Применение cd25-связывающих молекул для лечения пациентов, устойчивых к стероидам

Изобретение относится к области медицины и касается применения CD-связывающих молекул для лечения пациентов, устойчивых к стероидам. Сущность изобретения включает применение рекомбинантного антитела, имеющего гипервариабельные участки CDR области с определенной аминокислотной последовательностью для лечения и предупреждения неспецифического язвенного колита и болезни Крона у устойчивого к стероидам пациента. Преимущество изобретения заключается в разработке препарата для лечения вышеуказанных заболеваний у устойчивых к стероидам пациентов. 2 н. и 13 з.п. ф-лы, 2 табл.

 

Настоящее изобретение относится к применению СD25-связывающих молекул для лечения заболевания, выбранного из группы, включающей аутоиммунный гепатит, астму, экзему, васкулит, темпоральный артериит, системную красную волчанку, лейкоз, гломерулонефрит, рассеянный склероз, неспецифический язвенный колит, саркоид и болезнь Крона, у устойчивых к стероидам пациентов.

Неспецифический язвенный колит

Стероиды являются эффективным средством лечения большинства пациентов, страдающих неспецифическим язвенным колитом. Однако от 30 до 50% пациентов, страдающих неспецифическим язвенным колитом, нечувствительны к стероидной терапии, и лечение этих пациентов с помощью общепринятых методов терапии не дает удовлетворительных результатов и во многих случаях требуется хирургическое вмешательство. До начала применения стероидов для лечения серьезных случаев неспецифического язвенного колита уровень смертности от заболевания составлял порядка 50% (Truelove S.C. и Witts L.J., BMJ, 1955, сс.1041-1048). В современной практике пациентов, страдающих серьезным неспецифическим язвенным колитом, у которых не обнаружено облегчение состояния после применения стероидной терапии в течение 5-7 дней, подвергают экстренной операции (Jewell D.P. и др., Gastroenterol Int; 4, 1991, сс.161-164). Хирургическое вмешательство, хотя оно и приводит к исцелению, включает илеостомию подвздошной кишки, по крайней временно, и поэтому пациенты часто отказываются от хирургического вмешательства. Однако задержка в проведении операции у пациентов, не чувствительных к общепринятой терапии, является опасной из-за возможного возникновения предоперационного прободения, что повышает смертность (Ritchie J.KL., BMJ, 1974, сс.264-268). В качестве альтернативы хирургическому вмешательству для лечения некоторых устойчивых к стероидам пациентов, страдающих неспецифическим язвенным колитом, используют иммуносупрессант циклоспорин (Lichtiger S. и др. N Engi J Med, 330, 1994, сс.1841-1845). Однако для многих пациентов, которые первоначально нуждались в хирургическом вмешательстве, лечение в течение 6 месяцев дало неутешительные результаты и у многих пациентов обнаружены побочные действия, включая смертельную инфекционную пневмонию, вызываемую условно-патогенным видом, таким как Pnemocystis carinii, что является результатом иммуносупрессии, почечную недостаточность и гипертензию (Smith М.В., N Engi J Med; 327, 1992, сс.497-498; Sandborn W.J,. Inflamm Bowel Dis; 1, 1995, сс.48-63). Азатиоприн является эффективным терапевтическим средством для хронически активного устойчивого к стероидам или зависящего от стероидов неспецифического язвенного колита. Однако его действие наступает через продолжительный период времени (3-4 месяца) и поэтому он непригоден для пациентов, страдающих серьезным неспецифическим язвенным колитом, которые нуждаются в экстренном лечении (Ardixxone S. и др., J Clin Gastroenterol; 25, 1997, сс.330-333.). Таким образом, лечение устойчивого к стероидам неспецифического язвенного колита остается трудной проблемой и, как правило, для его лечения требуется операция, приводящая к стоме. Существует потребность в создании альтернативного консервативного пути лечения устойчивого к стероидам неспецифического язвенного колита, и одним из путей решения является понимание причин, по которым некоторые пациенты, страдающие неспецифическим язвенным колитом, теряют чувствительность к стероидной терапии. Для каждого отдельного пациента трудно предсказать чувствительность к стероидной терапии и, как следствие, необходимость в хирургическом вмешательстве или в применении другого пути лечения. При серьезном неспецифическом язвенном колите первоначальные признаки серьезности заболевания слабо коррелируют с конечным результатом (чувствительность к стероидной терапии) (Lindgren S.C. и др., Eur J.Gastrenterol Hepatol; 10, 1998, сс.831-835). Так, пациенты, нечувствительные к стероидной терапии, не обязательно являются пациентами с наиболее тяжелой формой болезни.

Астма

Современный метод лечения астмы заключается во введении стероидов, таких как глюкокортикоиды. Однако несмотря на обычно удовлетворительную реакцию, существует группа пациентов, которые не обладают чувствительностью к стероидной терапии. Таких пациентов называют пациентами с ″устойчивой к стероидам астмой″ и они впервые были выявлены в 1968 году. Как следствие, при устойчивой к стероидам астме не удается повысить на 15% односекундный объем воздуха при форсированном выдохе (ОФВ₁; мера функции легкого, которая снижается при астме) после применения в течение 7 дней преднизолона в дозе 20 мг в день (Carmichael J. и др., BMJ; 282, 1981, сс.1419-1422). Было проведено сравнительное исследование пациентов, страдающих устойчивой к стероидам астмой и чувствительных к стероидам астматиков, и установлено, что основная функция легкого и реакция на бронхолитические средства у них существенно не различались, что свидетельствует о том, что устойчивые к стероидам астматики не страдают более серьезной формой заболевания. Оценивали чувствительность к стероидам лимфоцитов периферической крови пациентов, страдающих устойчивой к стероидам астмой, на основе данных об ингибировании глюкокортикоидами стимулированной фитогемагглютинином (ФГА) пролиферации (Poznansky M.C. и др., Clin Sci; 67, 1984, сс.639-645; Alvarez J. и др., J.Allergy Clin Immunol; 89, 1992, сс.714-721; Corrigan C.J. и др., Am Rev Respir Dis; 144, 1991, сс.1026-1032, Hackzu А. и др., J Allergy Clin Immunol; 93, 1994, сс.510-519, Spahn J.D. и др., J Allergy Clin Immunol; 98, 1996, сс.1073-1079). Во всех исследованиях установлено, что лимфоциты астматиков, страдающих устойчивой к стероидам астмой, в существенно меньшей степени игибировались стероидами, чем лимфоциты астматиков, чувствительных к стероидам, что свидетельствует о том, что у пациентов, страдающих устойчивой к стероидам астмой, присутствуют устойчивые к стероидам лимфоциты. В проведенном позднее исследовании было обнаружено, что у 8 пациентов, страдающих устойчивой к стероидам астмой, присутствуют устойчивые к стероидам лимфоциты, и их лечили метотрексатом (Vrugt В. и др., Eur Respir J; 15, 2000, сс.478-485). Через 8 недель воспаление слизистой оболочки легких понизилось и чувствительность лимфоцитов к стероидам повысилась. Было высказано предположение, что благоприятное действие метотрексата на слизистую оболочку бронхов пациентов, страдающих устойчивой к стероидам астмой, является результатом повышения чувствительности к стероидам. Это является примером лекарственного средства, действующего в качестве ″усилителя стероидов″ и обладающего как способностью повышать чувствительность лимфоцитов к стероидам, так и клинической эффективностью. Было установлено, что у примерно 25% пациентов, у которых астма ″плохо поддается лечению″, обследованных для сравнения в третьем центре, обнаружена устойчивость лимфоцитов к стероидам (Chan M.T.S и др., J Allergy Clin Immunol; 101, 1998, сс.594-601).

Аутоиммунный гепатит

Аутоиммунный гепатит представляет собой форму хронического заболевания печени, характеризующегося прогрессирующим воспалением гепатоцитов, который, как правило, чувствителен к лечению кортикостероидами. Однако 10% пациентов, страдающих аутоиммунным гепатитом, устойчивы к кортикостероидам и у них развивается прогрессирующее заболевание печени и цирроз. Лечение этой группы пациентов, страдающих устойчивым к стероидам заболеванием, затруднено, и для лечения может потребоваться трансплантация. Для лечения устойчивого к стероидам аутоиммунного гепатита применяли циклоспорин (Fernandes N.F. и др., Am J Gastroenterol; 94, 1999, сс.241-248). При исследовании, проведенном на группе из 5 пациентов, такое лечение оказалось эффективным для 4 из них. К сожалению, у этого одного пациента, который оказался нечувствительным к циклоспорину, развилась прогрессирующая почечная недостаточность, ему была проведена ортотопическая трансплантация печени, и впоследствии он умер от диссеминирующей инфекции, вызванной цитомегаловирусом. Циклоспорин, как правило, хорошо переносился и ни у одного из пациентов не развилась почечная недостаточность. Можно предположить, что пациенты, страдающие устойчивым к стероидам аутоиммунным гепатитом, имели устойчивые к стероидам лимфоциты.

Экзема

Экзема представляет собой определенный тип кожного воспаления, который может вызываться или поддерживаться различными связанными с окружающей средой или внутренними факторами, например контактом с аллергеном и раздражителем, инфекционными агентами и атопией. Большинство страдающих экземой пациентов имеют относительно слабую форму заболевания и нуждаются в периодической местной терапии. Однако некоторые пациенты страдают более серьезной формой заболевания и нуждаются в систематической стероидной терапии (Hoare С. и др., Health Technol Assess; 4, 2000, сс.1-191; Heddle R.J. и др., Br Med J, изд-во Clin Res; 289, 1984, сс.651-654). Отсутствие чувствительности к стероидной терапии требует альтернативного лечения с использованием иммуносупрессоров, таких как циклоспорин (Granlund H. И др., Acta Derm. Venereol. 1996; 76: сс.371-6). Предполагается, что указанное отсутствие реакции на стероидную терапию является следствием устойчивости к стероидам пациента, имеющего устойчивые к стероидам лимфоциты.

Васкулит

Васкулиды представляют собой группу состояний, характеризующихся воспалением артерий. Некоторые из этих состояний вызывают также гломерулонефрит (включая грануломатоз Вегенера, синдром Гудпасчера и нодозный полиартрит). Стероиды остаются наиболее важным средством лечения всех указанных состояний (Bosch X. и др.. Lupus; 8, 1999, сс.258-262; Guillevin L. nephrol. Dial. Transplant 199;14: cc.2077-2079; Reinhold-Keller E. и др., Arthritis Rheum.; 43, 2000, 1021-1032). Как правило, совместно со стероидами применяют иммуносупрессорную терапию и нечувствительность к такой комбинированной терапии может иметь фатальные последствия. Предполагается, что основное большинство пациентов со сниженной чувствительностью к лечению несут устойчивые к стероидам лимфоциты.

Темпоральный артериит

Темпоральный артериит также является формой васкулита. Его осложнением является слепота, связанная с нарушением поставки крови в глаз, что вызвано воспалением артерии. Примерно 15% пациентов не чувствительны к основному пути лечения, основанного на использовании стероидов (Chevalet P. и др., J RheumatoL; 27, 2000, сс.1484-1491). Этих пациентов часто подвергают пролонгированному курсу лечения с помощью стероидов, которое оказывается неэффективным. Для лечения устойчивого к стероидам заболеванию применяли альтернативный подход, основанный на использовании метотрексата (Krall P.L. и др., Cleve Clin J Med; 56, 1989, сс.253-257). Указанное снижение чувствительности к стероидной терапии, вероятно, связано с устойчивостью к стероидам пациента, имеющего устойчивые к стероидам лимфоциты.

Саркоид

Саркоидоз представляет собой системное грануломатозное заболевание неизвестной природы. Саркоидоз является результатом избыточного опосредуемого Т-клетками иммунного ответа на неизвестный антиген. Стероиды остаются наиболее эффективным средством лечения (Barnard J. и др., Curr Opin RheumatoL; 13, 2001, сс.84-91). Альтернативу стероидной терапии часто используют либо в случае отсутствия чувствительности к стероидам либо с целью снижения дозы стероида и побочных действий.

Системная красная волчанка

Системная красная волчанка представляет собой аутоиммуное заболевание, которое включает аномалии Т-лимфоцитов, а также гиперреактивных В-клеток, которые продуцируют аутоантитела. Без лечения болезнь может привести к конечной стадии заболевания почек или смерти. Глюкокортикоиды представляют собой лекарственные средства, которые используют, в первую очередь, для лечения системной красной волчанки. Однако у некоторых пациентов отсутствует чувствительность к стероидной терапии.

У пациентов, страдающих системной красной волчанкой (СКВ), была изучена также корреляция между чувствительностью лимфоцитов к стероидам in vitro и клинической реакцией на стероидную терапию (Seki M. и др., Arthritis Rheum; 41, 1998, сс.823-830). В эксперименте принимали участие 27 японок, которых лечили в течение 1 месяца преднизолоном (пероральное введение, 50-60 мг в день). По клинической реакции на лечение стероидом 19 пациенток были классифицированы как чувствительные к стероидам, а 8 - как устойчивые к стероидам. Чувствительность к стероидам лимфоцитов оценивали in vitro no индуцированному стероидом апоптозу (гибель клеток) лимфоцитов периферической крови. При высоких концентрациях преднизолона лимфоциты страдающих СКВ пациентов в устойчивой к стероидам группе имели значительно более низкий процент апоптозных клеток по сравнению с чувствительной к стероидам группой (44,8% против 68,8%; р<0,05). Таким образом, хотя метод оценки чувствительности лимфоцитов к стероидам отличался от метода, с помощью которого оценивали уровень ингибирования глюкокортикоидами стимулированной ФГА пролиферацией лимфоцитов, установлено, что пациенты, нечувствительные к стероидной терапии, имели устойчивые к стероидам лимфоциты.

Лейкоз

Лейкоз представляет собой злокачественное заболевание лейкоцитов, при котором происходит пролиферация клеток-предшественников лейкоцитов, но у них отсутствует способность к дифференцировке. Хотя лейкоз не является воспалительным состоянием, в химиотерапевтические схемы, применяемые для лечения этого состояния, включают глюкокортикоиды. Глюкокортикоиды индуцируют апоптоз лимфобластов, и это используют в качестве меры чувствительности к стероидам при остром лимфобластном лейкозе (ОЛЛ). Критерием хорошей клинической реакции является высокая скорость апоптоза in vitro. И наоборот, устойчивость к стероидам выявлена примерно в 30% вновь диагностированных случаев ОЛЛ и представляет собой важную клиническую проблему (Kaspers G.J.L и др. Leuk Lymphoma;13, 1994, сс.187-201). Проведены сравнительные исследования in vitro чувствительности лимфоцитов не только к стероидам (дексаметазон и преднизолон), но также и к L-аспаргиназе и винкристину (Kaspers G.L.J и др. Blood; 90, 1997, сс.2723-2729; Hongo T. и др., Blood; 89, 1997, сс.2959-2965). Используя в качестве критерия чувствительность лимфоцитов к указанным лекарственным средствам, пациенты были классифицированы как чувствительные к указанным лекарственным средствам (чувствительность ко всем лекарствам), обладающие средней чувствительностью (чувствительные к 2 или 3 лекарствам) или устойчивые (чувствительные к одному или вообще нечувствительные ни к одному из лекарств). Через 3 года наиболее высокий процент выживших и вылечившихся от болезни обнаружен в группе чувствительных пациентов (85-100%) и наиболее низкий - у устойчивых пациентов (43-55%). Таким образом, чувствительность лимфобластов in vitro и чувствительность к заболеванию in vivo у страдающих ОЛЛ пациентов коррелирует с чувствительностью не только к стероидам, но и к другим химиотерапевтическим агентам.

Гломерулонефрит

Гломерулонефрит характеризуется воспалением почек и, как правило, представляет собой аутоиммунное заболевание. Стероиды являются важным средством лечения (Austin Н.А. и др., N Engl J Med; 314, 1986, 614-619), и нечувствительность к стероидной терапии при этом состоянии может привести к почечной недостаточности. Неэффективность стероидной терапии для устойчивых к стероидам пациентам, страдающих болезнью почек, привело к использованию иммуносупрессоров (как и в случае неспецифического язвенного колита) (McCauley J и др., Nephrol Dial Transplant; 8, 1993, 1286-1290). Исследование позволило выявить диапазон устойчивости к стероидам лимфоцитов у 16 пациентов, страдающих гломерулонефритом (Briggs W.A. и др., J Clin Pharmacol; 36, 1996, сс.707-714). Было установлено, что диапазон чувствительности лимфоцитов к стероидам объясняет различную реакцию на стероидную терапию, однако в этом исследовании не проведено сравнение чувствительности лимфоцитов к стероидам и клинической реакции при заболевании. Фокальный (очаговый) сегментарный гломерусклероз (ФСКС) представляет собой форму гломерулонефрита, который лечится также с помощью стероидов, хотя некоторые пациенты нечувствительны к ним (Ingulli E. и др., J Am Soc Nephrol; 5, 1995, 1820-1825). Были проведены сравнительные исследования чувствительности лимфоцитов к стероидам при этом состоянии и клинических реакций и установлено, что можно предсказывать предполагаемое улучшение функции почек в ответ на лечение стероидами. Пациенты, у которых обнаружены наиболее чувствительные лимфоциты, оказались наиболее восприимчивыми к стероидной терапии, а пациенты, у которых обнаружены устойчивые к стероидам лимфоциты, были мало восприимчивы к стероидам.

Рассеянный склероз

Рассеянный склероз представляет собой воспалительное демиелинизирующее заболевание центральной нервной системы, в патогенезе которого Т-лимфоциты, реактивные в отношении миелиновых протеинов, играют важную патогенную роль. Глюкокортикоиды применяют для лечения рассеянного склероза (Brusaferri F. И др., J Neurol; 247, 2000, сс.435-442). Лечение стероидами является эффективным в отношении ускорения кратковременного облегчения состояния страдающих рассеянным склерозом пациентов и может также снижать риск рецидива. Однако клиническая реакция варьируется в широких пределах для различных пациентов. У страдающих рассеянным склерозом пациентов оценивали чувствительность лимфоцитов к стероидам (Wei Т. и др., Acta Neurologica Scandinavica; 96, 1997, сс.28-33) и было обнаружено, что чувствительность лимфоцитов варьируется в широком диапазоне. В этом эксперименте не проводили сравнение чувствительности лимфоцитов к стероидам и клинической реакции больных рассеянным склерозом на стероидную терапию, но высказано предположение о том, что чувствительность лимфоцитов к стероидам in vitro может частично объяснить вариабельность реакций на стероидную терапию.

Чувствительность лимфоцитов к стероидам

Как отмечалось выше, пролиферацию лимфоцитов можно стимулировать in vitro с помощью митогена ФГА (Lindahl Kiessling К,. Peterson R.D., Exp Cell Res 1969; cc.5585-5587). Добавление стероидов в культуральную среду ингибирует пролиферацию лимфоцитов (Walker K.B. и др., Transplant Proc; 17, 1985, cc.1676-1678). В некоторых случаях лимфоциты являются чувствительными к стероидам, при этом добавление небольшого количества стероида вызывает выраженное ингибирование пролиферации, а в других случаях лимфоциты являются устойчивыми к стероидам, при этом добавление даже больших количеств стероида лишь в незначительной степени ингибирует пролиферацию. Ранее заявители настоящего изобретения исследовали связь между ЛЧС (чувствительность лимфоцитов к стероидам) и клинической реакцией на стероидную терапию у группы пациентов, страдающих серьезным неспецифическим язвенным колитом (Hearing S.D. и др., Gut; 45, 1999, cc.382-388). Всех пациентов лечили путем внутривенного введения стандартной дозы стероидов, и чувствительность лимфоцитов пациентов к стероидам (ЛЧС) оценивали по ингибированию дексаметазоном вызванной ФГА пролиферации лимфоцитов периферической крови. Была продемонстрирована выраженная корреляция между клинической реакцией и ЛЧС. Все пациенты, лимфоциты которых были чувствительны к стероидам, давали полную реакцию на стероидную терапию, а все пациенты, лимфоциты которых были устойчивыми к стероидам, давали слабую реакцию на стероидную терапию. Таким образом, при неспецифическом язвенном колите существует корреляция между ЛЧС и клинической реакцией, при этом устойчивость лимфоцитов к стероидам позволяет предсказать слабую реакцию на стероидную терапию.

Интерлейкины представляют собой группу цитокинов, которые продуцируются активированными макрофагами и лимфоцитами в процессе иммунного ответа. Они оказывают воздействие на лимфоциты и другие лейкоциты, стимулируя их пролиферацию и дифференцировку. Представитель этой группы интерлейкин-2 (IL-2) является одним из основных цитокинов, продуцируемых активированными Т-клетками, и посредством аутокринного воздействия стимулирует пролиферацию и дифференцировку Т-клетки, продуцирующей его. IL-2, который продуцируется активированными Т-лимфоцитами при неспецифическом язвенном колите, может играть важную роль в возникновении постоянного воспаления в слизистой оболочке путем активации способности других воспалительных клеток продуцировать дополнительные цитокины, которые могут приводить к дополнительному рекрутменту и активации воспалительных клеток (Kirman I. И др., J. Dig Dis Sci; 40, 1995, сс.291-295). Если пациент чувствителен к стероидной терапии, то важным действием стероидов является ингибирование производства IL-2, что препятствует пролиферации лимфоцитов и связанному с этим воспалению (стероиды обладают различными действиями, при этом ингибирование IL-2 является только одним из них). Однако если пациент обладает устойчивостью к стероидам, то производство IL-2 не будет ингибироваться стероидами, и воспалительный процесс будет продолжаться без ограничения.

С учетом большого количества пациентов, страдающих аутоиммунным гепатитом, астмой, экземой, васкулитом, темпоральным артериитом, системной красной волчанкой, лейкозом, гломерулонефритом, рассеянным склерозом, неспецифическим язвенным колитом, саркоидом и болезнью Крона, для которых лечение стероидами является неэффективным, существует потребность в разработке эффективного лечения в качестве альтернативы экстренной и инвазивной хирургии.

Более конкретно первым объектом настоящего изобретения является применение СD25-связывающей молекулы, которая содержит по меньшей мере один антигенсвязывающий центр антитела, включающий по меньшей мере один домен, который содержит расположенные последовательно гипервариабельные участки CDR1, CDR2 и CDR3; где CDR1 имеет аминокислотную последовательность Arg-Tyr-Trp-Met-His, CDR2 имеет аминокислотную последовательность Ala-Ile-Tyr-Pro-Gly-Asn-Ser-Asp-Thr-Ser-Tyr-Asn-Gln-Lys-Phe-Glu-Gly и CDR3 имеет аминокислотную последовательность Asp-Tyr-Gly-Tyr-Tyr-Phe-Asp-Phe; или ее непосредственных эквивалентов для лечения аутоиммунного гепатита, астмы, экземы, васкулита, темпорального артериита, системной красной волчанки, лейкоза, гломерулонефрита, рассеянного склероза, неспецифического язвенного колита, саркоида и болезни Крона. Как продемонстрировано ниже в примерах 1 и 2, CD25-связывающие молекулы по изобретению модулируют чувствительность лимфоцитов к стероидам таким образом, что устойчивые к стероидам пациенты становятся чувствительными к стероидам. Так, CD25-связывающие молекулы по изобретению можно применять для лечения у устойчивых к стероидам пациентов аутоиммунного гепатита, астмы, экземы, васкулита, темпорального артериита, системной красной волчанки, лейкоза, гломерулонефрита, рассеянного склероза, неспецифического язвенного колита, саркоида и болезни Крона.

Кроме того, CD25-связывающие молекулы по изобретению можно применять также для улучшения реакции на стероидную терапию у чувствительных к стероидам пациентов. Хотя следует ожидать, что чувствительные к стероидам пациенты определенным образом реагируют на стероидную терапию, применение CD25-связывающих молекул по изобретение, вероятно, может ускорить их реакцию или позволить применять более низкую дозу стероидов, снижая тем самым в значительной степени побочные действия, связанные с лечением стероидами. Таким образом, еще одним объектом изобретения является способ предупреждения, поддержания ремиссии/предупреждения рецидива и лечения аутоиммунного гепатита, астмы, экземы, васкулита, темпорального артериита, системной красной волчанки, лейкоза, гломерулонефрита, рассеянного склероза, неспецифического язвенного колита, саркоида и болезни Крона у чувствительного к стероидам пациента, который заключается во введении пациенту эффективного количества CD25-связывающих молекул по изобретению и при необходимости стероидов.

Под ″CD25-связывающей молекулой″ понимают любую молекулу, которая обладает способностью связываться с антигеном CD25 либо индивидуально либо в сочетании с другими молекулами, образуя обладающие высокой аффинностью IL-2-рецепторы.

Предпочтительно применяют СD25-связывающую молекулу, которая содержит по меньшей мере один антигенсвязывающий центр, включающий:

а) первый домен, который содержит последовательно расположенные последовательно гипервариабельные участки CDR1, CDR2 и CDR3; где CDR1 имеет аминокислотную последовательность Arg-Tyr-Trp-Met-His, CDR2 имеет аминокислотную последовательность Ala-Ile-Tyr-Pro-Gly-Asn-Ser-Asp-Thr-Ser-Tyr-Asn-Gln-Lys-Phe-Glu-Gly и CDR3 имеет аминокислотную последовательность Asp-Tyr-Gly-Tyr-Tyr-Phe-Asp-Phe, и

б) второй домен, который содержит последовательно расположенные гипервариабельные участки CDR1′, CDR2′ и CDR3′, где CDR1′ имеет аминокислотную последовательность Ser-Ala-Ser-Ser-Ser-Ile-Ser-Tyr-Met-Gln, CDR2′ имеет аминокислотную последовательность Asp-Thr-Ser-Lys-Leu-Ala-Ser и CDR3' имеет аминокислотную последовательность His-Gln-Arg-Ser-Ser-Tyr-Thr;

или ее непосредственные эквиваленты.

Если не указано иное, то подразумевается, что любая упомянутая в настоящем описании полипептидная цепь имеет аминокислотную последовательность, которая начинается на N-конце и заканчивается С-конце.

Когда антигенсвязывающий центр содержит и первый и второй домен, то они могут быть локализованы на одной и той же полипептидной молекуле, или предпочтительно каждый домен может находиться на различных цепях, причем первый домен представляет собой часть тяжелой цепи иммуноглобулина или ее фрагмент, а второй домен представляет собой часть легкой цепи иммуноглобулина или ее фрагмент.

Таким образом, изобретение относится также к применению CD25-связывающей молекулы, которая содержит по меньшей мере один антигенсвязывающий центр, включающий либо первый домен, который имеет аминокислотную последовательность, идентичную или практически идентичную последовательности, представленной в Seq. Id. No. 1 в ЕР 449769 В 1, которая начинается с аминокислоты в положении 1 и заканчивается аминокислотой в положении 117, или описанный выше первый домен, и второй домен, который имеет аминокислотную последовательность, идентичную или практически идентичную последовательности, представленной в Seq. Id. No. 2 в ЕР 449769В 1, которая начинается с аминокислоты в положении 1 и заканчивается аминокислотой в положении 104, содержание ЕР 449769В 1 включено в настоящее описание в качестве ссылки.

Более предпочтительная СD25-связывающая молекула, предназначенная для применения согласно изобретению, представляет собой антитело к CD25, которое содержит по меньшей мере

а) одну тяжелую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, которые включают (I) вариабельную область, содержащую последовательно расположенные гипервариабельные участки CDR1, CDR2 и CDR3, и (II) константную область человеческой тяжелой цепи или ее фрагмент; где CDR1 имеет аминокислотную последовательность Arg-Tyr-Trp-Met-His, CDR2 имеет аминокислотную последовательность Ala-Ile-Tyr-Pro-Gly-Asn-Ser-Asp-Thr-Ser-Tyr-Asn-Gln-Lys-Phe-Glu-Gly и CDR3 имеет аминокислотную последовательность Asp-Tyr-Gly-Tyr-Tyr-Phe-Asp-Phe, и

б) одну легкую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, которые включают (I) вариабельную область, содержащую последовательно расположенные гипервариабельные участки CDR1′, CDR2′ и CDR3′, и (II) константную область человеческой легкой цепи или ее фрагмент; где CDR1′ имеет аминокислотную последовательность Ser-Ala-Ser-Ser-Ser-Ile-Ser-Tyr-Met-GIn, CDR2′ имеет аминокислотную последовательность Asp-Thr-Ser-Lys-Leu-Ala-Ser и CDR3′ имеет аминокислотную последовательность His-Gln-Arg-Ser-Ser-Tyr-Thr; и его непосредственные эквиваленты.

В другом варианте CD25-связывающая молекула, предназначенная для применения согласно изобретению, может представлять собой одноцепочечную связывающую молекулу, которая содержит антигенсвязывающий центр, включающий

а) первый домен, который содержит расположенные последовательно гипервариабельные участки CDR1, CDR2 и CDR3, где гипервариабельные участки имеют аминокислотные последовательности, представленные в Seq. Id. No. 1 ЕР 449769 В 1, содержание которого включено в настоящее описание в качестве ссылки,

б) второй домен, который содержит последовательно расположенные гипервариабельные участки CDR1′, CDR2′ и CDR3′, где гипервариабельные участки имеют аминокислотные последовательности, представленные в Seq. Id. No. 2 ЕР 449769 В 1, содержание которого включено в настоящее описание в качестве ссылки, и

в) пептидный линкер, который связан либо с N-концом первого домена и с С-концом второго домена или с С-концом первого домена и N-концом второго домена;

и ее непосредственные эквиваленты.

Еще в одном варианте СD25-связывающая молекула, предназначенная для применения согласно изобретению, представляет собой одноцепочечную связывающую молекулу, которая содержит антигенсвязывающий центр гуманизированных антител, например даклизумаба (daclizumab), описанный наряду с методом его получения в ЕР 451216 В1, содержание которого включено в настоящее описание в качестве ссылки.

Как хорошо известно, минорные замены в аминокислотной последовательности, такие как деления, добавление или замещение одной, небольшого количества или нескольких аминокислот, могут приводить к получению аллельной формы исходного протеина, которая обладает идентичными или практически идентичными свойствами, например антигенсвязывающими свойствами. Таким образом, понятие ″непосредственные эквиваленты″ обозначает либо любой один домен CD25-связывающей молекулы (молекула X)

(I) в котором гипервариабельные участки CDR1, CDR2 и CDR3, взятые в целом, гомологичны по меньшей мере на 80%, предпочтительно гомологичны по меньшей мере на 90%, более предпочтительно гомологичны по меньшей мере на 95% гипервариабельным участкам, представленным в Seq. Id. No. 1 ЕР 449769 В1 или на фиг.3 и 4 ЕР 451216 В1, содержание которых включено в настоящее описание в качестве ссылки, и,

(II) который обладает способностью ингибировать связывание интерлейкина 2 (IL-2) с его рецептором практически в такой же степени, что и молекула, с которой проводится сравнение, имеющая каркасные участки, идентичные каркасным участкам молекулы Х, но имеющая гипервариабельные участки CDR1, CDR2 и CDR3, идентичные гипервариабельным участкам, которые представлены в Seq. Id. No. 1 ЕР 449769 В1 или на фиг.3 и 4 ЕР 451216 В1, содержание которых включено в настоящее описание в качестве ссылки;

либо любую СD25-связывающую молекулу, которая несет по меньшей мере два домена в связывающем центре (молекула X′)

(I) в которой гипервариабельные участки CDR1, CDR2, CDR3, CDR1′, CDR2′ и CDR3′, взятые в целом, гомологичны по меньшей мере на 80%, предпочтительно гомологичны по меньшей мере на 90%, более предпочтительно гомологичны по меньшей мере на 95% гипервариабельным участкам, представленным в Seq. Id. No. 1 и 2 ЕР 449769 В1 или на фиг.3 и 4 ЕР 451216 В1, содержание которых включено в настоящее описание в качестве ссылки, и,

(II) которая обладает способностью ингибировать связывание IL-2 с его рецептором практически в такой же степени, что и молекула, с которой проводится сравнение, имеющая каркасные участки и константные области, идентичные каркасным участкам и константным областям молекулы X′, но имеющая гипервариабельные участки CDR1, CDR2, CDR3, CDR1′, CDR2′ и CDR3′, идентичные представленным в Seq. Id. No. 1 и 2 ЕР 44,769 В1 или фиг.3 и 4 ЕР 451216 В1, содержание которого включено в настоящее описание в качестве ссылки.

Последний критерий можно легко оценивать с помощью различных методов анализа, описанных в ЕР 449769 В1 или ЕР 451216 В1, содержание которых включено в настоящее описание в качестве ссылки.

Более предпочтительная CD25-связывающая молекула, которую можно применять согласно изобретению, представляет собой химерное антитело к CD25, прежде всего химерное антитело к CD25, которое содержит по меньшей мере

а) одну тяжелую цепь, включающую вариабельную область, которая имеет аминокислотную последовательность, идентичную или практически идентичную последовательности, приведенной в Seq. Id. No. 1 в ЕР 449769, содержание которого включено в настоящее описание в качестве ссылки, начинающуюся с аминокислоты в положении 1 и заканчивающуюся на аминокислоте в положении 117, и константную область человеческой тяжелой цепи; и

б) одну легкую цепь, включающую вариабельную область, которая имеет аминокислотную последовательность, идентичную или практически идентичную последовательности, приведенной в Seq. Id. No. 2 в ЕР 449769 В1, начинающуюся с глутаминовой кислоты в положении 1 и заканчивающуюся глутаминовой кислотой в положении 104, и константную область человеческой легкой цепи, содержание ЕР 449769 В1 включено в настоящее описание в качестве ссылки.

Константная область человеческой тяжелой цепи может быть γ₁-, γ₂-, γ₃-, γ₄-, μ,-, α₁-, α₂-, δ- или ε-типа, предпочтительно γ-типа, более предпочтительно γ₁-типа, а константная область человеческой легкой цепи может быть κ- или λ-типа (включая подтипы λ₁, λ₂ и λ₃), но предпочтительно κ-типа. Аминокислотная последовательность всех этих константных областей представлена у Kabat и др., Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, Public Health Service, NIH.

Наиболее предпочтительные CD25-связывающие молекулы по изобретению представляют собой химерное антитело базиликсимаб (базиликсимаб), котрое поступает в продажу под товарным знаком SIMULECT^® фирмы Novartis AG, и гуманизированное антитело даклизумаб (daclizumab), которое поступает в продажу под товарным знаком ZENAPX^® фирмы Roche.

СD25-связывающие молекулы, которые можно применять согласно настоящему изобретению, можно получать с помощью методик, описанных, например, в ЕР 449769 В1 и ЕР 451216 В1, содержание которых включено в настоящее описание в качестве ссылки.

Как описано в ЕР-В-449769 В1 и ЕР 451216 В1, СD25-связывающие молекулы с учетом данных об их активности, установленной, например, с помощью анализа чувствительности лимфоцитов к стероидам, можно применять для предупреждения и лечения аутоиммунного гепатита, астмы, экземы, васкулита, темпорального артериита, системной красной волчанки, лейкоза, гломерулонефрита, рассеянного склероза, неспецифического язвенного колита, саркоида и болезни Крона у чувствительного к стероидам или устойчивого к стероидам пациента.

Таким образом, изобретение относится также к

(I) способу предупреждения и лечения аутоиммунного гепатита, астмы, экземы, васкулита, темпорального артериита, системной красной волчанки, лейкоза, гломерулонефрита, рассеянного склероза, неспецифического язвенного колита, саркоида и болезни Крона у чувствительных к стероидам или устойчивых к стероидам пациентов, который заключается в том, что пациенту вводят эффективное количество описанной выше СD25-связывающей молекулы;

(II) способу предупреждения и лечения аутоиммунного гепатита, астмы, экземы, васкулита, темпорального артериита, системной красной волчанки, лейкоза, гломерулонефрита, рассеянного склероза, неспецифического язвенного колита, саркоида и болезни Крона у чувствительных к стероидам или устойчивых к стероидам пациентов, который заключается в том, что пациенту вводят, например, одновременно или последовательно эффективное количество а) описанной выше СD25-связывающей молекулы и б) другого лекарственного средства, обладающего эффективностью в отношении предупреждения и лечения аутоиммунного гепатита, астмы, экземы, васкулита, темпорального артериита, системной красной волчанки, лейкоза, гломерулонефрита, рассеянного склероза, неспецифического язвенного колита, саркоида и болезни Крона;

(III) фармацевтической композиции, предназначенной для применения согласно способу, описанному в (I)-(II), которая содержит описанную выше СD25-связывающую молекулу и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель;

(IV) СD25-связывающей молекуле, как она описана выше, предназначенной для приготовления лекарственного средства, которое можно применять согласно способу, описанному в (I) или (II);

(V) терапевтической комбинации, например набору или упаковке, предназначенной для применения согласно любому из способов, описанных в (I) или (II), где комбинация включает фармацевтическую композицию, которая содержит описанную выше СD25-связывающую молекулу и дополнительно включает по меньшей мере одну фармацевтическую композицию другого лекарственного средства, эффективного в отношении предупреждения и лечения аутоиммунного гепатита, астмы, экземы, васкулита, темпорального артериита, системной красной волчанки, лейкоза, гломерулонефрита, рассеянного склероза, неспецифического язвенного колита, саркоида и болезни Крона у чувствительного к стероидам или устойчивого к стероидам пациента.

Для применения согласно изобретению соответствующая доза должна естественно зависеть, например, от конкретной применяемой CD25-связывающей молекулы, хозяина, пути введения и серьезности подлежащего лечению состояния и требуемых воздействий. Удовлетворительные результаты, как правило, можно получать при использовании доз от примерно 0,1 до примерно 100 мг. Можно вводить одну дозу или несколько доз в течение такого периода времени, который может быть показан с точки зрения клинической картины или с точки зрения профилактики для подавления последующего клинического рецидива, например, дозу от примерно 5 до примерно 100 мг можно вводить в течение от 1 дня до 5 недель, например, каждые 3-6 дней, до достижения контроля или облегчения болезни. Предпочтительная схема применения лекарственного средства предусматривает введение 20 мг CD25-связывающей молекулы, например базиликсимаба, в день 0 и последующее введение 20 мг в день 4. СD25-связывающую молекулу удобно вводить парентерально, например внутривенно, например, в находящуюся кпереди от локтевого сустава или другую периферическую вену. Другим вариантом схемы применения лекарственного средства является внутривенное введение 40 мг каждые 28 дней до достижения контроля или облегчения болезни.

Препараты для внутривенных инфузий можно приготавливать следующим образом: лиофилизированные антитела смешивают и диспергируют в 100 мл стерильного забуференного физиологического раствора, содержащего 4,5 мас.% человеческого альбумина. Эту дисперсию на основе физиологического раствора можно вводить пациентам либо в виде внутривенной болюсной инъекции либо путем внутривенной инфузий в течение 15 мин.

При создании изобретения было установлено также, что введение CD25-связывающих молекул в рекомендованных дозах не приводит к возникновению нежелательных побочных воздействий. Наиболее безопасными являются базиликсимаб или даклизумаб, разрешенные к применению Управлением по контролю за качеством пищевых продуктов, медикаментов и косметических средств (FDA) США, которые поступают в продажу.

Фармацевтические композиции по изобретению можно приготавливать общепринятым образом, например согласно методам, описанным, например, в ЕР 449769 В1 или ЕР 451216 В1, содержание которых включено в настоящее описание в качестве ссылки.

СD25-связывающую молекулу можно вводить в виде единственного действующего вещества или в сочетании с другими лекарственными средствами, обладающими иммуномодулирующими свойствами, или с другими противовоспалительными агентами. Например, CD25-связывающую молекулу согласно изобретению можно применять в сочетании с фармацевтическими композициями, эффективными в отношении различных указанных выше заболеваний, например, содержащими циклоспорины, рапамицины или аскомицины, или их аналоги, обладающие иммуносупрессорными свойствами, такие как циклоспорин А, циклоспорин G, FK-506, сиролимус, эверолимус; кортикостероиды, такие как преднизон; циклофосфамид; азатиопрен; метотрексат; соли золота, сульфасалазин, противомалярийные средства, бреквинар; лефлуномид; мизорибин; микофенольную кислоту; микофенолят мофетила; 15-дезоксиспергуалин; другие иммуносупрессорные моноклональные антитела, например моноклональные антитела к рецепторам лейкоцитов, например МНС, CD2, CD3, CD4, CD7, CD28, В7, CD40, CD45 или CD58, или их лиганды; или другие иммуномодуляторы, например CTLA4Ig.

Если CD25-связывающую молекулу вводят совместно с другой лекарственной субстанцией, то они обе могут быть упакованы индивидуально в один и тот же контейнер, снабженный инструкциями по смешению или одновременному введению. Например, наборы могут включать состоящий из несколько цилиндров шприц или двойную упаковку, содержащую отдельные стандартные дозы лекарственных средств.

Ниже изобретение проиллюстрировано на примерах.

Пример 1

В опыт были включены 4 мужчины и 4 женщины. Средний возраст участвующих в эксперименте людей составлял 52 года (диапазон от 34 до 70 лет). Два человека представляли собой здоровых добровольцев, а 6 человек представляли собой пациентов, у которых ранее был поставлен диагноз ″неспецифический язвенный колит″. Пяти из шести пациентов ранее требовалось хирургическое вмешательство из-за слабой реакции на консервативное лечение и они не подвергались лечению ни с использованием противоспалительных средств, ни иммуносупрессоров. У шестого пациента был обнаружен неактивный ЯК (неспецифический язвенный колит) и он получал месалазин, но не в день тестирования. Таким образом, месалазин, одним из свойств которого является небольшое ингибирование IL-2, должен был метаболизироваться к моменту тестирования. (Базиликсимаб (товарный знак SIMULECT^®), предназначенный для применения in vitro, был получен от фирмы Novartis).

Оценка чувствительности лимфоцитов к стероидам: чувствительность лимфоцитов периферической крови к глюкокортикоидам оценивали с помощью функционального анализа, т.е. оценивали пролиферацию in vitro, стимулированную фитогемагглютинином (ФГА) и ингибированную дексаметазоном (Hearing S.D. и др. Gut 1999;45: сс.382-8; Hearing S.D. и др., J Clin Endocrinol Metab 1999;84: cc. 4149-54). Образцы периферической крови получали в 09:00 ч и мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) отделяли путем центрифугирования в градиенте плотности. Центрифугирование в градиенте плотности включает отделение лимфоцитов от образца крови в результате центрифугирования в градиенте фикола. Фикол позволяет проникать эритроцитам, но препятствует прохождению лимфоцитов. Мононуклеарные клетки периферической крови (лимфоциты и макроциты) собирали с поверхности раздела фикола/плазмы. Пролиферацию РВМС стимулировали с помощью ФГА и ингибировали дексаметазоном с использованием 10-кратных серийных разведений в диапазоне от 10^-6 до 10^-10 моль/л, т.е. 10^-6, 10^-7, 10^-8, 10^-9, 10^-10 моль/л. Клеточную пролиферацию оценивали по поглощению тритированного тимидина, т.е. после 2-дневной инкубации в среду для культивирования лимфоцитов добавляли меченый с помощью радиоактивного изотопа тимидин (³Н-тимид), который включался в ДНК размножающихся лимфоцитов. Через 6 ч клетки переносили из термостата и собирали на фильтровальную пластину с помощью харвестера клеток. Затем клетки отмывали от лунки. ДНК лимфоцитов, которая включала тимидин, накапливали на фильтровальной бумаге. При оценке уровней радиоактивности лунки содержащие большое количество активно размножающихся лимфоцитов (вследствие чего в ДНК должно быть включено большое количество тимидина), должны иметь высокие уровни радиоактивности. Поэтому уровни радиоактивности (количество импульсов в мин, cpm) использовали в качестве меры пролиферации лимфоцитов. Результаты рассчитывали как среднее значение импульсов в мин (cpm), полученное при использовании взятых в трех повторностях культур. Включение тимидина при использовании каждой из изученных концентраций дексаметазона сравнивали с включением тимидина в стимулированные ФГА Т-лимфоциты в отсутствии дексаметазона и выражали в виде процента относительно позитивного контроля, в котором не происходило ингибирование пролиферации. Оценивали также воздействие различных концентраций базиликсимаба на пролиферацию лимфоцитов. Кроме того, в каждую клеточную культуру добавляли концентрацию базиликсимаба, равную добавленной в эту среду концентрации дексаметазона, и оценивали антипролиферативное действие.

Воздействие SIMULECT® на пролиферацию лимфоцитов: концентрация базиликсимаба в сыворотке, равная 0,2 мг/л, приводила к оккупации >90% IL-2R. Для оценки антипролиферативного действия базиликсимаба in vitro лимфоциты инкубировали с различными концентрациями базиликсимаба, составляющими от 0,01 до 10 мг/л, в отсутствии стероидов. Эти анализы подтвердили, что для проявления действия базиликсимаба in vitro необходимы концентрации базиликсимаба от >0,1 до 0,3 мг/л. Для дополнительной оценки, проводимой на этих же пациентах, применяли концентрацию 1 мг/л. В целом каждый эксперимент проводили на одних и тех же 8 пациентах. Действие базиликсимаба в концентрации 1 мг/л в отношении индуцированной ФГА клеточной пролиферации в отсутствии стероидов представлено в таблице 1.

Таблица 1
Пациент	1	2	3	4	5	6	7	8	Среднее значение
Только ФГА (cpm)	38634	25228	40829	32561	45441	66157	28886	36990	39341
ФГА+базил иксимаб (cpm)	21827	15157	27239	27538	21446	35003	16122	27209	23943
ингибирование (%)	43,5	39,9	33,3	15,4	52,8	47,1	44,2	26,4	37,8

Таким образом, добавление базиликсимаба вызывало в среднем 37,8%-ное ингибирование в отсутствии стероидов. Однако у изученных пациентов, страдающих неспецифическим язвенным колитом, уровень ингибирования все еще коррелировал со слабой клинической реакцией (<60%).

Воздействие SIMULECT^® на чувствительность к стероидам:

Стимулированные ФГА лимфоциты, полученные из крови всех 8 включенных в эксперимент человек, культивировали в присутствии возрастающих концентраций дексаметазона (10^-10-10^-6 моль/л) в присутствии базиликсимаба (1 мг/л) или без него. В предыдущих исследованиях неспецифического язвенного колита, проведенных заявителями, установлено, что максимальное подавление (I_max)<60% коррелировало со слабой реакцией на стероидную терапию (клиническая устойчивость к стероидам). Точное значение I_max нельзя оценить из-за того, что для этого ингибирование следует определять при использовании очень высокой дозы дексаметазона. Поэтому в качестве величины I_max использовали процент ингибирования пролиферации, наблюдаемый при максимальной примененной концентрации дексаметазона (10^-6 моль/л). На практике обнаружено, что существует хорошее соответствие между значением I_max и рассчитанным асимптотическим значением максимального ингибирования, полученного из графиков зависимости реакции от дозы (Hearing S.D. и др., Clin. Endoctrinol. Metab, 84, 1999, сс.4149-4154). Концентрация дексаметазона, составляющая 10^-7 моль/л, примерно эквивалентна с точки зрения активности глюкокортикоида концентрациям в сыворотке гидрокортизона, которые достигаются при его внутривенном введении в стандартных дозах. Так, для целей сравнения с потенциальным действием базиликсимаба in vivo интерес может представлять также оценка повышающего чувствительность к стероидам действия базиликсимаба при использовании указанной концентрации дексаметазона (Дек). Данные анализа пролиферации лимфоцитов для каждого участника эксперимента обобщены в таблице 2, в которой представлено действие базиликсимаба (Баз) в отношении ЛЧС. Участники эксперимента размещены по степени снижения чувствительности к стероидам (наиболее чувствительные расположены слева).

Таблица 2
Пациент	1	2	3	4	5	6	7	8
Только ФГА (cpm)	38634	25229	40829	32562	45442	66157	28887	36991
ФГА+Дек 10-6 (cpm)	3100	4109	9477	11568	21685	36495	18669	24681
РНА + Баз + Дек 10-6	639	4533	3059	3801	3563	6910	3352	5924
Imax (Дек) (%)	92	84	77	64	52	45	35	33
Imax (Дек + Баз) (%)	98	82	93	88	92	90	88	84
% подавления Дек 10-7	87	79	65	42	20	32	29	36
% подавления Дек 10-7+Баз	98	84	88	83	87	83	86	81
Чувствительный к стероидам (SS) или Устойчивый к стероидам (SR)	SS	SS	SS	SS	SR	SR	SR	SR

Четыре участника эксперимента оказались чувствительными к стероидам (I_max>60%; пациенты 1-4) и четыре оказались устойчивыми к стероидам (I_max<60%; пациенты 5-8). При анализе воздействия на I_max установлено, что у всех устойчивых к стероидам пациентов ЛЧС модулировалась базиликсимабом и они все приобретали чувствительность к стероидам. Кроме того, обнаружено также воздействие дексаметазона в концентрации 10^-7 моль/л на % подавления лимфоцитов.

Изменение базиликсимабом чувствительности лимфоцитов к стероидам аналогичным образом можно применять для изменения чувствительности к стероидам устойчивых к стероидам пациентов, страдающих аутоиммунным гепатитом, астмой, экземой, васкулитом, темпоральным артериитом, системной красной волчанкой, лейкозом, гломерулонефритом, рассеянным склерозом, саркоидом и болезнью Крона, а также при всех указанных состояниях, поскольку слабая реакция на стероидную терапию, вероятно, связана с устойчивостью к стероидам лимфоцитов. Модуляция чувствительности к стероидам с помощью базиликсимаба превращает устойчивые к стероидам лимфоциты в чувствительные к стероидам, что позволяет успешно лечить с помощью стероидов ранее нечувствительных к стероидной терапии пациентов. Кроме того, можно ожидать, что чувствительные к стероидам пациенты после обработки базиликсимабом при применении стероидной терапии будут быстрее на нее реагировать.

Пример 2

Лимфоциты периферической крови выделяли у 32 человек (25 здоровых добровольцев и 7 пациентов с неактивным неспецифическим язвенным колитом) (всего использовали 41 образца) с помощью центрифугирования в градиенте плотности. Чувствительность лимфоцитов к стероидам оценивали по антипролиферативному действию дексаметазона (Дек) в отношении стимулированных фитогемагглютинином лимфоцитов. Максимальное, вызванное стероидом, подавление выражали в виде % относительной пролиферации лимфоцитов в контроле (I_max). Значение I_max оценивали без базиликсимаба или в его присутствии (1 мг/л).

Добавление базиликсимаба существенно повышало антипролиферативное действие Дек (непараметрический ранговый критерий Вилкоксона, р<0,0001).

	Медиана Imax (%)	Внутриквартильный диапазон
Дексаметазон	78,0	66,1-86,4
Дексаметазон + Базиликсимаб	92,3	89,3-95,6

У всех 8 устойчивых к стероидам пациентов (I_max<60%) после добавления базиликсимаба изменилась (in vitro) чувствительность к стероидам. Таким образом, базиликсимаб обладает выраженной способностью усиливать действие стероидов in vitro.

1. Применение CD25-связывающей молекулы, содержащей по меньшей мере один антигенсвязывающий центр, который включает по меньшей мере один домен, содержащий последовательно расположенные гипервариабельные участки CDR1, CDR2 и CDR3; где CDR1 имеет аминокислотную последовательность Arg-Tyr-Trp-Met-His, CDR2 имеет аминокислотную последовательность Ala-Ile-Tyr-Pro-Gly-Asn-Ser-Asp-Thr-Ser-Tyr-Asn-Gln-Lys-Phe-Glu-Gly и CDR3 имеет аминокислотную последовательность Asp-Tyr-Gly-Tyr-Tyr-Phe-Asp-Phe; или ее непосредственные эквиваленты, предназначенные для предупреждения или лечения неспецифического язвенного колита и болезни Крона у устойчивого к стероидам пациента.

2. Применение по п.1, где непосредственный эквивалент представляет собой один домен CD25-связывающей молекулы (молекула X) (i) в котором гипервариабельные участки CDR1, CDR2 и CDR3, взятые в целом, гомологичны по меньшей мере на 80% аминокислотным последовательностям CDR1, CDR2 и CDR3, которые представлены в п.1, и (ii) который обладает способностью ингибировать связывание интерлейкина 2 (IL-2) с его рецептором практически в такой же степени, что и молекула, с которой проводится сравнение, имеющая каркасные участки, идентичные каркасным участкам молекулы X, но имеющая гипервариабельные участки CDR1, CDR2 и CDR3, идентичные аминокислотным последовательностям CDR1, CDR2 и CDR3, которые представлены в п.1.

3. Применение по п.2, где гипервариабельные участки CDR1, CDR2 и CDR3, взятые в целом, гомологичны по меньшей мере на 90% аминокислотным последовательностям CDR1, CDR2 и CDR3, которые представлены в п.1.

4. Применение по п.2, где гипервариабельные участки CDR1, CDR2 и CDR3, взятые в целом, гомологичны по меньшей мере на 95% аминокислотным последовательностям CDR1, CDR2 и CDR3, которые представлены в п.1.

5. Применение по п.1, где CD25-связывающая молекула дополнительно содержит по меньшей мере один антигенсвязывающий центр, включающий: а) первый домен, содержащийся в последовательности гипервариабельных участков CDR1, CDR2 и CDR3, которые представлены в п.1, (б) второй домен, содержащийся в последовательности гипервариабельных участков CDR1', CDR2' и CDR3', где CDR1' имеет аминокислотную последовательность Ser-Ala-Ser-Ser-Ser-Ile-Ser-Tyr-Met-GIn, CDR2' имеет аминокислотную последовательность Asp-Thr-Ser-Lys-Leu-Ala-Ser и CDR3' имеет аминокислотную последовательность His-Gln-Arg-Ser-Ser-Tyr-Thr; и ее непосредственные эквиваленты.

6. Применение по п.5, где прямой эквивалент является CD25-связывающей молекулой, которая несет по меньшей мере два домена в связывающем центре (молекула X') (i) в котором гипервариабельные участки CDR1, CDR2 и CDR3, взятые в целом, гомологичны по меньшей мере на 80% аминокислотным последовательностям CDR1, CDR2 и CDR3, которые представлены в п.1, и гипервариабельные участки CDR1', CDR2' и CDR3', взятые в целом, гомологичны по меньшей мере на 80% аминокислотным последовательностям CDR1', CDR2' и CDR3', которые представлены в п.5, и (ii) которая обладает способностью ингибировать связывание IL-2 с его рецептором практически в такой же степени, что и молекула, с которой проводится сравнение, имеющая каркасные участки, идентичные каркасным участкам молекулы X', но имеющая гипервариабельные участки CDR1, CDR2 и CDR3, идентичные аминокислотным последовательностям CDR1, CDR2 и CDR3, которые представлены в п.1, и гипервариабельные участки CDR1', CDR2' и CDR3', идентичные аминокислотным последовательностям CDR1', CDR2' и CDR3', которые представлены в п.5.

7. Применение по п.6, где гипервариабельные участки CDR1, CDR2 и CDR3, взятые в целом, гомологичны по меньшей мере на 90% аминокислотным последовательностям CDR1, CDR2 и CDR3, которые представлены в п.1, и где гипервариабельные участки CDR1', CDR2' и CDR3', взятые в целом, гомологичны по меньшей мере на 90% аминокислотным последовательностям CDR1', CDR2' и CDR3', которые представлены в п.5.

8. Применение по п.6, где гипервариабельные участки CDR1, CDR2 и CDR3, взятые в целом, гомологичны по меньшей мере на 95% аминокислотным последовательностям CDR1, CDR2 и CDR3, которые представлены в п.1, и где гипервариабельные участки CDR1', CDR2' и CDR3', взятые в целом, гомологичны по меньшей мере на 95% аминокислотным последовательностям CDR1', CDR2' и CDR3', которые представлены в п.5.

9. Применение по п.1, где CD25-связывающая молекула является химерным антителом к CD25, которое содержит по меньшей мере

(а) одну тяжелую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, включающую (i) вариабельный домен, содержащийся в последовательности гипервариабельных участков CDR1, CDR2 и CDR3, которые представлены в п.1, и (ii) его константную часть или ее фрагмент человеческой тяжелой цепи и

(б) одну легкую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, включающую (i) вариабельный второй домен, содержащийся в последовательности гипервариабельных участков CDR1', CDR2' и CDR3', и (ii) константную часть или ее фрагмент человеческой легкой цепи, где CDR1' имеет аминокислотную последовательность Ser-Ala-Ser-Ser-Ser-Ile-Ser-Tyr-Met-Gln, CDR2' имеет аминокислотную последовательность Asp-Thr-Ser-Lys-Leu-Ala-Ser и CDR3' имеет аминокислотную последовательность His-Gln-Arg-Ser-Ser-Tyr-Thr; и ее непосредственные эквиваленты.

10. Применение по п.1, где CD25-связывающая молекула представляет собой базиликсимаб или даклизумаб.

11. Применение по п.1, где CD25-связывающая молекула применяется в сочетании со стероидом или другим лекарственным средством, выбранным из циклоспорина, рапамицина, аскомицина, кортикостероида, циклофосфамида, азатиопрена, метотрексата, соли золота, сульфасалазина, противомалярийного средства, бреквинара, лефлуномида, мизорибина, микофенольной кислоты, микофенолята мофетила, 15-дезоксиспергуалина, иммуносупрессорного моноклонального антитела, их лиганды или иммуномодулятора.

12. Применение по п.11, где другое лекарственное средство выбирают из циклоспорина А, циклоспорина G, сиролимуса, эверолимуса, преднизона, FK-506, рапамицина, микофенольной кислоты, микофенолята мофетила, 15-дезоксиспергуалина, моноклонального антитела к рецептору лейкоцитов, их лиганды и CTLA4Ig.

13. Применение по п.12, где моноклинальное антитело представляет собой моноклональное антитело к CD28, CD40 или их смесь.

14. Применение CD-связывающей молекулы по любому из пп.1-10 для повышения чувствительности лимфоцитов к стероидам у пациента.

15. Применение по п.14 для повышения чувствительности лимфоцитов к стероидам у устойчивого к стероидам пациента.