Способ количественного определения белка в биологических жидкостях

Изобретение относится к медицине, в частности в клинико-диагностической лабораторной практике для проведения анализов на количественное содержание белка в биологических жидкостях (в моче или спинномозговой жидкости). Сущность изобретения: способ включает смешение раствора реагентов с образцом биологической жидкости, измерение оптической плотности раствора образовавшегося комплекса и расчет содержания белка по градуировочному графику или уравнению градуировочного графика. Раствор реагентов включает пирогаллоловый красный, молибдат натрия, янтарную кислоту, ацетат натрия, низкоатомный спирт и стабилизатор. В качестве низкоатомного спирта раствор содержит этанол, а в качестве стабилизатора - неионогенный ПАВ. Смешивание образца биологической жидкости с раствором реагентов ведут в соотношении 1:(10-50), и измерение оптической плотности проводят фотометрически при длине волны или нескольких длинах волн в диапазоне 600-700 нм. Изобретение обеспечивает повышение чувствительности и точности способа расширения диапазона линейности снижение расхода реактивов. 2 з.п. ф-лы, 1 ил.

 

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано в клинико-диагностической лабораторной практике для проведения анализов на содержание белка в биологических жидкостях (например, в моче и спинномозговой жидкости) с целью диагностирования различных заболеваний и наблюдения за ходом лечения.

К наиболее массовым методам определения белка в биологических жидкостях (в основном, в моче) с применением химических реагентов относится метод с использованием сульфосалициловой кислоты. Метод основан на помутнении пробы или на появлении белого хлопьевидного осадка в пробе вследствие преципитации белка в присутствии кислоты [Kingsbury F.B. et al. The Rapid Determination of Albumin in Urine // J. Lab. Clin. Med., 1926, v.11, p.981-989; Карпищенко А.И. Медицинские лабораторные технологии и диагностика: Справочник // СПб, изд-во "Интермедика", 2002, с.155-177].

Концентрацию белка в моче определяют по интенсивности помутнения через 5 минут после начала реакции исследуемого образца с кислотой на фотоэлектроколориметре против холостой пробы с помощью градуировочного графика, построенного по стандартным растворам альбумина. Применяемая в качестве преципитанта сульфосалициловая кислота более специфична к альбуминам, чем к другим белкам, а с некоторыми белками вообще не реагирует. Кроме того, метод обладает рядом следующих недостатков: на результат химической реакции оказывают значительное влияние вещества, содержащиеся в моче (форменные элементы крови, соли, различное сочетание белков, лекарственные препараты), рН, случайные встряхивания пробы, температура реакции, время инкубирования пробы и многие другие факторы; на результат измерения сильно влияют цвет и мутность мочи. Для того чтобы избежать влияния указанных факторов, требуется достаточно сложная процедура подготовки проб, включающая в себя либо фильтрование, либо центрифугирование образцов мочи и подготовка для каждого исследуемого образца собственной холостой пробы добавлением раствора хлорида натрия. Таким образом, длительная процедура подготовки проб и последующее измерение их двойного количества увеличивает время анализа и затрудняет проведение массовых исследований. Кроме того, данный способ для определения белка малочувствителен, обладает низкой точностью и не пригоден для анализа биологических жидкостей с низким содержанием белка (менее 0,1 г/л).

Широкое распространение получили способы определения белка в биологических жидкостях, и в частности в моче, использующие реагенты, содержащие красители, изменяющие окраску конечной смеси при взаимодействии с биологическим объектом, содержащим белок. Количественное содержание белка в этом случае определяют по интенсивности окраски.

Известен способ количественного определения содержания белка в биологических жидкостях, основанный на изменении окраски под воздействием красящего реагента, в качестве которого используется спиртовой раствор красителя кумасси синий [Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem., 1976, v.72, p.248-254]. Краситель в кислоте переходит в лейкооснование, образуя коллоидный раствор, который при взаимодействии с белком изменяет окраску пробы. Изменение окраски регистрируют фотометрически при длине волны 595 нм через 2-3 мин после реакции, содержание белка определяют по градуировочному графику, построенному по стандартному раствору альбумина.

Недостатком известного решения является то, что результаты измерения могут сильно искажаться из-за неодинакового взаимодействия красителя с различными белками, присутствующими в исследуемых образцах биологической жидкости. Результаты измерений могут искажаться также при наличии в образце многих лекарственных препаратов, солей, оснований, кислот. Использование данного метода является проблематичным для мутных образцов.

Известен способ количественного определения белка в биологических жидкостях, в основе которого лежит связывание комплекса красителя пирогаллоловый красный и ионов молибдата с молекулами белка в кислой среде [Watanabe N. et al. Urinary protein as measured with a pyrogallol redmolybdate complex, manually and in a Hitachi 726 automated analyzer // Clin. Chem., 1986, v.32(8), p.1551-1554]. Взаимодействие комплекса краситель-молибдат с белком приводит к изменению окраски пробы, которое регистрируется фотометрически при длине волны 600 нм через 10 мин при температуре 37°С. Количество белка определяют по градуировочному графику, построенному по стандартному раствору альбумина. Недостатком предложенного Ватанабе решения является неточность результатов измерения в присутствии различных белков в исследуемых образцах биологической жидкости.

Наиболее близким к изобретению является способ количественного определения белка в биологических жидкостях (моче и спинномозговой жидкости) с применением коммерческого набора "Fluitest USP. Ultrasensitive Proteins" производства компании Biocon Diagnostik, Германия [Инструкция по применению набора "Fluitest USP. Ultra-Sensitive Proteins", Biocon Diagnostik GmbH, Germany, 2003]. Способ включает смешивание раствора реагентов с образцом биологической жидкости, инкубацию пробы с перемешиванием в течение 10 мин, измерение оптической плотности относительно холостой пробы при длине волны 578 нм, 598 нм (604 нм) и определение концентрации белка по градуировочному графику или по стандартной формуле относительно градуировочного раствора альбумина. В качестве раствора-комплексообразователя используют смесь красителя пирогаллолового красного, молибдата натрия, детергента в сукцинатном буфере. Состав детергента не раскрывается. Данное решение выбрано в качестве прототипа.

Недостатками известного решения являются большой расход реактива (3 мл) на один анализ для достижения достаточной линейности при большом расходе исследуемой биологической жидкости (50 мкл), искажение результатов в присутствии хелатирующих агентов, и неточное определение концентрации белков в моче, содержащей белки Бенс Джонса.

Установлено, что прототип имеет сравнительно узкую область диапазона линейности (до 2 г/л) при соотношении образец/реактив 1:50 для образца мочи 20 мкл.

Техническим результатом изобретения является повышение чувствительности определения концентрации белка в биологических жидкостях, улучшение метрологических характеристик за счет расширения диапазона линейности, повышение точности результатов в присутствии интерферирующих факторов, снижение расхода реактива.

Сущность предложенного способа заключается в том, что для определения концентрации белка в биологической жидкости указанным способом, включающим смешивание образца биологической жидкости с реактивом-комплексообразователем, содержащим краситель пирогаллоловый красный и молибдат натрия, инкубацию пробы в течение 10 мин при комнатной температуре, измерение оптической плотности пробы фотометрически при длинах волн в диапазоне 600-700 нм и определение концентрации белка стандартным образом, используют реактив-комплексообразователь, дополнительно содержащий янтарную кислоту, ацетат натрия, низкоатомный спирт и стабилизатор, при следующих соотношениях компонентов (в мас.%): молибдат натрия - (0,6-1,6)×10^-3; пирогаллоловый красный - (1,0-2,0)×10^-3; янтарная кислота - 0,4-0,7; ацетат натрия - 0,04-0,10; низкоатомный спирт - 8,0-16,0; стабилизатор - 0,03-1,0; вода - остальное.

Реактив-комплексообразователь в качестве низкоатомного спирта может содержать этанол, метанол или другой, а в качестве стабилизатора - любой неионогенный ПАВ.

Смешивание биологической жидкости с реактивом-комплексообразователем ведут в соотношении 1:(10-50), при этом измерения оптической плотности проводят при одной длине волны из диапазона 600-610 нм или нескольких длинах волн: основная длина волны - из диапазона 600-610 нм, вспомогательные - из диапазона 610-700 нм.

Введение в реактив, содержащий молибдат натрия и пирогаллоловый красный, ацетата натрия и низкоатомного спирта позволяет стабилизировать раствор реактива во время приготовления и при дальнейшем хранении. При содержании спирта менее 8% реактив неустойчив во времени, а при содержании свыше 16% оптическая плотность полученного реактива значительно уменьшается, при этом ухудшается точность анализов.

Введение в реактив, содержащий молибдат натрия и пирогаллоловый красный, янтарной кислоты позволяет повысить буферную емкость реактива-комплексообразователя таким образом, что при добавлении образца биологической жидкости (в зависимости от природы заболевания и его тяжести рН биологических жидкостей может варьироваться в пределах от 5 до 9 ед. рН) рН конечной смеси будет находиться в оптимальных пределах от 2,5 до 3,4 ед. рН независимо от объема образца, а также повышает чувствительность и воспроизводимость измерений, увеличивает линейную область метода.

Введение в реактив, содержащий молибдат натрия и пирогаллоловый красный, стабилизатора позволяет предотвратить выпадение осадка и увеличивает срок хранения реактива-комплексообразователя до 12 мес.

При использовании концентраций компонентов ниже указанных не достигается необходимая буферная емкость реактива-комплексообразователя, снижается чувствительность реактива и ухудшается воспроизводимость результатов измерений, а при превышении концентраций - снижается точность измерений, а необходимая точность может быть достигнута только чрезмерным увеличением расхода реактива для анализа.

На чертеже приведены спектры поглощения растворов пирогаллолового красного (1), его комплекса с молибденом (2) и комплекса с молибденом в присутствии альбумина (3). Представленные на чертеже зависимости поясняют принцип описываемого способа количественного определения белка в биологических жидкостях: амплитуда пика поглощения линейно зависит от концентрации белка в образце.

Возможность практического использования заявленного способа иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения. Во всех примерах, за исключением примера 5, используют реактив-комплексообразователь, приготовленный следующим образом: вначале готовят раствор окрашенного реагента - пирогаллолового красного (ПГК) растворением препарата в воде в присутствии ацетата натрия, затем смесь отфильтровывают через фильтр, после чего разбавляют водно-спиртовой смесью (содержание этанола в конечном растворе не превышает 8 об.%). Растворы молибдата натрия, янтарной кислоты и стабилизатора готовят отдельно. Конечный раствор готовят смешиванием всех ранее приготовленных растворов с добавлением воды. Полученный реактив-комплексообразователь готов к использованию.

Пример 1. Нормальные значения содержания общего белка в моче варьируются в диапазоне 28-141 мг/сут [Tiez N.W. Fundamental of clinical chemistry // W.B.Saunders Company, 1976, p.356, 358, 369]. Выявление протеинурии при диагностике различных почечных заболеваний путем количественного определения концентрации общего белка в моче выполняют следующим образом. В кювету или пробирку с оптическим путем 1 см вносят 20 мкл образца мочи пациента, затем туда же добавляют 1 мл реактива-комплексообразователя. Проба инкубируется в течение 10 мин при комнатной температуре (+18...+25°С). Далее проводится измерение фотометрическим способом на измерительном приборе (фотоэлектроколориметре, фотометре или спектрофотометре) при длине волны 600 нм против холостой пробы. В качестве холостой пробы используется раствор, состоящий из 20 мкл воды и 1 мл реактива-комплексообразователя. Аналогичным образом проводят анализ стандартного водного раствора альбумина с концентрацией 1 г/л (градуировочного раствора альбумина).

По полученным значениям оптических плотностей для исследуемого образца (ОП образца) и градуировочного раствора альбумина (ОП градуир.р-ра) рассчитывают концентрацию С, г/л, белка в моче по формуле

С=С_{градуир.р-ра}·{ОП_{образца}/ОП_{градуир.р-ра}), где С_{градуир.р-ра}=1 г/л.

В случае, если расчетная величина концентрации белка превышает 3 г/л, необходимо развести образец мочи пациента водой 1:3 и провести анализ повторно, а полученный результат умножить на 3.

Пример 2. Микропротеинурией считается диапазон концентраций общего белка в моче, равный до 0,14 г/л [Tietz N.W. Clinical guide to laboratory tests // W.B.Saunders Company, 1995, p.520]. Выявление микропротеинурии, обусловленной микроальбуминурией, при диагностике ранних стадий диабета путем количественного определения концентрации общего белка выполняется, как описано в примере 1, за исключением того, что для анализа необходимо взять 100 мкл образца мочи пациента и соответственно 100 мкл градуировочного раствора альбумина с концентрацией 0,2 г/л. Требуемый градуировочный раствор может быть приготовлен из стандартного водного раствора альбумина с концентрацией 1 г/л путем разведения 1:4.

Пример 3. Нормальные значения содержания общего белка в спинномозговой жидкости варьируются в диапазоне 0,14-0,45 г/л [Tietz N.W. Clinical guide to laboratory tests // W.B.Saunders Company, 1990, p.470-473]. Выявление повышения уровня белка в спинномозговой жидкости при диагностике таких заболеваний, как опухоли мозга, спинномозговые кровоизлияния, воспаления (бактериальном менингите), множественный склероз, или при различных ранениях выполняется аналогичным образом, как описано в примере 2, но с образцом спинномозговой жидкости пациента.

Пример 4. Измерения при анализах содержания общего белка в биологических жидкостях, описанных в примерах 1-3 на примере одноволновой методики, могут выполняться на нескольких длинах волн. В данном примере рассматривается двухволновая методика измерений: основную длину волны выбирают из диапазона 600-610 нм, а дополнительную - из диапазона 610-700 нм. Разность величин оптической плотности, измеренных на выбранных длинах волн, позволяет улучшить точность измерений пробы в пробирках и скомпенсировать влияние загрязнений и дефектов на стенках кюветы или пробирки в зоне прохождения луча.

Выявление протеинурии путем количественного определения концентрации общего белка выполняется, как описано в примере 1, за исключением того, что измерения анализируемых образцов выполняются фотометрическим способом на измерительном приборе (фотоэлектроколориметре, фотометре или спектрофотометре) при двух длинах волн из указанных выше диапазонов против холостой пробы.

По полученным значениям оптических плотностей на основной и дополнительной длинных волн для исследуемого образца (ОП_{осн.образца} и ОП_{доп.образца}) и градуировочного раствора альбумина (ОП_{осн.градуир.р-ра} и ОП_{доп.градуир.р-ра}) рассчитывают концентрацию С, г/л, белка в моче по формуле

С=С_{градуир.р-ра}·((ОП_{осн.образца}-ОП_{доп.образца})/(ОП_{градуир.р-ра}-ОП_{доп.градуир.р-ра})), где С_{градуир.р-ра}=1 г/л.

Пример 5. Анализы белка в биологических жидкостях, описанные в примерах 1-4, выполняются с использованием реактива-комплесообразователя, приготовленного аналогичным образом как и в примерах 1-4, за исключением того, что вместо этанола используется метанол. Сравнительные характеристики реактивов, содержащих этанол и метанол, соответственно представлены в табл.1.

Таблица 1.
Характеристика реактива	Реактив-комплесксообразователь, содержащий следующий низкоатомный спирт
	этанол	метанол
1. Тип градуировочной зависимости	Линейный	Линейный
2. Линейная область определения концентрации, г/л	0,0-3,0	0,0-2,0
3. Допустимое отклонение от «линейности», %	5	5
4. Коэффициент вариации определения, %	5	5

Таким образом, преимуществами предложенного изобретения в сравнении с известными решениями является возможность более широкого практического применения реактива-комплексообразователя благодаря улучшенным аналитическим характеристикам. Чувствительность способа составляет 0,01 г/л, область линейности до 3 г/л в отличие от 2 г/л как у прототипа, получаемых в аналогичных условиях. Коэффициент вариации конечных результатов составляет менее 5% в отличие от 10% как у прототипа.

Благодаря модификации состава компонентов улучшены практические свойства реактива-комплексообразователя по отношению к прототипу: расход реактива на один анализ уменьшены до 1 мл вместо 3 мл (как у прототипа); при анализе высококонцентрированных белковых жидкостей нет необходимости разводить образец солевым раствором, а разрешается разведение дистиллированной водой; условия хранения более удобные - при комнатной температуре в темноте в течение 12 мес.

Способ по изобретению позволяет выполнять простой и быстрый количественный анализ белка в различных биологических жидкостях, а предлагаемый для его осуществления реактив-комплексообразователь обладает высокими аналитическими и практическими характеристиками и может быть использован для количественного определения белка в биологических жидкостях с применением описанного реактива-комплексообразователя в лабораторной практике, особенно при массовых медицинских обследованиях населения.

1. Способ количественного определения концентрации белка в биологических жидкостях, включающий смешивание образца биологической жидкости с реактивом-комплексообразователем, содержащим пирогаллоловый красный и молибдат натрия, инкубацию пробы в течение 10 мин при комнатной температуре, измерение оптической плотности пробы фотометрически при длинах волн в диапазоне 600-700 нм и определение концентрации белка, отличающийся тем, что реактив-комплексообразователь дополнительно содержит янтарную кислоту, ацетат натрия, низкоатомный спирт и стабилизатор при следующих соотношениях компонентов (мас. %): молибдат натрия (0,6-1,6)·10^-3; пирогаллоловый красный (1,0-2,0)·10^-3; янтарная кислота 0,4-0,7; ацетат натрия 0,04-0,10; низкоатомный спирт 8,0-16,0; стабилизатор 0,03-1,0; вода - остальное.

2. Способ количественного определения концентрации белка в биологических жидкостях по п.1, отличающийся тем, что водный раствор реагентов в качестве низкоатомного спирта содержит этанол, метанол, а в качестве стабилизатора - неиногенный ПАВ.

3. Способ количественного определения концентрации белка в моче по пп.1, 2, отличающийся тем, что смешивание образца биологической жидкости с раствором реагентов ведут в соотношении 1:(10-50) и измерение оптической плотности проводят фотометрически при одной длине волны из диапазона 600-610 нм или нескольких длинах волн в диапазоне 600-700 нм с учетом того, что основная длина волны находится в диапазоне 600-610 нм, а дополнительные - в диапазоне 610-700 нм.