. пример 5), анализировали с помощью связывающего ELISA. Коммерческое антитело ASC-3, специфичное в отношении бета-4-интегрина, использовали в качестве захватывающего антитела, на которое наносили различные разбавления неочищенного опухолевого экстракта. Затем его покрывали A3scFv-SEAm9. Связывание A3scFv-SEAm9 затем детектировали с анти-SEA-HRP (фигура 7А). На фигуре 7В коммерческое антитело NKI-GoH3 против α6-интегрина использовали для захвата различных разбавлений концентрированного аффинно очищенного элюата A3. Таким же образом, как на фигуре 7А, связанные протеины отслеживались с помощью A3scFv-SEAm9 и регистрировались с помощью анти-SEA-HRP. В обоих экспериментах определяли зависящий от концентрации сигнал. Данные результаты подтверждали специфичность A3 по отношению к гетеродимеру α6β4-интегрина, показывая также, что они специфически выделены из А3-аффинной колонки в примере 5.
Материалы и методы
Коммерческие антитела NKI-GoH3 или ASC-3 (Becton Dickinson Copenhagen, Дания), 100 мкл в 0,05 М NaHCO3, pH 9,6 использовали для покрытия лунки планшета E.I.A./R.I.A (Costar). Реакция протекала в течение ночи при 4°С, после чего все планшеты промывали 4 раза в DPBS +0,05% Твин 20. Затем лунки блокировали 200 мкл 3% обезжиренного молочного порошка в DPBS+0,05% Твина 20 в течение 1-2 часов при комнатной температуре (RT) при встряхивании. Лунки снова промывали, как описано выше, и 100 мкл экстракта антигена, разведенного в 3% обезжиренном молочном порошке в DPBS+0,05% Твина 20, наносили на 2 часа при комнатной температуре при встряхивании. Лунки снова промывали (4×DPBS+0,05% Твин 20), после чего 100 мкл первичных антител, разбавленных в 3% обезжиренном молочном порошке в DPBS+0,05% Твин 20, инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре при встряхивании. Лунки снова промывали, как описано выше, и 100 мкл вторичных антител, разбавленных в 3% обезжиренном молочном порошке в DPBS+0,05% Твин 20, добавляли в каждую лунку на 1 час при комнатной температуре при встряхивании. Лунки снова промывали, как описано выше, и окрашивали путем добавления 100 мкл пероксидазного субстрата (Sigma Fast OPD Peroxidase Substrate Tablet Set P-9187). Реакция протекала в течение 30 минут при комнатной температуре, в темноте и при перемешивании, и затем реакцию останавливали добавлением 50 мкл 3М H2SO4. Поглощение измеряли при 490 нм.
ПРИМЕР 8
Вестерн-блоттинг опухолевого антигена A3
Экстракты аффинно очищенного опухолевого антигена A3 разделяли с помощью SDS-PAGE и переносили на мембраны для вестерн-блоттинга. Экстракты наносили непосредственно или нагревали до 100°С в течение 5 минут, или нагревали до 100°С в течение 5 минут, но в присутствии меркаптоэтанола (ВМЕ) (фигура 8). Затем мембраны исследовали с помощью A3scFv-SEAm9 и анти-SEA-HRP или антитела против α6-интегрина или β4-интегрина. Антитела против β4-интегрина человека не взаимодействовали ни с одним из протеинов на мембране (фигура 8 [ii]). Антитела против α6-интегрина человека взаимодействовали с большинством проб, соответствующих молекулярным массам от 90 до 140 кДа, в А3-аффинно очищенном экстракте опухолевых антигенов (фигура 8 [iii]). Те же самые пробы были также детектированы с помощью A3scFv-SEAm9, причем детектирование также проводили после нагревания, но в этом случае результат был значительно слабее в восстанавливающих условиях (в присутствии ВМЕ) (фигура 8 [i]). Основная полоса в интервале 90-140 кДа соответствовала полосам в примере 5, которые анализировали путем пептидного картирования и обнаружили в них содержание α6-интегрина и β4-интегрина.
Материалы и методы
Антитело ASC-3 против β4-интегрина человека и антитело NKI-GoH3 против α6-интегрина человека получали от Becton Dickinson (Копенгаген, Дания). Образцы разгоняли в SDS-PAGE в 0,25 М трис-глицин рН 8,9 и 0,1% SDS при 100 V через верхний гель, затем 170V через разрешающий гель. Стандарты молекулярных весов (Biorad broad Range, Biorad) были нанесены во все гели. Разделенные образцы переносили на нитроцеллюлозу (Biorad) в переносном буфере (10 мМ Трис основной, 2М глицина, 40% (об/об) метанола) при 100V в течение 1 часа. Затем мембрану блокировали 5% (вес/об) БСА/TBS в течение по меньшей мере 2 часов при 4°С, затем инкубировали с соответствующим антителом, разведенным в 5% БСА/TBS/0,2% азида. Реакция протекала в течение по меньшей мере 2 часов при комнатной температуре, после чего мембраны экстенсивно промывали в TBST-T. Связанные антитела определяли, инкубируя мембраны в течение 1 часа с HRP конъюгированными антителами, разбавленными в TSB-T, содержащем 5% молочный порошок. Затем мембраны инкубировали с реагентами, усиливающими хемилюминесценцию (ECL) для детектирования (Renaissance® NEN™ Life Science Products, Бостон, МА), в течение 5 минут, и экспонировали на пленке в пределах 1 часа.
ОПИСАНИЕ ФИГУР
Фигура 1
Ассоциированный с опухолью антиген A3 гомогенно экспрессирован в первичных и метастатических опухолях
Иммуногистохимическое окрашивание замороженных и фиксированных ацетоном срезов опухолевых тканей человека с использованием A3 scFv-SEA(D227A) и С215 Fab-SEA(D227A) при 70 нМ. Слитый протеин A3 scFv взаимодействует сильно и гомогенно как с первичной карциномой ободочной кишки, так и поджелудочной железы, полученных при резекции у опухолевых больных. Характерное окрашивание первичного рака ободочной кишки показано в случае С215 Fab-SEA (D227A) в (А) и в случае A3 scFv-SEA(D227A) в (В). Окрашивание с помощью A3 scFv-SEA(D227A) метастазов в печени при раке ободочной кишки показано в (С), и первичного рака поджелудочной железы в (D).
Фигура 2
Покрытые A3 scFv-SEA(D227A) опухолевые клетки Соlо205 эффективно убиваются Т-клетками.
Суперантиген-антитело-зависимая клеточная цитотоксичность в отношении клеток Соlо205, опосредованная A3 scFv-SEA (D227A), достигала такого же максимального уровня цитотоксичности, что и в случае слитого протеина анти-ЕР-САМ С215 Fab-SEA (D227A), хотя и в 10 раз более высокой концентрации. Отсутствие цитотоксичности, опосредованной D1,3 scFv-SEA(D227A), свидетельствует о необходимости наличия в слитом протеине фрагмента антитела, нацеленного на опухоль.
Фигура 3
Иммуноаффинная хроматография опухолевого экстракта на А3scFv-SEAm9-колонке. Протеин, связанный с A3-содержащими колонками, экстенсивно промывали, затем элюировали, как описано в разделе "Материалы и методы" примера 5. Элюированные фракции исследовали методом УФ-спектроскопии (стрелка) и определяли единственный пик. Образцы элюировали градиентом рН, как указано в х.
Фигура 4
Препарат антигена A3 разделяли в невосстанавливающем SDS PAGE и окрашивали серебром. С помощью предшествующего вестерн-анализа определяли интервал молекулярных весов, в котором можно обнаружить A3. Отчетливые полосы внутри этой области (отмеченные I и II) исследовали методом пептидного картирования.
Фигуры 5А и 5В
Эпителиальный интегрин α6β4: полная первичная структура α6 и различных форм β4 (предшественник) (Tamura et al., J. Cell Biol 111:1593-1604 (1990)). Соответствующие пептиды, показанные в SEQ ID No: 5-1, подчеркнуты в последовательностях α6-интегрина человека (фиг.5А) и β4 (предшественника)-интегрина человека (фиг.5В), как опубликовано.
Фигура 6
Иммуногистохимия нормальной и малигнизированной ободочной кишки, с использованием A3scFv и коммерческих моноклональных антител против α6- и β4-интегрина человека.
Фигуры 7А и 7В
Связывающий анализ ELISA. На фиг.7А моноклональное антитело ASC-3, специфичное в отношении β4-интегрина, использовали в качестве связывающего антитела, на которое наносили в различных разведениях неочищенный опухолевый экстракт. На фиг.7В использовали моноклональное антитело NKI-GoH3 против α6-интегрина для связывания А3-аффинно очищенного элюата в различных разведениях. Как на фиг.7А, так и на фиг.7В, связанный интегриновый антиген затем успешно определяли с помощью A3scFv-SEAm9.
Фигуры 8А и 8В
Вестерн-блоттинг элюата из А3-аффинной колонки. Использованными первичными антителами являются (i) и (ii) A3scFv-SEAm9, (iii) антитело ASC-3 против β4-интегрина человека, и (iv) антитело NKI-GoH3 против α6-интегрина человека. Линия А - элюат наносился непосредственно, линия В - элюат нагревали до 100°С в течение 5 минут, а линия С - элюат нагревали до 100°С в течение 5 минут, но в присутствии меркаптоэтанола. Показаны положения для стандартных молекулярных весов.
Источники информации
1. DeCosse JJ, Tsioulias GJ, Jacobson JS. Colorectal cancer: detection, treatment, and rehabilitation. CA Cancer J Clin 1994; 44: 27-42.
2. Riethmuller G, et al. Monoclonal antibody therapy for resected Dukes'С colorectal cancer: seven-year outcome of a multicenter randomized trial. J Clin Oncol 1998; 16: 1788-1794.
3. Kuhn JA, Thomas G. Monoclonal antibodies and colorectal carcinoma: a clinical review of diagnostic applications. Cancer Invest 1994; 12: 314-323.
4. Tordsson J, et a2. Efficient selection of scFv antibody phage by adsorption to in situ expressed antigens in tissue sections. J Immunol Methods 1997; 210: 11-23.
5. Aujame L, Geoffroy F, Sodoyer R. High affinity human antibodies by phage display. Hum Antibodies 1997; 8: 155-168.
6. Clark RK, Trainer DL, Bailey DS, Greig RG Immunohistochemical analysis of antiserum from rhesus monkeys immunized with human colon carcinoma. Cancer Res 1989; 49: 3656-3661.
7. Lewis АР, et al. Cloning and sequence analysis of kappa and gamma cynomolgus monkey immunoglobulin cDNAs. Dev Comp Imniunol 1993; 17: 549-560.
8. Brodin TN, et al. Man-made superantigens: Tumor-selective agents for T-cell-based therapy. Adv Drug Deliv Rev 1998; 31: 131-142.
9. Dohlsten M,et a2. Monoclonal antibody - superantigen fusion proteins: tumor-specific agents for T-cell-based tumor therapy. Proc Natl Acad Sci USA 1994; 91: 8945-8949.
10. Liu С, et al. Eradication of large colon tumor xenografts by targeted delivery of maytansinoids. Proc Natl Acad Sci USA 1996; 93: 8618-8623.
1. Антитело, или его производное, или его фрагмент, имеющее структуру, связывающую структуру мишени, находящейся внутри и на поверхности эпителиальных опухолевых клеток желудочно-кишечного тракта человека и в субпопуляции нормальных эпителиальных клеток желудочно-кишечного тракта, причем указанная связывающая структура содержит последовательности определяющей комплементарность области (CDR) в легкой цепи, содержащие в основном аминокислоты под номерами 23-33 (CDR1), 49-55 (CDR2), 88-98 (CDR3) аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:2, и последовательности CDR в тяжелой цепи, содержащие в основном аминокислоты под номерами 158-162 (CDR1), 177-193 (CDR2), 226-238 (CDR3) аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:2, или другие связывающие структуры с подобными уникальными связывающими свойствами.
2. Антитело по п.1, которое отобрано фаговым методом.
3. Антитело по п.1, где последовательности происходят от Масаса fascicularis.
4. Антитело или его производное по п.1, которое происходит от человека.
5. Антитело по п.1, где последовательности по меньшей мере на 84% идентичны соответствующим последовательностям человеческого происхождения.
6. Антитело по п.1, которое характеризуется низкой иммуногенностью или отсутствием иммуногенности у человека.
7. Антитело по п.1, из которого получают производное путем генетического связывания с другими полипептидами и/или путем химической конъюгации с органическими или неорганическими химическими молекулами и/или путем ди-, олиго- или мультимеризации.
8. Антитело по п.1, которое генетически связано или химически конъюгировано с цитотоксическими полипептидами или цитотоксическими органическими или неорганическими химическими молекулами.
9. Антитело по п.1, которое генетически связано или химически конъюгировано с биологически активными молекулами.
10. Антитело по п.1, которое генетически связано или химически конъюгировано с иммуноактивирующими молекулами.
11. Антитело по п.1, которое изменено путем генетического связывания с молекулами или путем дериватизации, приводящим к изменению фармакокинетических свойств комбинированной молекулы.
12. Антитело по п.1, которое является меченым, при этом связывание меченого антитела со структурой мишени специфически ингибируется немеченой формой этого антитела.
13. Антитело по п.1, где указанная связывающая структура распознает нередуцированную форму α6β4-интегрина.
14. Структура-мишень, находящаяся внутри или на поверхности опухолевых клеток, причем указанная структура - мишень
а) обладает способностью специфически блокироваться и специфически блокировать связывающую структуру антитела по любому из пп.1-11 и другие связывающие структуры со сходными связывающими свойствами,
b) расположена внутри или на поверхности эпителиальных клеток желудочно-кишечного тракта человека,
c) имеет существенную гомологию с α6- и/или β4-интегриновыми цепями или их вариантами, представляющими собой широко распространенный или уникальный эпитоп,
d) является в высокой степени экспрессируемой на поверхности опухолевых клеток и
e) является мишенью для цитотоксических эффекторных механизмов.
15. Структура-мишень по п.14, где связывающая структура антитела является меченой и ее связывание со структурой-мишенью ингибируется немеченой формой связывающей структуры антитела.
16. Структура-мишень по п.14, где указанная связывающая структура содержит одну или более последовательностей, определяющих комплементарность областей (CDR), содержащих в основном аминокислоты под номерами 23-33, 49-55, 88-98, 158-162, 177-193, 226-238 аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:2, или другие связывающие структуры с подобными уникальными связывающими свойствами.
17. Структура-мишень по п.14, где указанное антитело содержит вариабельную область легкой цепи, содержащую в основном аминокислоты под номером 1-109 аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:2, и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую в основном аминокислоты под номерами 128-249 аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:2.
18. Структура-мишень по любому из пп.14-17, которая гомогенно экспрессируется в клетках эпителия ободочной кишки человека и в меньшем количестве - в клетках протока поджелудочной железы и желчного протока.
19. Структура-мишень по п.18, экспрессия которой коррелирует с дифференцировкой эпителия желудочно-кишечного тракта.
20. Структура-мишень по п.19, которая содержит в основном аминокислотную последовательность α6-интегрина, представленную в SEQ ID NO:3, и/или β4-интегрина, представленную в SEQ ID NO:4, и/или один или более фрагментов, и/или вариантов, или соединенных вариантов, и/или их субъединиц.
21. Структура-мишень по п.20, которая содержит гомо- или гетеромономеры, или гомо- или гетеромультимеры указанного α6β4-интегрина, и/или указанный один или более его фрагментов, и/или вариантов, и/или субъединиц.
22. Структура-мишень по п.20, которая имеет кажущийся молекулярный вес в своей нередуцированной форме от 90 до 140 кДа, наиболее предпочтительно от 80 до 160 кДа.
23. Структура-мишень по п.20, которая содержит пептид или полипептид(ы), содержащий в основном любую из аминокислотных последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 5-51, или содержит молекулу, образующую комплекс с указанным полипептидом (ами).
24. Структура-мишень по любому из пп.20-23, распознаваемая, исключительно или нет в своей нередуцированной форме, связывающей структурой, включенной в антитело по любому из пп.1-13.
25. Пептид, способный блокировать функцию структуры-мишени по любому из пп.14-24.
26. Фармацевтическая композиция, предназначенная для лечения злокачественного заболевания у человека, содержащая в качестве активного начала антитело по любому из пп.1-13.
27. Фармацевтическая композиция, предназначенная для лечения злокачественного заболевания у человека, содержащая в качестве активного начала структуру-мишень по любому из пп.14-24.
28. Вакцинная композиция, предназначенная для лечения злокачественного заболевания у человека, содержащая в качестве активного начала антитело по любому из пп.1-13, или структуру-мишень по любому из пп.14-24, или пептид по п.25.
29. Способ лечения состояний, основанных на антиангиогенном механизме, отличающийся тем, что человеку вводят антитело по любому из пп.1-13 или структуру-мишень по любому из пп.14-24, или пептид по п.25.
30. Способ лечения метастатических заболеваний человека, согласно которому человеку вводят антитело по любому из пп.1-13.
31. Способ гистопатологической диагностики in vitro и прогнозирования развития злокачественного заболевания у человека, отличающийся тем, что образец приводят в контакт с антителом по любому из пп.1-14 и индикатором, при этом наличие сигнала, полученного от индикатора, служит указанием на злокачественное заболевание у человека.
32. Способ по п.31, который подразумевает типирование опухоли.
33. Способ по п.31, который подразумевает скрининг опухоли.
34. Способ по п.31, который подразумевает мониторинг предшествующих малигнизации состояний.
35. Способ диагностики in vitro и прогнозирования развития злокачественного заболевания человека, отличающийся тем, что в жидкостях организма определяют концентрации антигена, содержащего структуру-мишень по любому из пп.14-24, при этом повышенная концентрация антигена служит указанием на злокачественное заболевание у человека.
36. Способ in vitro диагностики и прогнозирования злокачественного заболевания человека, отличающийся тем, что в жидкостях организма определяют концентрации антитела по любому из пп.1-13, при этом повышенная концентрация антитела служит указанием на злокачественное заболевание у человека.
37. Способ in vivo диагностики и прогнозирования злокачественного заболевания человека, отличающийся тем, что определяют локализацию антитела по любому из пп.1-13 относительно опухолевых отложений у человека, при этом идентификация антитела в опухолевых отложениях является показателем злокачественного заболевания у человека.
