Способ получения ассоциированной коклюшной, дифтерийной и столбнячной вакцины

Изобретение относится к микробиологии и касается способа получения ассоциированной коклюшной, дифтерийной и столбнячной вакцины (АКДС). Способ получения ассоциированной коклюшной, дифтерийной и столбнячной вакцины включает смешивание коклюшного компонента, дифтерийного и столбнячного анатоксинов, сорбцию смеси на гидроксиде алюминия, дозирование смеси в емкость, лиофилизацию смеси и герметическое запаивание емкости, при этом в качестве коклюшного компонента используют бесклеточный коклюшный анатоксин, смешивание бесклеточного коклюшного анатоксина, дифтерийного и столбнячного анатоксинов осуществляют одновременно в присутствии физиологического раствора, забуференного фосфатом, полученную смесь выдерживают в течение 1 часа при 4-10°С с последующей сорбцией на гидроксиде алюминия, непосредственно перед лиофилизацией в смесь добавляют сахарозу до конечной концентрации 9-10,5%, после чего смесь перемешивают и выдерживают при 4-10°С в течение 1 часа. Преимущество изобретения заключается в снижении реактогенности. 4 табл.

 

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано для получения ассоциированной коклюшной, дифтерийной, столбнячной вакцины (АКДС).

Известен способ получения ассоциированной коклюшной, дифтерийной и столбнячной вакцины путем смешивания дифтерийного и столбнячного анатоксинов, сорбции смеси на гидроксиде алюминия, перемешивания смеси 15-20 минут и выдерживания при 4-10°С до следующего дня с последующим удалением надосадочной жидкости и замены ее на изотонический раствор хлорида натрия с сахарозой до конечной концентрации 8%, добавлением суспензии убитых коклюшных микробов, перемешиванием смеси в течение 30 минут, розливом готовой АКДС-вакцины в ампулы по 1-2 разовых дозы для человека и лиофилизацией ее обычным путем (Руководство по вакцинно-сывороточному делу, Москва, Медицина, 1978 г., с.165-169).

Проблема получения высокоэффективной и слаботоксичной ассоциированной АКДС-вакцины для профилактики коклюшной, дифтерийной и столбнячной инфекций остается актуальной, поскольку применяемая в практике АКДС-вакцина с корпускулярньм коклюшным компонентом значительно реактогенна (в основном из-за реактогенности корпускулярного коклюшного компонента).

Снижение реактогенности АКДС-вакцины - одно из важных условий совершенствования этих препаратов.

Технический результат заявленного способа заключается в получении высокоактивной и малотоксичной АКДС-вакцины.

Для достижения указанного технического результата в способе получения ассоциированной коклюшной, дифтерийной и столбнячной вакцины путем смешивания коклюшного компонента, дифтерийного и столбнячного анатоксинов, сорбции смеси на гидроксиде алюминия, дозирования смеси в емкость, лиофилизации смеси и герметического запаивания емкости, согласно изобретению, в качестве коклюшного компонента используют бесклеточный коклюшный анатоксин, смешивание бесклеточного коклюшного анатоксина, дифтерийного и столбнячного анатоксинов осуществляют одновременно в присутствии физиологического раствора, забуференного фосфатом, полученную смесь выдерживают в течение 1 часа при 4-10°С с последующей сорбцией на гидроксиде алюминия, непосредственно перед лиофилизацией в смесь добавляют сахарозу до конечной концентрации 9-10,5%, после чего смесь перемешивают и выдерживают при 4-10°С в течение 1 часа.

Сущность изобретения поясняется на следующих примерах.

Пример 1. Для приготовления 100 ампул АКДС-вакцины, содержащей по 2 дозы для человека в 1 ампуле и включающей 52 мкг белка бесклеточного коклюшного анатоксина, 30 Lf (флокулирующих единиц) дифтерийного анатоксина, 10 ЕС (единиц связывания) столбнячного анатоксина, 2 мг гидроксида алюминия аммиачного и 0,054 г сахарозы, смешивают 6240 мкг белка коклюшного анатоксина, 3600 Lf дифтерийного анатоксина и 1200 ЕС столбнячного анатоксина одновременно в присутствии физиологического раствора, забуференного фосфатом (PBS), смесь выдерживают в холодильнике 4-10°С в течение 1 часа, затем добавляют 240 мг гидроксида алюминия. Смесь встряхивают в течение 1 часа при 4-10°С и оставляют на ночь в холодильнике при 4-10°С. На следующий день добавляют 5,4 г сахарозы до конечной концентрации 9%. Общий объем смеси должен составлять 60 мл. Смесь осторожно перемешивают, затем держат в холодильнике в течение 1 часа при 4-10°С, разливают в ампулы по 0,6 мл и подвергают вакуумной лиофилизации. После лиофилизации ампулы запаивают под вакуумом и хранят в холодильнике при 4-10°С. Перед вакцинацией в 1 ампулу добавляют 1,2 мл апирогенной стерильной дистиллированной воды и вводят внутримышечно препарат в дозе 0,5 мл (1 доза для человека).

Пример 2. Для приготовления 100 ампул АКДС-вакцины, содержащей 2 дозы для человека в одной ампуле и включающей 52 мкг белка бесклеточного коклюшного анатоксина, 30 Lf (флокулирующих единиц) дифтерийного анатоксина, 10 ЕС (единиц связывания) столбнячного анатоксина, 2 мг гидроксида алюминия аммиачного и 0,063 г сахарозы, смешивают 6240 мкг белка коклюшного анатоксина, 3600 Lf дифтерийного анатоксина и 1200 ЕС столбнячного анатоксина в растворе PBS, смесь выдерживают в холодильнике(4-10°С) в течение 1 часа, затем добавляют 240 мг гидроксида алюминия, смесь встряхивают в течение 1 часа при 4-10°С и оставляют на ночь в холодильнике при 4-10°С. На следующий день добавляют 6,3 г сахарозы до конечной концентрации 10,5%. Общий объем смеси должен составлять 60 мл. Смесь осторожно перемешивают, оставляют в холодильнике при 4-10°С в течение 1 часа, затем разливают в ампулы по 0,6 мл и подвергают вакуумной лиофилизации. После лиофилизации ампулы запаивают под вакуумом и хранят в холодильнике при 4-10°С. При использовании в 1 ампулу добавляют 1,2 мл апирогенной стерильной дистиллированной воды и вводят препарат в дозе 0,5 мл (одна доза для человека).

Как известно, реактогенность АКДС-вакцины, используемой в практике здравоохранения, в основном зависит от входящего в ее состав корпускулярного коклюшного компонента, представляющего собой суспензию убитых микробных клеток. Замена корпускулярного коклюшного компонента на слаботоксичный бесклеточный коклюшный компонент дает возможность снизить токсические свойства АКДС-вакцины. При конструировании АКДС-вакцины с бесклеточным коклюшным компонентом возникла проблема сорбции всех компонентов на гидроксиде алюминия вследствие того, что в АКДС-вакцине с корпускулярным коклюшным компонентом, получаемой известным способом, гидроксид алюминия требовался только для сорбции дифтерийного и столбнячного анатоксинов, а в АКДС-вакцине с бесклеточным коклюшным анатоксином все 3 компонента (коклюшный, дифтерийный и столбнячный) белковой природы и для оптимального проявления иммуногенных свойств каждый должен быть сорбирован на гидроксиде алюминия. При сорбции этих компонентов известным методом не было полной сорбции дифтерийного и столбнячного компонентов. При использовании заявляемого способа получения АКДС-вакцины удалось достигнуть сорбции всех 3 компонентов на оптимальном для вакцины количестве геля - 2 мг/мл (увеличение количества геля не рекомендовано Всемирной организацией здравоохранения). Полная сорбция коклюшного, дифтерийного и столбнячного анатоксинов была показана методом реакции нейтрализации антител (РНаТ) с соответствующими эритроцитарными диагностикумами.

Таблица 1. Определение полноты сорбции коклюшного, дифтерийного, столбнячного анатоксинов в АКДС-вакцине с бесклеточным коклюшным анатоксином.
Состав АКДС в 1 мл	Количество гидроксида алюминия (в мг/мл)	% сорбции
50 мкг коклюшного анатоксина	2	100
30 Lf дифтерийного анатоксина	2	100
10 ЕС столбнячного анатоксина	2	100

Исследование протективных свойств АКДС-вакцины, полученной заявляемым способом, показало, что все компоненты, входящие в ее состав: бесклеточный коклюшный анатоксин, дифтерийный и столбнячный анатоксины, - обладали высокими протективными свойствами и соответствовали требованиям, предъявляемым ВОЗ к АКДС-вакцине (табл.2).

Таблица 2. Протективные свойства бесклеточного коклюшного анатоксина, дифтерийного и столбнячного анатоксинов в АКДС-вакцине.
Количество серий АКДС-вакцины	Количество иммунизирующих единиц в 1 мл АКДС-вакцин
	Коклюшный анатоксин (в МЗЕ*)	Дифтерийный анатоксин (в МИЕ**)	Столбнячный анатоксин (в МИЕ*)
1 серия	12	124	534
2 серия	17,9	95	368
3 серия	14,7	115	422
4 серия	19,5	101	474
Средняя величина с доверительным интервалом	16 (14÷18)	109 (102÷116)	449 (374÷524)
Кол-во иммунизирующих единиц для АКДС-вакцины, требуемое ВОЗ	8	60	120
*МЗЕ - международные защитные единицы. **МИЕ - международные иммунизирующие единицы.

АКДС-вакцина обладала сниженными токсическими свойствами; так, в реакции сенсибилизации к гистамину мыши, привитые 1 человеческой дозой АКДС-вакцины, полученной заявляемым способом, в 3 сериях не давали гибели при введении 2 мг гистамина и в 1 серии гибель была низкой (16,6%) (табл.3), а привитые АКДС-вакциной, полученной известным способом, давали 62,26% гибели.

Таблица 3. Гистаминсенсибилизирующая активность АКДС-вакцин.
Препарат	№ серии	Доза, введенная 1 мыши	К-во введенного гистамина на мышь	Гибель мышей через 24 часа после введ. гист. в %
АКДС-		1
вакцина, полученная заявляемым способом	1	иммунизирующая доза для человека	2 мг	0
АКДС-		1
вакцина, полученная заявляемым способом	2	иммунизирующая доза для человека	2 мг	0
АКДС-		1
вакцина, полученная заявляемым способом	3	иммунизирующая доза для человека	2 мг	0
АКДС-		1
вакцина, полученная заявляемым способом	4	иммунизирующая доза для человека	2 мг	16,6
АКДС-		1
вакцина, полученная известным способом	5	иммунизирующая доза для человека	2 мг	62,26 (60,26÷64,26)

Сравнительное изучение токсических свойств АКДС-вакцины, полученной заявляемым способом, и АКДС, полученной известным способом, показало, что в опытах острой токсичности АКДС-вакцина, полученная заявляемым способом, была в 13,7 раз менее токсична, а в опытах гистаминсенсибилизации в 7,5 раз менее токсична, чем АКДС (табл.4).

Таблица 4 Сравнение токсических свойств АКДС-вакцин при равноценной протективной активности препаратов.
Препарат	Острая токсичность (ЛД50)*	ГСД50**
АКДС-вакцина, полученная заявляемым способом	746 мкг белка	151,6 мкг белка
Количество токсических доз на одну иммунизирующую дозу для человека (25 мкг белка)	0,027	0,13
АКДС-вакцина, полученная известным способом	27 мдрд. микроб. кл.	9,78 млрд. микроб. кл.
Количество токсических доз на 1 иммунизирующую дозу для человека (10 млрд.кл.)	0,37	0,978
Снижение токсичности АКДС-вакцины, полученной заявляемым способом, по отношению к АКДС-вакцине, полученной известным способом	13,7раз	7,5 раз
Примечание: *ЛД50 - средняя расчетная токсическая доза препарата, вызывающая гибель 50% мышей. **ГСД50 - средняя расчетная сенсибилизирующая к гистамину токсическая доза, вызывающая гибель 50% мышей после введения гистамина.

Полученные данные свидетельствуют о высоких протективных свойствах и сниженной токсичности АКДС-вакцины, полученной заявленным способом, по сравнению с АКДС-вакциной, полученной известным способом.

Преимущество изобретения заключается в том, что разработан способ получения высокоактивного и малотоксичного препарата АКДС-вакцины, полученной заявленным способом (АК_бДС-вакцины), с бесклеточным коклюшным анатоксином, который может быть использован в практике здравоохранения для профилактики коклюша, дифтерии и столбняка у детей.

Способ получения ассоциированной коклюшной, дифтерийной и столбнячной вакцины путем смешивания коклюшного компонента, дифтерийного и столбнячного анатоксинов, сорбции смеси на гидроксиде алюминия, дозирования смеси в емкость, лиофилизации смеси и герметического запаивания емкости, отличающийся тем, что в качестве коклюшного компонента используют бесклеточный коклюшный анатоксин, смешивание бесклеточного коклюшного анатоксина, дифтерийного и столбнячного анатоксинов осуществляют одновременно в присутствии физиологического раствора, забуференного фосфатом, полученную смесь выдерживают в течение 1 ч при 4-10°С с последующей сорбцией на гидроксиде алюминия, непосредственно перед лиофилизацией в смесь добавляют сахарозу до конечной концентрации 9-10,5%, после чего смесь перемешивают и выдерживают при 4-10°С в течение 1 ч.