Связывание патологических форм прионовых белков

Настоящее изобретение относится к диагностическим методам. Способ селективного связывания агрегирующей аномальной формы белка в присутствии неагрегирующей нормальной формы этого белка предусматривает контактирование в условиях селективного связывания материала, содержащего как указанную аномальную, так и нормальную формы, со связывающим агентом. Причем связывающий агент является полиионным материалом, имеющим авидность связывания в отношении указанной агрегирующей формы указанного белка, присутствующей в образце. Условия селективного связывания включают в себя присутствие конкурентного агента в растворе. Конкурентный агент имеет ионные группы, имеющие меньшую авидность связывания в отношении аномальной формы этого белка, чем связывающий агент. Вышеуказанное связывание определяют качественно или количественно путем проведения иммуноанализа на агрегирующую форму белка. Связывающим агентом могут служить полианионные материалы (полисульфат пентозана, сульфат декстрана и др.) или поликатионные материалы (гексадиметрин, полибрен и др.). Связывающий агент может быть иммобилизован на твердой среде. Использование предложенного способа позволяет повысить чувствительность и специфичность диагностических тестов на прионовые заболевания. 3 н. и 34 з.п. ф-лы, 1 ил.

 

Текст описания приведен в факсимильном виде

1. Способ селективного связывания агрегирующей аномальной формы белка в присутствии неагрегирующей нормальной формы этого белка, предусматривающий контактирование в условиях селективного связывания материала, содержащего как указанную аномальную, так и нормальную формы, со связывающим агентом, который является полиионным материалом, имеющим авидность связывания в отношении указанной агрегирующей формы указанного белка, присутствующей в образце, где указанные условия селективного связывания включают в себя присутствие конкурентного агента в растворе, причем конкурентный агент имеет ионные группы, имеющие меньшую авидность связывания в отношении аномальной формы этого белка, чем полиионный материал.

2. Способ по п.1, где связывающий агент является устойчивым к протеазам.

3. Способ по п.1 или 2, где протеаза присутствует во время указанного связывания или где указанный белок подвергают действию протеазы после его связывания.

4. Способ по п.1 или 2, где связывающий агент является полианионным материалом, имеющим множество анионных групп, или поликатионным материалом, имеющим множество катионных групп.

5. Способ по п.4, где указанный полиионный материал имеет множество анионных групп, которые являются сульфатными, карбоксильными или фосфатными группами, или множество катионных групп, которые являются аминогруппами, иминогруппами или четвертичными аммониевыми группами.

6. Способ по п.5, где указанный полиионный материал является полианионным полигликозидом.

7. Способ по п.6, где полианионный полигликозид является полисульфированным полигликозидом.

8. Способ по п.7, где полианионный полигликозид является полианионным производным пентозана или производным декстрана.

9. Способ по п.8, где полисульфированный полигликозид является полисульфатом пентозана (PPS) или сульфатом декстрана.

10. Способ по п.4, где указанный полиионный материал является бромидом гексадиметрина, дендримером РАМАМ, поли-L-лизином, pDADMAC или полиэтиленимином.

11. Способ по любому из пп.1, 2, 5-10, где конкурентный агент имеет меньшую плотность ионных групп, чем полиионный материал.

12. Способ по п.11, где конкурентный агент является анионным.

13. Способ по п.12, где конкурентный агент является анионным детергентом.

14. Способ по п.12, где конкурентный агент является амидным производным жирной кислоты, полученным конденсацией с аминокислотой.

15. Способ по п.14, где конкурентный агент является N-лауроилсаркозином.

16. Способ по любому из пп.1, 2, 5-10, 12-15, где рН является таким, что он стимулирует указанное связывание связывающего агента с аномальной формой белка.

17. Способ по п.16, где рН равен 8-9.

18. Способ по п.17, где рН равен 8,2-8,6.

19. Способ по любому из пп.1, 2, 5-10, 12-15, 17-18, где присутствует детергент, который стимулирует связывание связывающего агента с аномальной формой белка.

20. Способ по любому из пп.1, 2, 5-10, 12-15, 17-18, где указанный связывающий агент после связывания с указанной агрегированной аномальной формой белка захватывается иммобилизованным захватывающим агентом.

21. Способ по п.20, где указанный захватывающий агент является лектином или антителом, реактивным с указанным связывающим агентом.

22. Способ по п.20, где указанный связывающий агент обеспечен селективно связываемой маркерной группой, и указанный Захватывающий агент связывается с указанной маркерной группой.

23. Способ по любому из пп.1, 2, 5-10, 12-15, 17-18, где связывающий агент иммобилизуют на твердой среде перед экспонированием указанной аномальной форме белка.

24. Способ по п.23, где среда является субстратом, имеющим нанесенный на нее в виде покрытия указанный связывающий агент.

25. Способ по п.23, где связывающий агент обеспечивают селективно связываемой маркерной группой и иммобилизуют на указанной твердой среде через указанную маркерную группу.

26. Способ по п.22 или 25, где указанной связываемой маркерной группой является биотин, флуоресцеин, динитрофенол, дигокеигенин, последовательность нуклеиновой кислоты или аналога нуклеиновой кислоты или (His)6.

27. Способ по любому из пп.1, 2, 5-10, 12-15, 17-18, где указанный связывающий агент является твердым веществом, которое обеспечивает поверхность, имеющую указанную авидность связывания.

28. Способ по п.27, где эта поверхность является поверхностью полимера, имеющего ионные труппы, ковалентно связанные в структуре этого полимера или образованные модификацией поверхностных групп этого полимера.

29. Способ анализа на присутствие аномальной агрегирующей формы белка в образце, предусматривающий связывание указанной аномальной формы белка способом по любому из предыдущих пунктов с последующим определением наличия или количества связывания белка со связывающим агентом.

30. Способ по п.29, где указанное связывание определяют качественно или количественно путем проведения иммуноанализа на агрегирующую форму данного белка.

31. Способ по п.29 или 30, где связывание аномальной агрегирующей формы белка проводят селективно в присутствии нормальной неагрегирующей формы белка и затем связанный белок агрегированной формы отделяют от несвязанного белка нормальной формы и после этого проводят указанное определение наличия или количества указанного связывания.

32. Способ по п.29 или 30, где указанная аномальная форма белка является PrP^Sc, а указанная нормальная форма является PrP^c.

33. Способ по п.1, в котором аномальной агрегирующей формой белка является PrP^Sc, а нормальной неагрегирующей формой белка является PrP^c, дополнительно предусматривающий отделение PrP^Sc от PrP^c путем селективного связывания PrP^Sc со связывающим агентом в присутствии амидного производного жирной кислоты, полученного конденсацией с аминокислотой.

34. Способ по п.33, где амидное производное жирной кислоты, полученное конденсацией с аминокислотой, является N-лауроилсаркозином.

35. Способ по по п.33 или 34, проводимый при рН 8-9.

36. Связывающий агент для агрегирующей аномальной формы белка, который является гексадиметрином или поликатионным связывающим агентом, конъюгированным со связываемой маркерной группой, посредством которой этот связывающий агент может быть иммобилизован на твердой среде путем связывания указанной связываемой маркерной группы с захватывающим агентом на указанной твердой среде.

37. Селективный связывающий агент по п.36, являющийся поликатионным материалом, выбранным из бромида гексадиметрина, дендримера РАМАМ, поли-L-лизина, pDADMAC или полиэтиленимина.