Способ хранения плазмы или сыворотки крови для получения иммуноглобулиновых и альбуминовых биопрепаратов

Изобретение относится к биологической и медицинской промышленности, в частности к технологии хранения и обработки плазмы или сыворотки крови, предназначенной для получения иммуноглобулиновых, альбуминовых и других биопрепаратов крови. Способ заключается в том, что нативную плазму или сыворотку крови обрабатывают химическими реагентами: последовательно вносят фенол до его конечной концентрации (0,7±0,2)%, выдерживают в течение 5 суток при температуре (10±2)°С и затем добавляют сульфат аммония до концентрации 50% от насыщения, полученную суспензию белков хранят при температуре (10±2)°С и избирательно переводят в иммуноглобулиновые и альбуминовые полуфабрикаты путем центрифугирования сульфатных суспензий, с целью раздельного получения осадков иммуноглобуоинов и альбуминов осадки экстрагируют в 1-2% растворе хлорида кальция, малорастворимый сульфат кальция удаляют центрифугированием и целевые белки из надосадочного раствора переосаждают полиэтиленгликолем-6000. Изобретение позволяет хранить плазму или сыворотку крови при 10±2°С без денатурации иммуноглобулинов и альбуминов и на основе ресурсосберегающих подходов, исключающих низкотемпературный режим в процессе хранения, и без использования дорогостоящего оборудования и комплектующих для удаления примесей технологических реагентов, обеспечивающих стабилизацию белков и инактивацию инфекционных агентов. 1 з.п. ф-лы, 2 табл., 1 ил.

 

Изобретение относится к биологической или медицинской промышленности, в частности к технологии хранения плазмы или сыворотки крови, предназначенной для производства иммуноглобулиновых и альбуминовых биопрепаратов.

Хранение плазмы (сыворотки) крови для производства биопрепаратов медицинского, ветеринарного назначения в зависимости от сроков использования сырьевой заготовки регламентировано температурным режимом: от (-20)°С до (-30)°С (сборник «Препараты крови. Инструктивно-методические материалы по контролю и производству» Под редакцией Буренкова С.П., Изд-во Москва, 1976, стр.203-218; Русанов В.Н., Скобелев Л.И. «Фракционирование белков плазмы в производстве препаратов крови». - М.: Медицина, 1983, стр.49-83; Инструкция по фракционированию консервированной крови на клеточные компоненты и плазму. - М.: МЗ СССР, 1987; Приказ министерства здравоохранения РФ от 7 мая 2003 года №193).

За счет быстрого замораживания плазмы (сыворотки) крови до температуры (-35)°С-(-40)°С или (-196)°С возможно увеличить сроки их хранения в замороженном состоянии без потери физиологической активности белков (патент RU №2151617, А61М 1/38, опубл. 27.06.2000; Чардт Т., Радиоиммунологические методы, М.: Мир, 1981, стр.48).

Недостатком известных способов хранения является их энергозатратность и зависимость от бесперебойного энергообеспечения. В случае сбоев с подачей электроэнергии замороженные образцы подвергаются оттаиванию и последующей заморозке, что оказывает неблагоприятное денатурирующее воздействие на структуру-функцию белков, в частности, на активность и специфичность антител.

Задача изобретения состоит в создании способа хранения плазмы (сыворотки) крови при температуре (10±2)°С без денатурации иммуноглобулинов и альбуминов и на основе ресурсосберегающих подходов, исключающих низкотемпературный режим в процессе хранения, и без использования дорогостоящего оборудования и комплектующих для удаления примесей технологических реагентов, обеспечивающих стабилизацию белков и инактивацию инфекционных агентов.

Поставленная задача решается тем, что в способе хранения плазмы или сыворотки крови для получения иммуноглобулиновых и альбуминовых биопрепаратов путем воздействия химическими реагентами в качестве химических реагентов используют фенол и сульфат аммония, при этом воздействие осуществляют последовательным введением фенола и сульфата аммония, полученную суспензию с иммуноглобулинами в осадке и альбумином в надосадочной жидкости хранят при температуре (10±2)°С, затем избирательно переводят в полуфабрикаты для получения биопрепаратов иммуноглобулинов и альбумина.

Фенол вводят до его конечной концентрации (0,7±0,2)% в заготовке плазмы или сыворотки крови и выдерживают в течение 5 суток.

Сульфат аммония вносят до концентрации 50% от насыщения.

Перевод в полуфабрикаты для получения биопрепаратов иммуноглобулинов и альбумина осуществляют путем экстракции осадков целевых белков раствором хлорида кальция и переосаждением их из растворов полиэтиленгликолем.

Перевод в полуфабрикаты для получения биопрепаратов иммуноглобулинов и альбумина осуществляют на любом сроке хранения в течение 12 месяцев.

Изложенный подход апробирован при хранении донорской плазмы (сыворотки) крови человека, боенской плазмы (сыворотки) крови сельскохозяйственных животных (крупный и мелкий рогатый скот, свинья), мелких домашних животных и пушных зверей из семейства псовых и куньих.

Из анализа уровня техники следует, что фенол используется для инактивации вирусов и бактерий (Avram N., Paunescu GH., Gradinary D., et al. La resistance du virus de la leucose bovine (VLB) a certains agents physiques et chimiques/Bull. Acad. Sc. Agr. Forest, 1980, 10, p.205-209.; Европейская заявка №0281978 «Инактивирование вируса СПИД в содержащих белок растворах при помощи фенола». Опубликовано РЖ ИСМ 44-65-89; А.П.Красильников «Справочник по антисептике», Минск, «Вышейшая школа», 1995, стр.122-123). Известны также условия применения сульфата аммония с целью получения фракций плазмы (сыворотки) крови, обогащенных иммуноглобулинами или альбумином, в т.ч. технические трудности, обусловленные удалением из состава фракций фенола и сульфата аммония (Н. Suomela. An Ion Exchange Method for Immunoglobulin G production. In: Methods of Plasma Protein Fractionation / Ed. J.M. Curling / Academic Press, London, UK, 1980, pp.107-116.; P.K. Скоупс. Методы очистки белков. - М.: Мир, 1985. - 358 стр.; А.И. Черкасов, В.А. Пасечник. Мембраны и сорбенты в биотехнологии. - Л.: Химия, 1991. - 240 с.). Однако использование указанных реагентов для обеспечения надлежащего хранения плазмы (сыворотки) крови и нехроматографическое удаление их осаждением и переосаждением целевых белков в процессе формирования полуфабрикатов для производства иммуноглобулиновых или альбуминовых биопрепаратов на современном этапе развития уровня техники не известны.

Помимо прямого энергосберегающего эффекта, связанного с исключением низкотемпературного режима хранения, в техническом решении изобретения реализован и ресурсосберегающий эффект на стадии удаления низкомолекулярных технологических примесей. Перевод фенольно-сульфатной суспензии в полуфабрикаты осуществляют с помощью нехроматографических методов фракционирования. Удаление примесей SO₄ ^2- за счет формирования малорастворимого CaSO₄ в процессе экстракции осадков раствором хлорида кальция и переосаждение целевых белков с помощью полиэтиленгликоля (ПЭГ-6000) успешно заменяет известные и дорогостоящие приемы типа гель-фильтрации или ультрадиафильтрации на полых волокнах.

Способ осуществляется следующим образом.

В плазму (сыворотку) крови человека и указанных ранее животных вносят 40% раствор фенола в глицерине до его конечной концентрации (0,7±0,2)%. После экспозиции в течение 5 суток в обработанную фенолом плазму добавляют сухой сульфат аммония до 50%-ной концентрации от насыщения. Полученную таким образом фенольно-сульфатную суспензию хранят при температуре (10±2)°C и используют для производства биопрепаратов в течение 12 месяцев. Для использования в технологическом процессе фенольно-сульфатную суспензию подвергают последовательному центрифугированию, в условиях избирательного осаждения фракций, обогащенных иммуноглобулинами и альбумином. При экстракции осадков в 1-2%-ном растворе хлорида кальция центрифугированием удаляют малорастворимый сульфат кальция, а целевые белки переосаждают с помощью ПЭГ-6000. Растворы конечных осадков обладают заданными характеристиками для дальнейшего их фракционирования и производства иммуноглобулиновых или альбуминовых биопрепаратов либо с помощью хроматографических подходов, либо с помощью нехроматографических технологий на основе этанола, риванола или каприловой кислоты.

Примеры конкретного выполнения способа хранения донорской или боенской плазмы (сыворотки) крови для производства иммуноглобулиновых или альбуминовых биопрепаратов

В промышленном варианте к плазме (сыворотке) крови человека или животных постепенно при постоянном перемешивании механической мешалкой якорного типа со скоростью 60-70 об/мин добавляют 40%-ный раствор фенола в глицерине до его конечной концентрации (0,7±0,2)%. В лабораторном варианте для перемешивания используют магнитную мешалку типа ММ-5. Обработанную фенолом плазму (сыворотку) крови выдерживают при температуре (10±2)°С в течение 5 суток. После чего добавляют сухой сульфат аммония квалификации «хч» или «чда» из расчета 300 г порошка на 1 литр плазмы (сыворотки) крови. Порошок добавляют порционно при перемешивании ранее указанным способом, дополнительное перемешивание ведут еще 1,5-2 часа после полного растворения внесенного реагента. Под действием сульфата аммония уже через 2 часа формируется осадок и надосадочный раствор, обогащенные соответственно иммуноглобулинами и альбумином. Видовые фенольно-сульфатные суспензии плазмы (сыворотки) крови хранят при температуре (10±2)°С и используют в течение 12 месяцев для производства полуфабрикатов иммуноглобулинов и альбуминов.

Для получения полуфабриката иммуноглобулина фенольно-сульфатную суспензию подвергают центрифугированию. В лабораторных условиях используют центрифугу с охлаждением: 3000 об/мин, 30 минут, при температуре (+10)°С. В промышленном варианте центрифугирование с охлаждением осуществляют на проточной центрифуге типа ОТР при 15000 об/мин и скорости потока 60-70 литров/час. Сульфатный осадок в лабораторных условиях суспендируют в 1%-ном растворе хлорида кальция в объеме 1/10 от исходного объема плазмы (сыворотки) крови. В промышленном варианте собранный на проточной центрифуге осадок экстрагируют в трех объемах (вес/объем) 2%-ного раствора хлорида кальция. Перемешивание осуществляют в течение 2 часов ранее указанным образом. Малорастворимый осадок сульфата кальция удаляют центрифугированием. К центрифугату добавляют ПЭГ-6000, который вносят в объемно-весовом соотношении до конечной концентрации 15%. Внесение реагента ведут при постоянном перемешивании указанным ранее образом. По истечении дополнительных 1,5-2 часов после полного растворения ПЭГ-6000 суспензию центрифугируют, как указано ранее. Осадок представляет собой полуфабрикат для использования его в дальнейших стадиях производства иммуноглобулиновых биопрепаратов. Надосадочная жидкость является дополнительным источником при производстве альбуминового полуфабриката.

Для получения полуфабриката альбумина к надосадочной жидкости, полученной после центрифугирования фенольно-сульфатной суспензии, вносят сухой сульфат аммония указанной квалификации из расчета 100 г порошка на 1 литр центрифугата. Перемешивают, как указано ранее, до полного растворения реагента. С помощью 1 моль/л соляной или уксусной кислоты устанавливают рН инкубационной среды в пределах (4,7±0,1). Величину рН контролируют общепринятым способом, разводя пробу инкубационной среды в 25 раз с помощью дистиллированной воды. После дополнительного перемешивания в течение 1,5-2 часов сформировавшуюся суспензию центрифугируют. Сульфатный осадок экстрагируют при постоянном перемешивании в 5 объемах (1-2)%-ного раствора хлорида кальция в зависимости от масштабов (лабораторная и промышленная) схемы производства. Экстрагирование ведут при рН (6,8±0,2), контролируя рН, как указано ранее, с помощью защелачивания 1 моль/л раствором гидроксида кальция. После доведения рН перемешивание продолжают еще 1,5-2 часа и затем малорастворимый осадок удаляют центрифугированием. Надосадочную жидкость, полученную на данной стадии, объединяют с надосадочной жидкостью, полученной на стадии осаждения иммуноглобулинов ПЭГ-6000. Величину рН инкубационной среды доводят, как указано ранее, до значений (4,6±0,1) и добавляют сухой ПЭГ-6000, который вносят в объемно-весовом соотношении до конечной концентрации 20%. После дополнительного перемешивания в течение 1,5-2 часов суспензию центрифугируют для получения осадка альбумина.

В хроматографических схемах производства особое значение имеют рН, ионный состав и ионная сила буферных растворов целевых белков. Для достижения оптимального и наперед заданного состава растворов иммуноглобулинов и альбуминов полученные осадки растворяют в стартовых буферных растворах и переосаждают ПЭГ-6000.

На чертеже приведено распределение белков плазмы (сыворотки) крови при известной (37,5%) и предлагаемой (50%) концентрациях сульфата аммония. В таблице 1 в количественных критериях приводится перераспределение иммуноглобулинов и альбуминов между фракциями фенольно-сульфатной суспензии, а также титр антител в известном и предлагаемом способе хранения плазмы (сыворотки) крови. В таблице 2 представлены данные, характеризующие наиболее значимые характеристики полуфабрикатов иммуноглобулиновых и альбуминовых биопрепаратов.

Из приведенных на чертеже и в таблицах 1 и 2 данных следует, что в составе осадка фенольно-сульфатной суспензии регистрируется альбумин, а в надосадочном растворе IgG не обнаруживается. Уровни активности антител при хранении плазмы (сыворотки) крови известным способом и в форме фенольно-сульфатной суспензии характеризуются сходными величинами. В таблице 2 приведены характеристики полуфабрикатов иммуноглобулинов и альбуминов, необходимые для дальнейшего их фракционирования с целью производства конечных продуктов, в т.ч. установлено отсутствие бактериальной обсемененности и активности протеаз при хранении плазмы (сыворотки) крови в форме фенольно-сульфатной суспензии.

Таким образом, предложенный способ хранения плазмы (сыворотки) крови обладает выраженным ресурсосберегающим эффектом, в т.ч. не требует оборудования для замораживания плазмы (сыворотки) крови при транспортировке к месту их переработки. Фенольно-сульфатная суспензия сохраняет структуру-функцию белков иммуноглобулиновой и альбуминовой природы в течение 12 месяцев при температуре хранения (10±2)°С. Фракционный состав фенольно-сульфатной суспензии позволяет избирательно получать иммуноглобулиновые и альбуминовые полуфабрикаты для их дальнейшего фракционирования и производства биопрепаратов крови. При этом во фракционном составе фенольно-сульфатной суспензии имеет место увеличение % чистоты целевых белков, как правило, в 2 раза и более.

Таблица 1
Технологические параметры хранения плазмы (сыворотки) крови с целью производства иммуноглобулиновых и альбуминовых биопрепаратов различной видовой принадлежности
№ подпункта	Шифр сырьевой заготовки	Наименование фракции, обогащенной целевым белком	Содержание целевого белка в сформированных фракциях, %	Чистота целевого белка, %	Сохранение активности антител, %
Видовая принадлежность сырья	Способ хранения сырьевой заготовки
1	2	3	4	5	6	7
1	Крупный рогатый скот	Плазма (сыворотка) крови замороженная	В процессе хранения фракционирование не происходит	В процессе хранения фракционирование не происходит	32±7 и 40±10 соответственно для IgG и альбумина
		Фенольно-сульфатная суспензия плазмы (сыворотки) крови	Фракция, обогащенная IgG	100	55±5	100±20
Фракция, обогащенная альбумином	В объединенной фракции более 95	70±5
2	Мелкий рогатый скот: овцы, козы	Плазма (сыворотка) крови замороженная	В процессе хранения фракционирование не происходит	В процессе хранения фракционирование не происходит	33±10 и 40±10 соответственно для IgG и альбумина
		Фенольно-сульфатная суспензия плазмы (сыворотки) крови	Фракция, обогащенная IgG	100	50±5	100±20
Фракция, обогащенная альбумином	В объединенной фракции более 90	70±10
3	Свинья	Плазма (сыворотка) крови замороженная	В процессе хранения фракционирование не происходит	В процессе хранения фракционирование не происходит	21±4 и 50±5 соответственно для IgG и альбумина
		Фенольно-сульфатная суспензия плазмы (сыворотки) крови	Фракция, обогащенная IgG	100	50±10	100±20
Фракция, обогащенная альбумином	В объединенной фракции более 90	75±10
4	Животные из семейства псовых	Плазма (сыворотка) крови замороженная	В процессе хранения фракционирование не происходит	В процессе хранения фракционирование не происходит	10±2 и 60±8 соответственно для IgG и альбумина
		Фенольно-сульфатная суспензия плазмы (сыворотки) крови	Фракция, обогащенная IgG	100	50±10	100±20
Фракция, обогащенная альбумином	В объединенной фракции более 95	80±10
5	Животные из семейства куньих	Плазма (сыворотка) крови замороженная	В процессе хранения фракционирование не происходит	В процессе хранения фракционирование не происходит	10±2 и 51±4 соответственно для IgG и альбумина
		Фенольно-сульфатная суспензия плазмы (сыворотки) крови	Фракция, обогащенная IgG	100	50±15	100±25
Фракция, обогащенная альбумином	В объединенной фракции более 90	80±5
6	Человек	Плазма (сыворотка) крови замороженная	В процессе хранения фракционирование не происходит	В процессе хранения фракционирование не происходит	15±4 и 50±4 соответственно для IgG и альбумина
		Фенольно-сульфатная суспензия плазмы (сыворотки) крови	Фракция, обогащеннаяIgG	100	55±5	100±20
Фракция, обогащенная альбумином		90±10
Примечание: Содержание и % чистоты целевого белка в сформированных фракциях определяли с помощью электрофореза на ацетат-целлюлозе с последующим окрашиванием электрофореграмм, элюированием изолированных полос и фотометрированием окрашенных растворов в соответствии с требованиями МУК 4.1/4.2.588-96 «Методы контроля медицинских иммунобиологических препаратов, вводимых людям». Сохранение активности антител расчитывали как отношение их титров (после 12 месяцев хранения), выраженное в процентах: титр антител в образцах фенольно-сульфатной суспензии / титр антител в образцах плазмы (сыворотки) крови, хранившейся при температуре (-30)°С. Для выявления антител использовали наборы, основанные на традиционных и современных методах иммуноанализа: (а) Набор для выявления антител к вирусу лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС) методом иммуноферментного анализа (ИФА), НПО «Нарвак»; (б) Набор реагентов для выявления антител к цирковирусу свиней второго типа (ЦВС-2) иммуноферментным методом «Цирко-тест», НПО «Нарвак»; (в) Набор реагентов для выявления антител к вирусу классической чумы свиней иммуноферментным методом «КЧС-СЕРОТЕСТ», НПО «Нарвак»; (г) Набор специфических компонентов для диагностики болезни овец, вызываемой бруцеллой овис, ЦНПВЛ; (д) Набор антигена и контрольной сыворотки для серологической диагностики алеутской болезни норок в реакции иммуноэлектроосмофореза (диагностикума) РИОЭФ, ЗАО Фирма НПВ и ЗЦ Ветзвероцентр; (е) Тест-система иммуноферментная для выявления антител (IgG) к вирусу клещевого энцефалита, фирма «Вектор-Бест».

Таблица 2
Технологические параметры фенольно-сульфатной суспензии, сопряженного полуфабриката и нативной плазмы (сыворотки) крови
№ п/п	Показатели качества	Фенольно-сульфатная суспензия в процессе хранения	Полуфабрикаты для производства иммуноглобулиновых и альбуминовых биопрепаратов
Плазма (сыворотка) крови	Полуфабрикат из фенольно-сульфатной суспензии
1.	Бактериальная обсемененность	0	Боенская плазма (сыворотка) крови животных содержит как минимум 20 колоний на стандартную чашку Петри	Как правило, стерилен
2.	Активность трипсиноподобных протеаз	0	0.3-1,05 мкг×час/мл	Не определяли
3.	Электролитный (ионный) состав, в т.ч. рН и ионная сила		Величины рН, ионной силы, а также ионный состав плазмы (сыворотки) крови требуют оптимизации их количественных и качественных характеристик для проведения стадий фракционирования в технологии производства биопрепаратов	Содержание ПЭГ-6000 колеблется в пределах (15±5)%. В полуфабрикатах, подготовленных для хроматографического фракционирования, концентрация фенола и сульфата аммония составляет менее 0,001%
Примечание: Бактериальную обсемененность определяли по методу, рекомендованному Государственной фармакопеей, изд. XI, вып.2, стр.196; активность трипсиноподобных протеаз определяли по методу Т. Uete, M. Asahara, and H. Tsuchikura. A Fluorometric Determination of Trypsin-Like Amidase Activity and Activity of Trypsin Inhibitors in Serum. Clinical Chemistry, Vol. 16, No. 4, 1970.; концентрацию ПЭГ-6000 определяли в соответствии с требованиями ТУ 9382-001-43683877-03, сульфата аммония и фенола определяли в соответствии с требованиями МУК 4.1/4.2.588-96 "Методы контроля медицинских иммунобиологических препаратов, вводимых людям".

1. Способ хранения плазмы или сыворотки крови для получения иммуноглобулиновых и альбуминовых биопрепаратов, отличающийся тем, что нативную плазму или сыворотку крови обрабатывают химическими реагентами: последовательно вносят фенол до его конечной концентрации (0,7±0,2)%, выдерживают в течение 5 сут при температуре (10±2)°С и затем добавляют сульфат аммония до концентрации 50% от насыщения, полученную суспензию белков хранят при температуре (10±2)°С и избирательно переводят в иммуноглобулиновые и альбуминовые полуфабрикаты путем центрифугирования сульфатных суспензий с целью раздельного получения осадков иммуноглобулинов и альбуминов, осадки экстрагируют в 1-2%-ном растворе хлорида кальция, малорастворимый сульфат кальция удаляют центрифугированием и целевые белки из надосадочного раствора переосаждают полиэтиленгликолем-6000.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что избирательный перевод в полуфабрикаты для получения необходимого количества иммуноглобулинов и альбумина осуществляют на любом сроке хранения в течение 12 месяцев.