Способ прогнозирования развития клинической формы цистного эхинококкоза у детей

Настоящее изобретение относится к диагностическим методам в медицинской паразитологии. Предложенный способ прогнозирования развития клинической формы цистного эхинококкоза у детей заключается в том, что из лимфоцитов периферической венозной крови выделяют ДНК, проводят генотипирование полиморфизма Ile462Val 7 экзона гена CYP1A1, кодирующего фермент цитохром Р450. При обнаружении в генотипе аллеля Val прогнозируют риск развития цистного эхинококкоза у обследуемого. Использование изобретения дает возможность прогнозировать цистный эхинококкоз с высокой точностью.

 

Предлагаемое изобретение относится к медицине, а именно к медицинской паразитологии, и может быть использовано для выявления групп риска к заболеванию цистным эхинококкозом детей.

Цистный эхинококкоз (ЦЭ) - широко распространенное в мире тяжелое зооантропонозное заболевание, характеризующееся развитием кист в печени, легких, селезенке и других органах. Ключевым звеном патогенеза ЦЭ является проникновение онкосфер Е. granulosus в организм человека, однако клиническая реализация инвазии, ее последующее течение, развитие осложнений зависят от предрасполагающих факторов, многие из которых генетически детерминированы (Озерецковская Н.Н. Цестодозы-зоонозы - неотложная глобальная проблема. // Мед. паразитол. и пар. болезни. 2001. С.52-59). К числу наиболее актуальных аспектов проблемы профилактики эхинококкозов относятся вопросы своевременного выявления предрасполагающих факторов, среди которых наиболее важными являются эндогенный фон и неблагоприятное воздействие компонентов окружающей среды.

Имеется немало доказательств того, что люди значительно чаще заражаются эхинококкозом, чем заболевают ее клинической формой (абортивная форма заболевания развивается в 99% случаев). Известны случаи бессимптомного течения эхинококковой болезни или со слабо выраженными симптомами невыявленного эхинококкоза, которые заканчиваются полным выздоровлением (Тумольская Н.И. Клинические аспекты проблемы эхиноккозов и пути се решения // Мед паразитол. 1992. №5-6. С.5-9.). Биологическая сущность этих явлений пока только начинает изучаться.

Исследования показали, что интенсивность инвазии в очаге определяется в большой степени особенностями индивидуальной восприимчивости к заболеванию. В этой связи особую актуальность представляет определение прогностических критериев среди генетических маркеров риска.

К числу возможных генетических маркеров относятся гены биотрансформации ксенобиотиков, контролирующих процессы обезвреживания и выведения из организма экзо- и эндотоксикантов. Биотрансформация ксенобиотиков в классическом варианте представлена 3-этапным процессом. Первый этап - фаза 1 обеспечивается ферментами суперсемейства цитохромов Р450, локализованными в основном в мембранах эндоплазматического ретикулума клеток печени и легких (Баранов B.C., Баранова Е.В., Иващенко Т.Э., Асеев М.В. Геном человека и гены «предрасположенности». // СПб. - 2000. - 272 с.). Цитохром CYP1A1 участвует в биотрансформации многих лекарств, метаболизме полиароматических углеводородов, в том числе и некоторых канцерогенов. Гены, контролирующие синтез цитохромов Р450, отличаются значительным полиморфизмом. Генный (мутационный) полиморфизм CYP1A1 обусловлен однонуклеотидной транзицией (A-G) 7 экзона (A4889G), сопровождающейся аминокислотной заменой изолейцина (Ile) на валин (Val) в 462 кодоне молекулы цитохрома Р450. Согласно данным литературы появление аллеля Val, приводит к повышению активности и индуцибельности фермента, что может вызвать увеличение в организме концентрации промежуточных, часто токсических метаболитов (Баранов B.C., Баранова Е.В., Иващенко Т.Э., Асеев М.В. Геном человека и гены «предрасположенности». // СПб. - 2000. - 272 с.). Встречается у 7% европеоидов, среди населения Республики Башкортостан частота его составляет 4-8% (Янбаева Д.Г., Корытина Г.Ф., Загидуллин Ш.З., Викторова Т.В. Полиморфизм генов биотрансформации ксенобиотиков и антиоксидантной защиты. // Молекулярная медицина. - 2005. - №2. - С.58-64.).

Известен способ выявления эхинококкоза по серологическим реакциям (РЛА, РНГА, ELISA и др.), дополненный инструментальными методами (УЗИ, КТ, МРТ). Чувствительность, специфичность, разрешающая способность этих исследований недостаточна для выявления ранних стадий развития ларвоцист (Ахмедов И.Г., Османов А.О. // Хирургия, 2002, №9, с.28).

Таким образом, разработанные в настоящее время клинические, иммунологические, инструментальные методы не позволяют достоверно прогнозировать развитие эхинококковых кист, поскольку имеют следующие недостатки:

- отсутствие диагностических маркеров болезни на ранних этапах развития патологии из-за разнообразия клинических проявлений;

- недостаточно эффективные инструментальные методы при выявлении мелких кист;

- недостаточно чувствительные серологические реакции;

Авторами в научно-медицинской и патентной литературе не обнаружено сведений об известности способа прогнозирования кист у инвазированных эхинококком детей.

Нами выявлено, что среди детей, больных эхинококкозом, значительна доля лиц носителей полиморфной аллели Val гена CYP1A1 (χ2=14,21; р=0,001, OR=6,81).

Таким образом, генетическое тестирование полиморфизма Ile462Val 7 экзона гена CYP1A1 детей инвазированных эхинококком, позволяет с большой вероятностью (OR=6,81) прогнозировать возможность клинической манифестации до появления первых симптомов болезни.

Метод доступен по реактивам и оборудованию.

Техническим результатом изобретения является получение критериев прогнозирования развития клинической формы эхинококкоза у детей на основе выявления молекулярно-генетических маркеров.

Способ осуществляется следующим образом.

Материалом для исследования служат образцы ДНК, выделенные из лимфоцитов периферической венозной крови у больных эхинококкозом детей методом фенольно-хлороформной экстракции, описанным Mathew C.C. (The isolation of high molecular weight eucariotic DNA // Methods in Molecular Biology / Ed. J.M. Walker. - New York., London. - 1984. - Vol.2. - P.31-34).

1. Кровь в пробирке с консервантом тщательно перемешивают и переливают в центрифужный стакан на 100 мл, туда же добавляют 50 мл охлажденного лизирующего буфера, содержащего 320 мМ сахарозы, 1% раствор тритона Х-100, 5 мМ MgCl₂, 10 мМ трисHCl (pH 7,6).

2. Смесь центрифугируют 20 мин при 4000 об/мин.

3. Надосадочную жидкость сливают, к получившемуся осадку приливают 8 мл 25 мМ ЭДТА, pH 8.0, суспендируют.

4. К суспензии добавляют 0,8 мл 10% SDS и протеиназу К (концентрация - 10 мг/ мл). Смесь для лизиса оставляют на ночь в термостате при температуре 38°С.

Экстракцию ДНК осуществляют в следующем порядке.

1. Для депротеинизации к лизату добавляют 0.5 мл 5М перхлората натрия и 8 мл фенола, насыщенного 1 М трисHCl до pH 7,8.

2. Смесь центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин.

3. Отбирают водную фазу, содержащую ДНК, РНК и не денатурированные белки.

4. Отобранную фазу обрабатывают смесью фенол-хлороформа (1:1), а затем - хлороформом.

5. Препараты осаждают двумя объемами 96% этанола.

6. Образовавшийся осадок ДНК растворяют в 1,5 мл деионизированной Н₂O; раствор хранят при 20°C.

В дальнейшем полученную ДНК используют в качестве матрицы полимеразной цепной реакции (ПЦР) для амплификации нужного фрагмента.

Анализ полиморфизма Ile462Val 7 экзона гена CYP1A1 проводят методом ПЦР/ПДРФ (полиморфизм длин рестрикционных фрагментов) с использованием локусспецифических олигонуклеотидных праймеров (El-Zein R., Zwischenberger J.B., Wood Т.О., Abdel-Rahman S.Z., Brekelbaum C., Au W.W. Combined genetic polymorphism and risk for development of lung cancer // Mutat. Res. - 1997. - Vol.381. - N 2 - P.189-200):

F. 5'GAACTGCCACTTGAGCTGTCT3' и

R. 5'GAAAGACCTCCCAGCGGTCA3'.

Схема ПЦР следующая. Реакционная смесь содержит 2,5 мкл 10×ПЦР-буфера (60 мМ Tris-HCl pH 8.5), 1,5 мМ MgCl₂, 25 мМ KCl, 10 мМ 2-меркаптоэтанола; 0.1% тритон Х-100), 1 мкл смеси 5 мМ каждого dNTP, по 1 мкл соответствующих праймеров, примерно 200 нг геномной ДНК, 1 ед. Taq-полимеразы с добавлением деионизированной воды до объема 25 мкл.

После амплификации ПЦР-продукты подвергают гидролизу эндонуклеазой рестрикции HincII в стандартных условиях. Фрагменты ДНК разделяют электрофоретически в 7-8% ПААГ, окрашивают раствором бромида этидия и анализируют в проходящем ультрафиолетовом свете на трансиллюминаторе. Анализ полиморфизма Ile462Val 7 экзона гена CYP1A1 выполняют в стандартных условиях по ранее описанной методике (El-Zein R., Zwischenberger J.B., Wood Т.G., Abdel-Rahman S.Z., Brekelbaum C., Au W.W. Combined genetic polymorphism and risk for development of lung cancer // Mutat. Res. - 1997. - Vol.381. - N 2 - P.189-200). При наличии генотипа lie/lie формируются фрагменты размером 139 и 48 пар нуклеотидов (п.н.); при генотипе Ile/Val формируются фрагменты 139, 120, 48 и 19 п.н.; при генотипе Val/Val формируются фрагменты 120, 48 и 19 п.н.

Для количественной оценки предрасположенности к развитию эхинококкоза для вышеуказанного генетического маркера мы вычислили показатель относительного риска (relative ratio - RR) и соотношения шансов (odds ratio - OR). Для этого использовали формулу, предложенную Бландом (Bland, J.M. The odds ratio / J.M.Bland, D.G.Altman // Br. Med. J. - 2000. - Vol.320. - P.1468):

OR=(a×d)/(b×c)

где a - число лиц с наличием, b - с отсутствием маркера (аллеля Val гена CYP1A1) среди больных эхинококкозом; c и d - число лиц соответственно с наличием и отсутствием маркера среди здоровых индивидов. Повышенный риск развития констатировали при OR>1, RR>2.

Нами были исследованы дети (N=72), больные цистным эхинококкозом. Возраст пациентов - от 4 до 16 лет. Основную долю обследованных лиц составили дети школьного (69%) возраста. По половому составу распределение было следующим: 57% мальчики, 43% девочки. Поражение печени наблюдалось у 48% пациентов, легкого - 28%, сочетанное поражение легкого и печени - 23%. Установлено, что распределение частот генотипов гена CYP1A1 у больных эхинококкозом существенно отличалось от контроля. При изучении полиморфизма A-G гена CYP1A1 у больных ЦЭ выявлено, что частота встречаемости гомозигот Ile/Ile составляет 73,5% (в контроле 95,2%), гетерозигот Ile/Val составляет - 22,3% (в контроле 4,0%), гомозигот Val/Val - 4,2% (в контроле 0,5%). Частота носителей аллеля Val составляет 26,5%, в 4 раза больше чем в контроле (χ2=14,21; OR=6,81; p=0,001). Показатель относительного риска развития эхинококкоза для лиц носителей аллеля Val гена CYP1A1 оказался равным RR=2,21.

Полученные результаты показывают, что наличие полиморфного аллеля Val гена CYP1A1 в генотипе является предрасполагающим фактором к развитию клинической формы цистного эхинококкоза у детей, поэтому его можно использовать в качестве генетического маркера риска.

Пример 1. У девочки З., 5 лет при массовом обследовании методом ИФА (иммуноферментный анализ) выявлена положительная реакция. Проведено исследование по предложенной методике. Установлено: является носителем аллеля Val гена CYP1A1. В отношении развития эхинококковых кист прогноз неблагоприятный.

После обследования (УЗИ, КТ) выявлена эхинококковая киста печени, малых размеров.

Пример 2. У девочки М., 7 лет, брат поступил в хирургическое отделение с диагнозом: эхинококковая киста правого легкого. Девочке проведено исследование по предложенной методике. Установлено: является носителем генотипа Ile/Ile гена CYP1A1. В отношении развития эхинококковых кист прогноз благоприятный.

Через год проведено исследование УЗИ. Признаков развивающейся кисты эхинококка у пациентки не обнаружено.

Способ прогнозирования развития клинической формы цистного эхинококкоза у детей, характеризующейся тем, что из лимфоцитов периферической венозной крови выделяют ДНК, проводят генотипирование полиморфизма Ile462Val 7 экзона гена CYP1A1, кодирующего фермент цитохром Р450, и при обнаружении в генотипе аллеля Val прогнозируют риск развития цистного эхинококкоза у обследуемого.