Конъюгаты -интерферона
Изобретение относится к области иммунологии. Сущность его заключается в разработке конъюгатов, проявляющих активность γ-интерферона. Конъюгат содержит, по меньшей мере, одну неполипептидную группу, ковалентно связанную с IFNG-полипептидом, причем полипептид содержит аминокислотную последовательность, которая отличается от исходной последовательности IFNG-полипептида на, по меньшей мере, один введенный и/или удаленный аминокислотный остаток, содержащий группу для присоединения неполипептидной группы. Технический результат - повышение эффективности терапии различных заболеваний. 7 н. и 28 з.п. ф-лы, 1 табл.
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к конъюгатам с γ-интерферонподобной активностью, способам их получения, фармацевтическим композициям, содержащим такие молекулы, и к их применению при лечении заболеваний.
Уровень техники
γ-Интерферон (IFNG) является цитокином, продуцируемым Т-лимфоцитами и природными киллерными клетками, и существует в виде гомодимера двух нековалентно связанных полипептидных субъединиц. Зрелая форма каждого димера содержат 143 аминокислотных остатка (показанных в ПОСЛЕД. №2), причем форма его предшественника включает сигнальную последовательность из 166 аминокислотных остатков (показанных в ПОСЛЕД. №1).
Каждая субъединица имеет два потенциальных сайта N-гликозилирования (Aggarwal et al.. Human Cytokines, Blackwell Scientific Publications, 1992) в позициях 25 и 97. В зависимости от степени гликозилирования молекулярная масса IFNG в димерной форме составляет 34-50 кДа (Farrar et al., Ann. Rev. Immunol., 1993, 11:571-611).
О праймерной последовательности IFNG дикого типа человека (hulFNG) сообщается Gray et al. (Nature, 298:859-863, 1982), Taya et al. (EMBO J., 1:953-958, 1982), Devos et al. (Nucleic Acids Res., 10:2487-2501, 1982) и Rinderknecht et al. (J. Biol. Chem., 259:6790-6797, 1984), и в ЕР 77670, ЕР 89676 и ЕР 110044. О ЗD-структуре hulFNG сообщают Ealick et al. (Science, 252:698-702, 1991).
Имеются сообщения о встречающихся в природе или мутированных формах полипептидов с субъединицами IFNG, в том числе, о форме, содержащей N-концевую аминокислотную последовательность Cys-Tyr-Cys (позиции (-3)-(-1) относительно ПОСЛЕД. №2), о форме, содержащей N-концевой метионин (позиция -1 относительно ПОСЛЕД. №2) и различных процессированных по С-концу формах, содержащих 127-134 аминокислотных остатка. Известно, что из С-конца можно удалить 1-15 аминокислотных остатков без уничтожения IFNG-активности молекулы. Кроме того, Pan et al. (Eur. J. Biochem., 166:145-149, 1987) описывают гетерогенность С-конца hulFNG.
О мутеинах Hu IFNG сообщают Slodowski et al. (Eur. J. Biochem., 202:1133-1140, 1991), Luck et al. (J. Biol. Chem., 265: 13314-13319, 1990), Seelig et al. (Biochemistry, 27:1981-1987, 1988), Trousdale et al. (Invest. Ophtalmol. Vis. Sci., 26:1244-1251, 1985) и сообщается в ЕР 146354. О природном варианте hulFNG сообщают Nishi et al. (J. Biochem., 97:153-159, 1985).
В US 6046034 описываются варианты термоустойчивого рекомбинантного hulFNG (rhuIFNG), в которые включено до 4 пар цистеиновых остатков для возможности образования дисульфидной связи и, таким образом, стабилизации варианта IFNG в гомодимерной форме.
В WO 92/08737 описываются варианты IFNG, содержащие дополнительный метионин в N-конце полной (остатки 1-143) или неполной (остатки 1-132) аминокислотной последовательности IFNG дикого типа человека. В ЕР 219781 описываются неполные последовательности hulFNG, содержащие аминокислотные остатки 3-124 (ПОСЛЕД. №2). В US 4832959 описываются неполные последовательности hulFNG, содержащие остатки 1-127, 5-146 и 5-127 аминокислотной последовательности, которая, по сравнению с ПОСЛЕД. №2, содержат три дополнительных N-концевых аминокислотных остатка (CYC). В US 5004689 описывается последовательность ДНК, кодирующая hulFNG без 3 N-концевых аминокислотных остатков CYC, и ее экспрессия в Е. coli. В ЕР 446582 описывается продуцируемый Е. coli rhuIFNG, свободный от N-концевого метионина. В US 6120762 описывается пептидный фрагмент rhuIFNG, содержащий его остатки 95-134 (относительно ПОСЛЕД. №2).
О высоком уровне экспрессии rhuIFNG сообщают Wang et al. (Sci. Sin., В 24:1076-1084, 1994).
О варианте гликозилирования в rhuIFNG сообщают Curling et al. (Biochim. J., 272:333-337, 1990) и Hooker et al. (J. of Interferon and Cytokine Research, 1998, 18:287-295).
О модификации rhuIFNG полимерами сообщают Kita et al. (Drug Des. Deliv., 6:157-167, 1990) и сообщается в ЕР 236987 и US 5109120.
В WO 92/22310 описываются азиалогликопротеиновые конъюгатные производные интерферонов, в частности hulFNG.
Описываются белки, слитые с IFNG. Например, в ЕР 237019 описывается одноцепочечный полипептид, имеющий область, обнаруживающую активность интерферона β, и одну область, обнаруживающую IFNG-активность.
В ЕР 158198 описывается одноцепочечный полипептид, имеющий область, обнаруживающую IFNG-активность, и область, обнаруживающую активность IL-2. В некоторых ссылках описываются одноцепочечные димерные белки IFNG, например в Landar et al., J. Mol. Biol., 2000, 299:169-179.
В WO 99/02710 описываются одноцепочечные полипептиды, одним из примеров которых, среди многих, является IFNG.
В WO 99/03887 описываются варианты полипептидов с присоединенным PEG, принадлежащих к суперсемейству гормонов роста, где несущественные аминокислотные остатки, расположенные в определенной области полипептида, заменены цистеиновым остатком. IFNG упоминается в качестве примера члена суперсемейства гормонов роста, но его модификация сколько-нибудь подробно не обсуждается.
IFNG предложен для лечения интерстициальных болезней легких (также известных как интерстициальный фиброз легких (IPF) (Zeische et al. (N. Engl. J. Med., 341:1264-1269, 1999, и Chest, 110:Suppl:25S, 1996), и ЕР 795332), для целей которого IFNG можно использовать в сочетании с преднизолоном. Кроме IPF, с помощью IFNG можно лечить гранулематозные болезни (Bolinger et al., Clinical Pharmacy, 1992, 11:834-850), некоторые микобактиральные инфекции (N. Engl. J. Med., 330:1348-1355, 1994), рак почек (J. Urol., 152:841-845, 1994), остеопороз (N. Engl. J. Med., 332:1594-1599, 1995), склеродерму (J. Rheumatol., 23: 654-658, 1996), гепатит В (Hepatogastroentherology, 45:2282-2294, 1998), гепатит С (Int. Hepatol. Communic., 6:264-273, 1997), септический шок (Nature Medicine, 3:678-681, 1997) и рематоидный артрит.
В качестве фармацевтического соединения rhuINFG применяют с некоторым успехом во всех указанных выше случаях, против некоторых вирусных инфекций и опухолей. Как правило, rhuINFG можно применять парентерально, предпочтительно путем подкожной инъекции. Максимальная концентрация в сыворотке обнаруживается через семь часов, время полужизни в плазме составляет 30 минут после в/в введения. По этой причине эффективное лечение с помощью rhuINFG включает частые инъекции. Основное побочное действие заключается в лихорадке, ознобе, потоотделении, миалгии и сонливости. Указанное действие ассоциируется с инъецированием rhuINFG и наблюдается в течение первых часов после инъекции. Редкими побочными действиями являются местная боль и эритема, повышение содержания ферментов печени, обратимые грануло- и тромбопения и кардиотоксичность.
Необходимо создать новые молекулы с INFG-активностыо, имеющие улучшенные свойства, по сравнению с hulNFG или rhuINFG, в смысле фармакокинетики, гомогенности, иммуногенности и других побочных действий.
Сущность изобретения
В данной заявке описываются улучшенные INFG-подобные молекулы, обеспечивающие одно или несколько из вышеуказанных нужных свойств. В своем первом аспекте изобретение относится к конъюгату, проявляющему INFG-активность и содержащему, по меньшей мере, одну первую неполипептидную группу, ковалентно присоединенную к INFG-полипептиду, причем полипептид содержит аминокислотную последовательность, отличающуюся от исходного INFG-полипептида, по меньшей мере, на один введенный и/или, по меньшей мере, на один удаленный аминокислотный остаток, содержащий группу для присоединения неполипептидной группы. Конъюгаты имеют удлиненное время полужизни in vivo по сравнению с huINFG и rhuINFG и, необязательно, вызывают пониженную иммунную реакцию по сравнению с rhuINFG. При необходимости указанный класс молекул также имеет еще более улучшенные свойства в смысле способности к образованию гомогенных молекул, улучшенную устойчивость к протеолизу и/или повышенную биологическую доступность.
Следовательно, конъюгат изобретения предоставляет ряд преимуществ по сравнению с доступными в настоящее время соединениями INFG, в том числе более длительный промежуток времени между инъекциями или другими формами введения, более слабое побочное действие и/или повышенную эффективность из-за снижения числа антител. Кроме того, используя конъюгат изобретения, можно получить более высокие дозы активного белка и, таким образом, более эффективную лечебную реакцию.
В другом своем аспекте изобретение относится к конъюгату, проявляющему INFG-активность, содержащему, по меньшей мере, один IFNG-полипептид, обработанный PEG no N-концу. IFNG-полипептид может представлять собой huINFG или любой из IFNG-полипептидов, описанных в данном описании.
Еще в одном своем аспекте изобретение относится к средствам и способам получения конъюгата изобретения, включая нуклеотидные последовательности и экспрессирующие векторы, а также способы получения полипептида или конъюгата.
Еще в других своих аспектах изобретение относится к лечебной композиции, содержащей конъюгат изобретения, к конъюгату или композиции изобретения для применения при лечении, к применению конъюгата или композиции при лечении или для изготовления лечебного средства для лечения заболеваний.
Наконец, изобретение относится к применению определенных конъюгатов INFG для изготовления лечебного средства, фармацевтической композиции или составного набора для лечения интерстициальных болезней легких, рака, инфекционных болезней и/или воспалительных заболеваний, и в случае интерстициальных болезней легких, при необходимости, также в сочетании с глюкокортикоидами.
Подробное описание изобретения
Определения
В контексте настоящей заявки и изобретения применяются описанные далее термины.
Термин "конъюгат" (или, равнозначно, "конъюгированный полипептид") предназначается для того, чтобы определить гетерогенную (в смысле состава или химерности) молекулу, образованную путем ковалентного соединения одного или нескольких полипептидов с одной или несколькими неполипептидными группами. Термин "ковалентное соединение (присоединение)" означает, что полипептид и неполипептидная группа или непосредственно ковалентно соединяются друг с другом или, иначе, косвенно ковалентно соединяются друг с другом через промежуточную группу или группы, такие как мостиковая, спейсерная или линкерная группа или группы. Предпочтительно, конъюгат растворяется при соответствующих концентрациях и условиях, т.е. растворяется в физиологических жидкостях, таких как кровь. Примеры конъюгированных полипептидов изобретения включают гликозилированные и/или обработанные PEG полипептиды. Термин "неконъюгированный полипептид" может быть применен в отношении полипептидной части конъюгата.
Термин "неполипептидная группа" предназначается для определения молекулы, способной к конъюгации с группой для присоединения в IFNG-полипептиде. Предпочтительными примерами такой молекулы являются полимерные молекулы, липофильные соединения, группы сахаров или органические дериватизирующие агенты. При использовании в отношении конъюгата изобретения следует иметь в виду, что неполипептидная группа связывается с полипептидной частью конъюгата через группу для присоединения в полипептиде.
Термин "полимерная молекула" обозначает молекулу, образованную путем ковалентного связывания двух или нескольких мономеров, где ни один из мономеров не является аминокислотным остатком, за исключением случая, когда полимер представляет собой альбумин человека или другой распространенный белок плазмы. Термин "полимер" можно использовать на равных правах с термином "полимерная молекула". Термин "группа сахара" предназначается для определения углеводной молекулы, присоединяемой гликозилированием in vivo или in vitro, например, N- или O-гликозилированием. За исключением случая, где число неполипептидных групп, таких как полимерная(ые) молекула(ы), в конъюгате указывается определенно, при каждом обращении к "неполипетидной группе", содержащейся в конъюгате или иначе используемой в настоящем изобретении, должно быть указано одна группа или несколько неполипептидных групп в конъгате.
Термин "группа для присоединения" предназначен для определения группы аминокислотного остатка, способной к присоединению релевантной неполипептидной группы, такой как полимерная молекула или группа сахара. Полезные группы для присоединения и соответствующие им неполипептидные группы поясняются приведенной далее таблицей.
| Группа для присоед. | Аминокислота | Примеры неполи-пептидн. группы | Способ конъюгации/актив. PEG | Ссылка |
| -NH2 | N-конц. Lys | Полимер, напр., PEG | mPEG-SPA, тре-зилированный mPEG | Shearwater Inc., Delgado et al., Critical rewiews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 9(3,4):249-304 (1992) |
| -СООН | С-конц. Asp, Glu | Полимер, напр., PEG, группа сахара | mPEG-Hz Сочет. in vitro | Shearwater Inc. |
| -SH | Cys | Полимер, напр., PEG | PEG-винилсульфон PEG-малеимид | Shearwater Inc., Delgado et al., Critical rewiews in Therapeutic |
| Sys- | группа сахара | Сочет. in vitro | Drug Carrier terns, 9(3,4):249-304 (1992) | |
| -ОН | Ser, Thr, ОН-, Lys | группа сахара | Гликозилир. О-связ. in vivo | |
| -CONH2 | Asn как часть сайта N-гликозилирования | группа сахара | Гликозилировавание in vivo | |
| Аромат. остаток | Phe, Туг, Trp | группа сахара | Сочетание in vitro | |
| -CONH2 | Gin | группа сахара | Сочетание in vitro | Yan and Wold, Biochemistry, 1984, Jul 31: 23(16):3759-65 |
| Альдегид Кетон | Окисленный углевод | полимер, напр., PEG, PEG-гидразид | Обработка PEG | Andresz et al., 1978, Macromol. Chem., 179:301; WO 92/16555, WO 00/23114 |
| Гуанидино | Arg | группа сахара | Сочетание in vitro | Lundblad and Noyes, Chimical Reagents for Protein Modification, CRC Press Inc., Boca Raton, FI |
| Имида-зольный цикл | His | группа сахара | Сочетание in vitro | Как в случае гуанидино |
В случае N-гликозилирования in vivo термин "группа для присоединения" применяют необычно для того, чтобы указать на аминокислотные остатки, составляющие сайт гликозилирования (с последовательностью N-X'-S/T/C-X", где X' представляет собой любой аминокислотный остаток, за исключением пролина, X" представляет собой любой аминокислотный остаток, который может быть идентичен X' или отличается от него и который предпочтительно отличается от пролина, N представляет собой аспарагин и S/T/C представляет собой или серин, или треонин, или цистеин, предпочтительно серин или треонин и наиболее предпочтительно треонин). Хотя аспарагиновый остаток сайта N-гликозилирования является остатком, к которому во время гликозилирования присоединяется группа сахара, такого присоединения нельзя достигнуть, если не присутствуют другие аминокислотные остатки сайта N-гликозилирования. Соответственно, когда неполипептидная группа представляет собой группу сахара и необходимо достигнуть конъюгации путем N-гликозилирования, термин "аминокислотный остаток, содержащий группу для присоединения неполипептидной группы", используемый в связи с изменениями аминокислотной последовательности исходного полипептида, следует понимать так, что один, два или все аминокислотные остатки, составляющие сайт N-гликозилирования, должны быть изменены таким образом, что или в аминокислотную последовательность вводится функциональный сайт N-гликозилирования, или аминокислотная последовательность удаляется из указанной последовательности.
В настоящей заявке обозначения аминокислот и обозначения атомов (например, СА, СВ, CD, CG, SG, NZ, N, О, С и т.п.) используются так, как указывается в Банке данных по структуре белков (PDB) (www.pdb.org), на основании номенклатуры ИЮПАК (IUPAC Nomenclature and Symbolism for Amino Acids and Peptides (residue names, atoms names etc.), Eur. J. Biochem., 138, 9-37 (1984), вместе с исправлениями к ним в Eur. J. Biochem., 152, 1 (1985). СА иногда обозначают как Сα СВ как Сβ. Термин "аминокислотный остаток" предназначается для обозначения аминокислотного остатка, входящего в группу, состоящую из остатков аланина (Ala или А), цистеина (Cys или С), аспарагиновой кислоты (Asp или D), глутаминовой кислоты (Glu или Е), фенилаланина (Phe или F), глицина (Gly или G), гистидина (His или Н), изолейцина (Не или I), лизина (Lys или К), лейцина (Leu или L), метионина (Met или М), аспарагина (Asn или N), пролина (Pro или Р), глутамина (Gln или Q), аргинина (Arg или R), серина (Ser или S), треонина (Thr или Т), валина (Val или V), триптофана (Trp или W) и тирозина (Tyr или Y). Нумерация аминокислотных остатков в указанном документе начинается с N-конца hulFNG без сигнального пептида (т.е., ПОСЛЕД. №2). Терминологию, используемую для идентификации позиций/замен аминокислот, можно пояснить на примерах N25 (показывает позицию #25, занимаемую аспарагином в аминокислотной последовательности, показанной в ПОСЛЕД. №2) и N25C (показывает, что остаток Asp в позиции 25 заменен Cys). Множественные замены указываются с помощью "+", например QIN+P3T/S обозначает аминокислотную последовательность, содержащую замену остатка Gln в позиции 1 на Asn и замену остатка Pro в позиции 3 на Thr или Ser, предпочтительно на Thr.
Термин "нуклеотидная последовательность" предназначается для указания последовательного участка из двух или нескольких нуклеотидных молекул. Нуклеотидная последовательность может быть геномного происхождения, происходить от кДНК и РНК, полусинтетического и синтетического происхождения или происходить от их любого сочетания.
Термин "полимеразная цепная реакция" или "PCR", как правило, относится к способу амплификации нужной нуклеотидной последовательности in vitro, как описывается, например, в US 4683195. Вообще, метод PCR включает повторяющиеся циклы синтеза для удлинения праймера с использованием олигонуклеотидных праймеров, способных к избирательной гибридизации с матрицей нуклеиновой кислоты.
Термины "клетка", "клетка-хозяин", "клеточная линия" и "клеточная культура" в данном описании используются как равнозначные, и следует иметь в виду, что все такие термины включают потомство, образующееся в результате роста или культивирования клетки. Термины "трансформация" и "трансфекция" используются как равнозначные и относятся к способу введения ДНК в клетку.
Термин "операбельно связанный" относится к ковалентному соединению двух или нескольких нуклеотидных последовательностей с помощью ферментативного лигирования или иным способом в такую конфигурацию одного относительно другого, что может выполняться нормальная функция последовательности. Например, нуклеотидная последовательность, кодирующая препоследовательность или секреторную лидерную последовательность, операбельно связывается с нуклеотидной последовательностью полипептида, если он экспрессируется как препротеин, участвующий в секреции полипептида: промотор или энхансер операбельно связываются с кодирующей последовательностью, если он воздействует на транскрипцию последовательности; рибосомсвязывающий сайт операбельно связывается с кодирующей последовательностью, если располагается так, что облегчается трансляция. Как правило, "опрерабельно связанный" означает, что связывающиеся нуклеотидные последовательности являются соседними и, в случае секреторной лидерной последовательности, соседними и в фазе считывания. Связывание осуществляется посредством лигирования по обычным сайгам рестрикции. Если таких сайтов нет, тогда используют синтетические олигонуклеотидные адаптеры или линкеры, в соединении с обычными методами рекомбинантных ДНК.
Термин "введение", главным образом, предназначается для обозначения замены существующего аминокислотного остатка, но также может обозначать встраивание дополнительного аминокислотного остатка. Термин "удаление", главным образом, предназначается для обозначения замены аминокислотного остатка, который удаляют, на другой аминокислотный остаток, но также может обозначать делецию (без замены) удаляемого аминокислотного остатка.
Термин "аминокислотный остаток, содержащий группу для присоединения неполипептидной группы", предназначается для того, чтобы показать, что аминокислотный остаток является остатком, с которым связывается неполипептидная группа (в случае введенного аминокислотного остатка) или могла бы связываться (в случае удаленного аминокислотного остатка).
Термин "одно различие" или "отличается", применяемый в отношении аминокислотной последовательности IFNG-полипептида, описываемого в данном описании, предназначается для указания на возможность присутствия других различий. Соответственно, кроме различия по определенной аминокислоте, могут быть мутированными другие аминокислотные остатки, кроме указанных.
Термин "функциональное время полужизни in vivo" используется в его обычном значении, т.е., обозначает время, в течение которого 50% молекул конъюгата циркулируют в плазме или кровотоке перед выведением (также называемым "время полужизни в кровяном русле"), или время, в течение которого сохраняется 50% функциональности конъюгата. Полипептид или конъюгат обычно выводится благодаря действию одной или нескольких ретикулоэндотелиальных систем (РЭС), почек, селезенки или печени, или путем специфического или неспецифического протеолиза. Обычно выведение зависит от размера (относительно отрезка для клубочковой фильтрации), нагрузки, присоединенных углеводородных цепей и наличия рецепторов для белка. Обычно сохраняемую функциональность выбирают среди антивирусной, антипролиферативной, иммуномодулирующей или IFNG-рецепторсвязывающей активностей. Функциональное время полужизни in vivo можно определить любым подходящим способом, известным в технике, как описывается далее в разделе "Методы".
Термин "повышенное функциональное время полужизни" применяют, чтобы показать, что функциональное время полужизни in vivo конъюгата статистически существенно возросло относительно времени полужизни молекулы для сравнения, такой как hulFNG, необязательно, в гликозилированной форме, например, hulFNG или rhuIFNG, при определении в сравнимых условиях.
Термин "иммуногенность", используемый в связи с данным веществом, предназначается для указания на способность вещества индуцировать ответ иммунной системы человека. Иммунный ответ может быть опосредованной клеткой или антителом реакцией (для дополнительного определения иммуногенности см., например, Roitt: Essential Immunology (8th Edition, Blackwell)).
Термин "пониженная иммуногенность" предназначается для того, чтобы показать, что конъюгат настоящего изобретения вызывает измеримо более слабый иммунный ответ, чем молекула для сравнения, такая как hulFNG или rhuIFNG, при определении в сравнимых условиях.
Термин "проявляющий IFNG-активность" предназначается для того, чтобы показать, что полипептид обладает одной или несколькими функциями нативного IFNG, в частности, hulFNG или rhuIFNG, в том числе способностью связываться с IFNG-рецептором и вызывать трансдукцию сигнала, трансдуцированного после huIFNG-связывания его рецептора при определении in vitro или in vivo (т.е., биологическая активность in vitro или in vivo). IFNG-рецептор описывается Aguet et al. (Cell, 55:273-280, 1988) и Calderon et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:4837-4841, 1988). "IFNG-полипептид" представляет собой лолипептид, проявляющий IFNG-активность, и такой термин используется в данном описании для полипептида в мономерной или димерной форме, соответственно. Например, когда указываются специфические замены, они обычно указываются относительно мономера IFNG-полипептида. Когда делается ссылка на IFNG-часть конъюгата изобретения, это, как правило, димерная форма (и, таким образом, например, содержит два мономера IFNG-полипептида, модифицированных так, как описано). Димерная форма IFNG-полипептидов может быть образована путем обычного объединения двух мономеров или может представлять собой форму одноцепочечного димерного IFNG-полипептида.
Описываемый в данном описании IFNG-полипептид может обладать биологической активностью in vivo или in vitro такой же величины, как huIFNG или rhuIFNG, или более низкой или более высокой, например биологической активностью in vivo или in vitro в 1-100% биологической активности hulFNG или rhuIFNG, при измерении в сравнимых условиях, например в 1-25% или 1-50% или 25-100% или 50-100% биологической активности huIFNG или rhuIFNG.
Термин ""исходный IFNG" предназначается для обозначения молекулы, модифицируемой согласно изобретению. Как правило, исходный IFNG кодируется нуклеотидной последовательностью, которую модифицируют согласно настоящему изобретению таким образом, чтобы кодировать полипептидную часть конъюгата изобретения. Исходным IFNG, как правило, является huIFNG или rhuIFNG или их варианты или фрагменты. "Вариант" представляет собой полипептид, отличающийся от своего исходного полипетида, как правило, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 аминокислотными остатками. Фрагмент представляет собой часть полноразмерной последовательности huIFNG, проявляющую IFNG-активность, например ее версию, процессированную по С-концу или по N-концу.
Термин "функциональный сайт" предназначается для определения одного или нескольких аминокислотных остатков, которые незаменимы или иначе участвуют в функции или действии IFNG. Такие аминокислотные остатки "локализованы в" функциональном сайте. Функциональный сайт можно определить способами, известными в технике, и, предпочтительно, его идентифицируют анализом структуры полипептида, находящегося в комплексе с релевантным рецептором, таким как IFNG-рецептор.
Конъюгат изобретения
Как указывалось выше, в своем первом аспекте изобретение относится к конъюгату, проявляющему IFNG-активность и содержащему, по меньшей мере, одну неполипептидную группу, ковалентно связанную с IFNG-полипептидом, причем полипептид содержит аминокислотную последовательность, отличающуюся от аминокислотной последовательности IFNG-полипептида, по меньшей мере, на один введенный и/или, по меньшей мере, один удаленный аминокислотный остаток, содержащий группу для присоединения неполипептидной группы.
Путем удаления или введения аминокислотного остатка, содержащего группу для присоединения неполипептидной группы, можно специфически адаптировать полипептид таким образом, чтобы получить молекулу, более поддающуюся конъюгации с выбранной неполипептидной группой, чтобы оптимизировать картину конъюгации (например, обеспечить оптимальное распределение неполипептидных групп на поверхности IFNG-полипептида) и, таким образом, получить новую конъгатную молекулу, проявляющую IFNG-активность и, кроме того, одно или несколько улучшенных свойств по сравнению с доступными в настоящее время молекулами на основе huIFNG и rhuIFNG. Например, путем введения групп для присоединения IFNG-полипептид усиливается или изменяется иным образом, по содержанию специфичных аминокислотных остатков, с которыми связывается релевантная неполипептидная группа, посредством чего достигается более эффективная и/или расширенная конъюгация. Путем удаления одной или нескольких групп для присоединения можно избежать конъюгации с неполипептидной группой в частях полипептида, где такая конъюгация невыгодна, например, с аминокислотным остатком, расположенном в или вблизи функционального сайта полипептида (так как конъюгация в таком сайте может привести к инактивации или снижению IFNG-активности полученного конъюгата из-за ухудшенного узнавания рецептора). Кроме того, может оказаться выгодным удаление группы для присоединения, расположенной рядом с другой группой для присоединения, для того, чтобы избежать гетерогенной конъюгации по таким группам. В предпочтительных вариантах воплощения изобретения изменяют свыше одного аминокислотного остатка IFNG-полипептида, например альтерация заключает в себе удаление, а также введение аминокислотных остатков, содержащих сайты присоединения для выбранной неполипептидной группы. Предполагается, что такой вариант особенно интересен в том отношении, что можно специфически создать IFNG-полипептид таким образом, чтобы получить оптимальную конъюгацию с неполипептидной группой.
Кроме удаленного и/или введенного аминокислотного остатка, полипептид может содержать другие замены, не относящиеся к введению и/или удалению аминокислотных остатков, содержащих группу для присоединения неполипептидной группы.
Хотя исходный полипептид, модифицируемый по настоящему изобретению, может представлять собой любой полипептид с IFNG-активностью, и, таким образом, иметь любое происхождение, например, происходить не от человека, а от другого млекопитающего, предпочтительно, чтобы исходный полипептид представлял собой hulFNG с аминокислотной последовательностью, представленной в ПОСЛЕД. №2 или его вариантом или фрагментом. Примеры вариантов huIFNG описываются выше при описании предпосылок изобретения и включают, например, huIFNG с добавлением по N-концу CYC и модифицированные цистеином варианты, описываемые в US 6046034. Конкретными примерами фрагментов являются фрагменты, описываемые выше в разделе "Уровень техники", и к ним относятся huIFNG, процессированные по С-концам на 1-15 аминокислотных остатков, например на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 аминокислотных остатков, и/или процессированные по N-концам на 1-3 аминокислотных остатка.
Следует иметь в виду, что когда исходный IFNG-полипептид является вариантом или фрагментом huIFNG, модифицированный IFNG-полипептид, полученный из такого источника, содержит мутации или усечения исходной молекулы.
Исходный IFNG-полипептид также может представлять собой молекулу-гибрид мономера IFNG-полипептида и другого гомологичного полипептида, необязательно содержащий одну или несколько дополнительных замен, введенных в гибридную молекулу. Такие гибриды описываются выше в разделе "Уровень техники". Такая гибридная молекула может содержать аминокислотную последовательность, отличающуюся, в пределах 15, например, на 10 аминокислотных остатков, от аминокислотной последовательности, представленной ПОСЛЕД. №2. Для того, чтобы быть полезной для настоящего изобретения, гибридная молекула должна проявлять IFNG-активность.
Исходные IFNG, происходящие не от человека, можно модифицировать аналогично тому, как описано в данном описании, например, модифицируя соответствующую позицию IFNG, происходящего не от человека (например, определяемую из сравнительного анализа аминокислотной последовательности или 3D-структуры указанного IFNG и huIFNG), на позицию, описанную здесь.
Следует иметь в виду, что аминокислотный остаток, содержащий группу для присоединения неполипептидной группы, или удаляемый, или вводимый, выбирают на основе характера выбранной неполипептидной группы и, в большинстве случаев, на основе используемого способа конъюгации. Например, когда неполипетидная группа представляет собой полимерную молекулу, такую как полиэтиленгликоль или молекула, образованная от полиалкиленоксида, аминокислотные остатки, способные функционировать как группа для присоединения, можно выбрать из группы, состоящей из цистеина, лизина, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты и аргинина. Когда неполипептидная группа является группой сахара, группа для присоединения представляет собой, например, сайт гликозилирования in vivo, предпочтительно сайт N-гликозилирования.
Всякий раз, когда в IFNG-полипептид необходимо ввести группу для присоединения неполипептидной группы или удалить указанную группу согласно настоящему изобретению, позицию модифицируемого полипептида обычно выбирают следующим образом.
Позиция, предпочтительно, локализована на поверхности IFNG-полипептида и предпочтительнее занимается аминокислотным остатком, у которого более 25% его боковой цепи доступно для растворителя, предпочтительно более 50% его боковой цепи доступно для растворителя, что определяют на основе 3D-структуры или модели IFNG в его димерной форме, причем структура или модель, необязательно, также содержит одну или две молекулы IFNG-рецептора. Такие позиции (например, представляющие свыше 25% или свыше 50% доступной поверхности на модели с или без рецепторных молекул) перечислены в данном описании в разделе "Материалы и методы".
Также должна представлять интерес модификация любого из 23 С-концевых аминокислотных остатков исходного IFNG (путем введения и/или удаления аминокислотных остатков, содержащих группу для присоединения неполипептидной группы), так как такие остатки, как полагают, локализованы на поверхности IFNG-полипептида.
Кроме того, в IFNG-полипептидной части конъюгата изобретения группу для присоединения, расположенную в рецепторсвязывающем сайте IFNG, предпочтительно, удаляют, предпочтительно, путем замены аминокислотного остатка, содержащего такую группу. Аминокислотные остатки рецепторсвязывающего сайта IFNG идентифицированы ниже в разделе "Материалы и методы". В случае одноцепочечного IFNG-полипептида может быть достаточным удаление групп для присоединения в рецепторсвязывающем сайте только одного из мономеров и посредством этого получить конъюгат одноцепочечного IFNG-полипептида с одним активным и одним неактивным рецепторсвязывающим сайтом.
Для того, чтобы определить оптимальное распределение групп для присоединения, вычисляют расстояние между аминокислотными остатками, локализованными на поверхности IFNG-полипептида, на основе 3D-структуры IFNG-димерного полипептида. Конкретнее, определяют расстояние между СВ аминокислотных остатков, содержащих такие группы для присоединения, или расстояние между функциональной группой (NZ в случае лизина, CG в случае аспарагиновой кислоты, CD в случае глутаминовой кислоты, SG в случае цистеина) одного и СВ другого аминокислотного остатка, содержащего группу для присоединения. В случае глицина вместо СВ используют СА. В IFNG-полипептидной части конъюгата изобретения любое из указанных расстояний составляет, предпочтительно, более 8Å, в частности более 10Å, для того, чтобы избежать или уменьшить гетерогенную конъюгацию.
Также аминокислотная последовательность IFNG-полипептида может отличаться от аминокислотной последовательности исходного полипептида в том, что удаляют один или несколько аминокислотных остатков, составляющих часть эпитопа, предпочтительно, путем замены на аминокислотный остаток, содержащий группу для присоединения неполипептидной группы, с тем, чтобы разрушить или инактивировать эпитоп. Эпитопы huIFNG или rhuIFNG можно идентифицировать, используя способы, известные в технике, также известные как картирование эпитопов, см., например, Romagnoli et al., Biol. Chem., 1999, 380(5):553-9, DeLisser H.M., Methods Mol. Biol., 1999, 96:11-20; Van de Water et al., Clin. Immunol. Immunopathol., 1997, 85(3):229-35, Saint-Remy J.M., Toxicology, 1997, 119 (1):77-81 и Lane D.P. and Stephen C.W., Curr. Opin. Immunol., 1993, 5(2):268-71. По одному из способов необходимо установить библиотеку фаговых отображений, экспрессирующую рандомизированные олигопептиды из, например, 9 аминокислотных остатков. Анти-IgGl антитела из специфической антисыворотки к huIFNG или rhuIFNG выделяют в чистом виде иммунопреципитацией, и реакционноспособные фаги идентифицируют методом иммуноблоттинга. Секвенированием ДНК очищенных реакционноспособных фагов можно определить последовательность олигопептида с последующей локализацией последовательности на 3D-структуре IFNG. Посредством этого идентифицированная область на структуре составляет эпитоп, который затем можно выбрать в качестве области-мишени для введения группы для присоединения неполипептидной группы.
Для того, чтобы избежать слишком большого нарушения структуры и функции молекулы исходного IFNG, общее число изменяемых аминокислотных остатков, согласно настоящему изобретению (при сравнении с аминокислотной последовательностью, представленной ПОСЛЕД. №2), как правило, не должно превышать 15. Предпочтительно, IFNG-полипептид содержит аминокислотную последовательность, отличающуюся на 1-15 аминокислотных остатков от аминокислотной последовательности, представленной ПОСЛЕД. №2, например, отличающуюся на 1-8 или на 2-8 аминокислотных остатков, например на 1-5 или 2-5 аминокислотных остатков, от аминокислотной последовательности, представленной ПОСЛЕД. №2. Таким образом, как правило, IFNG-полипептид содержит аминокислотную последовательность, отличающуюся от зрелой части аминокислотной последовательности, представленной ПОСЛЕД. №2, на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 аминокислотных остатков. Предпочтительно, вышеуказанные числа представляют или общее число введенных или общее число удаленных аминокислотных остатков, содержащих группу для присоединения релевантной/ых неполипептидной/ых группы/групп, или общее число введенных и удаленных аминокислотных остатков, содержащих такую группу.
Точное число групп для присоединения, доступных для конъюгации и имеющихся в IFNG-полипептиде в димерной форме, зависит от действия, которое требуется достигнуть путем конъюгации. Получаемое действие, например, зависит от характера и степени конъюгации (например, идентичности неполипептидной группы, числа неполипептидных групп, требуемых для конъюгации или которые могут конъюгировать с полипептидом, где они должны быть конъюгированы и где следует избежать конъюгации, и т.п.).
IFNG-полипептидная часть конъюгата изобретения может находиться в процессированной форме (например, с процессированными 1-15 С-концевыми аминокислотными остатками, как описано выше в связи с исходным IFNG-полипептидом, или процессированными 1-3 N-концевыми аминокислотными остатками).
Функциональное время полужизни in vivo зависит, например, от молекулярной массы конъюгата, и число групп для присоединения, необходимых для получения повышенного времени полужизни, таким образом, зависит от молекулярной массы обсуждаемой неполипептидной группы. В одном из вариантов конъюгат изобретения имеет молекулярную массу, по меньшей мере, 67 кДа, в частности, по меньшей мере, 70 кДа, при измерении методом SDS-PAGE согласно Laemmli U.K., Nature, Vol.227 (1970), p.680-85. IFNG имеет молекулярную массу в интервале 34-50 кД, и, следовательно, требуются еще примерно 20-40 кДа, чтобы получить нужное действие. Это можно обеспечить, например, с помощью 2-4 молекул PEG в 10 кДа или иным образом, как описано в данном описании.
Предпочтительно, чтобы в конъюгате изобретения, по меньшей мере, примерно 50% всех способных к конъюгации групп для присоединения, например, по меньшей мере, 80%, а предпочтительно все такие группы, занимали релевантные неполипептидные группы. Соответственно, в предпочтительном варианте конъюгат изобретения содержит, например, 1-10 неполипетидных групп, например 2-8 или 3-6.
Как указывалось выше, в физиологических условиях IFNG существует в виде димерного полипептида. Согласно изобретению, IFNG-полипептидная часть конъюгата изобретения обычно находится в гомодимерной форме (например, полученной путем ассоциации двух молекул IFNG-полипептида, полученных как описано выше). Однако при необходимости IFNG-полипептидную часть конъюгата изобретения можно получить в форме одной цепи, где два мономера IFNG-полипептида соединяются через пептидную связь или пептидный линкер. Получение IFNG-полипептида в одноцепочечной форме имеет преимущество в том, что два составляющих IFNG-полипептида могут быть разными, когда это может быть выгодным, например, для того, чтобы обеспечить асимметричный мутагенез полипептидов. Например, из рецепторсвязывающего сайта одного из мономеров можно удалить сайты присоединения PEG, но сохранить их в другом. Посредством этого после обработки PEG один мономер имеет интактный рецепторсвязывающий сайт, в то время как в другом может произойти полное присоединение PEG (и обеспечить таким образом существенное возрастание молекулярной массы).
Предпочтительно, конъюгат изобретения имеет одно или несколько из перечисленных далее улучшенных свойств: 1) повышенное время полужизни in vivo по сравнению с hulFNG или rhuIFNG, например, повышенное в, по меньшей мере, примерно 5 раз, например, по меньшей мере, в 10 раз или даже больше; 2) пониженная иммуногенность по сравнению с hulFNG или rhuIFNG, например, пониженная на, по меньшей мере, 25%, например, на, по меньшей мере, 50% и предпочтительнее на, по меньшей мере, 75%.
Конъюгат изобретения, где неполипептидная группа является группой сахара
В предпочтительном варианте конъюгата изобретения первая неполипептидная группа является группой сахара, например О-присоединяемой или N-присоединяемой группой сахара, и IFNG-полипептид содержит, по меньшей мере, один удаленный и/или, по меньшей мере, один введенный сайт гликозилирования in vivo.
Например, сайт гликозилирования in vivo вводят в позицию исходного IFNG-полипептида, занимаемую аминокислотным остатком, обращенным к поверхности полипептида, предпочтительно, со свыше 25% боковой цепи, доступными для растворителя, в частности со свыше 50% боковой цепи, доступными для растворителя (указанные позиции идентифицируются в данном описании в разделе "Методы"). Сайт N-гликозилирования вводят таким образом, что остаток N указанного сайта локализуется в указанной позиции. Аналогично, сайт O-гликозилирования вводят таким образом, что в указанной позиции локализуется остаток S или Т, составляющие такой сайт. Кроме того, для того, чтобы обеспечить эффективное гликозилирование, предпочтительно, чтобы сайт гликозилирования in vivo, в частности остаток N сайта N-гликозилирования или остаток S или Т сайта O-гликозилирования, локализовался в пределах 118 N-концевых аминокислотных остатков IFNG-полипептида, предпочтительнее в пределах 93 N-концевых аминокислотных остатков. Еще более предпочтительно, когда сайт гликозилирования in vivo вводят в позицию, где для создания сайта необходима только одна мутация (т.е., где любые другие аминокислотные остатки, требуемые для создания функционального сайта гликозилирования, уже присутствуют в молекуле).
Например, замены, которые приводят к введению дополнительного сайта N-гликозилирования в позициях, обращенных к поверхности IFNG-полипептида и занимаемых аминокислотными остатками со свыше 25% боковой цепи, обращенными к поверхности (в структуре с рецепторной молекулой), включают
Q1N+P3S/T, P3N+V5S/T, K6N+A8S/T, E9N+L11S/T, K12S/T, K13N+F15S/T, Y14N+N16S/T, G18S/T, G18N, G18N+S20T, H19N+D21S/T, D21N+A23S/T, G26N+L28S/T, G31N+L33S/T, K34N+W36S/T, K37S/T, K37N+E39S/T, E38N, E38N+S40T, E39N+D41S/T, S40N+R42S/T, K55N+F57S/T, K58N+F60S/T, K61S/T, K61N+D63S/T, D62N+Q64S/T, D63N, D63N+S65T, Q64N+I66S/T, S65N+Q67S/T, Q67N, Q67N+S69T, K68N+V70S/T, E71N+I73S/T, T72N+K74S/T, K74N+D76S/T, E75N+M77S/T, K80S/T, V79N+F81S/T, K80N+F82S/T, N85S/T, S84N+K86S/T, K87S/T, K86N+K88S/T, K87N+R89S/T, D90N+F92S/T, E93N+L95S/T, K94N, K94N+T96S, S99N, S99N+T101S, T101N+L103S/T, D102N+N104S/T, L103N+V105S/T, Q106S/T, E119N, E119N+S121T, P122N+A124S/T, A123N+K125S/T, A124N, A124N+T126S, K125N+G127S/T, T126N+K128S/T, G127N+R129S/T, K128N+K130S/T, R129N+R131S/T, K130N, K130N+S132T, R131N+Q133S/T, S132N+M134S/T, Q133N+L135S/T, M134N+F136S/T, L135N+R137S/T, F136N+G138S/T, R137N+R139S/T, G138N+R140S/T, R139N+A141S/T, R140N и R140N+S142T, причем замены указываются относительно huIFNG с аминокислотной последовательностью, представленной ПОСЛЕД. №2. S/T показывает замену на остаток серина или треонина, предпочтительно на остаток треонина.
Замены, которые приводят к введению дополнительного сайта N-гликозилирования в позициях, обращенных к поверхности IFNG-полипептида, со свыше 50% боковой цепи, обращенными к поверхности (в структуре с рецепторной молекулой), включают P3N+V5S/T, K6N+A8S/T, K12S/T, K13N+F15S/T, G18S/T, D21N+A23S/T, G26N+L28S/T, G31N+L33S/T, K34N+W36S/T, K37N+E39S/T, E38N, E38N+S40S/T, E39N+D41S/T, K55N+F57S/T, K58N+P60S/T, K61S/T, D62N+Q64S/T, Q64N+I66S/T, S65N+Q67S/T, K68N+V70S/T, E71N+I73S/T, E75N+M77S/T, N85S/T, S84N+K86S/T, K86N+K88S/T, K87N+R89S/T, K94N, K94N+T96S, S99N, S99N+T101S, T101N+L103S/T, D102N+N104S/T, L103N+V105S/T, Q106S/T, P122N+A124S/T, A123N+K125S/T, A124N, A124N+T126S, K125N+G127S/T, T126N+K128S/T, G127N+R129S/T, K128N+K130S/T, R129N+R131S/T, K130N, K130N+S132T, R131N+Q133S/T, S132N+M134S/T, Q133N+L135S/T, M134N+F136S/T, L135N+R137S/T, F136N+G138S/T, R137N+R139S/T, G138N+R140S/T, R139N+A141S/T, R140N и R140N+S142T, причем замены указываются относительно huIFNG с аминокислотной последовательностью, представленной ПОСЛЕД. №2.
Замены, где требуется только одна мутация для того, чтобы ввести сайт N-гликозилирования, включают K12S/T, G18S/T, G18N, K37S/T, E38N, M45N, I49N, K61S/T, D63N, Q67N, V70N, K80S/T, F82N, N85S/T, K87S/T, K94N, S99N, Q106S/T, E119N, A124N, K130N и R140N, в частности K12S/T, G18N, G18S/T, K37S/T, E38N, K61S/T, D63N, Q67N, K80S/T, N85S/T, K94N, S99N, Q106S/T, A124N, K130N и R140N (позиции со свыше 25% своей боковой цепи, обращенными к поверхности (в структуре с без рецепторной молекулы) или, предпочтительнее, G18N, E38N, D63N, Q67N, K94N, S99N, A124N, K130N и R140N (со свыше 50% своей боковой цепи, обращенными к поверхности в структуре с без рецепторной молекулы).
Из приведенного выше перечня замен предпочтительно выбирать замены, локализованные в пределах 118 N-концевых аминокислотных остатков, в частности в пределах 93 N-концевых аминокислотных остатков.
Как указывалось выше, кроме одного или нескольких введенных сайтов гликозилирования, из IFNG-полипептида можно удалить существующие сайты гликозилирования. Например, любую из перечисленных выше замен для введения сайта гликозилирования можно объединить с заменой для удаления любого из двух природных сайтов N-гликозилирования IFNG. Например, IFNG-полипептид может содержать замену N25 и/или N97, например, одну из замен N25K/C/D/E и/или N97K/C/D/E, если конъюгат изобретения содержит неполипептидную группу, причем полипептид содержит в качестве группы для присоединения релевантные К, С, D, Е.
IFNG-полипептидная часть конъюгата изобретения может содержать один сайт гликозилирования in vivo на мономер. Однако для того, чтобы стать достаточным по размеру для повышения функционального времени полужизни, часто желательно, чтобы полипептид содержал более одного сайта гликозилирования in vivo, в частности 2-7 сайтов гликозилирования in vivo, например 2, 3, 4, 5, 6 или 7 сайтов гликозилирования in vivo. Таким образом, IFNG-полипептид может содержать один дополнительный сайт гликозилирования на мономер или может содержать два, три, четыре, пять, шесть, семь или больше введенных сайтов гликозилирования in vivo, предпочтительно, введенных с помощью одной или нескольких замен, перечисленных в любом из приведенных выше перечней.
Удаления и/или введения сайта гликозилирования in vitro можно достигнуть так, как описывается в последующих разделах в связи с модификацией IFNG-полипептида для введения и/или удаления сайтов для присоединения полимера.
Любой из гликозилированных IFNG-полипептидов, описанных в данном разделе, имеющий введенный и/или удаленный, по меньшей мере, один сайт гликозилирования, затем можно конъюгировать с другой неполипептидной группой. Например, другой неполипептидной группой является молекула полимера, такого как PEG/ или любая другая неполипептидная группа. Для указанной цели конъюгации можно достигнуть, используя группы для присоединения, уже имеющиеся в IFNG-полипептиде, или группы для присоединения можно ввести и/или удалить, в частности, таким образом, чтобы в целом доступными для конъюгации были 1-6, в частности, 3-4 или 1, 2, 3, 4, 5 или 6 групп для присоединения. Предпочтительно, в конъюгате изобретения, где IFNG-полипептид содержит два сайта гликозилирования, число и молекулярную массу неполипептидных групп выбирают таким образом, чтобы общая молекулярная масса, добавляемая неполипептидной группой, находилась в интервале 20-40 кДа, в частности примерно 20 кДа или 30 кДа.
В частности, гликозилированный IFNG-полипептид можно конъюгировать с полимером, имеющим в качестве группы для присоединения цистеин. Для указанной цели один или несколько цистеиновых остатков встраивают в IFNG-полипептид, например, так, как описывается в разделе, озаглавленном "Конъюгат изобретения, где неполипептидная группа является молекулой, содержащей цистеин в качестве группы для присоединения".
С другой стороны или кроме того, гликозилированный IFNG-полипептид можно конъюгировать с полимером, имеющим в качестве группы для присоединения лизин. Для указанной цели один или несколько остатков лизина исходного полипептида можно удалить, например, путем любой из замен, указанных в разделе, озаглавленном "Конъюгат изобретения, где неполипептидная группа является молекулой, содержащей лизин в качестве группы для присоединения". С другой стороны, или кроме того, остаток лизина можно ввести, например, с помощью одной или нескольких замен, упомянутых в указанном разделе.
В качестве альтернативы конъюгации с полимером через цистеиновую или лизиновую группу конъюгации можно достигнуть через кислотную группу, как описывается в разделе, озаглавленном "Конъюгат изобретения, где неполипептидная группа связывается с кислотной группой", или через любую другую подходящую группу.
Конъюгат изобретения, где первой неполипептидной группой является полимер
В альтернативном варианте первой неполипептидной группой является полимер, например, любой из описанных в разделе, озаглавленном "Конъюгация с молекулой полимера", в частности линейная или разветвленная молекула PEG, например, с цистеином, лизином, аспарагиновой кислотой и глутаминовой кислотой в качестве группы для присоединения. Введение и/или удаление группы для присоединения такого полимера иллюстрируется в последующих разделах. IFNG-полипептидная часть конъюгата по данному варианту может представлять собой гликозилированный полипептид, например, где используют один или оба природных сайта N-гликозилирования huIFNG или введенный сайт гликозилирования, как описывается в предыдущем разделе.
Конъюгат изобретения, где неполипептидная группа представляет собой молекулу с цистеином в качестве группы для присоединения
В предпочтительном варианте воплощения изобретения первой неполипептидной группой является полимер, для которой в качестве группы присоединения выступает цистеин, и, по меньшей мере, один цистеиновый остаток вводят в позицию IFNG-полипептида, которую в IFNG дикого типа человека занимает обращенный к поверхности аминокислотный остаток. Предпочтительно, остаток цистеина вводят согласно общим представлениям о введении и/или удалении групп для присоединения неполипептидных групп, приведенным в разделе, озаглавленном "Конъюгат изобретения". Например, IFNG-полипептид может содержать, по меньшей мере, одну замену, выбранную из группы, состоящей из Р3С, К6С, N10C, К13С, N16C, D21C, N25C, G26C, G31C, К34С, К37С, Е38С, Е39С, К55С, К58С, N59C, D62C, Q64C, S65C, К68С, Е71С, Е75С, N83C, S84C, К86С, К87С, К94С, N97C, S99C, Т101С, D102C, L103C и N104C (введение остатка цистеина в позицию, занимаемую аминокислотным остатком, у которого свыше 50% его боковой цепи обращено к поверхности в структуре с рецептором). Замены N25C и N97C представляют особый интерес, в особенности N25C + N97C, когда IFNG-полипептид экспрессируется в негликозилирующей клетке-хозяине, такой как E. coli, так как N25C и N97C составляют часть присущего huIFNG сайта гликозилирования.
Также, или с другой стороны, IFNG-полипептид по данному варианту воплощения изобретения может содержать, по меньшей мере, один остаток цистеина, введенный в позицию, занимаемую любым из аминокислотных остатков 121-143 hulFNG.
Предпочтительно, IFNG-полипептид конъюгата, согласно данному аспекту, содержит в целом 1-8, например 2-6 остатков Cys, например 1-3 остатка Cys, на мономер.
Конъюгации между полипептидом и полимером можно достичь любым подходящим способом, например так, как описывается в разделе, озаглавленном "Конъюгация с молекулой полимера", например, при использовании одностадийного способа или двухстадийным методом, описываемыми в указанном разделе. Когда конъюгат содержит две или большее число первых неполипептидных групп, как правило, каждая из них имеет молекулярную массу 5 или 10 кДа. Подходящим полимером является VS-PEG.
Конъюгат изобретения, где неполипептидная группа представляет собой молекулу с лизином в качестве группы для присоединения
Согласно данному варианту воплощения изобретения, неполипептидная группа представляет собой полимер с лизином в качестве группы для присоединения, и IFNG-полипептид модифицируют таким образом, что, по меньшей мере, один остаток лизина удаляют, причем остаток лизина выбирают из группы, состоящей из К6, К12, К13, К34, К37, К43, К55, К61, К68, К74, К80, К86, К87, К88, К94, К108, К125, К128 и К130, причем нумерация осуществляется относительно ПОСЛЕД. №2. Предпочтительнее, по меньшей мере, удаляют один остаток лизина, выбранный из группы, состоящей из К12, К34, К37, К108, К128 и К130. Посредством этого можно избежать конъюгации такого/таких остатков. Лизиновый(е) остаток (остатки) можно заменить любым другим аминокислотным остатком, но, предпочтительно, проводят замену на аргинин или глутамин.
Кроме того, IFNG-полипептид можно модифицировать с целью введения одного или нескольких остатков лизина, в частности, в позицию IFNG-полипептида, занимаемую обращенным к поверхности аминокислотным остатком. Предпочтительно, остаток лизина вводят согласно общим представлениям о введении и/или удалении групп для присоединения неполипептидной группы, приведенным в разделе, озаглавленном "Конъюгат изобретения", в частности, в позиции, которую занимает аминокислотный остаток с, по меньшей мере, 25%, например, по меньшей мере, 50%, его боковой цепи, обращенными к поверхности (причем такие позиции идентифицируются в разделе данного описания "Материалы и методы"). Также, по меньшей мере, один остаток лизина можно ввести путем замены любого из аминокислотных остатков 121-143 ПОСЛЕД. №2. С другой стороны, IFNG-полипептид может содержать лизин в, по меньшей мере, одной позиции, выбранной из группы, состоящей из D2, Е7, Е9, Н19, D21, D24, N25, Е38, Е39, D41, R42, D62, D63, Е71, Е75, D76, R89, D90, D91, Е93, N97, R107, H111, E112, Е119, R129, R131, R137, R139 и R140 ПОСЛЕД. №2 (позиции, занимаемые остатком N, R, D, Е или Н в huIFNG).
Согласно данному варианту воплощения изобретения, IFNG-полипептид содержит замену в одной или нескольких вышеуказанных позициях, в частности 1-15, например 1-8 или 2-8, предпочтительно в 1-5 или 2-5 позициях (удаление и/или введение остатков лизина) в мономере. Например, IFNG-полипептид может содержать замену в 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 вышеуказанных позициях. Замены N25K и N97K представляют особый интерес, в особенности N25K + N97K, когда IFNG-полипептид экспрессируется в негликозилирующей клетке-хозяине, такой как Е. coli, так как N25K и N97K составляют часть присущего hulFNG сайта гликозилирования.
Например, IFNG-полипептид конъюгата изобретения согласно данному варианту может содержать, по меньшей мере, одну из указанных выше замен для введения остатка лизина в сочетании с, по меньшей мере, одной заменой, удаляющей остаток лизина, как указано выше (предпочтительно, замену на R или Q), Например, IFNG-полипептид содержит, по меньшей мере, одну из замен N25K и N97K в сочетании с, по меньшей мере, одной заменой K128R, K128Q, K130R или K130Q. Даже конкретнее, IFNG-полипептид содержит замену N25K + K128R, N25K + K130R, N25K + K128R + K130R, N97K + K128R, N97K + K130R, N97K + K128R + K130R, N25K + N97K + K128R + K130R, N25K + N97K + K128R и N25K + N97K + K130R.
Несмотря на то, что неполипептидная группа конъюгата, согласно данному аспекту изобретения, может представлять собой любую молекулу, для которой, при использовании данного способа конъюгации, в качестве группы для присоединения выступает лизин (такую как группа сахара, липофильная группа или органический дериватизирующий агент), предпочтительно, чтобы неполипептидная группа представляла собой молекулу полимера. Молекула полимера может представлять собой любую из молекул, указанных в разделе, озаглавленном "Конъюгация с молекулой полимера", но предпочтительно, выбранной из группы, состоящей из линейного или разветвленного полиэтиленгликоля или полиалкиленоксида. Наиболее предпочтительно, молекула полимера представляет собой SS-PEG, NPC-PEG, альдегид-PEG, mPEG-SPA, mPEG-SCM или mPEG-BTC от Shearwater Polymers Inc., SC-PEG от Enzon Inc., трезилированный mPEG, описанный в US 5880255, или оксикарбонилокси-N-дикарбоксимид-PEG (US 5122614). Как правило, для конъюгации по остатку лизина неполипептидная группа имеет ММ примерно 5 или 10 кДа.
Конъюгат изобретения, где неполипептидная группа связывается по кислотной группе
Еще в одном из вариантов воплощения изобретения неполипептидная группа конъюгата изобретения представляет собой молекулу, для которой в качестве группы для присоединения выступает кислотная группа, и IFNG-полипептид содержит аминокислотную последовательность, отличающуюся от аминокислотной последовательности, представленной в ПОСЛЕД. №2, тем, что, по меньшей мере, один обращенный к поверхности аминокислотный остаток заменен на остаток аспарагиновой кислоты или остаток глутаминовой кислоты, предпочтительно, согласно общим представлениям, приведенным в разделе, озаглавленном "Конъюгат изобретения".
С другой стороны, остаток Asp или Glu можно ввести в позицию исходного IFNG-полипептида, занимаемую К, R, Q или N. Например, остатком Asp или Glu можно заменить N25, N97, К125, К128, R129, К130 и/или R131, предпочтительнее N25 и/или N97, наиболее предпочтительно N25 + N97.
Аналогично описанному в предыдущих разделах, один или несколько остатков Asp или Glu можно удалить, например, из рецепторсвязывающего сайта в случае, когда неполипептидная группа является группой, связывающейся по указанным остаткам.
Несмотря на то, что неполипептидная группа конъюгата, согласно указанному аспекту изобретения, которая имеет кислотную группу в качестве группы для присоединения, может представлять собой любую неполипептидную группу с таким свойством, в настоящее время предпочтительно, чтобы неполипептидная группа представляла собой молекулу полимера или органический дериватизирующий агент, в частности молекулу полимера, и конъюгат получают, например, так, как описывается в Sakane and Pardridge, Pharmaceutical Research, Vol.14, No.8, 1997, pp.1085-1091.
Неполипептидная группа конъюгата изобретения
Как уже указывалось выше, неполипептидную группу конъюгата изобретения выбирают, предпочтительно, из группы, состоящей из молекулы полимера, липофильного соединения, группы сахара (например, путем гликозилирования in vivo) и органического дериватизирующего агента. Все указанные агенты могут придавать полипептидной части конъюгата нужные свойства, в частности повышенное функциональное время жизни in vivo и/или пониженную иммуногенность. Полипептидную часть конъюгата, как правило, конъюгируют только с одним типом неполипептидной группы, но ее также можно конъюгировать с двумя или большим числом различных типов неполипептидных групп, например с молекулой полимера и группой сахара, с липофильной группой и группой сахара, с органическим дериватизирующим агентом и группой сахара, с липофильной группой и молекулой полимера и т.п.. Конъюгацию с двумя или большим числом различных неполипептидных групп можно осуществлять одновременно или последовательно.
Способы получения конъюгата изобретения
В последующих разделах "Конъюгация с липофильным соединением", "Конъюгация с молекулой полимера", "Конъюгация с группой сахара" и "Конъюгация с органическим дериватизирующим агентом" описывается конъюгация с конкретными группами неполипептидных групп.
Конъюгация с липофильным соединением
Полипептид и липофильное соединение можно конъюгировать друг с другом или непосредственно или с использованием линкера. Липофильное соединение может представлять сбой природное соединение, такое как насыщенная или ненасыщенная жирная кислота, дикетон жирной кислоты, терпен, простагландин, витамин, каротеноид или стероид, или синтетическое соединение, такое как карбоновая кислота, спирт, амин и сульфоновая кислота, с одним или несколькими алкил-, арил-, алкенил- или другими соединениями с несколькими ненасыщенностями. Конъюгацию между полипептидом и липофильным соединением, необязательно через линкер, можно осуществить согласно способам, известным в технике, например, так, как описывается в Bodanzky, Peptide Synthesis, John Wiley, New York, 1976, и в WO 96/12505.
Конъюгация с полимерной молекулой
Полимерная молекула для сочетания с полипептидом может представлять собой любую подходящую полимерную молекулу, такую как природный или синтетический гомополимер или гетерополимер, как правило, с молекулярной массой в интервале 300-100000 Да, например 300-20000 Да, предпочтительнее в интервале 500-10000 Да и даже предпочтительнее в интервале 500-5000 Да.
Примерами гомополимеров являются полиол (т.е., поли-ОН-соединение), полиамин (т.е., поли-NH2-соединение) и поликарбоновая кислота (т.е., поли-СООН-соединение). Гетерополимер представляет собой полимер, содержащий одну или несколько разных вступающих в сочетание групп, например гидроксильную группу и аминогруппу.
Примерами подходящих молекул полимера являются молекулы полимеров, выбранных из группы, состоящей из полиалкиленоксида (РАО), включая полиалкиленгликоль (PAG), такой как полиэтиленгликоль (PEG) и полипропиленгликоль (PPG), разветвленных PEG, поливинилового спирта (PVA), поликарбоксилата, поливинилпирролидона, полиэтилена с малеиновым ангидридом, полистирола с малеиновым ангидридом, декстрана, включая карбоксиметилдекстран, или любого другого биополимера, подходящего для снижения иммуногенности и/или повышения функционального времени полужизни in vivo и/или времени полужизни в кровяном русле. Еще одним примером молекулы полимера является альбумин человека или другой распространенный белок плазмы. Как правило, полимеры - производные полиалкиленгликолей являются биологически совместимыми, нетоксичными, неантигенными, неиммуногенными, имеют различную растворимость в воде и легко выводятся из живых организмов.
PEG является предпочтительной используемой молекулой полимера, так как имеет только несколько реакционноспособных групп, способных образовывать поперечные связи, по сравнению, например, с полисахаридами, такими как декстран и т.п.. В частности, представляет интерес монофункциональный PEG, т.е. монометоксиполиэтиленгликоль (mPEG), так как его химия сочетания относительно проста (только одна реакционноспособная группа доступна для конъюгации с группами для присоединения в полипептиде). Следовательно, опасность образования поперечных связей устраняется, получающиеся полипептидные конъюгаты более однородны, и легче контролировать взаимодействие молекул полимера с полипептидом.
Для того, чтобы осуществить ковалентное присоединение молекулы (молекул) полимера к полипептиду, гидроксильные концевые группы молекул полимера должны иметь активированную форму, т.е. иметь реакционноспособные функциональные группы (примерами которых являются первичные аминогруппы, гидразидная (HZ), тиольная, сукцинатная (SUC), сукцинимидилсукцинатная (SS), сукцинимидилсукцинамидная (SSA), сукцинимидилпропионатная (SPA), сукцинимидилкарбоксиметилатная (SCM), бензотриазолкарбонатная (ВТС), N-гидроксисукцинимидная (NHS), альдегидная, нитрофенилкарбонатная (NPC) и трезилатная (TRES) группы). Подходящим образом активированные молекулы полимеров коммерчески доступны, например, от Shearwater Polymers Inc., Хантсвилл, Алабама, США. С другой стороны, молекулы полимеров можно активировать обычными способами, известными в технике, например, так, как описывается в WO 90/13540. Конкретные примеры активированных линейных или разветвленных полимерных молекул для применения в настоящем изобретении приводятся в каталогах Shearwater Polymers Inc. за 1997 и 2000 годы (Functionalized Biocompatible Polymers for Research and Pharmaceuticals, Polyethylene Glycol and Derivatives, включены в данное описание в качестве ссылок). Конкретными примерами активированных полимеров PEG являются перечисленные далее линейные PEG: NHS-PEG (например, SPA-PEG, SSPA-PEG, SBA-PEG, SS-PEG, SSA-PEG, SC-PEG, SG-PEG и SCM-PEG) и NOR-PEG, BTC-PEG, EPOX-PEG, NCO-PEG, NPC-PEG, CDI-PEG, ALD-PEG, TRES-PEG, VS-PEG, IODO-PEG и MAL-PEG, и разветвленные PEG, такие как PEG2-NHS, и PEG, описываемые в US 5932462 и US 5643575, которые оба включены в данное описание в качестве ссылок. Кроме того, в публикациях, перечисленных далее, включенных в данное описание в качестве ссылок, описываются полезные полимерные молекулы и/или химия обработки PEG: US 5824778, US 5476653, WO 97/32607, ЕР 229108, ЕР 402378, US 4902502, US 5281698, US 5122614, US 5219564, WO 92/16555, WO 94/04193, WO 94/14758, WO 94/17039, WO 94/18247, WO 94/28024, WO 95/00162, WO 95/11924, W095/13090, WO 95/33490, WO 96/00080, WO 97/18832, WO 98/41562, WO 98/48837, WO 99/32134, WO 99/32139, WO 99/32140, WO 96/40791, WO 98/32466, WO 95/06058, ЕР 439508, WO 97/03106, WO 96/21469, WO 95/13312, ЕР 921 131, US 5736625, WO 98/05363, ЕР 809 996, US 5629384, WO 96/41813, WO 96/07670, US 5473034, US 5516673, ЕР 605963, US 5382657, ЕР 510356, ЕР 400472, ЕР 183503 и ЕР 154316.
Конъюгацию полипептидов и активированных полимерных молекул проводят с использованием обычного способа, т.е. так, как описывается в перечисленных далее ссылках (которые также включены в данное описание в качестве ссылок): Harris and Zaiipsky, eds., Poly(ethylene glycol) Chemistry and Biological Applications, AZC, Washington; R.F.Taylor (1991), "Protein immobilisation. Fundamenyal and applications". Marcel Dekker, N.Y.; S.S.Wong (1992), "Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking", CRC Press, Boca Raton; G.T.Hermanson et al. (1993), "Immobilized Affinity Ligand Techniques", Academic Press. N.Y.). Специалистам известно, что используемые способ активации и/или химия конъюгации зависят от группы (групп) для присоединения в IFNG-полипептиде, а также от функциональных групп полимера (например, представляющих собой амино, гидроксил, альдегидную группу или сульфгидрил). Обработка PEG может быть направлена на конъюгацию по всем доступным группам для присоединения на полипептиде (т.е., такие группы для присоединения, которые обращены к поверхности полипептида) или может быть направлена на определенные группы для присоединения, например N-концевую аминогруппу (US 5985265). Кроме того, конъюгации можно достигнуть в одну стадию или постадийно (например, как описывается в WO 99/55377).
Следует иметь в виду, что присоединение PEG планируется таким образом, чтобы получить оптимальную молекулу в отношении числа присоединившихся молекул PEG, размера и формы (например, будут ли они линейными или разветвленными) таких молекул и где такие молекулы присоединяются к полипептиду. Например, молекулярную массу используемого полимера можно выбрать на основании требуемого достигаемого действия. Например, если основной целью конъюгации является получение конъюгата с высокой молекулярной массой (например, для уменьшения почечного клиренса), как правило, желательно присоединить настолько мало молекул полимера с высокой ММ, насколько возможно, чтобы получить нужную молекулярную массу. Когда желательна высокая степень экранирования эпитопа, такой эффект можно получить, используя достаточно большое число низкомолекулярных полимеров (например, с молекулярной массой примерно 5000 Да), чтобы эффективно экранировать все или большую часть эпитопов полипептида. Например, можно использовать 2-8, например 3-6, таких полимеров.
В связи с конъюгацией по только одной группе для присоединения на белке (как описывается в US 5985265) может оказаться выгодным, чтобы полимерная молекула линейного или разветвленного полимера имела высокую молекулярную массу, например примерно 20 кДа.
Как правило, конъюгацию полимера осуществляют в условиях, способствующих взаимодействию всех возможных групп для присоединения полимера с полимерными молекулами. Как правило, молекулярное отношение активированных полимерных молекул к полипептиду составляет 1000-1, в частности 200-1, предпочтительно 100-1, например 10-1 или 5-1, для того, чтобы получить оптимальное взаимодействие. Однако можно использовать также эквимолекулярные соотношения.
Согласно изобретению, также предполагается сочетание молекул полимера с полипептидом через линкер. Подходящие линкеры хорошо известны специалистам. Предпочтительным примером является циануровый хлорангидрид (Abuchowski et al. (1977), J. Biol. Chem., 252, 3578-3581; US 4179337; Shafer et al. (1986), J. Polym. Sci. Chem., Ed., 24, 375-378).
После конъюгации оставшиеся активированные полимерные молекулы блокируются согласно способам, известным в технике, например путем добавления первичного амина к реакционной смеси, и полученные инактивированные полимерные молекулы удаляются подходящим способом.
Присоединение группы сахара
Присоединение группы сахара может происходить in vivo или in vitro. Для того, чтобы достигнуть гликозилирования in vivo полипептида с IFNG-активностыо, модифицированного таким образом, чтобы ввести один или несколько сайтов гликозилирования in vivo (см. раздел "Конъюгаты изобретения, где неполипептидная группа является группой сахара"), нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептидную часть конъюгата, следует встроить в гликозилирующего эукариотного экспрессирующего хозяина. Экспрессирующую клетку-хозяина можно выбрать среди клеток грибов (гифомицетов или дрожжевых), насекомых или животных или среди клеток трансгенных растений. Кроме того, гликозилирования можно достигнуть в организме человека при использовании нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептидную часть конъюгата изобретения или полипептида изобретения, в генной терапии. В одном из вариантов воплощения изобретения клетка-хозяин является клеткой млекопитающего, такой как СНО-клетка, ВНК- или НЕК-клетка, например НЕК293, или клеткой насекомого, такой как SF9-клетка, или дрожжевой клеткой, например клеткой Saccharomyces cerevisae, Pichia pastoris, или любого другого подходящего хозяина для гликозилирования, например, из числа описанных также ниже. Необязательно группы сахаров, присоединяемые к IFNG-полипептиду посредством гликозилирования in vivo, также модифицируют, используя гликозилтрансферазы, например, с использованием технологии glycoAdvanct™, продаваемой Neose, Хорсман, Пенсильвания, США. Посредством этого можно, например, повысить сиалирование гликозилированного IFNG-полипептида после экспрессии и гликозилирования in vivo СНО-клетками.
Ковалентное взаимодействие in vitro гликозидов с аминокислотными остатками IFNG можно использовать для модификации или повышения числа или профиля углеводных заместителей. В зависимости от используемого способа сочетания, сахар(а) может(гут) присоединяться к а) аргинину и гистидину, b) свободным карбоксильным группам, с) свободным сульфгидрильным группам, таким как группы цистеина, d) свободным гидроксильным группам, таким как группы серина, треонина, тирозина или гидроксипролина, е) ароматическим остаткам, таким как остатки фенилаланина или триптофана, или f) амидной группе глутамина. Указанные аминокислотные остатки являются примерами групп для присоединения группы сахара, которые можно ввести и/или удалить из IFNG-полипептида конъюгата изобретения. Подходящие способы сочетания in vitro описываются, например, в WO 87/05330 и в Aplin et al., CRC Crit. Rev. Biochem., pp.259-306, 1981. Сочетание in vitro групп сахаров или PEG с протеин- и пептидсвязанными GLn-остатками также можно осуществить с помощью трансглутаминаз (TGases), например, так, как описывается в Sato et al., 1996, Biochemistry, 35, 13072-13080, или в ЕР 725145.
Сочетание с органическим дериватизирующим агентом
Ковалентную модификацию IFNG-полипептида можно осуществить путем взаимодействия группы (групп) полипептида для присоединения с органическим дериватизирующим агентом. Подходящие дериватизирующие агенты и способы хорошо известны в технике. Например, цистеиниловые остатки наиболее часто вводят во взаимодействие с α-галогенацетатами (и соответствующими аминами), такими как хлоруксусная кислота или хлорацетамид, с образованием карбоксиметильных или карбоксиамидометильных производных. Цистеиниловые остатки также дериватизируются путем взаимодействия с бромтрифторацетоном, α-бром-β-(4-имидозоил)пропионовой кислотой, хлорацетилфосфатом, N-алкилмалеимидами, 3-нитро-2-пиридил-дисульфидом, метил-2-пиридилдисульфидом, п-хлорртутьбензоатом, 2-хлорртуть-4-нитрофенолом или хлор-7-нитробензо-2-окса-1,3-ди-азоллом. Гистидиловые остатки дериватизируются посредством взаимодействия с диэтилпирокарбонатом при рН 5,5-7,0, поскольку указанный агент является относительно специфическим для гистидиловой боковой цепи. Также полезен пара-бромфенацилбромид; взаимодействие, предпочтительно, осуществляют в 0,1 М растворе какодилата натрия при рН 6,0. Лизиниловые и аминоконцевые остатки вводят во взаимодействие с янтарным ангидридом или ангидридами других карбоновых кислот. Дериватизация указанными агентами имеет эффект обращения нагрузки лизиниловыми остатками. Другими подходящими реагентами для дериватизации α-аминосодержащих остатков являются сложные имидоэфиры, такие как метилпиколинимидат; пиридоксальфосфат; пиридоксал; хлорборогидрид; тринитробензолсульфоновая кислота; О-метилизомочевина; 2,4-пентан-дион и глиоксилат в реакции, катализируемой трансаминазой. Аргиниловые остатки модифицируют путем взаимодействия с одним или несколькими обычными реагентами, среди которых фенилглиоксаль, 2,3-бутандион, 1,2-циклогександион и нингидрин. Для дериватизации остатков аргинина требуется, чтобы взаимодействие осуществлялось в щелочной среде из-за высокой рКа гуанидиновой функциональной группы. Кроме того, такие реагенты могут взаимодействовать с группами лизина, а также аргинингуанидиногруппой. Карбоксильные боковые группы (аспартил или глутамил) селективно модифицируют путем взаимодействия с карбодиимидами (R-N=C=N=R'), где R и R' являются разными алкильными группами, такими как 1-циклогексил-3-(2-морфолинил-4-этил)карбодиимид или 1-этил-3-(4-азониа-4,4-диметилфенил)карбодиимид. Кроме того, аспартиловые и глутамиловые остатки превращают в аспарагиниловый и глутаминиловый остатки посредством взаимодействия с ионами аммония.
Блокирование функционального сайта
Имеются сообщения, что избыточная конъюгация с полимером может привести к потере активности полипептида, с которым конъюгируют полимер. Такую проблему можно устранить, например, удаляя группы для присоединения, расположенные в функциональном сайте, или блокируя функциональный сайт перед конъюгацией. Эти последние стратегии составляют другие варианты воплощения изобретения: причем примеры первой стратегии приводятся выше, например удаление остатков лизина, которые могут располагаться вблизи функционального сайта. Согласно второй стратегии, конъюгацию между полипептидом и неполипептидной группой проводят в условиях, когда функциональный сайт IFNG-полипептида блокируется хелперной молекулой, способной связываться с функциональным сайтом полипептида. Предпочтительно, хелперная молекула является молекулой, которая специфически узнает функциональный сайт полипептида, такой как рецептор. С другой стороны, хелперная молекула может представлять собой антитело, в частности моноклональное антитело, узнающее полипептид, проявляющий IFNG-активность. В частности, хелперная молекула может представлять собой нейтрализующее моноклональное антитело.
Полипептид вводят во взаимодействие с хелперной молекулой до осуществления конъюгации. Это гарантирует, что функциональный сайт полипептида экранируется или защищается и, следовательно, недоступен для дериватизации неполипептидной группой такой как полимер. После освобождения от хелперной молекулы конъюгат между неполипептидной группой и полипептидом можно извлечь с, по меньшей мере, частично сохранившимся функциональным сайтом.
Последующую конъюгацию полипептида с функциональным сайтом, блокированным для полимера, липофильного соединения, группы сахара, органического дериватизирующего агента или любого другого соединения проводят обычным способом, например, так, как описывается выше в разделах "Конъюгация с ...".
По другому варианту хелперную молекулу сначала ковалентно присоединяют к твердой фазе, такой как материалы для набивки колонки, например, к гранулам сефадекса или агарозы, или поверхности, например, реактора. Затем в материал для колонки, содержащий хелперную молекулу, загружают полипептид, и осуществляют конъюгацию согласно способам, известным в технике, например, так, как описывается выше в разделах "Конъюгация с...". Указанная процедура позволяет отделить конъюгат полипептида от хелперной молекулы путем элюции. Конъюгат полипептида элюируют обычными методами при физико-химических условиях, которые не приводят к существенному разрушению конъюгата полипептида. Жидкую фазу, содержащую конъюгат полипептида, отделяют от твердой фазы, на которой остается хелперная молекула, связанная с ней ковалентно. Разделения можно достигнуть разными способами. Например, хелперную молекулу можно дериватизировать второй молекулой (например, биотином), которую может узнавать специфический связующий агент (например, стрептавидин). Специфический связующий агент можно присоединить к твердой фазе, причем посредством этого создается возможность отделения конъюгата полипептида от комплекса хелперной молекулы со второй молекулой путем пропускания через вторую колонку с хелпером на твердой фазе, где будет удерживаться, при последующем элюировании, комплекс хелперной молекулы со второй молекулой, но не будет удерживаться конъюгат полипептида. Конъюгат полипептида можно освободить от хелперной молекулы любым подходящим способом. Удаления защитной группы можно достигнуть, создавая условия, при которых хелперная молекула отделяется от функционального сайта IFNG, с которым она связана. Например, комплекс антитела, с которым конъюгирует полимер, и антиидиотипического антитела можно разложить, доводя рН до кислого или щелочного.
Конъюгация меченного полипептида
В другом варианте воплощения изобретения IFNG-полипептид экспрессируется в виде слитого белка с меткой, т.е. аминокислотной последовательностью или пептидной цепочкой, составленной, как правило, из 1-30, например 1-20, аминокислотных остатков. Кроме возможности быстрой и легкой очистки, метка является удобным инструментом для достижения конъюгации между меченным IFNG-полипептидом и неполипептидной группой. В частности, метку можно использовать для достижения конъюгации на микропланшетах для титрования или других носителях, таких как парамагнитные гранулы, на которых меченный полипептид можно иммобилизовать с помощью метки. Конъюгация с меченным IFNG-полипептидом имеет то преимущество, что меченный полипептид можно иммобилизовать на микропланшетах прямо из культурального бульона (в принципе, без какой-либо очистки) и подвергнуть конъюгации. Посредством этого можно уменьшить общее число стадий процесса (от экспрессии до конъюгации). Кроме того, метка может функционировать как спейсерная молекула, обеспечивающая улучшенную доступность к иммобилизованному полипетиду для конъюгации. Конъюгация с использованием меченного полипептида может осуществляться с любой из неполипептидных групп, описанных в данном описании, например с молекулой полимера, такого как PEG.
Особенности конкретной используемой метки не являются критическими до тех пор, пока метка способна экспрессироваться с полипептидом и способна иммобилизовываться на подходящей поверхности или материале-носителе. Ряд подходящих меток коммерчески доступен, например, от Unizyme Laboratories, Дания. Например, метка может представлять собой любую последовательность из числа последовательностей
His-His-His-His-His-His;
Met-Lys-His-His-His-His-His-His;
Met-Lys-His-His-Ala-His-His-Gln-His-His;
Met-Lys-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln
(все доступны от Unizyme Laboratories, Дания),
или могут представлять собой следующее:
EQKLI SEEDL (С-концевая метка, описанная в Mol. Cell. Biol., 5:3610-16, 1985);
DYKDDDDK (С- или N-концевая метка);
YPYDVPDYA.
Антитела против вышеуказанных меток являются коммерчески доступными, например, от ADI, Aves Lab and Research Diagnostics.
Удобный способ с использованием меченного полипептида для обработки PEG приводится ниже в разделе "Материалы и методы".
Последующего отщепления метки от полипептида можно достигнуть с использованием коммерчески доступных ферментов.
Полипептиды изобретения
В другом аспекте изобретение относится к вообще новым IFNG-полипептидам, описанным в данном описании. Новые полипептиды являются важными промежуточными соединениями для получения конъюгата изобретения. Кроме того, сами полипептиды могут обладать интересными свойствами.
Например, новый IFNG-полипептид содержит, по меньшей мере, одну замену на К, R, D, Е, С, S, Т или N обращенного к поверхности аминокислотного остатка, что подробнее описывается в предыдущей части заявки.
Способы получения IFNG-полипептида
IFNG-полипептид, необязательно, в гликозилированной форме можно получить любым подходящим способом, известным в технике. К таким способам относятся конструирование нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, и экспрессия последовательности в подходящем трансформированном или трансфецированном хозяине. Однако полипептид изобретения можно получить, хотя менее эффективно, химическим синтезом или комбинацией химического синтеза или комбинацией химического синтеза и технологии рекомбинантных ДНК.
Нуклеотидную последовательность изобретения, кодирующую IFNG-полипептид (в мономерной или одноцепочечной форме), можно сконструировать путем выделения или синтеза нуклеотидной последовательности, кодирующей исходный IFNG, такой как huIFNG с аминокислотной последовательностью ПОСЛЕД. №2, и последующим изменением нуклеотидной последовательности таким образом, чтобы осуществить введение (т.е., встраивание или замену) или делецию (т.е., удаление или замену) релевантного(ых) аминокислотного(ых) остатка(ов).
Нуклеотидную последовательность удобно модифицировать сайтнаправленным мутагенезом согласно хорошо известным способам, см., например, Mark et al., "Site-specific Mutagenesis of the Human Fibroblast Interferon Gene", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, pp.5662-66 (1984); и US 4588585.
С другой стороны, нуклеотидную последовательность получают химическим синтезом, например, с использованием синтезатора олигонуклеотидов, где олигонуклеотиды создают на основе аминокислотной последовательности нужного полипептида и, предпочтительно, с отбором тех кодонов, которые предпочтимы в клетке-хозяине, где будет продуцироваться рекомбинантный полипептид. Например, можно синтезировать несколько небольших олигонуклеотидов, кодирующих части нужного полипептида, и собрать методом PCR, лигированием или цепной реакцией лигирования (LCR). Отдельные нуклеотиды, как правило, содержат 5'- или 3'-выступающие концы для комплементарной сборки.
Сразу после сборки (синтезом, сайтнаправленным мутагенезом или другим способом) нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, встраивают в рекомбинантный вектор и операбельно связывают с регуляторными последовательностями, необходимыми для экспрессии IFNG в нужной трансформированной клетке-хозяине.
Конечно, следует иметь в виду, что не все векторы и регулирующие экспрессию последовательности функционируют в равной степени хорошо для экспрессии нуклеотидной последовательности, кодирующей IFNG-полипептид, описываемый в данном описании. И не все хозяева будут в равной степени хорошо функционировать с одними и теми же экспрессионными системами. Однако специалист в данной области техники может сделать выбор среди указанных векторов, регулирующих экспрессию последовательностей, и хозяевами без чрезмерного экспериментирования. Например, при выборе вектора следует оценить хозяина, поскольку вектор должен реплицировать в нем или быть способным интегрироваться в хромосому. Число копий вектора, способность регулировать это число копий и экспрессия любых других белков, кодируемых вектором, таких как антибиотические маркеры, также должны приниматься в расчет. При выборе регулирующей экспрессию последовательности также следует рассматривать различные факторы. К ним относятся, например, относительная устойчивость последовательности, ее регулируемость и ее совместимость с нуклеотидной последовательностью, кодирующей полипептид, особенно, при рассмотрении потенциальных вторичных структур. Хозяев следует выбирать с учетом их совместимости с выбранным вектором, токсичности продукта, кодируемого нуклеотидной последовательностью, их характеристик секреции, их способности правильно складывать полипептид, их ферментации или требований к культивированию и легкости очистки продуктов, кодируемых нуклеотидной последовательностью.
Рекомбинантный вектор может представлять собой автономно реплицирующийся вектор, т.е. вектор, существующий как внехромосомная сущность, репликация которого не зависит от хромосомной репликации, например плазмиду. С другой стороны, указанный вектор представляет собой такой вектор, который, когда введен в клетку-хозяина, интегрируется в геном клетки-хозяина и реплицируется вместе с хромосомой(ами) в которую(ые) он интегрирован.
Вектор, предпочтительно, является экспрессирующим вектором, в котором нуклеотидная последовательность, кодирующая IFNG-полипептид, операбельно связана с дополнительными сегментами, необходимыми для транскрипции нуклеотидной последовательности. Вектор, как правило, происходит от плазмиды или вирусной ДНК. Многие подходящие экспрессирующие векторы для экспрессии в указанных в данном описании клетках-хозяинах доступны коммерчески или описываются в литературе. Полезными экспрессирующими векторами для эукариотных хозяев являются, например, векторы, содержащие экспрессирующие регуляторные последовательности из SV40, вируса папилломы крупного рогатого скота, аденовируса и цитомегаловируса. Специфическими векторами являются, например, pCDNA3.1(+)\Hyg (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, США) и pCI-neo (Stratagene, Ла-Джола, Калифорния, США). Полезными экспрессирующими векторами для бактериальных хозяев являются известные бактериальные плазмиды, такие как плазмиды из Е. coli, в том числе pBR322, рЕТ3а и рЕТ12а (обе от Novagen Inc., Висконсин, США), плазмиды для более широкого интервала хозяев, такие как RP4, фаговые ДНК, например многочисленные производные фага лямбда, например NM989, и другие фаги с ДНК, такие как М13, и нитевидные фаги с одноцепочечными ДНК. Полезными экспрессирующими векторами для дрожжевых клеток являются плазмида 2μ и ее производные, вектор РОТ1 (US 4931373), вектор pJS037, описанный в Okkels, Ann. New York Acad. Sci., 782, 202-207 (1996), и pPICZ А, В или С (Invitrogen). Полезными векторами для клеток насекомых являются pVL941, pBG311 (Cate et al., "Isolation of the Bovine and Human Genes for Mullerian Inhibiting Substance And Expression of the Human Gene In Animal Cells", Cell, 45, pp.685-998 (1986), pBluebac 4.5 и pMelbac (оба доступны от Invitrogen).
К другим векторам для применения в данном изобретении относятся векторы, допускающие амплификацию нуклеотидной последовательности, кодирующей IFNG-полипептид, в числе копий. Такие амплифицируемые векторы известны в технике. К ним относятся, например, векторы, способные к амплификации методом амплификации с DHFR (см., например, Kaufman, пат. США №4470461, Kaufman and Sharp, "Construction Of A Modular Dihydrafolate Reductase cDNA Gene: Analysis Of Signals Utilized For Efficient Expression", Mol. Cell. Biol., 2, pp.1304-19 (1982)) и методом амплификации с глутаминсинтетазой (″GS") (см., например, US 5122464 и ЕР 338841).
Рекомбинантный вектор также может содержать последовательность ДНК, дающую возможность вектору реплицироваться в обсуждаемой клетке-хозяине. Примером такой последовательности (когда клеткой-хозяином является клетка млекопитающего) является ориджин репликации SV40. Когда клеткой-хозяином является дрожжевая клетка, подходящими последовательностями, дающими возможность вектору реплицироваться, являются гены репликации дрожжевой плазмиды 2μ REP 1-3 и ориджин репликации.
Вектор также может содержать селектируемый маркер, например ген, продукт которого соответствует дефекту в клетке-хозяине, такой как ген, кодирующий дигидрофолат-редуктазу (DHFR) или ген TPI Schizosaccharomyces pombe (описанный P.R.Russell, Gene, 40, 1985, pp.125-130), или ген, придающий резистентность к лекарственному средству, например ампициллину, канамицину, тетрациклину, хлорамфениколу, неомицину, гигромицину или метотрексату. В случае гифомицетов селектируемые маркеры включают amds, pyrG, arcB, naiD, sC.
Термин "регуляторная последовательность" в данном описании определяется как включающий все компоненты, необходимые или выгодные для экспрессии IFNG-полипептида. Каждая регуляторная последовательность может быть нативной или чужеродной для нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид. К таким регуляторным последовательностям относятся, но не ограничиваются перечисленным, лидерная, последовательность полиаденелирования, последовательность пропептида, промотор, энхансер или активирующая последовательность, сигнальная пептидная последовательность и терминатор транскрипции. Как минимум, регуляторные последовательности включают промотор.
В настоящем изобретении можно использовать самые разные регуляторные последовательности экспрессии. К таким полезным регуляторным последовательностям экспрессии относятся регуляторные последовательности экспрессии, ассоциированные со структурными генами вышеуказанных экспрессирующих векторов, а также любая последовательность, известная как регулирующая экспрессию генов прокариотных или эукариотных клеток или их вирусов, и их различные сочетания.
Примерами подходящих регуляторных последовательностей экспрессии для управления транскрипцией в клетках млекопитающих являются ранний и поздний промоторы SV40 и аденовируса, например главный поздний промотор аденовируса 2, промотор МТ-1 (ген металлотионеина), немедленно-ранний промотор цитомегаловируса человека (CMV), промотор фактора элонгации 1α (EF-1α) человека, промотор минимального белка теплового шока 70 Drosophila, промотор вируса саркомы Рауса (RSV), промотор убиквитина С человека (UdC), терминатор гормона роста человека, сигналы области полиаденелирования SV40 или аденовируса Elb и консенсусная последовательность Козака (Kozak М., J. Mol. Biol., 1987, Aug. 20; 196(4):947-50).
Для того, чтобы улучшить экспрессию в клетках млекопитающих, можно встроить синтетический интрон в 5'-нетранслируемую область нуклеотидной последовательности, кодирующей IFNG-полипептид. Примером синтетического интрона является синтетический интрон из плазмиды pCI-Neo (доступный от Promega Corporation, Висконсин, США).
Примерами подходящих регуляторных последовательностей для управления транскрипцией в клетках насекомых являются полигидриновый промотор, промотор Р10, промотор основного белка вируса полиэдроза Autographa californica, промотор немедленно-раннего гена 1 бакуловируса и промотор отсроченно-раннего гена 39К бакуловируса и последовательность полиаденилирования SV40.
Примерами подходящих регуляторных последовательностей для применения в дрожжевых клетках-хозяинах являются дрожжевая система α-скрещивания, промотор дрожжевой триозофосфат-изомеразы (TPI), промоторы из дрожжевых гликолитических генов или генов спиртовой дегидрогеназы, промотор ADH2-4c и индуцибельный GAL-промотор.
Примерами подходящих регуляторных последовательностей для применения в клетках-хозяинах гифомицетов являются промотор и терминатор ADH3, промотор, образованный от генов, кодирующих амилазотриозфосфат-изомеразу ТАКА или щелочную протеазу Aspergillus oryzae, α-амилазу A. niger, глюкоамилазу A. niger или A. nidulans, ацетамидазу A. nidulans, аспарагиновую протеиназу или липазу Rhizomucor miehei, терминатор TPI1 и терминатор ADH3.
Примерами подходящих регуляторных последовательностей для применения в бактериальных клетках-хозяинах являются промоторы lac-системы, trp-системы, ТАС- или TRC-системы и главные промоторные области фага лямбда.
Нуклеотидная последовательность изобретения, получена ли она сайтнаправленным мутагенезом, синтезом или другими способами, также может содержать, а может и не содержать, нуклеотидную последовательность, кодирующую сигнальный пептид. Сигнальный пептид присутствует, когда полипептид должен секретироваться из клеток, в которых он экспрессируется. Такой сигнальный пептид, если он присутствует, должен узнаваться клеткой, выбранной для экспрессии полипептида. Сигнальный пептид может быть гомологичным (например, таким, какой обычно ассоциируется с huIFNG) или гетерологичным (т.е., происходящим от иного чем huIFNG источника) в отношении полипептида, может быть гомологичным или гетерологичным в отношении клетки-хозяина, т.е. представлять собой сигнальный пептид, обычно экспрессируемый от клетки-хозяина, или сигнальный пептид, который обычно не экспрессируется от клетки-хозяина. Соответственно, сигнальный пептид может быть прокариотным, например, полученным из бактерии, такой как Е. coli, или эукариотным, например, полученным из клетки млекопитающего, насекомого или дрожжей.
Наличие или отсутствие сигнального пептида будет, например, зависеть от экспрессии клетки-хозяина, используемой для продуцирования полипептида, экспрессируемого белка (является ли он внутриклеточным или межклеточным белком) и от того, желательно ли получить секрецию. В случае применения в гифомицетах сигнальный пептид обычно можно получить из гена, кодирующего амилазу или глюкоамилазу вида Aspergillus, гена, кодирующего липазу или протеазу Rhizomucor meihei или липазу Humicola lanuginosa. Сигнальный пептид, предпочтительно, получают из гена, кодирующего амилазу ТАКА A. oryzae, нейтральную α-амилазу A. niger, кислотоустойчивую амилазу А. niger или глюкоамилазу А. niger. В случае применения в клетках насекомых сигнальный пептид обычно можно получить из гена насекомого (ср. WO 90/05783), например гена предшественника адипокинетического гормона чешуекрылого Manduca sexta (ср. US 5023328), меллитина медоносной пчелы (Invitrogen), экдистероид-UDP-глюкозилтрансферазы (egt) (Murphy et al.. Protein Expression and Purification, 4, 349-357 (1993) или гена панкреатической липазы человека (hpl) (Methods in Enzymology, 284, pp.262-272, 1997).
Предпочтительным сигнальным пептидом для применения в клетках млекопитающих является сигнальный пептид hulFNG или сигнальный пептид легкой цепи муринового Ig-каппа (Coloma М. (1992), J. Imm. Methods, 152:89-104). Обнаружено, что в случае применения в дрожжевых клетках подходящими сигнальными пептидами являются сигнальный пептид α-фактора из S. cereviciae (ср. US 487008), сигнальный пептид амилазы слюны мыши (ср. О. Hagenbuchle et al., Nature, 289, 1981, pp.643-646), модифицированный сигнальный пептид карбоксипептидазы (ср. L.A.Valls et al., Cell, 48, 1987, pp.887-897), сигнальный пептид дрожжей BAR1 (ср. WO 87/02670) и сигнальный пептид аспарагиновой протеазы 3 дрожжей (YAP3) (ср. М. Egel-Mitani et al., Yeast, 6, 1990, pp.127-137).
Для продуцирования IFNG-полипептида можно использовать любого подходящего хозяина, в том числе клетки или клеточные линии бактерий, грибов (включая дрожжи), растений, насекомых, млекопитающих или любых других подходящих животных, а также трансгенных животных или растений. Примерами бактериальных клеток-хозяев являются грамположительные бактерии, такие как штаммы Bacillus, например В. brevis или В. subtilis, Pseudomonas или Streptomyces, или грамотрицательные бактерии, такие как штаммы Е. coli. Введение вектора в бактериальную клетку-хозяина можно осуществить, например, методом трансформации протопластов (см., например, Chang and Cohen, 1979, Molecular General Genetics, 168:111-115) с использованием компетентных клеток (см., например, Young and Spizizen, 1961, Journal of Bacteriology, 81:823-829, или Dubnau and Davidoff-Abelson, 1971, Journal of Molecular Biology, 56:209-221), методом электропорации (см., например, Shigekawa and Dower, 1988, Biotechniques, 6:742-751) или конъюгации (см., например, Koehler and Thorne, 1987, Journal of Bacteriology, 169:5271-5278).
Примерами подходящих гифомицетных клеток-хозяев являются штаммы Aspergillus, например A. oryzae, A. niger или А. nidulans, Fusarium или Trichoderma. Клетки грибов можно трансформировать способом, включающим образование протопластов, трансформацию протопластов и регенерацию клеточной стенки способом, самим по себе известным. Подходящие процедуры трансформации клеток-хозяев Aspergillus описываются в ЕР 238023 и US 5679543. Подходящие процедуры трансформации вида Fusarium описываются Malardier et al., 1989, Gene, 78:147-156, и в WO 96/00787. Дрожжи можно трансформировать с использованием процедур, описываемых Becker и Guarente, в Abelson J.N. and Simon M.I., editors. Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp. 182-187, Academic Press, Inc., New York; Ito et al., 1983, Journal of Bacteriology, 153:163; и в Hinnen et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 75:1920.
Примерами подходящих дрожжевых клеток-хозяев являются штаммы Saccaromyces, например S. cerevisiae, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, такие как Р. pastoris или Р. methanolica, Hansenula, такие как Н. Polymorpha, или Yarrowia. Способы трансформации дрожжевых клеток гетерологичной ДНК и получения в них гетерологичных полипептидов описываются Clontech Laboratories, Inc., Пало-Альто, Калифорния, США (в протоколе для продукта для Yeastmaker™ Yeast Transformation System Kit), и Reeves et al., FEMS Microbiology Letters, 99 (1992), 193-198, Manivasakam and Schiestl, Nucleic Acids Research, 1993, Vol.21, No.18, pp.4414-4415, и в Ganeva et al., FEMS Microbiology Letters, 121 (1994), 159-164.
Примерами подходящих клеток-хозяев насекомых являются клеточные линии Lepidoptora, такие как клетки Spodoptera frugiperda (Sf9 или Sf21) или Trichoplusioa ni (High Five) (US 5077214). Трансформацию клеток насекомых и получение гетерологичных полипептидов в них можно осуществить так, как описывает Invitrogen.
Примерами подходящих клеток млекопитающих являются клеточные линии яичника китайского хомячка (СНО) (например, СНО-К1; АТСС CCL-61), клеточные линии зеленой мартышки (COS) (например, COS 1 (АТСС CRL-1650), COS 7 (АТСС CRL-1651)); клетки мыши (например, NS/O), клеточные линии почек детенышей хомяка (ВНК) (например, АТСС CRL-1632 или АТСС CCL-10) и клетки человека (например, НЕК 293 (АТСС CRL-1573)), а также растущие клетки в культуре ткани. В технике известны другие подходящие клеточные линии, доступные из хранилищ, таких как Американская коллекция типовых культур, Роквилл, Мэриленд. Также клетки млекопитающих, такие как клетка СНО, можно модифицировать для экспрессии сиалилтрансферазы, например 1,6-сиалилтрансферазы, например, так, как описывается в US 5047335, для того, чтобы обеспечить улучшенное гликозилирование IFNG-полипептида.
Способы введения экзогенной ДНК в клетки-хозяина млекопитающих включают опосредованную фосфатом трансфекцию, электропорацию, опосредованную DEAE-декстраном трансфекцию, опосредованную липосомами трансфекцию, вирусные векторы и способ трансфекции, описанный Life Technologies Ltd., Пэйсли, Объединенное Королевство, с использованием липофектамина 2000. Указанные способы хорошо известны в технике и описываются, например, Ausbel et al. (eds.). Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, USA. Культивирование клеток млекопитающих проводят согласно установленным способам, например, так, как описывается в Animal Cell Biotechnology, Methods and Protocols, Edited by Nigel Jenkins, 1999, Human Press Inc., Totowa, New Jersey, USA, и в Harrison M.A. and Rae I.F., General Techniques of Cell Culture, Cambridge University Press, 1997.
Для того, чтобы получить гликозилированный полипептид, предпочтительно использовать эукариотную клетку-хозяина, например, указанного выше типа.
В способах получения настоящего изобретения клетки культивируют в питательной среде, подходящей для продуцирования полипептида, с использованием способов, известных в технике. Например, клетку можно культивировать методом культивирования во флаконе при встряхивании, ферментацией в небольшом или в крупном масштабе (в том числе, непрерывной, периодической, периодической с подпиткой или твердофазной ферментацией) в лабораторных или промышленных ферментерах, осуществляемой в подходящей среде и при условиях, позволяющих синтезировать и/или выделять полипептид. Культивирование происходит в подходящей питательной среде, содержащей источники углерода и азота и неорганические соли, с использованием процедур, известных в технике. Подходящие среды доступны от коммерческих поставщиков, или их можно получить в соответствии с составами, приведенными в публикациях (например, в каталогах Американской коллекции типовых культур). Если полипептид секретируется в питательную среду, его можно извлечь непосредственно из среды. Если полипептид не секретируется, его можно извлечь из клеточных лизатов.
Полученный полипептид можно извлечь способами, известными в технике. Например, полипептид можно извлечь из питательной среды с помощью обычных процедур, в том числе центрифугированием, фильтрацией, экстракцией, сушкой распылением, выпариванием или преципитацией, и другими методами.
Полипептид можно очистить многими методами, известными в технике, в том числе методом хроматографии (например, ионообменной, аффинной, гидрофобной хроматографией, хроматографическим фокусированием и гель-хроматографией), методом электрофореза (например, препаративного изоэлектрического фокусирования), используя различную растворимость (например, преципитацию сульфатом аммония), SDS-PAGE или экстракцией (см., например, Protein Purification, J.-С. Jonson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989). Специфические способы очистки полипептидов, проявляющих IFNG-активность, описываются в ЕР 110004 и непрошедшей экспертизу заявке на патент Японии №186995/84.
Биологическую активность IFNG-полипептида можно проанализировать любым подходящим способом, известным в технике. Такие анализы включают нейтрализацию антителами антивирусной активности, индукцию протеинкиназной, олигоаденилат-2,5-А-синтетазной или фосфодиэстеразной активностей, как описывается в ЕР 41313 В1. К таким анализам также относятся иммуномодуляторные анализы (см., например, US 4753795), анализы подавления роста и измерение связывания с клетками, экспрессирующими интерфероновые рецепторы. Конкретные анализы описываются в данном описании в разделе "Материалы и методы".
Кроме того, изобретение относится к усовершенствованным способам лечения, в частности, интерстициальных болезней легких, а также гранулематозных болезней, рака, инфекционных болезней, нарушений в костях (например, нарушения костного метаболизма, такого как злокачественный остеопороз) и аутоиммунных заболеваний, таких как ревматоидный артрит, причем ключевым преимуществом является менее частое и/или менее инвазивное назначение более эффективной терапии и, необязательно, меньшая опасность иммунных реакций на терапевтически активное(ые) соединение(я).
Конъюгат изобретения, предпочтительно, вводят в композицию, содержащую фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент. Термин "фармацевтически приемлемый" означает, что носитель или эксципиент не оказывает каких-либо неблагоприятных действий на пациентов, которым его вводят. Такие фармацевтически приемлемые носители и эксципиенты хорошо известны в технике (Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A.R.Gennaro, Ed., MackPublishing Company [1990]; Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins, S. Frokjaer and L. Hovgaard, Eds., Taylor & Francis [2000]; и Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd edition, A. Kibbe, Ed., Pharmaceutical Press [2000]).
Конъюгат изобретения можно применять "как есть" и/или в форме его соли. Подходящими солями являются, но не ограничиваются перечисленным, соли с щелочными металлами или щелочноземельными металлами, такими как натрий, калий, кальций и магний, а также, например, соли цинка. Такие соли или комплексы могут присутствовать в виде кристаллической и/или аморфной структуры.
Конъюгат изобретения вводят в дозе, приблизительно соответствующей дозе, которую используют при лечении известными коммерческими препаратами IFNG, такими как актиммун или описанные в ЕР 795332. Точная вводимая доза зависит от обстоятельств. Как правило, доза должна быть способна к предупреждению или уменьшению тяжести или распространения состояния или показаний для лечения. Для специалистов в данной области техники будет очевидно, что эффективное количество конъюгата или композиции изобретения зависит, среди прочего, от заболевания, дозы, схемы введения, вводят ли полипептид, конъюгат или композицию отдельно или в сочетании с другими лечебными средствами, времени полужизни композиции в кровяном русле и общего состояния здоровья пациента.
Изобретение также относится к применению а) конъюгата, содержащего, по меньшей мере, одну неполипептидную группу, ковалентно связанную с IFNG-полипептидом, причем IFNG-полипептид выбирают из группы, состоящей из huIFNG, rhuIFNG или IFNG-полипептида, описанного в данном описании (т.е., конъюгата, представляющего собой конъюгат изобретения), или b) фармацевтической композиции изобретения для изготовления лечебного средства, фармацевтической композиции или составного набора для лечения интерстициальных болезней легких, рака, инфекционных болезней, нарушений в костях (например, нарушения костного метаболизма, такого как злокачественный остеопороз) и/или воспалительных заболеваний, в частности интерстициальных болезней легких, наиболее часто идиопатического фиброза легких. Также можно включать глюкокортикоид, такой как преднизолон. Предпочтительная дозировка составляет 1-4, предпочтительнее 2-3, мкг полипептидного компонента на кг массы пациента на дозу. Предпочтительная дозировка составляет 100-350, предпочтительнее 100-150, мкг глюкокортикоида на кг массы пациента на дозу.
Описываются также улучшенные средства доставки молекул или препаратов, необязательно, содержащих дополнительно глюкокортикоиды.
Изобретение также относится к составному набору, подходящему для лечения интерстициальных болезней легких, содержащему первую фармацевтическую композицию, содержащую активные компоненты а) или b), указанные выше, и вторую фармацевтическую композицию, содержащую, по меньшей мере, один глюкокортикоид, каждый, необязательно, вместе с фармацевтически приемлемым носителем и/или эксципиентом.
Конъюгат изобретения можно ввести в фармацевтические композиции хорошо известными способами. Подходящие составы описываются в Remington's Pharmaceutical Sciences, E.B. Martin, и в US 5183746.
Фармацевтическую композицию можно получить во многих формах, включая жидкость, гель, лиофилизованный порошок, спрессованное твердое вещество или в любой другой подходящей форме. Предпочтительная форма будет зависеть от конкретных показаний, по которым проводят лечение, и будет ясна для специалистов в данной области техники.
Фармацевтическую композицию можно вводить перорально, подкожно, внутривенно, интрацеребрально, интраназально, трансдермально, интраперитонеально, внутримышечно, в легкие, вагинально, ректально, в глаза или любым другим приемлемым способом, например, с использованием технологии PowderJect или ProLease. Композиции можно вводить непрерывно методом инфузии, хотя приемлема болюсная инъекция, с использованием методов, хорошо известных в технике, таких как насосы или имплантация. В некоторых случаях композиции можно применять непосредственно в виде раствора или спрея. Предпочтительный способ введения будет зависеть от конкретного показания для лечения и будет очевиден для специалиста в данной области техники.
Фармацевтическую композицию изобретения можно вводить в сочетании с другими лечебными средствами. Такие средства можно включать в ту же фармацевтическую композицию как ее часть или можно вводить отдельно от полипептида или конъюгата изобретения, или одновременно или согласно любой другой приемлемой схеме лечения. Кроме того, полипептид, конъюгат или фармацевтическую композицию изобретения можно применять в качестве вспомогательного средства для других видов лечения. В частности, рассматриваются сочетания с глюкокорикоидами, как описывается в ЕР 795332.
Парентеральные препараты
Примером фармацевтической композиции является раствор, созданный для парентерального введения. Хотя во многих случаях фармацевтические композиции-растворы предоставляются в жидкой форме, подходящей для немедленного применения, такие композиции для парентерального введения также могут предоставляться в замороженной или лиофилизованной форме. В первом случае композиция должна быть оттаяна до применения. Последнюю форму часто используют для повышения устойчивости активного соединения, содержащегося в композиции, в широком интервале условий хранения, так как специалистам в данной области техники известно, что лиофилизованные препараты, как правило, более устойчивы, чем их жидкие аналоги. Такие лиофилизованные препараты восстанавливают перед применением, добавляя один или несколько фармацевтически приемлемых разбавителей, таких как стерильная вода для инъекций или стерильный физиологический раствор.
В случае парентеральных препаратов их получают для хранения в виде лиофилизованных композиций или водных растворов, смешивая, соответствующим образом, полипептид нужной степени чистоты с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми носителями, эксципиентами или стабилизаторами, обычно используемыми в технике (которые все называются "эксципиентами"), например буферирующими веществами, стабилизаторами, консервантами, веществами, придающими изотоночность, неионными детергентами, антиоксидантами и/или различными другими добавками.
Буферирующие вещества помогают поддерживать рН в интервале, приближающемся к физиологическим условиям. Как правило, они присутствуют в концентрации, колеблющейся от примерно 2 мМ до примерно 50 мМ. Подходящими буферирующими веществами для применения в настоящем изобретении являются как органические, так и неорганические кислоты и их соли, такие как цитратные буферы (например, смесь мононатрийцитрата и динатрийцитрата, смесь лимонной кислоты и тринатрийцитрата, смесь лимонной кислоты и мононатрийцитрата и т.п.), сукцинатные буферы (например, смесь янтарной кислоты и мононатрийсукцината, смесь янтарной кислоты и гидроксида натрия, смесь янтарной кислоты и динатрийсукцината и т.п.), тартратные буферы (например, смесь винной кислоты и тартрата натрия, смесь винной кислоты и тартрата калия, смесь винной кислоты и гидроксида натрия и т.п.), фумаратные буферы (например, смесь фумаровой кислоты и мононатрийфумарата, смесь фумаровой кислоты и динатрийфумарата, смесь мононатрийфумарата и динатрийфумарата и т.п.), глюконатные буферы (например, смесь глюконовой кислоты и глюконата натрия, смесь глюконовой кислоты и гидроксида натрия, смесь глюконовой кислоты и глюконата калия и т.п.), оксалатные буферы (например, смесь щавелевой кислоты и оксалата натрия, смесь щавелевой кислоты и гидроксида натрия, смесь щавелевой кислоты и оксалата калия и т.п.), лактатные буферы (например, смесь молочной кислоты и лактата натрия, смесь молочной кислоты и гидроксида натрия, смесь молочной кислоты и лактата калия и т.п.) и ацетатные буферы (например, смесь уксусной кислоты и ацетата натрия, смесь уксусной кислоты и гидроксида натрия и т.п.). Кроме того, также можно применять фосфатные буферы, гистидиновые буферы и соли триметиламина, такие как трис.
Консерванты добавляют для замедления размножения микробов, и, как правило, их добавляют в количествах примерно 0,2%-1% (мас./об.). Подходящими консервантами для применения в настоящем изобретении являются фенол, бензиловый спирт, мета-крезол, метилпарабен, пропилпарабен, хлорид октадецилдиметилбензиламмония, галогениды бензалкония (например, бензалконийхлорид, -бромид или -иодид), гексаметонийхлорид, алкилпарабены, такие как метил или пропилпарабен, катехин, резорцин, циклогексанол и 3-пентанол.
Агенты для придания растворам изотоничности добавляют для обеспечения изотоничности жидких композиций и включают многоосновные сахароспирты, предпочтительно, трехосновные или высшие сахароспирты, такие как глицерин, эритрит, арабит, ксилит, сорбит и маннит. Многоосновные спирты могут присутствовать в количестве от 0,1 мас.% до 25 мас.%, как правило 1%-5%, с учетом относительного количества других ингредиентов.
Стабилизаторы относятся к широкой категории эксципиентов, имеющих функции от наполнителя до добавки, растворяющей лечебное средство или способствующей предотвращению денатурации или прилипания к стенкам емкости. Типичными стабилизаторами могут быть многоосновные сахароспирты (перечисленные выше); аминокислоты, такие как аргинин, лизин, глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аланин, орнитин, L-лейцин, 2-фенилаланин, глутаминовая кислота, треонин и т.п., органические сахара или сахароспирты, такие как лактоза, трегалоза, стахиоза, маннит, сорбит, ксилит, рибит, миоинизит, галактит, глицерин и т.п., включая циклиты, такие как инозит; полиэтиленгликоль; полиаминокислоты; серусодержащие восстановители, такие как мочевина, глутатион, тиоктовая кислота, тиогликолят натрия, тиоглицерин, α-монотиоглицерин и тиосульфат натрия; низкомолекулярные полипептиды (т.е., с числом остатков <10); белки, такие как сывороточный альбумин человека, бычий сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; моносахариды, такие как ксилоза, манноза, фруктоза и глюкоза; дисахариды, такие как лактоза, мальтоза и сахароза; трисахариды, такие как рафиноза, и полисахариды, такие как декстран. Стабилизаторы, как правило, присутствуют в количестве от 0,1 до 10000 мас. частей относительно массы активного белка.
Неионные поверхностно-активные вещества или детергенты (также известные как "смачиватели") могут присутствовать для того, чтобы способствовать растворению лечебного средства, а также для защиты терапевтического полипептида от агрегации, вызываемой перемешиванием, что также предотвращает денатурацию полипептида в композиции, подвергаемой поверхностному напряжению сдвига. Подходящими неионными поверхностно-активными веществами являются полисорбаты (20, 80 и т.п.), полиоксамеры (184, 188 и т.п.), полиолы плюроники®, моноэфиры полиоксиэтиленсорбитана (твин®-20, твин®-80 и т.п.).
К различным другим эксципиентам относятся вещества, создающие объем, или наполнители (например, крахмал), хелатообразующие вещества (например, ЭДТК), антиоксиданты (например, аскорбиновая кислота, метионин, витамин Е) и сорастворители. Активный ингредиент также может захватываться микрокапсулами, полученными, например, методом коацервации или межфазной полимеризацией, например, микрокапсулами из гидроксиметилцеллюлозы, желатина или полиметилметакрилата, коллоидными системами доставки лекарственных средств (например, липосомами, микросферами альбумина, микроэмульсиями, наночастицами и нанокапсулами) или макроэмульсиями. Такие методы описываются в Remington's Pharmaceutical Sciences, цит. выше.
Парентеральные композиции, применяемые in vivo, должны быть стерильными. Это легко осуществить, например, фильтрацией через мембраны для стерилизации фильтрованием.
Препараты с отсроченным высвобождением
Подходящие примеры препаратов с отсроченным высвобождением включают полупроницаемые матрицы из твердых гидрофобных полимеров, содержащие конъюгат, причем матрицы имеют подходящую форму, например, такую, как пленка или микрокапсулы. Примерами матриц с отсроченным высвобождением являются сложные полиэфиры, гидрогели (например, поли(2-гидроксиэтилметакрилат) или поливиниловый спирт), поликислоты, сополимеры L-глутаминовой кислоты и этил-L-глутамата, неразлагающийся сополимер этилена и винилацетата, разлагающиеся сополимеры молочной кислоты и гликолевой кислоты, такие как по технологии ProLease® или Lupron Depot® (микросферы для инъекций, состоящие из сополимера молочной кислоты и гликолевой кислоты и лейпролидацетата), и поли-D-(-)-3-гидроксибутиловая кислота. В то время как полимеры, такие как сополимер этилена и винилацетата и молочной и гликолевой кислот, способны высвобождать молекулы в течение длительного времени - свыше 100 дней, некоторые гидрогели высвобождают белки в течение более короткого периода. Когда инкапсулированные полипептиды остаются в организме в течение длительного времени, они могут денатурироваться или агрегироваться в результате воздействия влаги при 37°С, причем в результате утрачивается биологическая активность и возможные изменения иммуногенности. Разумная стратегия может быть рассчитана на стабилизацию, зависящую от заключенного в ней механизма. Например, если обнаруживается, что механизм агрегации является образованием межмолекулярной связи S-S через взаимообмен тио-дисульфид, стабилизации можно достигнуть путем модификации сульфгидрильных остатков, лиофилизацией из кислых растворов, регулированием содержания влаги, применением соответствующих добавок и разработкой определенных составов полимерных матриц.
Пероральное введение
В случае перорального введения фармацевтическая композиция может находиться в твердой или жидкой форме, например в форме капсулы, таблетки, суспензии, эмульсии или раствора. Фармацевтическую композицию, предпочтительно, получают в форме единицы дозировки, содержащей заданное количество активного ингредиента. Подходящая суточная доза для человека или другого млекопитающего может изменяться в широких пределах в зависимости от состояния пациента и других факторов, но может быть определена специалистами в этой области техники с использованием обычных способов.
Твердые лекарственные формы для перорального введения могут включать капсулы, таблетки, суппозитории, порошки и гранулы. В таких твердых лекарственных формах активное соединение может быть смешано с, по меньшей мере, одним инертным разбавителем, таким как сахароза, лактоза или крахмал. Такие лекарственные формы также могут содержать, как в обычной практике, дополнительные вещества, например смазывающие вещества, такие как стеарат магния. В случае капсул, таблеток и пилюль лекарственные формы также могут содержать буферирующие вещества. Таблетки и пилюли также можно получить с энтеросолюбильными покрытиями.
Конъюгаты можно смешивать с адъювантами, такими как лактоза, сахароза, порошок крахмала, эфиры целлюлозы и алкановых кислот, стеариновая кислота, тальк, стеарат магния, оксид магния, натриевые и кальциевые соли фосфорной и серной кислот, аравийская камедь, желатин, альгинат натрия, поливинилпирролидон и/или поливиниловый спирт, и таблетировать или инкапсулировать для удобства введения. С другой стороны, их можно растворить в физиологическом растворе, воде, полиэтиленгликоле, пропиленгликоле, этаноле, маслах (таких как кукурузное масло, арахисовое масло, хлопковое масло или сезамовое масло), трагакантовой смоле и/или различных буферах. Другие адъюванты и способы введения хорошо известны в фармации. Носитель или разбавитель могут содержать материал, замедляющий растворение, такой как глицерилмоностеарат или глицерилдистеарат, одни или с воском или другими веществами, хорошо известными в технике.
Фармацевтические композиции можно подвергнуть обычным фармацевтическим операциям, таким как стерилизация, и/или они могут содержать обычные адъюванты, такие как консерванты, стабилизаторы, смачиватели, эмульгаторы, буферные вещества, наполнители и т.п., например, которые упоминаются в данном описании.
Жидкие лекарственные формы для перорального введения могут включать фармацевтически приемлемые эмульсии, растворы, суспензии, сиропы и эликсиры, содержащие инертные разбавители, обычно используемые в технике, такие как вода. Такие композиции также могут содержать адъюванты, такие как смачиватели, подслащиватели, корригенты и отдушки.
Местное введение
Композиции, подходящие для местного введения, включают жидкие или полужидкие препараты, подходящие для проникания через кожу (например, линименты, лосьоны, мази, кремы или пасты), и капли, подходящие для введения в глаза, уши или нос.
Доставка в легкие
Композиции, подходящие для применения с помощью распылителя или жидкостного или ультразвукового, как правило, будут содержать полипептид или конъюгат, растворенный в воде при концентрации, например, примерно 0,01-25 мг конъюгата на мл раствора, предпочтительно примерно 0,1-10 мг/мл. Композиция также может содержать буфер и простой сахар (например, для стабилизации и регулирования осмотического давления) и/или сывороточный альбумин человека в интервале концентраций от 0,1 до 10 мг/мл. Примерами буферов, которые можно использовать, являются буферы с ацетатом натрия, цитратом и глицином. Предпочтительно, буфер будет иметь состав и молярность, подходящие для доведения рН раствора до величины в интервале 3-9. Как правило, для указанной цели подходящей является молярность буфера от 1 мМ до 50 мМ. Примерами сахаров, которые можно использовать, являются лактоза, мальтоза, маннит, сорбит, трегалоза и ксилоза, как правило, в количествах в интервале от 1 мас.% до 50 мас.% от композиции.
Композиция для распылителя также может содержать поверхностно-активное вещество для снижения или предотвращения агрегации белка на поверхности, вызываемой превращением раствора в аэрозоль. Можно использовать различные обычные поверхностно-активные вещества, такие как полиоксиэтилированные эфиры жирных кислот и спиртов и полиоксиэтиленсорбитановые эфиры жирных кислот. Количества, как правило, будут составлять от 0,001 мас.% до 4 мас.% от композиции. Особенно предпочтительным поверхностно-активным веществом для целей данного изобретения является полиоксиэтиленсорбитанмоноолеат.
Конкретные составы и способы получения подходящих дисперсий жидких частиц по изобретению описываются в WO 94/20069, US 5915378, US 5960792, US 5957124, US 5934272, US 5915378, US 5855564, US 5826570 и US 5522385, включенных в данное описание в качестве ссылок.
Композиции для применения с мерным устройством для ингаляции, как правило, будут содержать тонкоизмельченный порошок. Такой порошок можно получить путем лиофилизации жидкой композиции с конъюгатом и последующего измельчения, и он может содержать стабилизатор, такой как сывороточный альбумин человека (HSA). Как правило, HSA добавляют более 0,5% (мас./масс.). Кроме того, в препарат при необходимости можно добавить один или несколько сахаров. Примерами являются лактоза, мальтоза, маннит, сорбит, сорбитоза, трегалоза, ксилит и ксилоза. Количество, добавляемое в композицию, может находиться в интервале примерно 0,01-200% (мае./масс.), предпочтительно приблизительно 1-50%, от присутствующего конъюгата. Такие композиции затем лиофилизуют и измельчают до частиц нужного размера.
Затем частицы нужного размера суспендируют в пропелленте с помощью поверхностно-активного вещества. Пропеллент может представлять собой обычное вещество, используемое для такой цели, такое как полностью хлорфторированный углеводород, частично хлорфторированный углеводород, полностью фторированный углеводород или частично фторированный углеводород, в том числе трихлорфторметан, дихлордифторметан, дихлортетрафторэтанол и 1,1,2,2-тетрафторэтан или их сочетания. Подходящими поверхностно-активными веществами являются сорбитантриолеат и соевый лецитин. В качестве поверхностно-активного вещества также может быть полезна олеиновая кислота. Затем указанную смесь загружают в устройство для доставки. Примером коммерчески доступного мерного ингалятора, подходящего для применения в настоящем изобретении, является мерный ингалятор Ventolin, производимый Glaxo Inc., Research Triangle Park, Северная Каролина.
Композиции для порошковых ингаляторов будут содержать тонкоизмельченный сухой порошок, содержащий конъюгат, и также могут содержать наполнитель, такой как лактоза, сорбит, сахароза или маннит, в количествах, облегчающих подачу порошка из устройства, например 50 мас.% 90 мас.% от композиции. Частицы порошка должны иметь аэродинамические свойства в легком, соответствующие частицам плотностью примерно 1 г/см2 со средним диаметром менее 10 мкм, предпочтительно от 0,5 до 5 мкм, наиболее предпочтительно от 1,5 до 3,5 мкм. Примером порошкового ингалятора, подходящего для применения согласно приведенным в данном описании указаниям, является порошковый ингалятор Spinhaler, изготовляемый Fisons Corp., Бедфорд, Массачусетс.
Порошки для указанных устройств можно получать и/или доставлять способами, описываемыми в US 5997848, US 5993873, US 5985248, US 5976574, US 5922354, US 5785049 и US 5654007.
К механическим устройствам, разработанным для доставки в легкие лечебных продуктов, относятся распылители, мерные ингаляторы и порошковые ингаляторы, и другие устройства, которые все знакомы специалистам в данной области техники. Конкретными примерами коммерчески доступных устройств, подходящих для практического применения данного изобретения, являются распылитель Ultravent, изготовляемый Mallinckrodt, Inc., Сент-Луис, Миссури; распылитель Acorn II, изготовляемый Marquest Medical Products, Инглвуд, Колорадо; мерный ингалятор Ventolin, изготовляемый Glaxo Inc., Research Triangle Park, Северная Каролина; порошковый ингалятор Spinhaler, изготовляемый Fisons Corp., Бедфорд, Массачусетс; устройство "стоячее облако" от Inhale Therapeutic Systems, Inc., Сан-Карлос, Калифорния; ингалятор AIR, изготовляемый Alkermes, Кэмбридж, Массачусетс; и система для доставки лекарственных средств в легкие AERx, изготовляемая Aradigm Corporation, Хейворд, Калифорния.
Изобретение относится к композициям и способам лечения бактериальных и вирусных инфекционных заболеваний, раковых болезней или опухолей, интерстициальных болезней легких, таких как идиопатический фиброз легких, гранулематозных болезней, нарушений в костях (например, нарушения костного метаболизма, такого как злокачественный остеопороз) и аутоиммунных заболеваний, таких как ревматоидный артрит.
В другом своем аспекте изобретение относится к способу лечения млекопитающего с циркулирующими антителами против huIFNG или rhuIFNG, включающему введение соединения, обладающего биологической активностью IFNG, не взаимодействующего с указанными антителами. Соединение представляет собой, предпочтительно, конъюгат, описанный в данном описании, причем млекопитающим является, предпочтительно, человек. Млекопитающие, которых лечат, могут страдать от любой из перечисленных выше болезней, в случае которых полезным лечебным средством является IFNG. Кроме того, изобретение относится к способу получения фармацевтического продукта для применения при лечении млекопитающих, имеющих циркулирующие антитела против huIFNG или rhuIFNG, где соединение, обладающее биологической активностью IFNG и не взаимодействующее с указанными антителами, вводят в состав композиций для инъекций или других подходящих композиций. Термин "циркулирующие антитела" предназначен для обозначения антител, образующихся в организме млекопитающего в ответ на лечение какими-либо коммерчески доступными IFNG-препаратами.
Также предполагается применение нуклеотидной последовательности, кодирующей IFNG-полипептид изобретения, в генной терапии. В частности, может представлять интерес применение нуклеотидной последовательности, кодирующей IFNG-полипептид, описанное выше в разделе "Гликозилированные полипептиды изобретения, модифицированные для введения дополнительных сайтов гликозилирования". Гликозилирование полипептида, таким образом, достигается во время курса генной терапии, т.е. после экспрессии нуклеотидной последовательности в организме человека.
Рассматриваемые применения в генной терапии включают лечение таких заболеваний, при которых ожидается, что полипептид обеспечит эффективное лечение.
Местная доставка IFNG с использованием генной терапии может обеспечить лекарственным средством намеченную область, причем в то же время удается избежать возможных проблем токсичности, связанных с неспецифическим введением.
Рассматривается методология генной терапии как in vitro, так и in vivo.
Известны некоторые способы переноса потенциально лечебных генов в определенные клетки. Для дополнительной информации см., например, Mulligan, "The Basic Science Of Gene Therapy", Science, 260, pp.926-31 (1993). К таким способам относятся
прямой перенос генов, например, как описывается в Wolff et al., "Direct Gene transfer Into Mouse Muscle In vivo", Science, 247, pp.1465-68 (1990);
опосредованный липосомами перенос ДНК, например, как описывается в Caplen et al., "Liposome-mediated CFTR Gene Transfer to the Nasal Epithelium Of Patients With Cystic Fibrosis", Nature Med., 3, pp.39-46 (1995); Crystal, "The Gene As A Drug", Nature Med., 1, pp.15-17 (1995); Gao and Huang, "A Novel Cationic Liposome Reagent For Efficient Transfection of Mammalian Cells", Biochem. Biophys. Res. Comm., 179, pp.280-85 (1991);
опосредованный ретровирусами перенос ДНК, например, как описывается в Кау et al., "In vivo Gene Therapy of Hemophilia B: Sustained Partial Correction In Factor IX-Deficient Dogs", Science, 262, pp.117-19 (1993); Anderson, "Human Gene Therapy", Science, 256, pp.808-13 (1992);
опосредованный ДНК-овыми вирусами перенос ДНК. К таким ДНК-овым вирусам относятся аденовирусы (предпочтительно, векторы на основе Ad-2 или Ad-5), вирусы герпеса (предпочтительно, векторы на основе вируса простого герпеса) и парвовирусы (предпочтительно, векторы на основе "дефектных" или неавтономных парвовирусов, предпочтительнее векторы на основе аденоассоциированных вирусов, наиболее предпочтительно - векторы на основе AAV-2). См., например, Ali et al., "The Use Of DNA Viruses as Vectors for Gene Therapy", Gene Therapy, 1, pp.367-84 (1994); US 4797368 и US 5139941.
Изобретение также описывается в приведенных далее примерах. Примеры никоим образом не следует понимать как ограничивающие общие утверждения настоящего описания и формулы изобретения.
Материалы и методы
Анализы
Схема анализа с интерфероном
Ранее сообщалось, что IFNG взаимодействует и активирует IFNG-рецепторы на клетках HeLa. Следовательно, транскрипция активируется при промоторах, содержащих элемент ответа, стимулированный интерфероном (ISRE). Таким образом, возможно проводить скриниг агонистов интерфероновых рецепторов с применением ISRE в сочетании с геном рецептора люциферазы (ISRE-luc), помещенным на клетках HeLa.
Первичный анализ
Клетки HeLa котрансфецируют с ISRE-Luc, и создают pCDNA 3.1/hygro и foci (клеточные клоны) путем отбора в среде DMEM, содержащей гигромицин В. Клеточные клоны скринируют на люциферазную активность в присутствии или в отсутствие IFNG. Указанные клоны, показывающие наивысшее отношение стимулированной люциферазной активности к нестимулированной, используют в дальнейших анализах.
Для того, чтобы скринировать мутеины, в 96-луночные культуральные планшеты высевают 15000 клеток/лунку и инкубируют в течение ночи в среде DMEM. На следующий день к клеткам в разных концентрациях добавляют мутеины, а также известный стандарт. Планшеты инкубируют в течение 6 часов при 37°С в атмосфере с 5% CO2. Затем в каждую лунку добавляют субстрат LucLite (Packard Bioscience, Гронинген, Нидерланды). Планшеты запаивают, и измеряют люминесценцию на люминометре TopCount (Packard) методом SPC (подсчет единичных фотонов). Каждый отдельный планшет содержит лунки, инкубированные с IFNG в качестве стимулированного контроля, и другие лунки, содержащие обычную среду, в качестве нестимулированного контроля. Отношение между стимулированной и нестимулированной люциферазной активностью служит в качестве внутреннего стандарта как в случае мутеиновой активности, так и при изменениях от эксперимента к эксперименту.
Функциональное время полужизни in vivo IFNG-конъюгата
Измерение биологического времени полужизни можно осуществить многими способами, описанными в литературе. В одном из способов, описанном Rutenfranz et al. (J. Interferon Res., 1990, vol.10, p.337-341), используют внутривенную и внутримышечную инъекцию IFNG 8-недельным мышам C57BL/6. Биологическое время полужизни измеряют с помощью биологического анализа, определяющего титр IFNG в муриновой сыворотке, с использованием клеток Нер-2 и вируса везикулярного стоматита (WS). В качестве альтернативы авторы также применяли ELISA для определения уровня IFNG в сыворотке.
В качестве другого способа можно применить мечение IFNG радиоактивными изотопами для исследования подкожной абсорбции и локального распределения IFNG. Croos and Roberts (J. Pharm., 1993, vol.45, р.606-609) провели исследования с 125IFNG на подвергнутых наркозу самках крыс Spraque-Dawley. После подкожного введения собирали образцы крови и ткани, и определяли количество IFNG, подсчитывая гамма-кванты.
Обработка IFNG PEG
Обработанный PEG ruIFNG можно получить так, как описывается в примере 2 в US 5109120. Аналогично, можно обработать PEG описываемые здесь IFNG-полипептиды, например, содержащие мутацию N25K. Полученный конъюгат PEG-IFNG-N25K содержит дополнительную присоединенную молекулу PEG по сравнению с конъюгатом ruIFNG.
Получение фармацевтической композиции
Фармацевтическую композицию, например, для лечения интерстициальных болезней легких можно получить, вводя релевантный очищенный конъюгат изобретения в композицию для инъекций согласно процедурам, хорошо известным специалистам в данной области техники, таким образом, чтобы в каждой ампуле конъюгат содержался в количестве, соответствующем 50, 100, 200, 300, 400 или 500 мкг, например ruIFNG или IFNG-N25K.
Идентификация обращенных к поверхности аминокислотных остатков
Структуры
Об экспериментальных 3D-структурах ruIFNG, определенных методом рентгеновской кристаллографии, сообщается в Ealick et al.. Science, 252:698-702 (1991), где сообщается о С-альфа следе гомодимера IFNG. Walter et al., Nature, 376:230-235 (1995) сообщают о структуре гомодимера IFNG в комплексе с двумя молекулами растворимой формы IFNG-рецептора. Координаты такой структуры ранее нигде не публиковались. Thiel et al., Structure, 8:927-936 (2000) сообщают о структуре гомодимера IFNG в комплексе с двумя молекулами растворимой формы IFNG-рецептора, содержащей третью молекулу рецептора в структуре, не вступающей во взаимодействие с гомодимером IFNG.
Методы
Площадь доступной поверхности (ASA)
Для вычисления площади доступной поверхности (ASA) отдельных атомов в структуре используют компьютерную программу Access (В. Lee and F.V.Richards, J. Mol. Biol., 55:379-400 (1971)), версия 2 (Copyright (c) Yale University). При данном способе, как правило, используют зонд размером 1,4Å и определяют площадь доступной поверхности (ASA) как площадь, образованную с зондом в центре. Перед таким вычислением все молекулы воды, атомы водорода и другие атомы, непосредственно не связанные с белком, удаляют из системы координат.
Фракционная ASA боковой цепи
Фракционную ASA атомов боковой цепи рассчитывают путем деления суммы ASA атомов в боковой цепи на величину, представляющую ASA атомов боковой цепи такого типа остатка в растянутом трипептиде ALA-x-ALA. См. Hubbard, Campbell & Thronton (1991), J. Mol. Biol., 220:507-530. В случае указанного примера атом СА рассматривается как часть боковой цепи остатков глицина, но не для оставшихся остатков. Приведенную далее таблицу используют в качестве стандартной 100% ASA для боковой цепи.
Ala 69.23 Å2
Arg 200.35 Å2
Asn 106.25 Å2
Asp 102.06 Å2
Cys 96.69 Å2
Gin 140.58 Å2
Glu 134.61 Å2
Gly 32.28 Å2
His 147.00 Å2
De 137.91 Å2
Leu 140.76 Å2
Lys 162.50 Å2
Met 156.08 Å2
Phe 163.90 Å2
Pro 119.65 Å2
Ser 78.16 Å2
Thr 101.67 Å2
Tip 210.89 Å2
Tyr 176.61 Å2
Val 114.14 Å2
Остатки, не обнаруживаемые в структуре, определяют как имеющие 100% доступность, так как считается, что остаток находится в гибких участках.
Определение расстояний между атомами
Расстояние между атомами определяют с использованием программного обеспечения молекулярной машинной графики, например, InsightII v.98.0, MSI INC.
Определение рецепторсвязывающего сайта
Рецепторсвязывающий сайт определяют как содержащий все остатки, у которых изменяется площадь доступной поверхности после связывания рецептора. Это определяют путем, по меньшей мере, двух вычислений ASA: одного на изолированном(ых) лиганде(ах) в комплексе лиганд(ы)/рецептор(ы) и другого на полном комплексе лиганд(ы)/рецептор(ы).
Результаты
Используемая рентгеновская структура соответствует гомодимеру IFNG в комплексе с двумя молекулами растворимой формы IFNG-рецептора, содержащему третью молекулу IFNG-рецептора в структуре, не взаимодействующую с гомодимером IFNG, как сообщают Thiel et al.. Structure, 8:927-936 (2000). Структура состоит из гомодимера IFNG, где две молекулы называют А и В. Для целей конструирования имеется дополнительный метионин, размещенный перед последовательностью IFNG, названной М0, и последовательность является процессированной по С-концу на десять остатков (причем Q133 является последним остатком в сконструированных молекулах). М0 удаляют из структуры при всех вычислениях в данном примере. Структура двух мономеров IFNG имеет очень слабую электронную плотность после остатка 120, и остатки моделируются только до остатка Т126. Следовательно, остатки S121-T126 удаляются из структуры перед вычислениями в данном примере. Два фрагмента рецептора, названные С и D, непосредственно взаимодействуют с гомодимером IFNG, а третья рецепторная молекула, названная Е, не контактирует с гомодимером IFNG и не участвует в данных вычислениях.
Доступность поверхности
Осуществляя вычисления фракционной ASA на гомодимере из молекул А и В, исключая МО и S121-T126 в обеих молекулах, получают перечисленные далее остатки, в которых свыше 25% их боковых цепей обращено к поверхности в, по меньшей мере, одном из мономеров: Q1, D2, Р3, К6, Е9, N10, К12, К13, Y14, N16, G18, Н19, S20, D21, А23, D24, N25, G26, Т27, G31, К34, N35, К37, Е38, Е39, S40, К55, К58, N59, К61, D62, D63, Q64, S65, Q67, К68, Е71, Т72, К74, Е75, N78, V79, К80, N83, S84, N85, К86, К87, D90, Е93, К94, N97, S99, Т101, D102, L103, N104, H111, Q115, A118 и Е119.
В перечисленных далее остатках свыше 50% их боковых цепей обращено к поверхности в, по меньшей мере, одном из мономеров: Q1, D2, Р3, К6, Е9, N10, К13, N16, G18, Н19, S20, D21, А23, D24, N25, G26, Т27, G31, К34, К37, Е38, Е39, К55, К58, N59, D62, Q64, S65, К68, Е71, Е75, N83, S84, К86, К87, К94, N97, S99, Т101, D102, L103, N104, Q115, А118, Е119.
Осуществляя вычисления фракционной ASA на гомодимере из молекул А и В, исключая М0 и S121-T126 в обеих молекулах и включая рецепторные молекулы С и D, получают перечисленные далее остатки, в которых свыше 25% их боковых цепей обращено к поверхности в, по меньшей мере, одном из мономеров: Q1, D2, Р3, К6, Е9, N10, К13, Y14, N16, G18, Н19, D21, N25, G26, G31, К34, N35, К37, Е38, Е39, S40, К55, К58, N59, К61, D62, D63, Q64, S65, Q67, К68, Е71, Т72, К74, Е75, N78, V79, К80, N83, S84, N85, К86, К87, D90, Е93, К94, N97, S99, Т101, D102, L103, N104, Е119. В перечисленных далее остатках свыше 50% их боковых цепей обращено к поверхности в, по меньшей мере, одном из мономеров: Р3, К6, N10, К13, N16, D21, N25, G26, G31, К34, К37, Е38, Е39, К55, К58, N59, D62, Q64, S65, К68, Е71, Е75, N83, S84, К86, К87, К94, N97, S99, Т101, L103 и N104.
Все вышеуказанные позиции являются мишенями для модификации согласно настоящему изобретению.
Сравнение двух перечней приводит к тому, что К12, S20, А23, D24, Т27, H111, Q115 и А118 удаляются из перечня с 25% ASA боковых цепей после связывания рецептора, a Q1, D2, Е9, G18, Н19, S20, А23, D24, Т27, Q115, А118 и Е119 удаляются из перечня с 50% ASA боковых цепей после связывания рецептора.
Остатки, не определенные в структуре, обрабатывают как с полностью доступной поверхностью, т.е., остатки S121, Р122, А123, А124, К125, Т126, G127, К128, R129, К130, R131, S132, Q133, М134, L135, F136, R137, G138, R139, R140, А141, S142, Q143. Указанные остатки также составляют отдельные мишени для введения групп для присоединения согласно настоящему изобретению (или их можно рассматривать как принадлежащие к группе обращенных к поверхности аминокислотных остатков, например, у которых доступных боковых цепей свыше 25% или свыше 50%).
Рецепторсвязывающий сайт
Осуществляя вычисления ASA так, как описано выше, получают перечисленные далее остатки молекулы IFNG с уменьшенной ASA, по сравнению с вычислением для изолированного димера, в, по меньшей мере, одном из мономеров в комплексе: Q1, D2, Y4, V5, Е9, К12, G18, Н19, S20, D21, V22, А23, D24, N25, G26, Т27, L30, К34, К37, К108, H111, E112, I114, Q115, А118, Е119.
Примеры
Пример 1
Создание экспрессионной кассеты для экспрессии IFNG в
дрожжевых и СНО-клетках
Последовательность ДНК, GenBank, инвентарный номер Х13274, включающую в себя полноразмерную кДНК, кодирующую зрелый huIFNG без его нативного сигнального пептида, модифицируют для того, чтобы облегчить высокую экспрессию в дрожжевых клетках. Во-первых, вводят сигнальный пептид MATа вместо сигнального пептида IFNG для того, чтобы облегчить секрецию в дрожжевые среды. Во-вторых, модифицируют кодоны нуклеотидной последовательности hulFNG путем смещения в применении кодонов в сторону кодонов, часто используемых в дрожжах. Затем некоторые нуклеотиды в последовательности заменяют на другие для того, чтобы ввести сайт рестрикции для эндонуклеаз для ДНК. Создают такие праймеры, чтобы можно было синтезировать ген.
Праймеры собирают на синтетическом гене методом одностадийной PCR с использованием набора Pfx-полимераз Platinum (Life Technologies) и параметров циклизации трехстадийной PCR. Собранный ген амплифицируют PCR с использованием тех же условий, и получают последовательность, представленную в ПОСЛЕД. №3.
Синтезированный ген клонируют в pJS037-lip (Okkels J.S. (1966), Rec. DNA Biotech. III, vol.782, 202-207) между сайтом HindIII в 5'-конце и XbaI в 3'-конце, и получают pIGY-1.
Для того, чтобы создать одноцепочечную конструкцию, содержащую ковалентно связанные мономерные IFNG-полипептиды, создают конструкции, описанные далее.
I) Конструкция, содержащая два зрелых полноразмерных huIFNG-полипептида, соединенных через 19-мерный линкерный пептид, смоделированный после шарнирных областей IgAl человека (Lunn С.A. et al., J. Biol. Chem., 17920-17924, 1992). Это осуществляют методом PCR с использованием следующих праймеров:
ADJ002 5'-GGTTTGATATCGATGGCCAA-3' (ПОСЛЕД. №4);
ADJ003 5'-GCGGCCCTCTAGATTACT-3' (ПОСЛЕД. №5);
ADJ004 5'-CATCTCCGTCCACTCCGACTCCATAGCATGCAAGATCCATATGTGA AAGAA-3' (ПОСЛЕД. №6);
ADJ007 5'-ATCTTGCATGCTATGGAGTCGGAGTGGACGGAGATGGAGTTGGCGG AGTAGAAGGAACCGCTGTTTTAGCAGCTGGAGACAATT-3 (ПОСЛЕД. №7).
Фрагменты PCR клонируют в pIGY-1 между ClaI в 5'-конце и XbaI в 3'-конце, собирая два мономера в SphI (введенном в линкерную область). Данную конструкцию называют pIGY-2.
II) Конструкция, содержащая два мономерных зрелых полноразмерных huIFNG-полипептида без линкера. Для этого для PCR используют следующие праймеры:
ADJ002 5'-GGTTTGATATCGATGGCCAA-3' (ПОСЛЕД. №8);
ADJ003 5'-GCGGCCCTCTAGATTACT-3' (ПОСЛЕД. №9);
ADJ006 5'-TTTAGAGGTAGAAGAGCTTCTCAGCAAGATCCATATGTGAAAGAA
СТ-3' (ПОСЛЕД. №10);
ADJ009 5'-AGCTTCTTTCACATATGGATCTTGCTGAGAAGCTCTTCTACGTCT
AAA-3' (ПОСЛЕД. №11).
Фрагмент PCR собирают двухстадийной PCR и клонируют между ClaI в 5'-конце и XbaI в 3'-конце и называют pIGY-3.
III) Конструкция, содержащая два процессированных по С-концу (последние 11 аминокислот) мономерных IFNG-полипептида, ковалентно связанных через 19-мерный пептидный линкер, указанный выше. Используют следующие праймеры:
ADJ001 5'-TGCTCTAGACATCTGAGATCGTTTTCTCTTTCC-3' (ПОСЛЕД. №12);
ADJ002 5'-GGTTTGATATCGATGGCCAA-3' (ПОСЛЕД. №13);
ADJ004 5' -CATCTTCCGTCCACTCCGACTCCATAGCATGCAAGATCCATATGT GAAAGAA-3' (ПОСЛЕД. №14);
ADJ005 5'-ATCTTGCATGCTATGGAGTCGGAGTGGACGGAGATGGAGTTGGCG GAGTAGAAGGAACCGGCATCTGAGATCTTTTTCTCC-3' (ПОСЛЕД. №15).
Фрагменты PCR клонируют в pIGY-1 между ClaI в 5'-конце и XbaI в 3'-конце, собирая два мономера в SphI (введенном в линкерную область). Данную конструкцию называют pIGY-4.
Конструкции для экспрессии в СНО-клетках
Для того, чтобы экспрессировать IFNG в СНО-клетках, синтезируют указанные далее олигонуклеотиды, чтобы создать возможность для клонирования IFNG, включая его сигнальный пептид, в pcDNA3.1/hygro (Invitrogen).
ADJ012 5'-CGCGGATCCATGAAATATACAAGTTATATCTTGGCTTTTCAGCTCTGCATCGTTTT GGGTTCTCTTGGCTGTTACTGCCAAGATCCATATGTGAAAGAAGCT-3' (ПОСЛЕД. №16).
Для того, чтобы клонировать IFNG в таком экспрессирующем векторе, PCR-амплификацией с использованием ADJ012 и ADJ003 и pIGY-1 в качестве матрицы получают фрагмент в 450 п.о., который можно клонировать между BamHI в 5'-конце и Xbal в 3'-конце pcDNA3.1/hygro, причем приходят к pIGY-5.
Для того, чтобы ввести сайты гликозилирования в IFNG, создают олигонуклеотиды таким образом, чтобы генерируемые PCR изменения можно было ввести в экспрессирующую плазмиду (pIGY-5) классической двухстадийной PCR с последующим клонированием PCR-фрагмента между BamHI в 5'-конце и XbaI в 3'-конце.
Поэтому создают два векторных праймера для применения со специфическими мутационными праймерами
ADJ013 5'-GATGGCTGGCAACTGAGAAG-3' (ПОСЛЕД. №17)
(антисмысловой последующий векторный праймер) и
ADJ014 5'-TGTACGGTGGGAGGTCTAT-3' (ПОСЛЕД. №18)
(смысловой предыдущий векторный праймер).
Для различных мутеинов создают следующие праймеры:
К12Т
ADJ015 5'-AGCATTAAAATACTTCGTCAAGTTTTCAGC-3' (ПОСЛЕД. №19)
ADJ016 5'-GCTGAAAACTTGACGAAGTATTTTAATGCT-3' (ПОСЛЕД. №20)
G18T
ADJ017 5'-CACATCAGAATGAGTAGCATTAAAATA-3' (ПОСЛЕД. №21)
ADJ018 5'-TATTTTAATGCTACTCATTCTGATGTG-3' (ПОСЛЕД. №22)
E38N
ADJ019 5'-CATAATTTTTCGATCGGATTCGTTTTTCCAATTCTT-3' (ПОСЛЕД. №23)
ADJ020 5'-AAGAATTGGAAAAACGAATCCGATCGAAAAATTATG-3' (ПОСЛЕД. №24)
К61Т
ADJ021 5'-AATAGACTGATCGTCTGTAAAGTTTTTAAA-3' (ПОСЛЕД. №25)
ADJ022 5'-TTTAAAAACTTTACAGACGATCAGTCTATT-3' (ПОСЛЕД. №26)
N85T
ADJ023 5'-ТСТТТТСТТТТТАСТАСТАТТСАААААСТТ-3' (ПОСЛЕД. №27)
ADJ024 5'-AAGTTTTTCAATAGTACTAAAAAGAAAAGA-3' (ПОСЛЕД. №28)
K94N
ADJ025 5'-ATAATTAGTCAAATTTTCGAAGTCATG-3' (ПОСЛЕД. №29)
ADJ026 5'-GATGACTTCGAAAATTTGACTAATTAT-3' (ПОСЛЕД. №30)
S99N
ADJ027 5'-AATCAAGTCAGTAACGTTATAATTAGTCAA-3' (ПОСЛЕД. №31)
ADJ028 5'-TTGACTAATTATAACGTTACTGACTTGAAT-3' (ПОСЛЕД. №32)
Q106T
ADJ029 5'-ATGAATAGCTTTACTAGTCACATTCAAGTC-3' (ПОСЛЕД. №33)
ADJ030 5'-GACTTGAATGTGACTAGTAAAGCTATTCAT-3' (ПОСЛЕД. №34)
После двухстадийной PCR и гидролиза с BamHI и XbaI каждая из указанных пар праймеров дает фрагмент в 447 п.о., который клонируют в pIGY-5.
Экспрессия интерферона γ в СНО-клетках
Вышеуказанные конструкции готовы для трансфекции в клеточную линию СНО K1 (ATCC#CCL-61) путем применения липофектамина 2000 (Life Technologies, США) в качестве агента трансфекции. Через 24 часа культуральная среда готова для сбора и анализа на активность интерферона γ и его содержание.
1. Конъюгат, проявляющий активность γ-интерферона (IFNG-активность), содержащий
а) полипептид, включающий аминокислотную последовательность, которая отличается на 1-15 аминокислотных остатков от человеческого γ-интерферона (huIFNG) дикого типа, приведенного в SEQ ID NO: 2, или его фрагмент, укороченный с С-конца на 1-15 аминокислотных остатков, и
б) по меньшей мере, одну N-присоединяемую углеводную группу, ковалентно присоединенную к введенному сайту N-гликозилирования, причем указанный введенный сайт N-гликозилирования расположен внутри N-концевого участка длиной в 118 аминокислотных остатков IFNG-полипептида.
2. Конъюгат по п.1, где указанный введенный сайт N-гликозилирования расположен внутри N-концевого участка длиной в 93 аминокислотных остатка IFNG-полипептида.
3. Коньюгат по п. 1 или 2, где указанный полипептид включает аминокислотную последовательность, которая отличается на 1-8 аминокислотных остатков от huIFNG, или его фрагмент.
4. Коньюгат по п.3, где указанный полипептид включает аминокислотную последовательность, которая отличается на 1-5 аминокислотных остатков от huIFNG, или его фрагмент.
5. Конъюгат по п.1, где указанный сайт N-гликозилирования вводят в позицию, которая занята аминокислотным остатком, у которого, по меньшей мере, 25% его боковой цепи обращено к поверхности.
6. Конъюгат по п.5, где указанный сайт N-гликозилирования вводят в позицию, которая занята аминокислотным остатком, у которого, по меньшей мере, 50% его боковой цепи обращено к поверхности.
7. Конъюгат по п.1, где указанный сайт N-гликозилирования вводят путем замены, выбранной из группы, состоящей из Q1N+P3S/T, P3N+V5S/T, K6N+A8S/T, E9N+L11S/T, K12S/T, K13N+F15S/T, Y14N+N16S/T, G18S/T, G18N, G18N+S20T, H19N+D21S/T, D21N+A23S/T, G26N+L28S/T, G31N+L33S/T, K34N+W36S/T, K37S/T, K37N+E39S/T, E38N, E38N+S40T, E39N+D41S/T, S40N+R42S/T, K55N+F57S/T, K58N+F60S/T, K61S/T, K61N+D63S/T, D62N+Q64S/T, D63N, D63N+S65T, Q64N+I66S/T, S65N+Q67S/T, Q67N, Q67N+S69T, K68N+V70S/T, E71N+I73S/T, T72N+K74S/T, K74N+D76S/T, E75N+M77S/T, K80S/T, V79N+F81S/T, K80N+F82S/T, N85S/T, S84N+K86S/T, K87S/T, K86N+K88S/T, K87N+R89S/T, D90N+F92S/T, E93N+L95S/T, K94N, K94N+T96S, S99N, S99N+T101S, T101N+L103S/T, D102N+N104S/T, L103N+V105S/T и Q106S/T.
8. Конъюгат по п.7, где указанный сайт N-гликозилирования вводят путем замены, выбранной из группы, состоящей из P3N+V5S/T, K6N+A8S/T, K12S/T, K13N+F15S/T, G18S/T, D21N+A23S/T, G26N+L28S/T, G31N+L33S/T, K34N+W36S/T, K37N+E39S/T, E38N, E38N+S40S/T, E39N+D41S/T, K55N+F57S/T, K58N+F60S/T, K61S/T, D62N+Q64S/T, Q64N+I66S/T, S65N+Q67S/T, K68N+V70S/T, E71N+I73S/T, E75N+M77S/T, N85S/T, S84N+K86S/T, K86N+K88S/T, K87N+R89S/T, K94N, K94N+T96S, S99N, S99N+T101S, T101N+L103S/T, D102N+N104S/T, L103N+V105S/T и Q106S/T.
9. Конъюгат по п.1, где указанный сайт N-гликозилирования вводят путем замены, выбранной из группы, состоящей из K12S/T, G18S/T, G18N, K37S/T, E38N, M45N, I49N, K61S/T, D63N, Q67N, V70N, K80S/T, F82N, N85S/T и K87S/T.
10. Конъюгат по п.9, где указанный сайт N-гликозилирования вводят путем замены, выбранной из группы, состоящей из К12Т, G18N, G18T, К37Т, E38N, К61Т, D63N, Q67N, К80Т и N85T.
11. Конъюгат по п.10, где указанный сайт N-гликозилирования вводят путем замены, выбранной из группы, состоящей из G18N, E38N, D63N и Q67N.
12. Конъюгат по п.8, где указанный сайт N-гликозилирования вводят путем замены E38N+S40T.
13. Конъюгат по п.1, где указанная аминокислотная последовательность дополнительно содержит по меньшей мере один введенный остаток цистеина.
14. Конъюгат по п.13, где остаток цистеина вводят в позицию, которая занята аминокислотным остатком, у которого, по меньшей мере, 25% его боковой цепи обращено к поверхности.
15. Конъюгат по п.14, где остаток цистеина вводят в позицию, которая занята аминокислотным остатком, у которого, по меньшей мере, 50% его боковой цепи обращено к поверхности.
16. Конъюгат по п.15, где остаток цистеина вводят путем замены, выбранной из группы, состоящей из N10C, N16C, Е38С, N59C, N83C, К94С и N104C.
17. Конъюгат по п.13, где цистеиновый остаток введен в положение, занятое любым из аминокислотных остатков 121-143.
18. Конъюгат по п.13, где неполипептидная часть ковалентно связана с введенным остатком цистеина.
19. Конъюгат по п.18, где неполипептидная группа представляет собой молекулу полимера.
20. Конъюгат по п.19, где полимер представляет собой линейный или разветвленный полиэтиленгликоль.
21. Конъюгат по любому из пп.1 и 2 и 4-20, где конъюгат укорочен с С-конца на 11 аминокислотных остатков.
22. Конъюгат по любому из пп.1-2 и 4-20 для применения в качестве лечебного средства.
23. Конъюгат по п.3 для применения в качестве лечебного средства.
24. Конъюгат по п.21 для применения в качестве лечебного средства.
25. Нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептидную часть конъюгата по любому из пп.1-24.
26. Экспрессирующий вектор, содержащий нуклеотидную последовательность по п.25.
27. Способ получения клетки-хозяина, продуцирующей полипептидную часть конъюгата по любому из пп.1-24, который предусматривает введение нуклеотидной последовательности по п.25 или экспрессирующего вектора по п.26.
28. Фармацевтическая композиция, содержащая конъюгат по любому из пп.1-24, и фармацевтически приемлемый разбавитель, носитель или адъювант.
29. Фармацевтическая композиция по п.28 для применения в качестве лечебного средства.
30. Лечебное средство для лечения интерстициальных болезней легких, содержащее конъюгат по любому из пп.1-24 в качестве активного начала.
31. Лечебное средство по п.30, где интерстициальной болезнью легких является идиопатический фиброз легких.
32. Лечебное средство по п.31, которое вводят подкожно.
33. Способ лечения интерстициальных болезней легких, включающий введение нуждающемуся в этом пациенту конъюгата по любому из пп. 1-24 или фармацевтической композиции по п.28.
34. Способ по п.33, где интерстициальной болезнью легких является идиопатический фиброз легких.
35. Способ по п.34, где лечебное средство вводят подкожно.
По пунктам формулы установлены следующие приоритеты:
По п.1 - 12 ноября 1999г. на основании приоритетной заявки РА 1999 01631, поданной в Патентное ведомство Дании (за исключением оговорки «причем указанный сайт N-гликозилирования расположен внутри N-концевого участка длиной в 118 аминокислотных остатков IFNG-полипептида»); 13 ноября 2000 г. - в отношении названной оговорки.
По п.2 - 13 ноября 2000 г.
По пп.3, 4 - 12 ноября 1999 г. на основании приоритетной заявки РА 1999 01631, поданной в Патентное ведомство Дании.
Однако указанные пункты являются зависимыми от п.1, в котором вышеназванная оговорка имеет приоритет 13 ноября 2000 г.
По пп.5, 6 - 13 ноября 2000 г.
По пп.7-12 - 12 ноября 1999 г. на основании приоритетной заявки РА 1999 01631, поданной в Патентное ведомство Дании, в отношении части перечисленных замен, 13 ноября 2000 г. в отношении части перечисленных замен.
По п.13 - 12 ноября 1999 г. на основании приоритетной заявки РА 1999 01631, поданной в Патентное ведомство Дании. Однако указанный пункт является зависимым от п.1, в котором вышеназванная оговорка имеет приоритет 13 ноября 2000 г.
По пп.14, 15 - 13 ноября 2000 г.
По п.16 - 12 ноября 1999 г. на основании приоритетной заявки РА 1999 01631, поданной в Патентное ведомство Дании, в отношении части перечисленных замен, 13 ноября 2000г. в отношении части перечисленных замен.
По п.17 - 13 ноября 2000 г.
По пп.18-20 - 12 ноября 1999 г. на основании приоритетной заявки РА 1999 01631, поданной в Патентное ведомство Дании. Однако указанные пункты являются зависимыми от п.1, в котором вышеназванная оговорка имеет приоритет 13 ноября 2000 г.
По п.21 - 13 ноября 2000 г.
По пп.22-35 - 12 ноября 1999 г. на основании приоритетной заявки РА 1999 01631, поданной в Патентное ведомство Дании, в отношении части перечисленных замен, 13 ноября 2000 г. в отношении части перечисленных замен.
