Способ определения оксибензола и его монометильных производных в биологическом материале

Изобретение относится к способу определения оксибензола и его монометильных производных в биологическом материале, заключающемуся в том, что анализируемые вещества извлекают из объекта с использованием этилацетата, вытяжки упаривают, остаток растворяют в смеси растворителей гексан-диэтиловый эфир (6:4) и хроматографируют в колонке с силикагелем, отбирая при этом фракции, содержащие оксибензол и его монометильные производные, которые после этого обрабатывают нитрующим агентом, предварительно разделив полученные нитросоединения оксибензола и его монометильных производных с помощью экстракции диэтиловым эфиром при рН 1 и рН 4, определяют их качественное и количественное содержание по содержаниям соответствующих полинитропроизводных, определенным по данным хроматограмм, полученных методом ВЭЖХ, с использованием подвижной фазы гексан-диоксан-пропанол-2 (40:5:1) для растворов, содержащих полинитропроизводные 2 метилоксибензола и 4 метилоксибензола, и с ипользованием подвижной фазы гексан-диоксан-муравьиная кислота (5:3:0,2) для растворов, содержащих полинитропроизводные оксибензола и 3 метилоксибензола. Технический результат: повышение чувствительности и селективности определения оксибензола и его монометильных производных при их совместном присутствии, сокращение продолжительности анализа. 6 табл., 2 ил.

 

Изобретение относится к биологии и токсикологической химии, а именно к способам определения оксибензола и его монометильных производных в биологическом материале, и может быть использовано в практике санэпидстанций, химико-токсикологических и ветеринарных лабораторий. Способ относится к числу массовых.

Известен способ определения оксибензола в биологическом материале путем измельчения биологического объекта, подкисления раствором виннокаменной кислоты, прибавления сульфата кадмия, проведения дистилляции с использованием парообразователя, отбора дистиллята, встряхивания дистиллята с оксидом алюминия с последующей обработкой дистиллята водно-этанольным раствором 2,6-дибромхинонхлоримида в присутствии боратного буфера с рН 10,5 и фотометрированием образующегося окрашенного раствора на фоне воды. (Гадаскина И.Д., Филов В.А. Превращения и определение промышленных органических ядов в организме. Л.: Медицина, 1970. - С.38-39). Способ малоселективен, характеризуется недостаточной высокой точностью.

Известен способ определения фенола (оксибензола) и его монометильных производных (крезолов) в биологических объектах путем измельчения биологической ткани, смешивания ее с водой, подкисления органической кислотой и осуществления дистилляции с водяным паром с последующим сбором дистиллята, экстракцией анализируемых веществ из дистиллята диэтиловым эфиром, отгонкой экстрагента и определением исследуемых соединений методом броматометрического титрования (Швайкова М.Д. Токсикологическая химия. - М.: Медицина, 1975. - С.67-69, 111-114).

Способ малоселективен, отличается недостаточно высокой чувствительностью.

Наиболее близким является способ определения 4-метилоксибензола в моче, заключающийся в том, что анализируемую пробу подкисляют серной кислотой, перегоняют с водяным паром, полученный дистиллят обрабатывают 65% азотной кислотой, выдерживают при 37°С в течение 24 часов, нейтрализуют 20% раствором гидроксида натрия, прибавляют к реакционной смеси буферный раствор с рН 12 и проводят полярографическое определение (Гадаскина И.Д., Филов В.А. Превращения и определение промышленных органических ядов в организме. Л.: Медицина, 1970. - С.204).

Способ характеризуется длительностью выполнения, недостаточно высокой чувствительностью, не может обеспечить селективное определение оксибензола и его монометильных производных при их совместном присутствии.

Задачей настоящего изобретения является повышение чувствительности и селективности определения, сокращение продолжительности анализа.

Поставленная задача достигается с помощью предлагаемого способа, который заключается в том, что биологическую ткань (например, ткань печени) измельчают, двукратно по 30 минут обрабатывают этилацетатом, этилацетатные извлечения объединяют, обезвоживают, этилацетат испаряют при 16-20°С, остаток растворяют в смеси растворителей гексан-диэтиловый эфир (8:2), хроматографируют в колонке с силикагелем с использованием подвижной фазы гексан-диэтиловый эфир (8:2), фракции элюата, содержащие оксибензол и его монометильные производные, объединяют, обезвоживают, элюент испаряют, остаток обрабатывают смесью азотной (65%-ной) и серной (94%-ной) кислот при кипячении на водяной бане, реакционную смесь разбавляют водой, подщелачивают до рН 4, экстрагируют диэтиловым эфиром, подкисляют до рН 1 и повторно экстрагируют диэтиловым эфиром, экстракт из раствора с рН 4 упаривают до сухого остатка, остаток растворяют в системе растворителей гексан-диоксан-пропанол-2 (40:5:1) и хроматографируют методом ВЭЖХ в колонке с сорбентом "Силасорб-600", используя подвижную фазу гексан-диоксан-пропанол-2 (40:5:1), экстракт из раствора с рН 1 упаривают до сухого остатка, остаток растворяют в системе растворителей гексан-диоксан-муравьиная кислота (5:3:0,2) и хроматографируют методом ВЭЖХ в колонке с сорбентом "Силасорб-600", используя подвижную фазу гексан-диоксан-муравьиная кислота (5:3:0,2).

Изобретение поясняется чертежами. На фигуре 1 представлена хроматограмма смеси полинитропроизводных 2-метилоксибензола и 4-метилоксибензола (соответственно 2-метил-4,6-динитрооксибензола и 4-метил-2,6-динитрооксибензола). На фигуре 2 представлена хроматограмма смеси полинитропроизводных оксибензола и 3-метилоксибензола (соответственно 2,4,6-тринитрооксибензола и 3-метил-2,4,6-тринитрооксибензола).

Способ осуществляется следующим образом: биологическую ткань, содержащую смесь оксибензола и его монометильных производных, измельчают, дважды настаивают с этилацетатом при перемешивании (каждый раз в течение 30 минут), извлечение отделяют от твердых частиц биоматериала, объединяют, обезвоживают безводным сульфатом натрия, экстрагент испаряют в токе воздуха при 16-20°С, остаток растворяют в смеси растворителей гексан-диэтиловый эфир (8:2), хроматографируют в колонке с силикагелем с использованием подвижной фазы гексан-диэтиловый эфир (8:2), фракции элюата, содержащие оксибензол и его монометильные производные, объединяют, обезвоживают безводным сульфатом натрия, элюент испаряют, остаток обрабатывают смесью азотной (65%-ной) и серной (94%-ной) кислот, взятых в соотношении 1:1 по объему, при кипячении на водяной бане, реакционную смесь разбавляют водой, подщелачивают до рН 4, экстрагируют диэтиловым эфиром, водный слой подкисляют до рН 1 и повторно экстрагируют диэтиловым эфиром, экстракт из раствора с рН 4 упаривают до сухого остатка, остаток растворяют в системе растворителей гексан-диоксан-пропанол-2 (40:5:1) и хроматографируют методом ВЭЖХ в колонке с сорбентом "Силасорб-600", используя подвижную фазу гексан-диоксан-пропанол-2 (40:5:1), экстракт из раствора с рН 1 упаривают до сухого остатка, остаток растворяют в системе растворителей гексан-диоксан-муравьиная кислота (5:3:0,2) и хроматографируют методом ВЭЖХ в колонке с сорбентом "Силасорб-600", используя подвижную фазу гексан-диоксан-муравьиная кислота (5:3:0,2). Способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1

Качественное определение оксибензола и его монометильных производных в ткани печени

К 10 г мелкоизмельченной ткани свежей трупной печени человека прибавляют смесь оксибензола, 2-метилоксибензола, 3-метилоксибензола и 4-метилоксибензола по 5 мг каждого из веществ, тщательно перемешивают биологическую ткань с веществами и оставляют на сутки при температуре 16-20°С. По истечении указанного времени смесь заливают 20 мл этилацетата и выдерживают 30 минут, периодически перемешивая. Извлечение отделяют, операцию настаивания повторяют в указанных условиях. Вытяжки объединяют, экстрагент испаряют в токе воздуха при температуре 16-20°С, остаток растворяют в 10 мл смеси растворителей гексан-диэтиловый эфир (8:2). 2 мл полученного раствора вносят в колонку размером 490×11 мм, заполненную 10 г силикагеля типа L 40/100 μ. Хроматографируют, используя подвижную фазу гексан-диэтиловый эфир (8:2). Элюат собирают отдельными фракциями по 2 мл каждая. Фракции с 5 по 13 включительно объединяют, элюент испаряют в токе воздуха над 1 г безводного сульфата натрия при температуре 16-20°С. К остатку прибавляют 4 мл воды, остаток обрабатывают смесью азотной (65%-ной) и серной (94%-ной) кислот, взятых в соотношении 1:1 по объему, при кипячении на водяной бане в течение 5 минут, к реакционной смеси прибавляют 20%-ный раствор гидроксида натрия до рН 4. Образующийся раствор доводят буферным раствором с рН 4 до 50 мл и экстрагируют диэтиловым эфиром дважды порциями по 50 мл каждая. Эфирные экстракты объединяют, экстрагент испаряют (остаток А). Водный раствор подкисляют 24%-ным раствором хлороводородной кислоты до рН 1, доводят буферным раствором до объема 75 мл и экстрагируют образующийся раствор дважды порциями диэтилового эфира по 75 мл каждая. Эфирные экстракты объединяют, экстрагент испаряют (остаток Б). Остаток А растворяют в 25 мл системы растворителей гексан-диоксан-пропанол-2 (40:5:1). 8 мкл полученного раствора вводят в жидкостный хроматограф типа "Милихром". Процесс хроматографирования осуществляют в колонке размером 64×2 мм, заполненной сорбентом с гидроксилированной поверхностью "Силасорб-600", используя в качестве подвижной фазы систему растворителей гексан-диоксан-пропанол-2 (40:5:1). Скорость подачи элюента составляет 50 мкл/мин, скорость диаграммной ленты - 720 мм/час. Оптическую плотность регистрируют при длине волны 266 нм. Качественное определение 2-метилоксибензола и 4-метилоксибензола осуществляют по величинам характерных объемов или времени удерживания их соответствующих полинитропроизводных (2-метил-4,6-динитрооксибензола и 4-метил-2,6-динитрооксибензола).

Общий вид хроматограммы смеси 2-метил-4,6-динитрооксибензола и 4-метил-2,6-динитрооксибензола представлен на фиг.1. Первый пик (с меньшим временем удерживания) на хроматограмме соответствует 4-метил-2,6-динитрооксибензолу, второй (с большим временем удерживания) соответствует 2-метил-4,6-динитрооксибензолу.

Значения объемов и времени удерживания полинитропроизводных 2-метилоксибензола и 4-метилоксибензола представлены в таблице 1.

Остаток Б растворяют в 25 мл системы растворителей гексан-диоксан-муравьиная кислота (5:3:0,2). 8 мкл полученного раствора вводят в жидкостный хроматограф типа "Милихром". Процесс хроматографирования осуществляют в колонке размером 64×2 мм, заполненной сорбентом с гидроксилированной поверхностью "Силасорб-600", используя в качестве подвижной фазы систему растворителей гексан-диоксан-муравьиная кислота (5:3:0,2). Скорость подачи элюента составляет 100 мкл/мин, скорость диаграммной ленты 720 мм/час. Оптическую плотность регистрируют при длине волны 334 нм. Качественное определение оксибензола и 3-метилоксибензола осуществляют по величинам характерных объемов или времени удерживания их соответствующих полинитропроизводных (2,4,6-тринитрооксибензола и 3-метил-2,4,6-тринитрооксибензола).

Общий вид хроматограммы смеси 2,4,6-тринитрооксибензола и 3-метил-2,4,6-тринитрооксибензола представлен на фиг.2. Первый пик (с меньшим временем удерживания) на хроматограмме соответствует 3-метил-2,4,6-тринитрооксибензолу, второй (с большим временем удерживания) соответствует 2,4,6-тринитрооксибензолу.

Значения объемов и времени удерживания полинитропроизводных оксибензола и 3-метилоксибензола представлены в таблице 1.

Пример 2

Количественное определение 2-метилоксибензола в ткани печени в присутствии оксибензола, 3-метилоксибензола и 4-метилоксибензола

К 10 г мелкоизмельченной ткани свежей трупной печени человека прибавляют смесь оксибензола, 2-метилоксибензола, 3-метилоксибензола и 4-метилоксибензола по 5 мг каждого из веществ, тщательно перемешивают биологическую ткань с веществами и оставляют на сутки при температуре 16-20°С. По истечении указанного времени смесь заливают 20 мл этилацетата и выдерживают 30 минут, периодически перемешивая. Извлечение отделяют, операцию настаивания повторяют в указанных условиях. Вытяжки объединяют, встряхивают с 7 г безводного сульфата натрия, фильтруют через стеклянный фильтр с безводным сульфатом натрия, фильтр дополнительно промывают 20 мл этилацетата, фильтраты объединяют, экстрагент испаряют в токе воздуха при температуре 16-20°С, остаток растворяют в 10 мл смеси растворителей гексан-диэтиловый эфир (8:2). 2 мл полученного раствора вносят в колонку размером 490×11 мм, заполненную 10 г силикагеля L 40/100 μ. Хроматографируют, используя подвижную фазу гексан-диэтиловый эфир (8:2). Элюат собирают отдельными фракциями по 2 мл каждая. Фракции с 5 по 7 включительно объединяют, элюент испаряют в токе воздуха над 1 г безводного сульфата натрия при температуре 16-20°С. К остатку прибавляют 4 мл воды и 4 мл смеси азотной (65%-ной) и серной (94%-ной) кислот, взятых в соотношении 1:1 по объему, и кипятят реакционную смесь на водяной бане в течение 5 минут, после чего к реакционной смеси прибавляют 20%-ный раствор гидроксида натрия до рН 4. Образующийся раствор доводят буферным раствором с рН 4 до 50 мл и экстрагируют диэтиловым эфиром дважды порциями по 50 мл каждая. Эфирные экстракты объединяют, экстрагент испаряют. Остаток растворяют в 25 мл системы растворителей гексан-диоксан-пропанол-2 (40:5:1). 8 мкл полученного раствора вводят в жидкостный хроматограф типа "Милихром". Процесс хроматографирования осуществляют в колонке размером 64×2 мм, заполненной сорбентом "Силасорб-600", используя в качестве подвижной фазы систему растворителей гексан-диоксан-пропанол-2 (40:5:1). Скорость подачи элюента составляет 50 мкл/мин, скорость диаграммной ленты 720 мм/час. Оптическую плотность регистрируют при длине волны 266 нм.

Пик на хроматограмме с временем удерживания 7,40 мин (объемом удерживания 370 мкл) соответствует полинитропроизводному 2-метилоксибензола-2-метил-4,6-динитрооксибензолу.

Количественное содержание 2-метилоксибензола определяют исходя из площади хроматографического пика 2-метил-4,6-динитрооксибензола по уравнению калибровочного графика и пересчитывают на навеску 2-метилоксибензола, внесенную в биологический материал.

Построение калибровочного графика

В ряд пробирок вносят по 0,5 мл 0,0375%, 0,0750%, 0,15%, 0,30%, 0,45%, 0,60%, растворов 2-метилоксибензола, по 0,5 мл воды и прибавляют к содержимому каждой пробирки 1 мл смеси азотной (65%-ной) и серной (94%-ной) кислот, взятых в соотношении 1:1 по объему и кипятят на водяной бане в течение 5 минут, после чего к каждой реакционной смеси прибавляют 20%-ный раствор гидроксида натрия до рН 4 и доводят объем образующегося раствора буферным раствором с рН 4 до 10 мл.

Полученный раствор экстрагируют диэтиловым эфиром дважды порциями по 10 мл каждая. Эфирные экстракты объединяют, экстрагент испаряют. Остаток растворяют в 50 мл системы растворителей гексан-диоксан-пропанол-2 (40:5:1). 8 мкл полученного раствора вводят в хроматограф. Хроматографирование осуществляют в колонке размером 64×2 мм, заполненной сорбентом "Силасорб-600", используя в качестве подвижной фазы систему растворителей гексан-диоксан-пропанол-2 (40:5:1). Скорость подачи элюента составляет 50 мкл/мин, скорость диаграммной ленты 720 мм/час. Оптическую плотность регистрируют при длине волны 266 нм. По результатам измерения на хроматографе строят график зависимости площади пика от концентрации определяемого вещества. График линеен в интервале концентраций 0,03-0,48 мкг. Методом наименьших квадратов рассчитывают уравнение калибровочного графика, которое имеет вид:

S=34,9774·С+0,1096,

где S - площадь хроматографического пика 2-метил-4,6-динитрооксибензола, см²,

С - условная концентрация 2-метилоксибензола в анализируемой пробе, мкг.

Результаты количественного определения 2-метилоксибензола в ткани печени представлены в таблице 2.

Пример 3

Количественное определение 4-метилоксибензола в ткани печени в присутствии оксибензола, 2-метилоксибензола и 3-метилоксибензола

К 10 г мелкоизмельченной ткани свежей трупной печени человека прибавляют смесь оксибензола, 2-метилоксибензола, 3-метилоксибензола и 4-метилоксибензола по 5 мг каждого из веществ, тщательно перемешивают биологическую ткань с веществами и оставляют на сутки при температуре 16-20°С. По истечении указанного времени смесь заливают 20 мл этилацетата и выдерживают 30 минут, периодически перемешивая. Извлечение отделяют, операцию настаивания повторяют в указанных условиях. Вытяжки объединяют, встряхивают с 7 г безводного сульфата натрия, фильтруют через стеклянный фильтр с безводным сульфатом натрия, фильтр дополнительно промывают 20 мл этилацетата, фильтраты объединяют, экстрагент испаряют в токе воздуха при температуре 16-20°С, остаток растворяют в 10 мл смеси растворителей гексан-диэтиловый эфир (8:2). 2 мл полученного раствора вносят в колонку размером 490×11 мм, заполненную 10 г силикагеля L 40/100 μ. Хроматографируют, используя подвижную фазу гексан-диэтиловый эфир (8:2). Элюат собирают отдельными фракциями по 2 мл каждая. Фракции с 10 по 13 включительно объединяют, элюент испаряют в токе воздуха над 1 г безводного сульфата натрия при температуре 16-20°С. К остатку прибавляют 4 мл воды и 4 мл смеси азотной (65%-ной) и серной (94%-ной) кислот, взятых в соотношении 1:1 по объему, и кипятят реакционную смесь на водяной бане в течение 5 минут, после чего к реакционной смеси прибавляют 20%-ный раствор гидроксида натрия до рН 4. Образующийся раствор доводят буферным раствором с рН 4 до 50 мл и экстрагируют диэтиловым эфиром дважды порциями по 50 мл каждая. Эфирные экстракты объединяют, экстрагент испаряют. Остаток растворяют в 25 мл системы растворителей гексан-диоксан-пропанол-2 (40:5:1). 8 мкл полученного раствора вводят в жидкостный хроматограф типа "Милихром". Процесс хроматографирования осуществляют в колонке размером 64×2 мм, заполненной сорбентом "Силасорб-600", используя в качестве подвижной фазы систему растворителей гексан-диоксан-пропанол-2 (40:5:1). Скорость подачи элюента составляет 50 мкл/мин, скорость диаграммной ленты 720 мм/час. Оптическую плотность регистрируют при длине волны 266 нм.

Пик на хроматограмме с временем удерживания 9,92 мин (объемом удерживания 496 мкл) соответствует полинитропроизводному 4-метилоксибензола-4-метил-2,6-динитрооксибензолу.

Количественное содержание 4-метилоксибензола определяют исходя из площади хроматографического пика 4-метил-2,6-динитрооксибензола по уравнению калибровочного графика и пересчитывают на навеску 4-метилоксибензола, внесенную в биологический материал.

Построение калибровочного графика

В ряд пробирок вносят по 0,5 мл 0,05%, 0,1%, 0,2%, 0,3%, и 0,4% растворов 4-метилоксибензола, 0,5 мл воды и прибавляют к содержимому каждой пробирки 1 мл смеси азотной (65%-ной) и серной (94%-ной) кислот, взятых в соотношении 1:1 по объему, и кипятят на водяной бане в течение 5 минут, после чего к каждой реакционной смеси прибавляют 20%-ный раствор гидроксида натрия до рН 4 и доводят объем образующегося раствора буферным раствором с рН 4 до 10 мл.

Полученный раствор экстрагируют диэтиловым эфиром дважды порциями по 10 мл каждая. Эфирные экстракты объединяют, экстрагент испаряют. Остаток растворяют в 50 мл системы растворителей гексан-диоксан-пропанол-2 (40:5:1). 8 мкл полученного раствора вводят в хроматограф. Хроматографирование осуществляют в колонке размером 64×2 мм, заполненной сорбентом "Силасорб-600", используя в качестве подвижной фазы систему растворителей гексан-диоксан-пропанол-2 (40:5:1). Скорость подачи элюента составляет 50 мкл/мин, скорость диаграммной ленты 720 мм/час. Оптическую плотность регистрируют при длине волны 266 нм. По результатам измерений на хроматографе строят график зависимости площади пика от концентрации определяемого вещества. График линеен в интервале концентраций 0,04-0,32 мкг. Методом наименьших квадратов рассчитывают уравнение калибровочного графика, которое имеет вид:

S=26,0663·C+0,00804,

где S - площадь хроматографического пика 4-метил-2,6-динитрооксибензола, см²,

С - условная концентрация 4-метилоксибензола в анализируемой пробе, мкг.

Результаты количественного определения 4-метилоксибензола в ткани печени представлены в таблице 3.

Пример 4

Количественное определение оксибензола в ткани печени в присутствии 2-метилоксибензола, 3-метилоксибензола и 4-метилоксибензола

К 10 г мелкоизмельченной ткани свежей трупной печени человека прибавляют смесь оксибензола, 2-метилоксибензола, 3-метилоксибензола и 4-метилоксибензола по 5 мг каждого из веществ, тщательно перемешивают биологическую ткань с веществами и оставляют на сутки при температуре 16-20°С. По истечении указанного времени смесь заливают 20 мл этилацетата и выдерживают 30 минут, периодически перемешивая. Извлечение отделяют, операцию настаивания повторяют в указанных условиях. Вытяжки объединяют, встряхивают с 7 г безводного сульфата натрия, фильтруют через стеклянный фильтр с безводным сульфатом натрия, фильтр дополнительно промывают 20 мл этилацетата, фильтраты объединяют, экстрагент испаряют в токе воздуха при температуре 16-20°С, остаток растворяют в 10 мл смеси растворителей гексан-диэтиловый эфир (8:2). 2 мл полученного раствора вносят в колонку размером 490×11 мм, заполненную 10 г силикагеля L 40/100 μ. Хроматографируют, используя подвижную фазу гексан-диэтиловый эфир (8:2). Элюат собирают отдельными фракциями по 2 мл каждая. Фракции с 5 по 8 включительно объединяют, элюент испаряют в токе воздуха над 1 г безводного сульфата натрия при температуре 16-20°С. К остатку прибавляют 4 мл воды и 4 мл смеси азотной (65%-ной) и серной (94%-ной) кислот, взятых в соотношении 1:1 по объему и кипятят реакционную смесь на водяной бане в течение 5 минут, после чего к реакционной смеси прибавляют 20%-ный раствор гидроксида натрия до рН 4. Образующийся раствор доводят буферными растворами с рН 4 до 50 мл и экстрагируют диэтиловым эфиром дважды порциями по 50 мл каждая.

Эфирные извлечения отделяют, водный слой подкисляют 24%-ным раствором хлороводородной кислоты до рН 1, доводят буферным раствором до объема 75 мл и экстрагируют образующийся раствор дважды порциями диэтилового эфира по 75 мл каждая.

Эфирные экстракты объединяют, экстрагент испаряют. Остаток растворяют в 25 мл системы растворителей гексан-диоксан-муравьиная кислота (5:3:0,2). 8 мкл полученного раствора вводят в жидкостный хроматограф типа "Милихром". Процесс хроматографирования осуществляют в колонке размером 64х2 мм, заполненной сорбентом "Силасорб-600", используя в качестве подвижной фазы систему растворителей гексан-диоксан-муравьиная кислота (5:3:0,2). Скорость подачи элюента составляет 100 мкл/мин, скорость диаграммной ленты 720 мм/час. Оптическую плотность регистрируют при длине волны 334 нм.

Пик на хроматограмме с временем удерживания 9,12 мин (объемом удерживания 912 мкл) соответствует полинитропроизводному оксибензола-2,4,6-тринитрооксибензолу.

Количественное содержание оксибензола определяют исходя из площади хроматографического пика 2,4,6-тринитрооксибензола по уравнению калибровочного графика и пересчитывают на навеску оксибензола, внесенную в биологический материал.

Построение калибровочного графика

В ряд пробирок вносят по 1 мл 0,075%, 0,15%, 0,3%, 0,6%, 1,2%, 2,2% растворов оксибензола и 1 мл смеси азотной (65%-ной) и серной (94%-ной) кислот, взятых в соотношении 1:1 по объему, и кипятят на водяной бане в течение 5 минут, после чего к каждой реакционной смеси прибавляют 20%-ный раствор гидроксида натрия до рН 4 и доводят объем образующегося раствора буферным раствором с рН 4 до 10 мл.

Полученный раствор экстрагируют диэтиловым эфиром дважды порциями по 10 мл каждая. Эфирные извлечения отделяют, водный слой подкисляют 24%-ным раствором хлороводородной кислоты до рН 1, доводят буферным раствором до объема 15 мл и экстрагируют образующийся раствор дважды порциями диэтилового эфира по 15 мл каждая.

Эфирные экстракты объединяют, экстрагент испаряют. Остаток растворяют в 50 мл системы растворителей гексан-диоксан-муравьиная кислота (5:3:0,2). 8 мкл полученного раствора вводят в хроматограф. Хроматографирование осуществляют в колонке размером 64×2 мм, заполненной сорбентом "Силасорб-600", используя в качестве подвижной фазы систему растворителей гексан-диоксан-муравьиная кислота (5:3:0,2). Скорость подачи элюента составляет 100 мкл/мин, скорость диаграммной ленты 720 мм/час. Оптическую плотность регистрируют при длине волны 334 нм.

По результатам измерений на хроматографе строят график зависимости площади пика от концентрации определяемого вещества. График линеен в интервале концентраций 0,12-3,36 мкг. Методом наименьших квадратов рассчитывают уравнение калибровочного графика, которое имеет вид:

S=4,3334·C+0,0095,

где S - площадь хроматографического пика 2,4,6-тринитрооксибензола, см²,

С - условная концентрация оксибензола в анализируемой пробе, мкг.

Результаты количественного определения оксибензола в ткани печени представлены в таблице 4.

Пример 5

Количественное определение 3-метилоксибензола в ткани печени в присутствии оксибензола, 2-метилоксибензола и 4-метилоксибензола

К 10 г мелкоизмельченной ткани свежей трупной печени человека прибавляют смесь оксибензола, 2-метилоксибензола, 3-метилоксибензола и 4-метилоксибензола по 5 мг каждого из веществ, тщательно перемешивают биологическую ткань с веществами и оставляют на сутки при температуре 16-20°С. По истечении указанного времени смесь заливают 20 мл этилацетата и выдерживают 30 минут, периодически перемешивая. Извлечение отделяют, операцию настаивания повторяют в указанных условиях. Вытяжки объединяют, встряхивают с 7 г безводного сульфата натрия, фильтруют через стеклянный фильтр с безводным сульфатом натрия, фильтр дополнительно промывают 20 мл этилацетата, фильтраты объединяют, экстрагент испаряют в токе воздуха при температуре 16-20°С, остаток растворяют в 10 мл смеси растворителей гексан-диэтиловый эфир (8:2). 2 мл полученного раствора вносят в колонку размером 490×11 мм, заполненную 10 г силикагеля L 40/100 μ. Хроматографируют, используя подвижную фазу гексан-диэтиловый эфир (8:2). Элюат собирают отдельными фракциями по 2 мл каждая. Фракции с 8 по 11 включительно объединяют, элюент испаряют в токе воздуха над 1 г безводного сульфата натрия при температуре 16-18°С. К остатку прибавляют 4 мл воды и 4 мл смеси азотной (65%-ной) и серной (94%-ной) кислот, взятых в соотношении 1:1 по объему, и кипятят реакционную смесь на водяной бане в течение 5 минут, после чего к реакционной смеси прибавляют 20%-ный раствор гидроксида натрия до рН 4. Образующийся раствор доводят буферными растворами с рН 4 до 50 мл и экстрагируют диэтиловым эфиром дважды порциями по 50 мл каждая.

Эфирные извлечения отделяют, водный слой подкисляют 24%-ным раствором хлороводородной кислоты до рН 1, доводят буферным раствором до объема 75 мл и экстрагируют образующийся раствор дважды порциями диэтилового эфира по 75 мл каждая.

Эфирные экстракты объединяют, экстрагент испаряют. Остаток растворяют в 25 мл системы растворителей гексан-диоксан-муравьиная кислота (5:3:0,2). 8 мкл полученного раствора вводят в жидкостный хроматограф типа "Милихром". Процесс хроматографирования осуществляют в колонке размером 64×2 мм, заполненной сорбентом "Силасорб-600", используя в качестве подвижной фазы систему растворителей гексан-диоксан-муравьиная кислота (5:3:0,2). Скорость подачи элюента составляет 100 мкл/мин, скорость диаграммной ленты 720 мм/час. Оптическую плотность регистрируют при длине волны 334 нм.

Пик на хроматограмме с временем удерживания 3,77 мин (объемом удерживания 377 мкл) соответствует полинитропроизводному 3-метилоксибензола-3-метил-2,4,6-тринитрооксибензолу.

Количественное содержание 3-метилоксибензола определяют исходя из площади хроматографического пика 3-метил-2,4,6-тринитрооксибензола по уравнению калибровочного графика и пересчитывают на навеску 3-метилоксибензола, внесенную в биологический материал.

Построение калибровочного графика

В ряд пробирок вносят по 1 мл 0,0625%, 0,125%, 0,25%, 0,5%, 1,0%, 1,5% растворов 3-метилоксибензола и 1 мл смеси азотной (65%-ной) и серной (94%-ной) кислот, взятых в соотношении 1:1 по объему, и кипятят на водяной бане в течение 5 минут, после чего к каждой реакционной смеси прибавляют 20%-ный раствор гидроксида натрия до рН 4 и доводят объем образующегося раствора буферным раствором с рН 4 до 10 мл.

Полученный раствор экстрагируют диэтиловым эфиром дважды порциями по 10 мл каждая. Эфирные извлечения отделяют, водный слой подкисляют 24%-ным раствором хлороводородной кислоты до рН 1, доводят буферным раствором до объема 15 мл и экстрагируют образующийся раствор дважды порциями диэтилового эфира по 15 мл каждая.

Эфирные экстракты объединяют, экстрагент испаряют. Остаток растворяют в 50 мл системы растворителей гексан-диоксан-муравьиная кислота (5:3:0,2). 8 мкл полученного раствора вводят в хроматограф. Хроматографирование осуществляют в колонке размером 64×2 мм, заполненной сорбентом "Силасорб-600", используя в качестве подвижной фазы систему растворителей гексан-диоксан-муравьиная кислота (5:3:0,2). Скорость подачи элюента составляет 100 мкл/мин, скорость диаграммной ленты 720 мм/час. Оптическую плотность регистрируют при длине волны 334 нм.

По результатам измерения на хроматографе строят график зависимости площади пика от концентрации определяемого вещества. График линеен в интервале концентраций 0,10-2,4 мкг. Методом наименьших квадратов рассчитывают уравнение калибровочного графика, которое имеет вид:

S=30,9829·C+0,0217,

где S - площадь хроматографического пика 3-метил-2,4,6-тринитрооксибензола, см²,

С - условная концентрация 3-метилоксибензола в хроматографируемой пробе, мкг.

Результаты количественного определения 3-метилоксибензола в ткани печени представлены в таблице 5.

Предлагаемый способ по сравнению с прототипом в 20 раз повышает чувствительность определения в анализируемой пробе и в 2 раза - в ткани печени, в 1,2-1,5 раза увеличивает степень извлечения оксибензола и его монометильных производных из ткани печени (для 4-метилоксибензола степень извлечения увеличивается с 49,96 до 75,65%), характеризуется более высокой селективностью (позволяет в отличие от прототипа определять любое из четырех рассматриваемых веществ в присутствии трех остальных, а также в присутствии их метаболитов), сокращает продолжительность процесса определения более чем в 3 раза.

Сравнительная характеристика предлагаемого и известного способов представлена в таблице 6.

Таблица 1
Параметры хроматографирования полинитропроизводных оксибензола и его монометильных замещенных методом ВЭЖХ (колонка размером 64×2, заполненная сорбентом " Силасорб" -600)
Хроматографируемое вещество	Объем удерживания VR, мкг	Время удерживания tR, мин	Относительное удерживание (по отношению к удерживанию оксибензола)
Элюент гексан-диоксан-муравьиная кислота (5:3:0,2)
3-метил-2,4,6-тринитрооксибензол (производное 3-метилоксибензола)	377	3,77	1,07
2,4,6-тринитрооксибензол (производное оксибензола)	912	9,12	2,16
Элюент гексан-диоксан-пропанол-2 (40:5:1)
2-метил-4,6-динитрооксибензол (производное 2-метилоксибензола)	370	7,40	0,98
4-метил-2,6-динитрооксибензол (производное 4-метилоксибензола)	496	9,92	1,31

Таблица 2
Результаты определения 2-метилоксибензола в ткани печени в присутствии оксибензола, 3-метилоксибензола и 4-метилоксибензола
N	Внесено в 10 г печени	Найдено 2-метилоксибензола	Метрологические характеристики
2-метилоксибензола	оксибензола	3-метилоксибензола	4-метил-оксибензола	мг	%
1	5,0	5,0	5,0	5,0	3,39	67,81	х=70,38
2	5,0	5,0	5,0	5,0	3,42	68,42	S=2,49
3	5,0	5,0	5,0	5,0	3,70	73,80	Sx=1,11
4	5,0	5,0	5,0	5,0	3,59	71,75	Δx=2,86
5	5,0	5,0	5,0	5,0	70,02	70,02	ε=4,07

Таблица 3
Результаты определения 4-метилоксибензола в ткани печени в присутствии 2-метилоксибензола, оксибензола и 3-метилоксибензола
N	Внесено в 10 г печени	Найдено 4-метилоксибензола	Метрологические характеристики
4-метилоксибензола	оксибензола	2-метилоксибензола	3-метил-оксибензола	мг	%
1	5,0	5,0	5,0	5,0	3,71	74,12	х=75,05
2	5,0	5,0	5,0	5,0	3,67	73,41	S=2,06
3	5,0	5,0	5,0	5,0	3,83	76,63	Sx=0,92
4	5,0	5,0	5,0	5,0	3,66	73,26	Δx=2,36
5	5,0	5,0	5,0	5,0	13,89	77,83	ε=3,16

Таблица 4
Результаты определения оксибензола в ткани печени в присутствии 2-метилоксибензола, 3-метилоксибензола и 4-метилоксибензола
N	Внесено в 10 г печени	Найдено оксибензола	Метрологические характеристики
оксибензола	2-метилоксибензола	3-метилоксибензола	4-метил-оксибензола	мг	%
1	5,0	5,0	5,0	5,0	3,89	77,85	х=77,81
2	5,0	5,0	5,0	5,0	3,68	73,64	S=2,52
3	5,0	5,0	5,0	5,0	4,01	80,17	Sx=1,13
4	5,0	5,0	5,0	5,0	3,97	79,33	Δx=2,89
5	5,0	5,0	5,0	5,0	3,90	78,09	ε=3,72

Таблица 5
Результаты определения 3-метилоксибензола в ткани печени в присутствии оксибензола, 2-метилоксибензола и 4-метилоксибензола
N	Внесено в 10 г печени	Найдено 3-метилоксибензола	Метрологические характеристики
3-метилоксибензола	оксибензола	2-метилоксибензола	4-метил-оксибензола	мг	%
1	5,0	5,0	5,0	5,0	3,28	65,61	x=68,94
2	5,0	5,0	5,0	5,0	3,54	70,75	S=2,09
3	5,0	5,0	5,0	5,0	3,41	68,19	Sx=0,94
4	5,0	5,0	5,0	5,0	3,51	70,21	Δх=2,40
5	5,0	5,0	5,0	5,0	3,49	69,92	ε=3,49

Таблица 6
Сравнительная характеристика предлагаемого и известного способов
Показатели	Предлагаемый способ	Известный способ
1	2	3
1. Селективность	Позволяет определять индивидуально оксибензол и каждое из его монометильных производных при их совместном присутствии в биологическом материале. Определению не мешают основные метаболиты (продукты окисления) оксибензола и его монометильных производных (1,2-диоксибензол, 1,4-диоксибензол, 1-метил-3,4-диоксибензол, 1-метил-2,5-диоксибензол,4-оксибензойная кислота)	Не позволяет (за исключением 4-метилоксибензола) определять индивидуально оксибензол и каждое из его монометильных производных при их совместном присутствии в биологическом материале. Определению мешают основные метаболиты (продукты окисления) оксибензола и его монометильных производных.
2. Чувствительность (открываемый минимум) (на примере 4-метилоксибензола)
а) в 100 г ткани печени	0,4 мг	0,8 мг
б) в анализируемой пробе	0,04 мг	0,91 мг
3. Интервал линейности калибровочного графика (мкг в анализируемой пробе) (на примере 4-метилоксибензола)	0,04-0,32 мкг	0,91-9,1 мкг

		Продолжение таблицы 6
1	2	3
4. Степень извлечения определяемого вещества, в процентах от предварительно внесенного в биоматериал количества (на примере 4-метилоксибензола)	75,64%	49,96%
5. Относительная ошибка среднего результата (n=5; P=0,95) (при условии содержания 50 мг определяемого вещества в 100 г биоматериала) (на примере 4-метилоксибензола)	±3,16%	±7,24%
6. Продолжительность одного определения	Около 8 часов	26-27 часов

Способ определения оксибензола и его монометильных производных в биологическом материале, заключающийся в том, что анализируемые вещества извлекают из объекта, обрабатывают нитрующим агентом и определяют их качественное и количественное содержание физико-химическим методом, отличающийся тем, что извлечение анализируемых веществ осуществляют путем обработки биологической ткани этилацетатом двукратно по 30 мин, перед обработкой нитрующим агентом этилацетатные вытяжки объединяют, обезвоживают, этилацетат испаряют при 16-20°С, остаток растворяют в смеси растворителей гексан-диэтиловый эфир (6:4), хроматографируют в колонке с силикагелем с использованием подвижной фазы гексан-диэтиловый эфир (6:4), фракции, содержащие оксибензол и его монометильные производные, отбирают, объединяют, обезвоживают, элюэнт испаряют до получения остатка, остаток разбавляют водой и обрабатывают нитрующим агентом в равном объемном соотношении, в качестве нитрующего агента применяют смесь 65%-ной азотной и 94%-ной серной кислот в соотношении 1:1 по объему, обработку ведут на водяной бане, после чего реакционную смесь подщелачивают до рН 4 и разбавляют буферным раствором с рН 4, полученный раствор двукратно экстрагируют диэтиловым эфиром в соотношении 1:1 по объему, эфирные извлечения, содержащие полинитропроизводные 2 метил-оксибензола и 4 метил-оксибензола, отделяют, а водный слой подкисляют до рН 1 и разбавляют буферным раствором, полученный раствор снова дважды обрабатывают диэтиловым эфиром в соотношении по объему 1:1, экстракт из раствора с рН 4 упаривают до сухого остатка, остаток растворяют в системе растворителей гексан-диоксан-пропанол-2 (40:5:1) и хроматографируют методом ВЭЖХ в колонке с сорбентом «Силасорб-600» с использованием подвижной фазы гексан-диоксан-пропанол-2 (40:5:1) при скорости подачи элюэнта 50 мкл/мин, концентрацию соответствующих монометильных производных оксибензола вычисляют по данным хроматограмы, полученной регистрацией оптической плотности раствора, выходящего из колонки, качественное определение монометильных производных производят по величинам характерных объемов или времени удержания соответствующих полинитропроизводных, экстракт из раствора с рН 1, содержащий полинитропроизводные оксибензола и 3 метилоксибензола, упаривают до сухого остатка, остаток растворяют в системе растворителей гексан-диоксан-муравьиная кислота (5:3:0,2) и хроматографируют методом ВЭЖХ в колонке с сорбентом «Силасорб-600» с использованием подвижной фазы гексан-диоксан-муравьиная кислота (5:3:0,2) при скорости подачи элюэнта 100 мкл/мин, концентрацию оксибензола и соответствующего монометильного производного оксибензола вычисляют по данным хроматограмы, полученной регистрацией оптической плотности раствора, выходящего из колонки, качественное определение оксибензола и монометильного производного производят по величинам характерных объемов или времени удержания соответствующих полинитропроизводных.