Способ коррекции нарушений эритропоэза при экспериментальной энцефалопатии

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальному обоснованию терапии для коррекции нарушений эритропоэза, развивающихся при энцефалопатии. Для этого используют гранулоцитарный колониестимулирующий фактор. Это средство в дозе 125 мкг/кг вводят подкожно 1 раз в день в течение 1-5 дней. При этом энцефалопатию моделируют гипоксией или внутрибрюшинным введением раствора солянокислого фенилгидразина. Предлагаемый способ позволяет эффективно проводить коррекцию нарушений эритропоэза за счет нейропротективного действия и предотвращения повреждения коммитированных клеток-предшественников эритропоэза. 3 табл.

 

Изобретение относится к области медицины, конкретно к фармакологии, и касается способа коррекции нарушений эритропоэза, развивающихся при энцефалопатии.

Известны способы коррекции нарушений эритропоэза, развивающихся при моделировании гипоксии, сопровождающейся развитием энцефалопатии, с помощью оксибутирата натрия, вводимого сразу после воздействия в наркотической дозе 750 мг/кг [1] и с помощью неселективного бета-адреноблокатора - пропранолола [2].

Недостатком способа коррекции нарушений эритропоэза, развивающихся при моделировании гипоксической энцефалопатии, с помощью оксибутирата натрия является его низкая эффективность в случае отсроченного применения данного препарата, когда развитие гипоксической энцефалопатии (а нарушения в системе крови связаны именно с энцефалопатией [1]) предотвратить уже невозможно, а в клинической практике далеко не всегда является возможным проведение лечебных мероприятий сразу после гипоксической травмы [3].

Недостатком способа коррекции нарушений эритропоэза, сопровождающих энцефалопатию, с помощью пропранолола является факт отсутствия значимого влияния данного препарата на непосредственную причину развития нарушений в системе крови - поражение структур ЦНС. В связи с чем способ эффективен только при постоянном приеме препарата.

Данный способ (с помощью пропранолола) является наиболее близким к заявляемому по достигаемому результату и выбран в качестве способа прототипа.

Задачей, решаемой данным изобретением, является повышение эффективности предлагаемого способа.

Поставленная задача достигается техническим решением, представляющим собой коррекцию нарушений эритропоэза, заключающимся в подкожном введении лабораторным животным (мыши) после моделирования энцефалопатии препарата гранулоцитарного колониестимулирующего фактора в дозе 125 мкг/кг 1 раз в день, в течение 1-5 дней.

Новым в предлагаемом изобретении является использование препарата гранулоцитарного колониестимулирующего фактора, вводимого в дозе 125 мкг/кг 1 раз в день, в течение 1-5 дней.

Повреждение головного мозга при воздействии различных болезнетворных факторов зачастую сопровождается расстройствами функционирования органов и систем, подчиненных регуляторному влиянию тех структур центральной нервной системы, которые ответственны за их деятельность и которые существенно "пострадали" в результате воздействия. Таким образом, поражение структур ЦНС, ответственных за управление деятельностью внутренних органов и систем, способно приводить к развитию дизрегуляторной патологии висцеральных органов после воздействия [4].

Система крови играет одну из ключевых ролей в поддержании гомеостаза и формировании адекватных компенсаторно-приспособительных реакций организма при воздействии болезнетворных факторов. В то же время известно, что развитие энцефалопатии при гипоксических воздействиях вызывает дизадаптацию гемопоэтической ткани, проявляющуюся в повреждении кроветворных прекурсоров, снижении уровня гиперплазии эритроидного ростка кроветворения и продукции патологических форм эритроцитов, что существенно ухудшает окислительное обеспечение тканей организма, перенесшего терминальное состояние [1, 5].

Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (Г-КСФ) является линейно рестриктивным гемопоэтическим фактором с его основным специфическим гранулоцитопоэз-стимулирующим действием [6]. При этом сведений о существенном стимулирующем влиянии данного цитокина на эритропоэз нет. В то же время известно, что Г-КСФ обладает выраженным нейропротективным действием и способен положительно влиять на психоневрологический статус при энцефалопатии различного генеза [7]. Однако факт применения препарата Г-КСФ с целью коррекции нарушений эритропоэза для специалиста не является очевидным. Эксперимент показал непредсказуемые результаты. При этом в предварительных экспериментах было выявлено, что доза 125 мкг/кг гранулоцитарного колониестимулирующего фактора является оптимальной и эффективна даже при однократном введении препарата. В то же время увеличение кратности введения Г-КСФ до 5 раз (1 раз в день, 5 дней) повышает эффективность способа максимально.

Заявляемые существенные признаки проявили в совокупности новые свойства, не вытекающие явным образом из уровня техники в данной области. Новые признаки позволяют эффективно коррегировать нарушения эритропоэза при энцефалопатии, и предлагаемое изобретение может быть использовано в медицине. Идентичной совокупности признаков не обнаружено при исследовании уровня техники по патентной и научно-медицинской литературе.

Исходя из вышеизложенного, следует считать заявляемое техническое решение соответствующим критериям: "Новизна", "Изобретательский уровень", "Промышленная применимость".

Способ осуществляют следующим образом.

Лабораторному животному (мыши) после моделирования энцефалопатии 1 раз в день подкожно вводили по 125 мкг/кг в течение 1-5 дней препарата рекомбинантного человеческого гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (рч Г-КСФ).

Предлагаемый способ был изучен в экспериментах на мышах линии CBA/CaLac в количестве 278 штук, массой 18-20 г. Мыши 1 категории (конвенциональные линейные мыши) получены из питомника отдела экспериментального биомедицинского моделирования НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН (сертификат имеется).

На 3, 5, 7, 10-е сут определяли показатели периферической крови с помощью автоматического гематологического анализатора ABACUS (Diatron, Австрия) в ветеринарном режиме, костномозгового кроветворения стандартными гематологическими методами, содержание эритроидных клеток-предшественников (КОЕ-Э) в костном мозге, их пролиферативную активность и интенсивность дифференцировки [8]. Обработку результатов проводили методом вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента и непараметрического U-критерия Вилкоксона-Манна-Уитни.

Пример 1.

Гипоксическая энцефалопатия моделировалась с помощью гермокамеры объемом 500 мл. Мыши помещались в гермокамеру, крышка закрывалась, и мыши оставались там до агонального судорожного припадка или остановки дыхания, определяемой визуально, в течение 10-15 секунд. После извлечения из гермокамеры и восстановления самостоятельного дыхания, через 5-10 минут, мыши вновь помещались в гермокамеру также до наступления агонального состояния (генерализованного судорожного припадка или остановки дыхания) [5]. Контрольной группе животных по схеме способа прототипа однократно подкожно на 2-е сут после воздействия вводили пропранолол ("Arzneimittelwerk", Германия) в дозе 5 мг/кг. Опытным животным на 2-е сут после моделирования гипоксии подкожно однократно вводили 125 мкг/кг препарата рекомбинантного человеческого гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (рчГ-КСФ) - нейпоген ("Hoffinan-la Roche", Швейцария) - в эквивалентном объеме растворителя (0,2 мл).

В ходе эксперимента введение пропранолола на 2-е сут после воздействия приводило к увеличению в периферической крови числа эритроцитов (7-е сут), содержания гемоглобина (5-е сут) и отмене развития гипохромной анемии. Указанные изменения со стороны периферической крови явились закономерным отражением динамики костномозгового эритропоэза. Отмечалось увеличение количества эритрокариоцитов в костном мозге на 5-е сут опыта, связанное с повышением содержания эритроидных прекурсоров (5-е сут) в гемопоэтической ткани, и ускорение темпа их деления на 3-е сут исследования.

Назначение рчГ-КСФ в те же сроки после воздействия сопровождалось значительно более существенным и продолжительным увеличением количества эритроцитов (7, 10-е сут), содержания гемоглобина (5, 7, 10-е сут) в периферической крови, числа эритроидных ядросодержащих клеток (5, 10-е сут) и КОЕ-Э в костном мозге (5, 7, 10-е сут) на фоне ускорения деления прекурсоров эритропоэза на 3, 5, 7-е сут опыта (табл.1).

Пример 2.

Энцефалопатия моделировалась на мышах линии CBA/CaLac, массой 18-20 г путем однократного внутрибрюшинного введения раствора соляно-кислого фенилгидразина в дозе 150 мг/кг [9]. Контрольной группе животных по схеме способа прототипа подкожно на 1-3-е сут после воздействия вводили пропранолол ("Arzneimittelwerk", Германия) в дозе 5 мг/кг. Опытным животным в те же сроки подкожно вводили в дозе 125 мкг/кг препарата рекомбинантного человеческого гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (рчГ-КСФ) - нейпоген ("Hoffman-la Roche", Швейцария).

Проведенные исследования показали, что введение пропранолола приводило к достоверным, но незначительным изменениям со стороны системы эритрона. Отмечалось повышение количества эритроцитов и гематокрита на 7, 10-е сут наблюдения. Со стороны костномозгового кроветворения имело место повышение уровня гиперплазии эритроидного ростка на 5-е сут опыта в результате повышения содержания колониеобразующих единиц эритропоэза (3-е сут) в костном мозге.

При введении препарата рчГ-КСФ увеличение количества эритроцитов и гематокрита также регистрировалось на 7, 10-е сут, а числа эритрокариоцитов в костном мозге на 5, 7, 10-е сут. При этом имело место возрастание содержания КОЕ-Э в гемопоэтической ткани на 5, 7, 10-е сут эксперимента, связанное с повышением их пролиферативной активности (табл.2).

Пример 3.

Энцефалопатию моделировали у мышей линии CBA/CaLac, массой 18-20 г, путем пункции ретроорбитального синуса и выпускания через промытую раствором гепарина пастеровскую пипетку в течение 3-х часов дробно, за 3 раза, 70% объема циркулирующей крови. Расчет необходимого для забора количества крови производят из предположения, что у грызунов объем циркулирующей крови составляет 1/13 часть от массы тела животного [10]. Контрольной группе животных по схеме способа прототипа подкожно с 1 по 5-е сут после воздействия вводили пропранолол ("Arzneunittelwerk", Германия) по 5 мг/кг. Опытным животным в те же сроки подкожно вводили в дозе 125 мкг/кг препарата рекомбинантного человеческого гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (рчГ-КСФ) - нейпоген ("Hoffinan-la Roche", Швейцария).

Введение пропранолола повышало количество эритроцитов на 5, 7, 10-е сут и гематокрит на 5-е сут наблюдения. При этом в костном мозге имело место увеличение количества эритрокариоцитов в костном мозге на 5, 7-е сут опыта по сравнению с животными, которым активность адренергических механизмов не коррегировалась. Культуральные методы исследования механизмов развития описанных феноменов выявили возрастание числа КОЕ-Э в костном мозге на 3, 7-е сут наблюдения.

Курсовое введение рчГ-КСФ увеличивало количество эритроцитов и гематокрит на 5, 7, 10-е сут после воздействия. Повышение количества эритрокариоцитов в костном мозге регистрировалось на 5, 7, 10-е сут опыта, причем изменения данного параметра значительно превосходили аналогичные значения в группе животных, леченных по способу-прототипу. Описанные изменения явились следствием возрастания пролиферативной активности КОЕ-Э и увеличения их содержания в костномозговой ткани практически во все сроки наблюдения (табл.3).

Таким образом, введение препарата гранулоцитарного колониестимулирующего фактора при моделировании энцефалопатии приводило к повышению содержания прекурсоров эритропоэза в гемопоэтической ткани, возрастанию уровня гиперплазии эритроидного ростка кроветворения и увеличению количества эритроцитов в периферической крови. По всем показателям "положительный" эффект рчГ-КСФ превосходил эффект коррекции нарушений эритропоэза по способу-прототипу. При этом механизмом действия препарата, очевидно, являлось его нейропротективное действие [7] и предотвращение повреждения коммитированных клеток-предшественников эритропоэза в результате отмены дизрегуляции системы крови.

Предлагаемый способ позволяет эффективно проводить коррекцию нарушений эритропоэза, развивающихся при энцефалопатии различного генеза.

Цитируемая литература

1. Зюзьков Г.Н. Механизмы регуляции гемопоэза в постгипоксическом периоде: Дисс... канд. мед. наук. - Томск, 2003. - 158 с.

2. Зюзьков Г.Н., Абрамова Е.В., Дыгай А.М., Гольдберг Е.Д. Роль адренергических механизмов регуляции эритропоэза при гипоксии высокой степени тяжести // Бюл. эксперим. биол. и медицины. - 2005. - №7. - С.18-23.

3. Алексеева Г.В., Гурвич А.М., Семченко В.В. Постреанимационная энцефалопатия (патогенез, клиника, профилактика и лечение). - Омск; Омская областная типография, 2003.-152 с.

4. Дизрегуляционная патология. / Под ред. Г.Н.Крыжановского. - М.: Медицина, 2002. - 652 с.

5. Патент РФ на изобретение №2240604 "Способ моделирования постгипоксической энцефалопатии и связанных с ней нарушений в системе крови".

6. Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Жданов В.В. Роль гемопоэзиндуцирующего микроокружения при цитостатических миелосупрессиях. - Томск, 1999. - 114 с.

7. Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Зюзьков Г.Н., Жданов В.В., Суслов Н.И., Ставрова Л.А., Сотникова Н.В. Психофармакологические эффекты гранулоцитарного колониестимулирующего фактора и их механизмы при гипоксии высокой степени тяжести // Бюл. эксперим. биол. и медицины. - 2005. - №4. - С.367-370.

8. Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Шахов В.П. Методы культуры ткани в гематологии. - Томск: Изд-во ТГУ, 1992. - 264 с.

9. Патент РФ на изобретение №2253152 "Способ моделирования гипоксической энцефалопатии".

10. Патент РФ на изобретение №2257620 "Способ моделирования постгеморрагической энцефалопатии".

Таблица 1
Динамика показателей системы эритрона у мышей линии CBA\CaLac при постгипоксической энцефалопатии (1), при введении пропранолола (2) и Г-КСФ (3) после гипоксического воздействия, (Х±m)
Сроки исследования, сутки	Эритроциты, Т/л	Гемоглобин, г/л	Эритрокариоциты, × 106/бедро	КОЕ-Э, на 105/нуклеаров	КОЕ-Э в S-фазе, %	Интенсивность диф-ки, в усл.ед.
интакт	11,42±0,14	147,72±5,48	1,31±0,06	4,5±0,56	23,19±8,42	13,51±0,49
3-е	1	11,78±10,32	151,12±10,2	6,22±0,59	7,67±0,49	17,84±6,34	24,65±1,75
				*	*		*
	2	11,41±0,12	148,78±6,91	5,87±0,43	7,5±0,98	71,09±3,42	10,98±0,57
				*	*	*#
	3	11,5±0,45	156,7±7,1	5,7±1,2	6,89±0,93	80,1±7,4	20,1±2,3
						*#	*
	1	11,45±0,26	143,3±4,2	3,19±0,31	8,14±0,74	29,81±8,47	22,25±1,87
5-е				*	*		*
		12,26±0,06	162,25±4,94	4,12±0,2	11,53±0,31	39,22±1,58	24,69±2,97
	2	*	*#	*#	*#	*	*
		11,97±0,22	164,7±5,3	4,56±0,47	10,3±0,26	74,5±5,6	27,4±3,6
	3		*#	*#	*#	*#	*
	1	10,6±0,24	121,4±6,74	3,9±0,61	5,5±0,50	21,73±4,75	29,12±3,34
7-е		*	*	*			*
	2	11,98±0,06	149,94±12,35	4,3±0,68	5,8±0,43	28,6±3,78	20,98±0,57
		*#		*	*		*
	3	11,73±0,04	153,48±6,1	4,51±1,01	8,4±6,1	62,9±7,1	27,89±2,9
		*#	#	*	*#	*#	*
10-е	1	11,0±0,21	151,4±3,95	3,35±0,27	7,16±0,60	55,77±3,74	24,14±3,29
				*	*	*	*
	2	11,51±0,2	149,17±7,26	4,1±0,78	7,43±0,49	43,36±3,54	23,7±1,34
				*	*	*	*
		12,01±0,27	167,32±4,5	4,78±0,32	10,2±0,49	61,2±11,7	19,4±2,3
	3	*#	*#	*#	*#	*	*
* - отмечена достоверность различий с интактным контролем при р<0,05
# - отмечена достоверность различий с показателями в группе животных без препарата (1) при р<0,05

Таблица 2
Динамика показателей системы эритрона у мышей линии CBA\CaLac после моделирования энцефалопатии, введением 150 мг/кг солянокислого фенилгидразина (1), при введении пропранолола (2) и Г-КСФ (3) после воздействия, (Х±m)
Сроки исследования, сутки	Эритроциты, Т/л	Гематокрит, %	Эритрокариоциты, × 106/бедро	КОЕ-Э, на 105/нуклеаров	КОЕ-Э в S-фазе, %	Интенсивность диф-ки, в усл.ед.
интакт	11,22±0,16	45,88±0,76	3,02±0,25	3,83±0,48	37,33±6,17	15,56±2,89
3-е	1	5,57±0,17	20,47±0,82	3,39±0,17	5,67±0,49	53,79±3,62	34,79±1,77
		*	*		*		*
	2	6,07±0,14	27,15±4,28	3,2±0,58	7,83±0,73	53,28±5,05	41,04±4,38
		*	*				*
	3	6,07±0,14	27,15±4,28	3,2±0,58	7,4±0,8	83,28±4,05	39,5±3,74
		*	*			*#	*
5-е	1	5,59±0,65	21,9±2,36	5,01±0,31	4,33±0,61	70,0±3,35	37,99±2,79
		*	*	*	*	*	*
	2	6,2±0,1	29,32±4,53	6,2±0,29	7,0±0,58	62,93±6,2	39,49±6,45
		*	*	*#	*#		*
	3	6,2±0,1	29,32±4,53	6,7±0,34	7,3±0,44	60,4±3,9	42,3±5,97
		*	*	*#	*#	*	*
7-е	1	4,4±0,55	18,5±2,84	4,91±0,27	5,17±0,4	56,0±2,0	19,95±0,77
		*	*	*	*	*
	2	5,63±0,19	24,2±3,38	5,82±0,21	5,4±0,43	61,67±9,12	23,53±2,87
		*#	*#	*	*		*
	3	5,9±0,34	28,3±2,09	6,07±0,35	6,9±0,16	88,6±6,9	33,53±4,2
		*#	*#	*#	*#	*#	*
10-е	1	3,94±0,57	21,32±3,11	5,34±0,46	8,67±0,88	57,55±3,51	25,96±1,65
		*	*	*	*	*	*
	2	5,1±0,11	30,48±1,91	5,5±0,26	7,03±1,1	42,47±6,75	26,24±5,82
		*#	*#	*	*
		6,0±0,18	34,7±2,2	6,5±0,17	12,03±1,07	47,31±12,1	16,24±8,2
	3	*#	*#	*#	*#
* - отмечена достоверность различий с интактным контролем при р<0,05
# - отмечена достоверность различий с показателями в группе животных без препарата (1) при р<0,05

Таблица 3
Динамика показателей системы эритрона у мышей линии CBA\CaLac после моделирования энцефалопатии, вызванной потерей 70% объема циркулирующей крови (1), при введении пропранолола (2) и Г-КСФ (3) в постгеморрагическом периоде, (Х±m)
Сроки исследования, сутки	Эритроциты, Т/л	Гематокрит, %	Эритрокариоциты, × 106/бедро	КОЕ-Э, на 105/ нуклеаров	КОЕ-Э в S-фазе, %	Интенсивность диф-ки, в усл.ед.
интакт	11,42±0,28	48,45±1,05	2,44±0,3	7,67±1,12	19,95±5,43	6,64±0,56
3-е	1	6,22±0,09	27,98±0,31	5,45±0,64	9,33±1,91	57,02±6,9	18,08±1,6
		*	*	*	*	*	*
	2	6,33±0,07	29,91±0,54	5,7±0,41	14,5±0,43	41,09±6,62	17,29±1,16
		*	*	*	*#	*	*
	3	6,41±0,14	27,1±0,61	5,7±0,41	13,7±0,24	75,4±7,11	16,9±2,3
		*	*	*	*#	*#	*
5-е	1	6,49±0,12	29,73±0,53	4,88±0,23	10,5±0,72	46,79±4,44	16,26±0,4
		*	*	*	*	*	*
	2	7,85±0,41	36,34±0,89	6,74±0,31	11,8±0,86	38,79±3,41	16,22±1,53
		*#	*#	*#	*	*	*
	3	8,15±0,48	37,4±0,87	7,0±0,62	13,8±0,91	81,6±10,02	19,4±2,6
		*#	*#	*#	*#	*#	*
7-е	1	6,59±0,14	30,08±0,71	6,33±0,68	10,5±1,1	44,67±2,96	12,0±1,59
		*	*	*	*	*	*
	2	7,27±0,27	33,78±2,7	7,1±0,95	15,67±0,9	44,38±4,18	15,68±1,38
		*#	*	*	*#	*	*
	3	7,8±0,21	35,0±1,1	7,33±0,11	11,67±1,09	79,3±7,62	14,8±0,97
		*#	*#	*#		*#	*
10-е	1	9,08±0,39	39,5±1,18	6,01±0,24	12,33±0,8	29,17±3,11	7,16±0,65
		*	*	*	*
	2	8,87±0,21	40,45±1,27	7,2±0,21	15,33±1,84	37,06±2,9	7,66±0,74
		*#	*	*#	*	*
	3	9,68±0,21	42,6±0,97	7,06±0,18	18,7±1,4	33,2±4,1	6,39±1,3
		*#	*#	*#	*#	*
* - отмечена достоверность различий с интактным контролем при р<0,05
# - отмечена достоверность различий с показателями в группе животных без препарата (1) при р<0,05

Способ коррекции нарушений эритропоэза при экспериментальной энцефалопатии путем введения препарата, отличающийся тем, что энцефалопатию моделируют гипоксией или внутрибрюшинным введением раствора солянокислого фенилгидразина, а для коррекции нарушений эритропоэза в качестве препарата используют гранулоцитарный колониестимулирующий фактор, который вводят подкожно после моделирования энцефалопатии в дозе 125 мкг/кг 1 раз в день в течение 1-5 дней.