Способ приготовления закваски для консервирования растительных субстратов
Владельцы патента RU 2351155:
Государственное научное учреждение СИБИРСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ СЫРОДЕЛИЯ Сибирского отделения Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ СибНИИС СО РАСХН) (RU)
Изобретение относится к производству кормов для сельскохозяйственных животных. Способ приготовления закваски для консервирования растительных субстратов предусматривает отбор штаммов мезофильных лактобацилл по устойчивости к вирулентным бактериофагам, циркулирующим в консервируемых растительных субстратах, и штаммов пропионовокислых бактерий вида P.freudenreichii - по способности ферментировать растительные углеводы, активно развиваться в растительных субстратах и проявлять биологическую совместимость с отобранными штаммами мезофильных лактобацилл, их раздельное выращивание, смешивание и высушивание. Изобретение позволяет повысить выход и качество силоса. 1 з.п. ф-лы, 2 табл.
Изобретение относится к области производства кормов для сельскохозяйственных животных, а именно к бактериальным закваскам для консервирования растительного кормового сырья с применением определенных видов и штаммов микроорганизмов, и может быть использовано на технологических участках по производству сенажа и силоса.
Известен способ приготовления закваски для консервирования растительных субстратов с использованием штаммов мезофильных лактобацилл (Шмидт В., Ветерау Г. Производство силоса, М., Колос, 1975, с.10-17). Однако такая закваска применяется только для провяленного растительного сырья, а на непровяленном сырье не дает однозначных результатов по качеству конечного продукта.
Известен также способ приготовления закваски для консервирования растительных субстратов, предусматривающий отбор штаммов мезофильных лактобацилл по комплексу производственно-ценных свойств, включающему активное кислотообразование в растительных субстратах, высокую антагонистическую активность по отношению к патогенной и гнилостной микрофлоре, выраженную амилазную активность и способность ферментировать пентосахара, и штаммов пропионовокислых бактерий вида P.freudenreichii - по способности ферментировать растительные углеводы, активно развиваться в растительных субстратах и проявлять биологическую совместимость с отобранными штаммами мезофильных лактобацилл, их раздельное выращивание, смешивание и высушивание (патент РФ №2265655, МПК А23К 3/02, заявлено 09.07.2003 г., опубл. 10.12.2005 г.).
Это техническое решение является наиболее близким к заявляемому по совокупности существенных признаков (прототип).
Предусматривание в известном способе отбора штаммов мезофильных лактобацилл по комплексу производственно-ценных свойств, включающему активное кислотообразование в растительных субстратах, высокую антагонистическую активность по отношению к патогенной и гнилостной микрофлоре, выраженную амилазную активность и способность ферментировать пентосахара, а также использования пропионовокислых бактерий, позволяет снизить требования к исходному растительному сырью по влажности, дает возможность получить силос с хорошей усваиваимостью, увеличить содержание питательных свойств силоса и снизить себестоимость его получения.
Вместе с тем закваска, приготовленная по известному способу, может быть эффективно применена только для консервирования растительных субстратов, в которых отсутствуют бактериофаги, вирулентные по отношению к штаммам лактобацилл. В противном случае существует потенциальная опасность фаговой атаки на заквасочную микрофлору, следствием которой будет снижение активности штаммов микроорганизмов, входящих в состав полученной по известному способу закваски, и, как результат, угнетение процесса молочнокислого брожения, а вместе с этим и консервирующего эффекта. Угнетение процесса молочнокислого брожения ведет к увеличению продолжительности ранней стадии процесса силосования и создает благоприятные условия для вредной микрофлоры, развитие которой ведет к снижению выхода, питательной ценности и поедаемости консервируемых кормов, а также к повышению содержания в них микробных токсинов.
Кроме того, использование полученной по известному способу закваски малоэффективно для консервирования трудносилосуемого растительного сырья.
Таким образом, функциональные возможности закваски, полученной известным способом, недостаточно широки.
Задачей настоящего изобретения является создание такого способа приготовления закваски для консервирования растительных субстратов, который позволил бы получить закваску с более широкими функциональными возможностями.
Техническим результатом изобретения является снижение продолжительности процесса силосования, повышение выхода и качества кормов, его питательной ценности и поедаемости, расширение номенклатуры консервируемого сырья.
Указанный технический результат достигается тем, что в известном способе приготовления закваски для консервирования растительных субстратов, предусматривающем отбор штаммов мезофильных лактобацилл по комплексу производственно-ценных свойств, включающему активное кислотообразование в растительных субстратах, высокую антагонистическую активность по отношению к патогенной и гнилостной микрофлоре, выраженную амилазную активность и способность ферментировать пентосахара, и штаммов пропионовокислых бактерий вида P.freudenreichii - по способности ферментировать растительные углеводы, активно развиваться в растительных субстратах и проявлять биологическую совместимость с отобранными штаммами мезофильных лактобацилл, их раздельное выращивание, смешивание и высушивание, согласно изобретению в качестве мезофильных лактобацилл используют штаммы видов L.plantarum и L.casei, которые дополнительно отбирают по устойчивости к вирулентным бактериофагам, циркулирующим в консервируемых растительных субстратах, с коэффициентом фагочувствительности, не превышающим 0,04.
Использование в закваске в качестве мезофильных лактобацилл штаммов видов L.plantarum и L.casei, дополнительно отобранных по устойчивости к вирулентным бактериофагам, циркулирующим в консервируемых растительных субстратах, с коэффициентом фагочувствительности, не превышающим 0,04, придает ей свойство противостоять фаговой атаке, вследствие чего процесс молочнокислого брожения остается стабильно интенсивным даже в присутствии вирулентных бактериофагов и отсутствуют условия для развития вредной микрофлоры. За счет этого происходит снижение продолжительности процесса силосования, повышаются выход, питательная ценность и поедаемость корма. Возможно расширение номенклатуры консервируемого растительного субстрата за счет трудносилосуемого сырья.
Способ приготовления закваски для консервирования растительных субстратов осуществляют следующим образом.
Вначале производят отбор бактериальных штаммов. Для этого отбирают биологически совместимые штаммы мезофильных лактобацилл видов L.plantarum и L.casei и пропионовокислых бактерий вида P.freudenreichii по комплексу производственно ценных свойств. Для штаммов мезофильных лактобацилл таковыми являются активное кислотообразование в растительных, в том числе трудносилосуемых, субстратах, высокая антагонистическая активность по отношению к патогенной и гнилостной микрофлоре, выраженная амилазная активность, способность ферментировать пентосахара и устойчивость к вирулентным бактериофагам, циркулирующим в консервируемых растительных субстратах.
Отбор штаммов мезофильных лактобацилл по активности кислотообразования в растительных субстратах проводят, например, с помощью теста, основанного на оценке их способности снижать активную кислотность травяного отвара, предпочтительно отвара трудносилосуемого растительного субстрата (например, донника), за 24 ч инкубации при 30°С не менее чем на 2 ед. pH.
Отбор штаммов мезофильных лактобацилл по антагонистической активности по отношению к патогенной и гнилостной микрофлоре ведут по их способности при посеве методом перпендикулярных штрихов образовывать зоны подавления тест-штаммов E.coli после 24 ч инкубации при 30°С диаметром не менее 5 мм.
Наличие у штаммов мезофильных лактобацилл выраженной амилазной активности устанавливают по их способности при посеве на пептонный агар с крахмалом образовывать зоны гидролиза крахмала после 7 суток инкубации при 30°С.
В целях интенсификации процесса консервирования штаммы мезофильных лактобацилл отбирают по способности сбраживать углеводы, широко распространенные в растительных субстратах (сахароза, раффиноза, целлобиоза и др.), в том числе пентозоуглеводы (арабиноза, ксилоза и др.).
Для улучшения показателей закваски отбирают штаммы мезофильных лактобацилл, которые проявляют высокую устойчивость к вирулентным бактериофагам, циркулирующим в растительных кормах, т.е. имеют коэффициент фагочувствительности (Kphs - отношение числа фагов, лизирующих данный штамм лактобацилл, к общему числу тест-фагов), не превышающий 0,04.
Лактобациллы, включаемые в состав закваски, могут быть также подобраны таким образом, чтобы они различались по составу лизирующих их бактериофагов, то есть не совпадали по фаготипу.
Штаммы пропионовокислых бактерий вида P.freudenreichii отбирают по способности ферментировать растительные углеводы, активно развиваться в растительных субстратах и проявлять биологическую совместимость с отобранными штаммами мезофильных лактобацилл.
Отбираемые штаммы пропионовокислых бактерий вида P.freudenreichii должны ферментировать такие растительные углеводы, как арабиноза, мальтоза и манноза, и при двухсуточной инкубации в травяном отваре при 30°С накапливать не менее 109 KOE/см3.
Отбираемые штаммы мезофильных лактобацилл и пропионовокислых бактерий при совместном посеве методом перпендикулярных штрихов на подходящие плотные питательные среды и последующей инкубации посевов в течение 3 суток в анаэробных условиях при 30°С не должны образовывать взаимных зон ингибирования партнеров.
После отбора штаммы мезофильных лактобацилл и пропионовокислых бактерий выращивают раздельно в подходящих питательных средах, предпочтительно на основе растительных субстратов, при температуре 28-30°С до достижения плотности клеточных популяций в пределах 108-109 КОЕ/см3 для мезофильных лактобацилл и 109-1010 КОЕ/см3 для пропионовокислых бактерий.
После раздельного выращивания каждую клеточную биомассу отделяют от культуральной среды одним из известных способов (например, центрифугированием в асептических условиях), смешивают с защитной средой в соотношении 1:1 (по объему) и получают суспензию мезофильных лактобацилл и суспензию пропионовокислых бактерий. Каждую из суспензий высушивают методом сублимации до остаточной влажности 4-6%. Сухие препараты мезофильных лактобацилл и пропионовокислых бактерий смешивают в соотношении 9:1 (по весу) и получают готовую закваску для консервирования растительных субстратов.
Закваска для консервирования растительных субстратов может быть получена и в жидкой форме. Для этого после получения суспензии мезофильных лактобацилл и суспензии пропионовокислых бактерий их смешивают в соотношении 9:1. Полученный препарат содержит мезофильных лактобацилл не менее 109 KOE/см3 и пропионовокислых бактерий не менее 109 КОЕ/см3.
Для иллюстрации эффективности закваски, приготовленной по предлагаемому способу, были приготовлены два варианта закваски одного и того же видового состава бактерий, но различающихся по устойчивости используемых штаммов мезофильных лактобацилл (в качестве одного из возможных вариантов были использованы штаммы L.plantarum 578, L.plantarum 366 и L.casei 43-02, L.casei 152) к вирулентным бактериофагам, которые были выделены из образца сенажа и силоса, заготовленного в хозяйствах Алтайского края. У фагочувствительных штаммов мезофильных лактобацилл коэффициент фагочувствительности составлял 0,64-0,76, а у фагоустойчивых - не превышал 0,04 (таблица 1).
| Таблица 1 | |||
| Варианты заквасок для консервирования кормов | |||
| Фагочувствительная | Фагоустойчивая | ||
| Вид, штамм | Коэффициент фагочувствительности Kphs | Вид, штамм | Коэффициент фагочувствительности Kphs |
| L.plantarum 578 | 0,76 | L.plantarum 366 | 0,04 |
| L.casei 43-02 | 0,64 | L.casei 152 | 0,00 |
Оба варианта закваски применили для консервирования трудносилосуемого растительного субстрата (смесь донника и люцерны) в лабораторных условиях с добавлением и без добавления в растительный субстрат препарата вирулентных фагов. Закваски внесли в дозе, обеспечивающей исходный уровень мезофильных лактобацилл в зеленой массе около 106 КОЕ/г, доза заражения вирулентными фагами составила 105 КОЕ/г. Инокулированные субстраты инкубировали в течение 15 суток в анаэробных условиях при температуре 30°С, наблюдая за изменением их кислотности. Контролем служил неинокулированный субстрат, инкубировавшийся в тех же условиях. Результаты эксперимента представлены в таблице 2.
| Таблица 2 | |||||
| Интенсивность молочнокислого брожения в бобовом силосе, обработанном фагочувствительным (1) и фагоустойчивым (2) вариантами закваски | |||||
| Вариант опыта | Вариант закваски | Активная кислотность растительной массы, ед. pH, в процессе силосования, сутки | |||
| 0 | 5 | 10 | 15 | ||
| Без добавления фага | 1 | 6,4±0,1 | 5,2±0,2 | 5,0±0,1 | 4,8±0,1 |
| 2 | 6,4±0,1 | 5,4±0,1 | 5,1±0,2 | 5,1±0,2 | |
| С добавлением фага | 1 | 6,4±0,1 | 6,8±0,1 | 6,8±0,2 | 7,1±0,3 |
| 2 | 6,4±0,1 | 5,2±0,1 | 5,1±0,1 | 5,0±0,1 | |
| Контроль | - | 6,4±0,1 | 6,5±0,3 | 6,8±0,2 | 7,4±0,4 |
Оба варианта закваски обеспечивали должный уровень молочнокислого брожения в растительной массе, не содержавшей вирулентных фагов, однако в присутствии фагов процесс силосования протекал нормально только при использовании фагоустойчивой закваски.
Таким образом, приготовленная по предлагаемому способу закваска обеспечивает активное протекание процесса силосования в условиях фаговой инфекции, что существенно расширяет ее функциональные возможности, ведет к снижению продолжительности процесса силосования, повышению выхода и качества силоса, улучшению его питательной ценности и поедаемости, расширению номенклатуры консервируемого сырья.
1. Способ приготовления закваски для консервирования растительных субстратов, предусматривающий отбор штаммов мезофильных лактобацилл по комплексу производственно-ценных свойств, включающему активное кислотообразование в растительных субстратах, высокую антагонистическую активность по отношению к патогенной и гнилостной микрофлоре, выраженную амилазную активность и способность ферментировать пентосахара, и штаммов пропионовокислых бактерий вида P.freudenreichii - по способности ферментировать растительные углеводы, активно развиваться в растительных субстратах и проявлять биологическую совместимость с отобранными штаммами мезофильных лактобацилл, их раздельное выращивание, смешивание и высушивание, отличающийся тем, что в качестве мезофильных лактобацилл используют штаммы видов L.plantarum и L.casei, которые дополнительно отбирают по устойчивости к вирулентным бактериофагам, циркулирующим в консервируемых растительных субстратах, с коэффициентом фагочувствительности, не превышающим 0,04.
2. Способ приготовления закваски для консервирования растительных субстратов по п.1, отличающийся тем, что в состав закваски включают штаммы мезофильных лактобацилл с несовпадающим фаготипом.
