Способ определения активности перекисного окисления липидов в биологических тканях
Владельцы патента RU 2350956:
Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Смоленская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию (RU)
Изобретение относится к медицине и археологии и может быть использовано в судебной медицине для хемилюминесцентного анализа скелетированных трупов. Способ включает измельчение биологической ткани, экстракцию фосфатным буферным раствором, отделение экстракта с последующим проведением его хемилюминесцентного анализа, при этом исследуют костную ткань скелетированных трупов, которую измельчают механическим способом, высушивают при 37°С, экстрагируют раствором, содержащим фосфатный буфер и 96° этиловый спирт в соотношении 5:1 соответственно, полученную суспензию выдерживают на кипящей водяной бане 10 минут, фильтруют, а при хемилюминесцентном анализе экстракта учитывают интенсивность быстрой вспышки, время полузатухания, интенсивность ингибирования и светосумму люминесценции. Изобретение позволяет определять активность перекисного окисления липидов в костной ткани скелетированных трупов. 1 з.п. ф-лы, 1 табл., 2 ил.
Изобретение относится к медицине и археологии и может быть использовано в судебной медицине для анализа хемилюминесценции костных останков.
Известен способ определения активности перекисного окисления липидов (ПОЛ) в биологических тканях с помощью хемилюминесцентного анализа, где исследуемый материал, исключая кровь, подлежит предварительной гомогенизации, для чего 500 мг исследуемой ткани гомогенизируют в 5 мл фосфатного буфера электрическим гомогенизатором с тефлоновым пестиком в течение 2 минут. Гомогенат центрифугируют 10 мин при 3000 об/мин для получения супернатанта, который и используется для оценки интенсивности хемилюминесценции по стандартной методике (Кулагин К.Н. Фармакодинамика производных 3-оксипиридина при черепно-мозговой травме: Дис. ... канд. мед. наук. - Смоленск, 2005. - 150 с.).
Данный способ не позволяет оценивать интенсивность хемилюминесценции липидов в гомогенате костей скелетированных трупов, т.к. они не переходят в среду гомогенизации.
Предлагаемый способ расширяет арсенал методов определения ПОЛ в биологических тканях.
Задачей изобретения является разработка способа, позволяющего определять активность ПОЛ в костях скелетированных трупов.
Сущность предложенного способа состоит в том, что исследуют костную ткань скелетированных трупов, которую измельчают механическим способом, высушивают при 37°С, экстрагируют раствором, содержащим фосфатный буфер и 96° этиловый спирт в соотношении 5:1 соответственно, полученную суспензию выдерживают на кипящей водяной бане 10 минут, фильтруют, а при анализе экстракта дополнительно оценивают интенсивность быстрой вспышки, время полузатухания и интенсивность ингибирования.
При этом на 500 мг костной ткани берут 6 мл экстрагирующего раствора, состав и соотношение которого определено опытным путем. Время экстракции на кипящей водяной бане соответствует 10 мин и также определено экспериментально.
Пример. Проводили оценку активности перекисного окисления липидов трубчатых костей пяти скелетированных трупов, найденных при археологических раскопках в г.Смоленске.
Кости измельчали механическим способом. Затем высушивали, запаковав в фильтровальную бумагу, в термостате при температуре 37,0°С. После чего 500 мг костного материала помещали в сосуд с вытянутым горлышком, содержащий 5 мл фосфатного буфера (0,015М К2НРО4, 0,105 М KCl) и 1 мл 96° этилового спирта. Полученную суспензию выдерживали на кипящей водяной бане 10 минут, затем фильтровали через фильтровальную бумагу. Получали около 3 мл экстракта.
Оценку хемилюминесценции проводили на хемилюминометре CL3603, для чего в силиконизированную кювету помещали 0,2 мл экстракта, 0,1 мл сульфата железа (12 мМ) и на 5-ом цикле добавляли 0,1 мл 3% Н2О2. Время регистрации ХЛ - 50 циклов, что соответствовало 50 сек (фиг.1).
Оценку ПОЛ производили по полученной кинетической кривой, при этом учитывали интенсивность быстрой вспышки, время полузатухания, интенсивность ингибирования, светосумму люминесценции (см. табл.).
Параллельно мы провели оценку хемилюминесценции костного гомогената, который получали измельчением костного материала электрическим гомогенизатором в фосфатном буфере. Хемилюминесценции зафиксировано не было (фиг.2).
Таким образом, предложенный способ определения активности перекисного окисления липидов в костной ткани с помощью хемилюминесцентного анализа позволяет оценивать активность ПОЛ. Данная методика может применяться в судебной медицине для исследования костей эксгумированных трупов либо в археологии.
| Таблица | |||||
| Способ определения активности перекисного окисления липидов в костной ткани | |||||
| № | Цикл быстрой вспышки | Интенсивность вспышки | Время полуатухания быстрой вспышки | Максимальная скорость ингибирования | Площадь светосуммы |
| 1 | 6 | 37050 | 0,05 | 33810 | 7351 |
| 2 | 6 | 23040 | 0,15 | 10810 | 10177 |
| 3 | 6 | 32910 | 0,06 | 28080 | 7684 |
| 4 | 6 | 33740 | 0,06 | 29420 | 7797 |
| 5 | 6 | 37770 | 0,07 | 28770 | 11933 |
1. Способ определения активности перекисного окисления липидов в биологических тканях, включающий измельчение биологической ткани, экстракцию фосфатным буферным раствором, отделение экстракта с последующим проведением его хемилюминесцентного анализа, отличающийся тем, что исследуют костную ткань скелетированных трупов, которую измельчают механическим способом, высушивают при 37°С, экстрагируют раствором, содержащим фосфатный буфер и 96° этиловый спирт в соотношении 5:1, соответственно полученную суспензию выдерживают на кипящей водяной бане 10 мин, фильтруют, а при хемилюминесцентном анализе экстракта учитывают интенсивность быстрой вспышки, время полузатухания, интенсивность ингибирования и светосумму люминесценции.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что на 500 мг костного материала берут 6 мл экстрагирующего раствора.
