Способ получения биологически активной фракции s-1-10, фармацевтическая композиция, снижающая тремор при паркинсонизме и судорожную активность при эпилепсии

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для получения биологически активной пептидной фракции из сыворотки крови птиц, полезной при ряде заболеваний и расстройств в организме человека и животных. Предлагаемый способ получения биологически активной пептидной фракции, снижающей тремор при паркинсонизме, судорожную активность при эпилепсии заключается в том, что проводят электростимуляцию головы птицы в режиме 70-80 В в течение 2-3 с, забирают кровь, инкубируют при 4-8°С в течение 18-24 ч, затем отобранную сыворотку крови облучают С₀ ⁶⁰ в режиме 25±5,0 кГр, экстрагируют после облучения 0,5 мМ раствором фенилметан сульфонил фторида в дистиллированной воде при соотношении 1:10, перемешивают при 5°С в течение 1 ч, центрифугируют при 12000 об/мин в течение 30 мин, далее осадок повторно экстрагируют раствором фенилметансульфонилфторида, повторно центрифугируют при тех же условиях, надосадочную жидкость фильтруют последовательно через мембрану с диаметром пор 0,45 мкм и 10 кДа, и целевой продукт, представляющий собой пептидную фракцию с молекулярной массой до 10 кДа, лиофилизируют и хранят при 4-8°С. Предлагаемая фармацевтическая композиция, снижающая тремор при паркинсонизме, судорожную активность при эпилепсии характеризуется тем, что в качестве активного начала содержит эффективное количество пептидов с молекулярной массой до 10 кДа, полученных по п.1 и фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель. Изобретение обеспечивает получение новой биологически активной пептидной фракции до 10 кДа и разработку ее лекарственной формы. 2 н.п. ф-лы, 3 табл.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Предлагаемое изобретение относится к медицине, может быть использовано для получения биологически активной пептидной фракции из сыворотки крови птиц, полезной при ряде заболеваний и расстройств в организме человека и животных (физическая работоспособность, координация движений, паркинсонизм, эпилепсия, стресс и т.д.)

Уровень техники

Широко известны способы получения биологически активной сыворотки крови, основанные на взятии крови у доноров и животных, инкубации, отделение с последующим консервированием. Способы предполагают получение сыворотки крови, повышающей устойчивость организма к таким экзогенным и эндогенным факторам, как атмосферное давление, температура, сила тяжести, свет и т.п., а также голод, жажда, сонная и половая потребности и т.п. (Патент Японии №2123287, ЕР 0542303 А2, Патенты России №2096041, 2120301).

Сыворотку получают из крови донора, предварительно введенного в определенное функциональное состояние, при этом, в зависимости от характера воздействия, получают сыворотки с биологической активностью различного характера: миогенной, сомногенной, офтальмогенной, аудиоактивной, термоактивной, диетактивной, сексактивной, антигипоксической, антиалкогольной и антиникотиновой.

Сыворотку от животных подвергают гамма-обработке с целью усиления биологической активности (патент PCT/RU00/00073 - Россия и ЕР).

Задачей данного изобретения было получение биологически активной пептидной фракции до 10 кДа из электрошоковой сыворотки крови кур.

Краткое изложение сущности изобретения

Оказалось, что если электрошоковую сыворотку крови птиц облучить в интервале 20-30 кГр, профильтровать через мембраны 0,45 мм и 10 кДа, то можно получить низкомолекулярную биологически активную пептидную фракцию, обладающую рядом активностей (будут раскрыты далее), которые полезны при некоторых неблагоприятных состояниях пациента (будут раскрыты далее).

Таким образом, целью настоящего изобретения является разработка нового способа получения биологически активной пептидной фракции S-1-10.

Еще одной целью настоящего изобретения яляется разработка лекарственной формы новой биологически активной сыворотки. Изобретение предполагает разные лекарственные формы: в том числе для перорального, парентерального, назального, буккального, в виде суппозитариев и т.п.введения.

В изобретении предусматривается использование подходящих физиологически приемлемых носителей (таких как дистил. вода, физиол. р-р), наполнителей (например, масло какао, витепсол), биологически активной пептидной фракции. Электрошоковая биологически активная пептидная фракция может применяться как самостоятельно, так и в сочетании с другими лечебными средствами.

Дополнительной целью изобретения является фармацевтическая композиция, в которой активным началом является пептидная фракция согласно настоящему изобретению. При этом фармацевтическая композиция должна содержать активный ингредиент в количестве, достаточном для оказания благоприятного воздействия на организм пациента, т.е. содержать его в эффективном количестве.

Еще одной целью изобретения является определение эффективной дозы пептидной фракции согласно данному изобретению. Полагается, что эта доза находится в интервале от 0,1 до 50 мг/кг веса пациента. Очевидно, что конкретная доза будет определяться лечащим врачом в зависимости от состояния пациента, его возраста, веса и курса лечения.

Подробное раскрытие изобретения

Далее изобретение подробно раскрывается в предпочтительных вариантах конкретного выполнения, при этом приводимые примеры активной пептидной фракции, фармацевтических композиций, лекарственных форм не должны стать основанием для ограничения притязаний, а предназначены исключительно лишь для демонстрации осуществимости изобретения и реализации указанного(ых) назначения(ий). Каждый специалист в данной области безусловно убедится, что могут быть предложены многочисленные модификации приводимых вариантов выполнения изобретения, которые подпадают под притязания, отраженные далее в формуле изобретения.

1. Получение биологически активной пептидной фракции S-1-10.

Для получения биологически активной пептидной фракции S-1-10 использовали кровь птиц (кур), взятую через 3-4 с после электростимуляции головы в течение 2-3 с током напряжением 70-80 В. Кровь собирали самотоком в полиэтиленовые флаконы после перерезки сонных артерий и вен и инкубируют при температуре 4-8°С в течение 18-24 ч, сыворотку отсасывали и облучали С₀ ⁶⁰ в режиме 25±5,0 кГр.

Обработанную сыворотку экстрагировали дистиллированной водой, содержащей 0,5 мМ фенилметан сульфонил фторид (PMSF) в соотношении 1:10, размешивали в течение 1 ч при температуре 5°С. Полученную суспензию цетрифугировали при 12000 об/мин в течение 30 мин. Осадок вновь экстрагировали водой с PMSF и вновь центрифугировали при 12000 об/мин в течение 30 мин. Надосадочную жидкость фильтровали через мембрану с диаметром пор 0,45 мкм, а затем фильтрат вторично фильтровали через мембраны 10 кДа. Окончательный фильтрат (пептидная фракция) лиофилизировали общепринятым методом и хранили при температуре 4-8°С.

2. Доказательства биологической активности пептидной фракции S-1-10.

2.1. Физическая выносливость животных

Физическая выносливость определялась по влиянию пептидной фракции на продолжительность плавания крыс линии Wistar при 25°С, с грузом на основании хвоста массой в 10% от веса животного. В эксперименте использовано 40 крыс весом 180-200 г. Крысы были разделены на 4 группы по 10 животных в каждой группе. 1 группа - контроль, крысам вводили 1,0 мл физиологического раствора, II, III и IV группам вводили пептидную фракцию в дозах 0,1; 1,0; 50,0 мг/кг веса, растворенных в 1,0 мл физиологического раствора.

Все исследуемые растворы вводились внутрибрюшинно за 30 мин до тестирования.

Результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1
Влияние пептидной фракции на физическую выносливость животных (М+m)
Статист. показатели	Контроль	Доза пептидной фракции (мг/кг веса)
0,1	1,0	50
М+m	3′31±24′′	4′23±26′′	4′36′′±29′′	5′27±36′′
Р		>0,05	>0,05	<0,05

Таким образом, пептидная фракция в дозе 50 мг/кг веса повышает физическую выносливость на 54% от контроля.

2.2. Болезнь Паркинсона

При моделировании болезни Паркинсона использовался аналог 6-ГД - окситреморин, который вызывал у животных изменения, типичные для паркинсонизма: тремор конечностей, латентный период начала общего тремора (всего тела), периоды отсутствия тремора, прекращение тремора.

Окситреморин вводили внутрибрюшинно в дозе 1,0 мг/кг веса в физиологическом растворе, взятом в объеме 1,0 мл. Пептидную фракцию вводили в дозах 0,1; 1,0; 10,0; и 50 мг/кг веса, также растворенных в 1,0 мл физиологического раствора. Фракция вводилась за 45 минут до применения окситреморина. В эксперименте были использованы 49 крыс линии Wistar весом 200-220 г.

Результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2
Влияние пептидной фракции на тремор при паркинсонизме (М±m)
Показатели тремора	Контроль	Доза фракции (мг/кг веса)
0,1	1,0	10,0	50,0
1. Латентный период начала тремора конечностей (с)	64,4±3,8	85,0±7,1 >0,05	92,8±7,3 <0,05	126,4±17,7 <0,01	157,1±26,0 <0,01
2. Латентный период начала общего тремора животных (с)	216,4±21,7	294,4±19,9<0,05	Отсутствует	Отсутствует	Отсутствует
3. Появление периодов отсутствия общего тремора (мин)	7,4±0,5	6,7±1,0 >0,05	Отсутствует	Отсутствует	Отсутствует
4. Прекращение тремора конечностей (мин)	32,1±5,7	21,3±2,5 <0,05	21,2±2,3 <0,05	23,1±3,1 <0,05	14,9±4,0 <0,01

Таким образом, пептидная фракция, введенная за 45 мин до моделирования болезни Паркинсона, уже в дозе 0,1 мг/кг веса удлиняет период начала общего тремора (тремор конечностей и туловища) на 31% и сокращает время исчезновения тремора конечностей на 50% от контроля. Дозы в интервале от 1,0 до 50 мг веса проявляют наибольшую эффективность, не только изменяя указанные параметры в 2 раза (при дозе 50 мг/кг), но и полностью предотвращают общий тремор животных (дозы: 1,0; 10.0 и 50,0 мг/кг).

2.3. Эпилепсия

Исследовали влияние различных концентраций пептидных фракций на начало появления тонических и клонических судорог при моделировании эпилепсии внутрибрюшинным введением 0,5 мл. 20% раствора камфоры.

Лиофилизированные образцы пептидной фракции, растворенные в 0,5 мл физиологического раствора, также вводились внутрибрюшинно за 45 минут до введения камфоры.

Были исследованы 4 образца пептидной фракции в дозах 0,1; 1,0; 10,0 и 50,0 мг/кг веса животного.

Всего было использовано 50 крыс линии Wistar весом 220-230 г.

Результаты представлены в таблице 3.

Таблица 3
Влияние пептидной фракции на судорожную активность при эпилепсии (М+т)
Параметры судорожной активности	Контроль (камфора)	Доза фракции(мг/кг веса)
0,1	1,0	10,0	50,0
1. Начало тонических судорог (мин)
6,7±0,8	7,1±1,1 >0,05	9,0±1,0 <0,05	10,4±1,1 <0,01	11,0±1,4 <0,01
2. Начало клонических судорог (мин)	14,3±1,0	15,7+1,6	18,7+1,4	20,0±1,9	20,6±1,0
		>0,05	<0,05	<0,01	<0,01

Таким образом, пептидная фракция, введенная за 45 мин до моделирования эпилепсии, взятая в дозах от 1,0 до 50 мг/кг веса животных, удлиняет время проявления тонических и клонических судорог на 30-50% соответственно, т.е. снижают судорожное проявление эпилептической болезни.

1. Способ получения биологически-активной пептидной фракции, снижающей тремор при Паркинсонизме, судорожную активность при эпилепсии, характеризующийся тем, что проводят электростимуляцию головы птицы в режиме 70-80 В в течение 2-3 с, забирают кровь, инкубируют при 4-8°С в течение 18-24 ч, затем отобранную сыворотку крови облучают С₀⁶⁰ в режиме 25±5,0 кГр, экстрагируют после облучения 0,5 мМ раствором фенилметан сульфонил фторида в дистиллированной воде при соотношении 1:10, перемешивают при 5°С в течение 1 ч, центрифугируют при 12000 об/мин в течение 30 мин, далее осадок повторно экстрагируют раствором фенилметан сульфонил фторида, повторно центрифугируют при тех же условиях, надосадочную жидкость фильтруют последовательно через мембрану с диаметром пор 0,45 мкм и 10 кДа, и целевой продукт, представляющий собой пептидную фракцию с молекулярной массой до 10 кДа, лиофилизируют и хранят при 4-8°С.

2. Фармацевтическая композиция, снижающая тремор при Паркинсонизме, судорожную активность при эпилепсии, характеризующийся тем, что в качестве активного начала содержит эффективное количество пептидов с молекулярной массой до 10 кДа, полученных по п.1 и фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель.