Липиды, содержащие жирные кислоты омега-3 и омега-6
Изобретение относится к химико-фармацевтической и пищевой промышленности и касается липидного препарата, содержащего глицерофосфолипид фосфатидилсерин (PS) формулы (I), конъюгированный с ЕРА и DHA. Раскрытые препараты обладают улучшенной биологической активностью и применимы при лечении различных когнитивных и психических состояний и расстройств и для сохранения нормальных функций систем и процессов, связанных с головным мозгом. 14 з.п. ф-лы, 1 табл., 6 ил.
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к препаратам фосфолипидов и полярных липидов, обогащенных жирными кислотами омега-3 и/или омега-6, ковалентно присоединенными к липидным остовам. Фосфолипидные препараты изобретения особенно применимы в качестве нутрацевтиков, пищевых добавок и/или фармацевтических средств для лечения различных состояний, в частности, связанных с когнитивными функциями.
Предпосылки создания изобретения
Липиды, и особенно полярные липиды, азотсодержащие липиды и углеводсодержащие липиды (фосфолипиды, сфингозины, гликолипиды, церамиды, сфингомиелины) являются основными строительными блоками клеточных мембран, тканей и т.д. Кроме того, они играют важную роль в процессах передачи сигналов и в ряде каскадов биохимических и биосинтетических реакций.
Глицерофосфолипиды - липиды на основе глицериновой главной цепи и содержащие фосфатную концевую группу, являются основными строительными блоками клеточных мембран. Так как в большинство биохимических процессов, если не во все, вовлекаются клеточные мембраны, структурные и физические свойства мембран в различных тканях являются критическим фактором для нормального и эффективного функционирования мембран во всех биохимических процессах.
В свете появления категории функциональных пищевых продуктов в области диетических липидов полезное действие на здоровье приписывают потреблению некоторых жирных кислот. Например, во многих исследованиях сообщается, что полиненасыщенные жирные кислоты (PUFA) типа омега-3 и омега-6 оказывают полезное действие на здоровье при сердечно-сосудистых заболеваниях, иммунных расстройствах и воспалениях, почечных расстройствах, аллергиях, диабете и раке. Такие типы жирных кислот встречаются в природе главным образом в рыбе и водорослях, где они случайно распределены по положениям sn-1, sn-2 и sn-3 глицеринового остова триглицеридов.
В специальной литературе подчеркивается важность адекватного питания, включающего жирные кислоты омега-3. При широких клинических исследованиях о важности докозагексаеновой кислоты (DHA) - одной из наиболее важных жирных кислот омега-3 для головного мозга - обнаружено, что низкие уровни DHA связаны с депрессией, потерей памяти, деменцией и проблемами со зрением. Все исследования показывают существенное улучшение функционирования головного мозга у пожилых людей, когда повышаются уровни DHA в крови.
К другим благоприятным действиям DHA относятся пониженная опасность аритмии, уменьшение риска внезапной смерти больных с заболеванием сердца, более низкие уровни триглицеридов в плазме и склонность к пониженной свертываемости крови. Кроме того, DHA может иметь значение в области улучшения функционирования головного мозга, обогащения детского питания, при диабете и раке. В исследованиях в области питания о важности DHA для головного мозга обнаружено, что низкие уровни DHA ассоциируются с депрессией, потерей памяти, ухудшением познавательной способности, деменцией и проблемами со зрением.
Человеческий организм не синтезирует DHA адекватно. Поэтому ему необходимо получать ее с питанием. Люди получают DHA из своего питания - сначала через плаценту, затем с грудным молоком и позднее из пищевых источников, таких как рыба, красное мясо, мясо органов животных и яйца. Популярная рыба тунец, лосось и сардины являются богатыми источниками. До последнего времени основным источником пищевых добавок с DHA были рыбьи жиры. Способность ферментов продуцировать семейство омега-6 и омега-3 продуктов линолевой и альфа-линоленовой кислоты падает с возрастом. Поскольку синтез с возрастом падает, с возрастом наша потребность получать DHA непосредственно из питания или добавок возрастает. Действительно, в некоторых недавних публикациях предлагается рассматривать DHA как незаменимую жирную кислоту [например, в Muskiet F. et al. (2000), J. Nutr., 134(1): 183-6].
Поскольку DHA важна для передачи сигналов в головном мозгу, для зрения и нервной системы, многие потребители, имеющие дело с поддержанием ясности мышления, ищут правильный безопасный способ восполнения своих уровней DHA.
Показано, что полиненасыщенные кислоты, в частности длинноцепочечные, такие как омега-3 и -6, оказывают разнообразное благоприятное действие на здоровье людей. Мировой рынок длинноцепочечных PUFA, включая пищевой сектор, быстро растет.
Однако большинство усилий в промышленности направляется на улучшение методов переработки PUFA и создание более качественных концентрированных производных PUFA, обеспечивающих потребности пищевых добавок и функциональных пищевых продуктов.
В меньшей степени научные и индустриальные сообщества озабочены разработкой различных подходов к доставке PUFA для того, чтобы улучшить их биологическую доступность и их эффективность в смысле их известного разнообразного благоприятного действия на здоровье. Такие благоприятные действия охватывают интервал от предупреждения до лечения CVD, диабета, расстройств и/или ухудшения познавательной способности, нарушений зрения, кожных состояний, расстройств обучения и т.д. Кроме того, показано, что PUFA способствуют развитию познавательной способности и зрения у детей.
PUFA-липиды
PS-PUFA
Фосфатидилсерин, также известный как PS, является природным фосфолипидом с биологическим действием, которое делает его одной из наиболее перспективных пищевых добавок в области питания для головного мозга. PS и его полезное действие на здоровье известны исследователям и специалистам в области питания с 1970-х. Проводились многочисленные исследования для того, чтобы установить такую эффективность для многих познавательных и психических функций. Эти исследования показали, что PS может улучшать память, бороться с деменцией, бороться с ранними стадиями болезни Альцгеймера, снижать стресс и напряжение, улучшать период внимания, улучшать настроение и бороться с депрессией - немногое из того, что можно назвать.
PS является одним из наиболее важных строительных блоков клеточных мембран в головном мозгу. Поэтому уровень PS в клеточных мембранах головного мозга обеспечивает подвижность и структуру этих мембран. Нормальный уровень обеспечивает нормальные и эффективные процессы передачи сигналов, эффективный расход глюкозы и другие каскады биологических реакций, которые приводят к нормальным когнитивным и психическим функциям.
Так как PS не распространен в питании людей и так как у многих людей, особенно пожилых, биосинтетические каскады реакций, ответственные за продуцирование PS, действуют неправильно, уровни PS в организме и головном мозгу являются низкими. Это приводит ко многим когнитивным и психическим расстройствам, таким как депрессия, потеря памяти, короткий период внимания, трудности обучения и т.д.
Добавление PS в питание пожилых людей с такими расстройствами приводит, во многих случаях, к существенному улучшению при таких расстройствах. В последние годы исследования показывают, что даже более молодые люди могут получить пользу от добавления в питание PS. Показано, что PS улучшает способность к обучению у студентов, улучшает память и период внимания и т.д.
Поэтому целью настоящего изобретения являются специальные препараты PS для применения, главным образом, в качестве нутрацетиков и функциональных пищевых добавок.
PC-PUFA
Как указывалось ранее, фосфолипиды являются необходимыми компонентами всех клеточных и субклеточных мембран. Фосфатидилхолин и фосфатидилэтаноламин преобладают количественно, составляя, по существу, типичную двухслойную конфигурацию. Фосфолипиды принадлежат к амфифильным молекулам с водорастворимым и жирорастворимым компонентом. В двухслойной конфигурации гидрофильные группы располагаются на внешней и внутренней стороне мембраны к окружающей среде; липофильные группы, напротив, обращены друг к другу на внутренней стороне двухслойной конфигурации.
Другими важными составляющими биологических мембран являются холестерин, гликолипиды и периферические и интегральные белки. Таким образом, основная структура биологических мембран представляет собой ряд повторяющихся звеньев комплексов липид-белок. Мембрана является асимметричной. Функция наружных (клеточных) и внутренних (субклеточных) систем мембраны зависит от их состава и целостности их фосфолипидной структуры. Кроме их присутствия в клеточных мембранах фосфолипиды составляют структурные и функциональные элементы поверхностных монослоев липопротеинов и поверхностно-активных веществ.
Крайне важной для функционирования биологических мембран является их текучесть, на которую несомненно влияют фосфолипиды. Кроме содержания холестерина и белков и характера заряда полярных головных групп фосфолипидов в системе, текучесть мембраны зависит от длины цепей остатков жирных кислот в молекуле фосфолипида, а также от числа и типа образования пар их двойных связей.
Фосфолипиды, содержащие полиненасыщенные жирные кислоты, снабжают организм важными строительными блоками, которые улучшают текучесть мембран.
Исследования, проведенные с PUFA-содержащими фосфолипидами, показали следующее.
1. Они являются высокоэнергетическими, базовыми, структурными и функциональными элементами всех биологических мембран, таких как клетки, кровяных корпускул, липопротеинов, и поверхностно-активным веществом.
2. Они совершенно необходимы для дифференцировки, пролиферации и регенерации клеток.
3. Они поддерживают и промотируют биологическую активность многих мембрансвязывающих белков и рецепторов.
4. Они играют решающую роль для активности и активации многочисленных располагающихся в мембранах ферментов, таких как натрий-калиевая-АТФаза, аденилатциклаза и липопротеинлипаза.
5. Они важны для переноса молекул через мембраны.
6. Они регулируют мембранзависимые метаболические процессы между внутриклеточным и внеклеточным пространством.
7. Полиненасыщенные кислоты, содержащиеся в них, такие как линолевая кислота, являются предшественниками цитозащитных простагландинов и других эйкозаноидов.
8. Как доноры холина и жирных кислот они оказывают влияние на некоторые неврологические процессы.
9. Они эмульгируют жир в желудочно-кишечном тракте.
10. Они являются важными эмульгаторами в желчи.
11. Они совместно определяют агрегацию эритроцитов и тромбоцитов.
12. Они влияют на иммунологические реакции на клеточном уровне.
Фосфолипиды, содержащие PUFA, теоретически влияют на все такие заболевания, при которых имеют место повреждения структур мембран, уменьшение уровней фосфолипидов и/или снижение текучести мембран. Такая гипотеза поддерживается экспериментальными и клиническими исследованиями различных мембраноассоциированных расстройств и заболеваний.
Исследования в отношении активного начала, а также фармакологические и клинические испытания доступны на множестве патологических отклонений и заболеваний, связанных с повреждениями мембран. Например, при заболеваниях печени структуры гепатоцитов повреждаются, например, вирусами, органическими растворителями, алкоголем, лекарственными препаратами, лекарственными средствами или жирной пищей. Как следствие, текучесть и проницаемость мембран могут быть нарушены, и мембранозависимые патологические процессы, а также мембраноассоциированная активность ферментов могут ухудшиться. Это существенно подавляет метаболизм в печени.
Другими примерами являются гиперлипопротеинемия с атеросклерозом или без него, нарушения реологии крови с повышенным отношением холестерин/фосфолипиды в мембранах тромбоцитов и эритроцитов, неврологические заболевания, желудочно-кишечные воспаления, болезни почек и различные симптомы старения.
Все такие весьма различные заболевания обычно имеют сравнимые мембранные расстройства. С помощью молекул полиненасыщенного фосфатидилхолина можно положительно повлиять на такие расстройства, устранить их или даже улучшить состояние по сравнению с нормальным из-за высокого содержания полиненасыщенных жирных кислот. Далее приводятся некоторые примеры механизмов, которые опосредуют такой феномен.
1. Частицы липопротеина высокой плотности (HDL), обогащенные PUFA-содержащим фосфатидилхолином, способны поглощать больше холестерина из липопротеина низкой плотности (LDL) и тканей. Больше холестерина может быть перенесено обратно в печень. Также уникально действие на обратный перенос холестерина. Все другие липидпонижающие средства уменьшают или абсорбцию холестерина в организме или синтез холестерина в печени и его распределение по периферии. Однако указанные вещества не мобилизуют физиологически холестерин, уже имеющийся на периферии.
2. Отношение холестерин/фосфолипиды в мембранах, тромбоцитах и эритроцитах уменьшается, и функция мембран улучшается до нормального уровня.
3. Реакции перекисного окисления ослабляются, восстанавливаются поврежденные структуры мембран гепатоцитов, текучесть мембран и функция стабилизируются, иммуномодуляция и защита клеток улучшаются и усиливаются мембраноассоциированные функции печени.
4. С нормализацией отношения холестерин/фосфолипиды также стабилизируется желчь.
5. Из-за своего специфического свойства как поверхностно-активного эмульгатора PUFA-содержащий фосфатидилхолин растворяет жир и используется для уменьшения опасности и лечения жировой эмболии.
6. Замещение полиненасыщенными кислотами и холином может иметь цитопротекторное действие в головном мозгу и активировать нейронные процессы.
7. Липосомы с молекулами полиненасыщенного фосфатидилхолина могут действовать как переносчики лекарственных средств, таких как витамин Е.
Болезнь печени
Экспериментальные и клинические результаты поддерживают предположение, что лечебное применение PUFA-содержащего фосфатидилхолина оказывает защитное и даже лечебное и восстанавливающее действие на биологические мембраны эндотелиальных клеток синусов и гепатоциты. Цитопротекторное действие PUFA-содержащего фосфатидилхолина подтверждено в 7 экспериментах in vitro и 55 in vivo, в которых использовали 20 различных моделей животных пяти различных видов. Наиболее применимыми типами интоксикации, о которых известно, что они играют роль в этиологии болезни печени, являются химические вещества, лекарственные средства, алкоголь, холестаз, иммунологические явления, воздействие радиации и т.д.
Гепатопротекторное действие PUFA-содержащего фосфатидилхолина подтверждено и было более выражено, как перечислено далее, при более раннем введении PUFA-содержащего фосфатидилхолина.
1. Структуры мембран были нормальными или нормализованными по большей части.
2. Жировую инфильтрацию и некроз гепатоцитов можно было уменьшить или даже устранить.
3. Получены соответствующие данные о перекисном окислении липидов, трансаминазной активности и холинэстеразной активности и сывороточных липидах; усиливался метаболизм в клетках печени.
4. Усиление синтеза РНК и белков и содержание гликогена в печени указывали на стимуляцию клеток печени.
5. Пониженное продуцирование коллагена, отношение коллаген/ДНК и содержание гидроксипролина в печени указывали на пониженное образование соединительной ткани.
Дозировка PUFA-содержащего фосфатидилхолина колебалась от 525 до 2700 мг/сутки при пероральном введении и от 500 до 3000 мг/сутки при внутривенном применении. Длительность обработки составляла от нескольких недель до 30 месяцев. Основными показаниями состояния печени были острый гепатит, хронический гепатит, жировая инфильтрация, токсическое повреждение печени, цирроз печени и печеночная кома.
Клинические результаты, показывающие эффективность PUFA-содержащего фосфатидилхолина, можно суммировать, в целом, следующим образом.
1. Ускоренное улучшение и нормализация субъективных ощущений, клинических результатов и некоторых биохимических показателей.
2. Более хорошие гистологические результаты по сравнению с контрольными группами.
3. Сокращенное время госпитализации.
Обнадеживающие результаты получены также при почечных расстройствах, длительном амбулаторном перитонеальном диализе, гиперлипопротеинемии/атеросклерозе, воспалениях желудочно-кишечного тракта, псориазе и других заболеваниях.
Последние научные исследования показали, что обогащенные PUFA фосфолипиды, выделенные из эмбрионов радужной форели, оказывают полезное действие на здоровье, не выявленное ранее. К таким полезным действиям относятся лечение опухолевых клеток, подавление активности 5-липооксигеназы, снижение уровней нейтральных жиров (таких как холестерин).
Имеются доказательства, что у людей, которые получали обогащенные фосфолипиды с пищей, указанные фосфолипиды переходят через интестинальный барьер и гематоэнцефалический барьер, достигая, таким образом, головного мозга. Недавно исследователи из Ponroy Laboratories описали эксперимент, в котором мышей, лишенных незаменимых жирных кислот, т.е. линолевой кислоты (18:2, n-6) и α-линоленовой кислоты (18:3, n-3), которые служили в качестве единственных источников LC-PUFA, кормили церебральными фосфолипидами и определяли количество фосфолипидов в каждой части головного мозга. Указанные фосфолипиды обнаружили в цитоплазме, в синапсах и других частях головного мозга [Carrie et al. (2000), J. Lipid Res., 41, 465-472].
Использование фосфолипидов, обогащенных PUFA, имеет много потенциальных преимуществ с клинической точки зрения. Фосфолипид может доставлять незаменимую жирную кислоту в определенные органы или части тела, такие как головной мозг, и способствовать включению указанных жирных кислот в мембраны. Другие преимущества могут происходить из того факта, что фосфолипиды, обогащенные PUFA, не имеют проблем с запахом, какие обнаруживаются у рыбьего жира - их основного на сегодня нутрацевтического источника. Кроме того, некоторые предыдущие клинические исследования показали, что PUFA, включенные в фосфолипиды, обладают лучшей эффективностью, чем PUFA, содержащиеся в триглицеридах [Song et al. (2001), Atherosclerosis, 155, 9-18].
Другие исследования показали, что активность содержащего DHA липида отличается от активности триацилглицерина, содержащего DHA, в случае крыс со спонтанной гипертензией [Irukayama-Tomobe et al. (2001), Journal of Oleo Sciences, 50(12), 945-950]. Крыс со спонтанной гипертензией (SHR) в течение шести недель кормили кормами с испытываемыми липидами, содержащими фосфолипид с 30% докозагексаеновой кислоты (DHA) (DHA-PL), экстрагированный из рыбьей икры, или рыбий жир с 30% DHA (DHA-TG). Контрольный корм содержал кукурузное масло при наличии испытываемых липидов. По завершении кормления обнаружили, что кровяное давление в группах, получавших корма DHA-TG и DHA-PL, существенно ниже по сравнению с контролем. Содержание жирных кислот в сыворотке - дигомолинолевой кислоты (DHLnA) и арахидоновой кислоты (АА) в группе, получавшей корм DHA-PL, существенно ниже, чем в контрольной группе или группе, получавшей корм DHA-TG. Сывороточные триацилглицерин, фосфолипид и общий холестерин в группах, получавших корма DHA-TG и DHA-PL, существенно ниже, чем в контрольной группе. Общий холестерин в печени в группе, получавшей корм DHA-PL, в два раза больше общего холестерина в группе, получавшей корм DHA-TG, и контрольной группе. Таким образом, оказывается, что механизм удаления холестерина из крови DHA-PL может отличаться от такового в случае DHA-TG. Сывороточный пероксид липида (LPO) в группах, получавших корма DHA-TG и DHA-PL, по существу, такой же, как в контрольной группе.
Проблемами многих содержащих PUFA средств является устойчивость и качество вследствие высокой степени окисления полиненасыщенных жирных кислот. Указанные проблемы требуют включения антиоксидантов, а также принятия специальных мер, с помощью которых можно попытаться уменьшить такое окисление. Использование фосфолипидов как носителей PUFA может привести к повышенной устойчивости таких продуктов из-за антиокислительных свойств фосфолипидов.
Представляется, что одним из наиболее эффективных механизмов переноса таких незаменимых жирных кислот является присоединение указанных групп к молекулам фосфолипида. Показано, что фосфолипиды переходят через гематоэнцефалический барьер и переносят DHA туда, где она требуется.
Органолептические интересы
PUFA традиционно экстрагируют из рыб холодных вод. Несмотря на имидж полезности для здоровья, одной из проблем восприятия потребителем является получающийся в результате сильный рыбный вкус. Для решения этого вопроса в последние 15 лет пионерными были микроинкапсулированные формы омега-3. Следующей стадией стала разработка содержащих яйца продуктов, таких как обогащенный DHA майонез и паста. Также предвидилась разработка обогащенных DHA йогуртов, хлебобулочных изделий и бройлеров.
Не существует другого пищевого продукта или ингредиента, который рассматривают как средство для доставки PUFA. Все имеющиеся сегодня коммерческие продукты основаны на самих жирных кислотах в инкапсулированной форме или продуктах, обогащенных PUFA за счет специальных животных/зерновых включений.
Поэтому целью настоящего изобретения является обеспечение липидного препарата, обогащенного жирными кислотами омега-3 или омега-6, для применения, главным образом, в качестве нутрацетиков и в качестве функциональных пищевых добавок. Состав указанного препарата таков, что придает препарату свойство усиления биологической доступности PUFA. Таким образом, после его потребления предпочтительно в форме нутрацетиков, пищевых добавок или фармацевтических композиций, организм может наиболее эффективным путем пользоваться благоприятным действием, оказываемым указанным препаратом, который будет описано подробно ниже.
Раскрытие изобретения
В первом аспекте настоящее изобретение относится к липидному препарату, где указанный липид выбирают из числа глицерофосфолипидов и их солей, конъюгатов и производных и любой их смеси, содержащему ацильные группы полиненасыщенных жирных кислот (PUFA), в частности ацильные группы длинноцепочечных полиненасыщенных жирных кислот (LC-PUFA), предпочтительно ацильные группы омега-3 и/или омега-6, в концентрации, по меньшей мере, 5% (маc./маc.) от общего содержания жирных кислот в указанном препарате, предпочтительно более 10% (мас./мас), предпочтительнее 20-50% (мас./мас), где указанные PUFA ковалентно связаны с указанным липидом.
Указанный липид может представлять собой липид, встречающийся в природе, или синтетический липид. Предпочтительно, указанный липид представляет собой глицерофосфолипид, в котором, по меньшей мере, некоторые sn-1 или sn-2 группы глицеринового остова замещены указанными ацильными группами полиненасыщенных жирных кислот (PUFA).
В одном частном воплощении указанный липид представляет собой глицерофосфолипид формулы I
где R” представляет собой группу, выбранную из числа остатков серина (PS), холина (PC), этаноламина (РЕ), инозита (PI), глицерина (PG) и водорода (фосфатидная кислота - РА), и R и R', которые могут являться идентичными или различными, представляют, независимо, атомы водорода или ацильные группы, где указанные ацильные группы выбирают из числа насыщенных, мононенасыщенных или полиненасыщенных ацильных групп (PUFA), в частности длинноцепочечных полиненасыщенных жирных кислот (LC-PUFA), предпочтительнее ацильных групп омега-3 и/или омега-6, и их солей, при условии, что R и R' не могут одновременно представлять атомы водорода, и где указанные полиненасыщенные ацильные группы составляют, по меньшей мере, 5% (мас./мас.) от общего содержания жирных кислот в липиде, предпочтительно более 10% (мас./мас) и особенно 20-50% (мас./мас).
В одном более частном воплощении указанного препарата R представляет водород, и R' представляет ацильную группу. С другой стороны, R' представляет водород и R представляет ацильную группу.
Что касается указанных последних воплощений, то когда ацильная группа предпочтительно является ацильной группой омега-3, она может представлять собой эйкозапентаеноильную (ЕРА), докозагексаеноильную (DHA) группу или остаток линоленовой кислоты омега-3. И, когда указанная ацильная группа представляет собой предпочтительно ацильную группу омега-6, она может представлять собой арахидоноильную (ARA) группу или остаток линоленовой кислоты омега-6. Другая возможность состоит в том, что указанная ацильная группа может представлять собой линоленоильную (18:3) группу.
В еще одном воплощении перпарата изобретения R” может представлять собой любую группу из числа остатков серина, холина, этаноламина, инозита или глицерина.
В еще одном частном воплощении идентичность и содержание R и R' устанавливают предварительно.
Препарат изобретения, содержащий соединение формулы I, в котором R” представляет собой серин, имитирует композицию PS головного мозга человека.
Тем не менее изобретение также относится к препаратам, содержащим соединение формулы I, в котором R” представляет собой серин, которые отличаются от PS головного мозга человека, но еще обладают улучшенной биологической активностью, в частности, по сравнению с PS соевых бобов (PS сои). Такая улучшенная биологическая активность приводит к благоприятным действиям, как на обучаемость, так и на оперативную память у пожилых людей, в частности, при состяниях с ухудшенной холинергической активностью, подобных болезни Альцгеймера.
Изобретение также относится к получению препарата PS, имитирующего PS головного мозга человека, эффективного при дозировках более низких (2-3 раза) по сравнению с PS сои, причем в то же время обладающего схожей или улучшенной биологической активностью по сравнению с PS сои.
PS может быть из растительного и животного источника или микроорганизмов и обогащенным PS формулы I, где R” представляет остаток серина.
Препарат изобретения также может быть обогащен PS формулы I и отличаться наличием ослабленных органолептических воздействий, связанных с рыбой, или их отсутствием. Такой препарат может особенно подходить для включения в пищевые продукты, содержащие шоколад или на основе молока (в том числе, сгущенного молока).
Препарат изобретения можно использовать при улучшении или лечении когнитивных и психических состояний и расстройств, а также для поддержания нормальных функций систем и процессов, связанных с головным мозгом, предпочтительно при ADHD, старении, болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона, рассеянном склерозе (MS), дислексии, депрессии, для улучшения способности к обучению, интенсивности энцефалограммы, при стрессе, тревоге, умственных и психических расстройствах, для улучшения сосредоточенности и внимания, настроения, утилизации глюкозы головным мозгом, улучшения общего когнитивного и психического состояния, при неврологических расстройствах и гормональных расстройствах.
Препарат изобретения особенно применим для усиления биологической доступности жирных кислот омега-3 и омега-6.
Препарат изобретения можно применять для комбинированного улучшения когнитивных и психических функций вместе с улучшением других расстройств здоровья или состояний. Такими другими расстройствами здоровья или состояниями могут являться, по меньшей мере, высокие уровни холестерина в крови, высокие уровни триглицеридов, высокие уровни фибриногена в крови, отношение HDL/LDL, диабет, метаболический синдром, состояния, связанные с менопаузой, или постклимактерические состояния, расстройства, связанные с гормонами, расстройства зрения, воспалительные расстройства, иммунные расстройства, болезни печени, хронический гепатит, себорея, фосфолипидная недостаточность, перекисное окисление липидов, аритмия регенерации клеток, дестабилизация клеточных мембран, ишемическая болезнь сердца, высокое кровяное давление, рак, гипертензия, старение, болезнь почек, кожные болезни, отек, желудочно-кишечные заболевания, болезни периферической сосудистой системы, аллергии, нейродегенеративные и психические заболевания.
Препарат изобретения также можно применять для уменьшения и/или предупреждения сывороточного окислительного стресса, ведущего к атеросклерозу, сердечно-сосудистым расстройствам и/или ишемической болезни сердца.
Изобретение также относится к нутрацевтическим композициям, содержащим липидный препарат изобретения. Нутрацевтическая композиция может находиться в форме мягких капсул, таблеток, сиропа или любой другой системы для доставки пищевой добавки.
Изобретение также относится к функциональному пищевому продукту, содержащему липидный препарат изобретения. Такой функциональный пищевой продукт можно выбрать из числа молочных продуктов, молочных напитков, мороженого, хлебобулочных изделий, кондитерских изделий, сухого печенья, соевых продуктов, мучных кондитерских изделий и хлеба, соусов, приправ, масел и жиров, маргарина, пастообразных продуктов, круп, напитков и коктейлей, детских смесей, продуктов детского питания (печенье, протертые овощи и фрукты, каши), концентратов, сухих завтраков, конфет и шоколада.
В еще одном аспекте изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим липидный препарат изобретения и также содержащим, необязательно, по меньшей мере, одну фармацевтически приемлемую добавку, разбавитель или эксципиент.Фармацевтическая композиция по изобретению также может содержать, необязательно, по меньшей мере, одно фармацевтически активное средство.
Краткое описание чертежей
Фиг.1, A-D. Поведение крыс по обнаружению в задаче с пространственным лабиринтом Морриса (Morris).
Анализируют с использованием видеокамеры латентный период до подъема на платформу при трехдневном обследовании (2 сеанса в сутки) взрослых крыс, получавших в течение трех месяцев различные добавки, подробно описанные ниже, с предварительной обработкой (незаштрихованные квадраты) 1 мг/кг скополамина или без обработки (черные кружочки).
Фиг.1A. Крысы, получавшие МСТ, Р<0,007.
Фиг.1B. Крысы, получавшие PS-ω3, Р<0,07.
Фиг 1С. Крысы, получавшие SB-PS, Р<0,02.
Фиг.1D. Крысы, получавшие LC-PUFA, Р<0,03.
Величины представляют среднее ± S.E.M. для четырех-пяти крыс на добавку.
Аббревиатуры: лат.п. - латентный период, с - секунды.
Фиг.2. Поведение крыс, обработанных скополамином, в задаче с водным лабиринтом Морриса в испытании с пространственными датчиками.
Данная диаграмма представляет, при анализе с использованием видеокамеры, процент времени (Т.), которое взрослые крысы, получавшие в течение трех месяцев МСТ (незаштрихованные столбики), PS-ω3 (черные столбики), SB-PS (столбики с точками) или LC-PUFA (столбики с полосами), проводили в различных участках после удаления платформы после предварительной обработки 1 мг/кг скополамина. Величины представляют среднее ± станд.ош. для четырех-пяти крыс на добавку. Значимость по сравнению с контрольной группой (МСТ) *Р<0,02 и **Р<0,08.
Фиг.3, A-D. Поведение крыс, стимулированных скополамином, по обнаружению платформы после ее возвращения.
Анализируют с использованием видеокамеры латентный период до подъема на платформу при пятидневном обследовании в испытании с водным лабиринтом, в котором платформу возвращают между сеансами, у взрослых крыс, получавших в течение трех месяцев различные добавки, подробно описанные ниже, с предварительной обработкой (незаштрихованные квадраты) 1 мг/кг скополамина или без обработки (черные кружочки).
Фиг.3А. Крысы, получавшие МСТ.
Фиг.3В. Крысы, получавшие PS-ω3.
Фиг.3С. Крысы, получавшие SB-PS.
Фиг.3В. Крысы, получавшие LC-PUFA.
Величины представляют среднее ± станд.ош. для четырех-пяти крыс на добавку.
Аббревиатуры: лат.п. - латентный период, с - секунды, исп. - испытания.
Фиг.4, А-В. Уровни фосфолипидов в тканях крыс, измеренные с использованием 31Р-ЯМР.
Липиды экстрагируют из тканей взрослых крыс, получавших в течение трех месяцев МСТ (незаштрихованные столбики), PS-ω3 (черные столбики), SB-PS (столбики с точками) или LC-PUFA (столбики с полосами). Уровни фосфолипидов анализируют с использованием прибора 31Р-ЯМР и представляют относительные уровни фосфатидилхолина при различных обработках.
Фиг.4А. Анализ липидов, экстрагированных из печени.
Фиг.4В. Анализ липидов, экстрагированных из головного мозга (участок коры головного мозга).
Величины представляют среднее ± станд.откл. для тканей четырех-пяти крыс на добавку. Значимость по сравнению с контрольной группой (МСТ) *Р<0,05 и **Р<0,1. Сокращения: общ. фл. - общие фосфолипиды.
Фиг.5. Родительские оценки детей с ADHD согласно шкалам оценок поведения.
Диаграмма представляет процент детей с ADHD, которые показали улучшение или отсутствие улучшения с точки зрения родителей после приема в течение двух месяцев масла канола (canola) (незаштрихованные столбики), DHA (черные столбики) или PS-ω3 (заштрихованные столбики). Оценка включает замечания в связи с поведенческими тенденциями дома, в школе, с братьями или сестрами или ровесниками и замечания учителей. Величины представляют процент для двадцати-двадцати пяти детей с ADHD на добавку. Отмечается, что двенадцать родителей отказались отвечать на вопросы, и шесть детей не завершили период приема добавок из-за плохого вкуса или серьезных проблем с дисциплиной (в основном контрольная группа).
Аббревиатуры: улучш. - улучшение, незн.улучш. - незначительное улучшение, б.и. - без изменений, ухудш. - ухудшение.
Фиг.6. Влияние PC-DHA на сывороточный окислительный стресс.
Мышей Аро Еo кормили в течение 10 недель плацебо (незаштрихованные столбики) или PC-DHA (черные столбики). Уровни пероксидов липидов в сыворотке (сыв.пер.) измеряют с использованием спектрфотометрического анализа. Величины представляют среднее ± станд.откл. для 5 мышей на обработку.
Осуществление изобретения
В первом аспекте настоящее изобретение относится к липидному препарату, где указанный липид представляет собой глицерофосфолипид, его соль, конъюгат и производное и любую их смесь, содержащие ацильные группы полиненасыщенных жирных кислот (PUFA), в частности ацильные группы длинноцепочечных полиненасыщенных жирных кислот (LC-PUFA), предпочтительно ацильные группы омега-3 и/или омега-6, в концентрации, по меньшей мере, 5% (мас./мас.) от общего содержания жирных кислот в указанном препарате, предпочтительно более 10% (мас./мас), предпочтительнее 20-50% (мас./мас), где указанная PUFA ковалентно связана с указанным глицерофосфолипидом.
Указанный липид может представлять собой липид, встречающийся в природе, или синтетический липид. Предпочтительно указанный липид представляет собой глицерофосфолипид, в котором, по меньшей мере, некоторые sn-1 или sn-2 группы глицеринового остова замещены указанными ацильными группами полиненасыщенных жирных кислот (PUFA).
В одном частном воплощении указанный липид представляет собой глицерофосфолипид формулы I
где R” представляет собой группу, выбранную из числа остатков серина (PS), холина (PC), этаноламина (РЕ), инозита (PI), глицерина (PG) и водорода (фосфатидная кислота - РА), и R и R', которые могут являться идентичными или различными, представляют, независимо, атомы водорода или ацильные группы, где указанные ацильные группы выбирают из числа насыщенных, мононенасыщенных или полиненасыщенных ацильных групп (PUFA), в частности, длинноцепочечных полиненасыщенных жирных кислот (LC-PUFA), предпочтительнее ацильных групп омега-3 и/или омега-6, и их солей, при условии, что R и R' не могут одновременно представлять атомы водорода, и где указанные полиненасыщенные ацильные группы составляют, по меньшей мере, 5% (мас./мас.) от общего содержания жирных кислот в липиде, предпочтительно более 10% (мас./мас), и особенно 20-50% (мас./мас).
В одном более частном воплощении указанного препарата R представляет водород, и R' представляет ацильную группу. С другой стороны, R' представляет водород и R представляет ацильную группу.
Что касается указанных последних воплощений, то когда ацильная группа предпочтительно является ацильной группой омега-3, она может представлять собой эйкозапентаеноильную (ЕРА), докозагексаеноильную (DHA) группу или остаток линоленовой кислоты омега-3. И когда указанная ацильная группа представляет собой предпочтительно ацильную группу омега-6, она может представлять собой арахидоноильную (ARA) группу или остаток линоленовой кислоты омега-6. Другая возможность состоит в том, что указанная ацильная группа может представлять собой линоленоильную (18:3) группу.
В еще одном воплощении препарата изобретения R” может представлять собой любую группу из числа остатков серина, холина, этаноламина, инозита или глицерина.
В еще одном частном воплощении идентичность и содержание R и R' устанавливают предварительно.
Препарат изобретения, содержащий соединение формулы I, в котором R” представляет собой серин, имитирует композицию PS головного мозга человека.
Тем не менее изобретение также относится к препаратам, содержащим соединение формулы I, в котором R” представляет собой серин, которые отличаются от PS головного мозга человека, но еще обладают улучшенной биологической активностью, в частности, по сравнению с PS сои.
Традиционно активные PS-ингредиенты, используемые как пищевые добавки, получали экстрагированием головного мозга животных, в частности, головного мозга коров. PS, экстрагированный из тканей головного мозга животного, подобного PS головного мозга человека, имеет композицию жирных кислот, которая характеризуется относительно высокими уровнями групп омега-3 по сравнению с уровнями омега-3, обнаруженными в фосфолипидах растений.
PS имеет структуру, отображенную далее.
PS головного мозга человека характеризуется 20-30% содержанием в PS ацильных групп жирных кислот омега-3 предпочтительно в положении sn-2 глицериновой группы, главным образом DHA и ЕРА. Как указано выше, фосфолипиды, и PS в частности, ответственны за структуру и физические свойства мембран. Одним из основных физических свойств, определяемых фосфолипидами, является текучесть указанных мембран. Жирные кислоты омега-3, в частности DHA и ЕРА, также играют ключевую роль в текучести мембран в свете их уникальной структуры 3D. Поэтому PS с ацильными группами омега-3, в частности DHA и ЕРА, обладает уникальной биологической функциональностью, которая не может проистекать только из основного фосфолипидного скелета такого фосфолипида.
С учетом опасностей заражения прионовыми болезнями, в частности коровьей губчатой энцефалопатией (BSE), а также других недостатков, связанных с ингредиентами, получаемыми из животных источников, добавки с PS, как правило, получают с использованием PS, происходящего из лецитина соевых бобов. Такой лецитин обогащают, как правило, ферментативно PS. Такой способ получения приводит к PS с профилем жирных кислот соевых фосфолипидов, который характеризуется низким уровнем жирных кислот омега-3 и почти полным отсутствием DHA и ЕРА. Такой PS-активный ингредиент также известен как PS сои.
Хотя показано, что биологическая функциональность PS сои по улучшению когнитивной функции схожа с функциональностью коровьего PS, она все еще отличается от функциональности PS головного мозга человека. Целью настоящего изобретения является PS-ингредиент с заранее установленной композицией жирных кислот, которая имитирует композицию жирных кислот PS головного мозга человека.
Другой целью настоящего изобретения является PS-ингредиент, который хотя и не идентичен встречающемуся в природе PS головного мозга, характеризуется улучшенной функциональностью, в частности, по сравнению с PS сои. Улучшенный PS-ингредиент имеет заранее установленную композицию жирных кислот.
PS-ингредиент настоящего изобретения обогащен ацильными группами жирных кислот омега-3, предпочтительно DHA, ЕРА или линоленовой кислоты омега-3. Кроме того, PS данного изобретения обогащен ацильными группами жирных кислот омега-3, ковалентно связанными с любым из положений sn-1 или sn-2 глицериновой группы цепи остова PS или с обоими указанными положениями.
Настоящее изобретение также относится к и описывает другие фосфолипиды, такие как фосфатидилхолин (PC), фосфатидилэтаноламин (ЗУ), фосфатидилинозит (PI), фосфатидилглицерин (PG) и фосфатидная кислота (РА), обогащенные жирными кислотами омега-3, предпочтительно DHA, ЕРА или линоленовой кислотой, и которые ковалентно связаны с любым из положений sn-1 или sn-2 глицериновой группы фосфолипида или с обоими указанными положениями. С другой стороны, фосфолипиды по изобретению обогащены жирными кислотами омега-6.
Когда в данном описании упоминается PS, следует иметь в виду, что он также может обозначать любые другие липиды, такие как полярные липиды, перечисленные выше, но не ограничиваясь ими.
В предпочтительном воплощении количество жирных кислот омега-3 (в частности, DHA, ЕРА или линоленовой кислоты) или омега-6 (в частности, ARA или линолевой кислоты) в PS-ингредиенте по изобретению составляет более 10% в любом из положений sn-1 или sn-2 или в обоих положениях, предпочтительно в положении sn-2 предпочтительно более 20% и наиболее предпочтительно более 40%.
Как указывалось, нужные ацильные группы жирных кислот омега-3/омега-6 могут быть связаны с обоими или только с одним из положений sn-1 и sn-2.
Композиция жирных кислот в препарате с PS данного изобретения может иметь заранее установленный состав, подобный или отличающийся от состава композиции жирных кислот, найденной в головном мозгу здорового человека, при условии, что она обладает усиленной активностью, в частности, по сравнению с активностью растительного PS, например PS сои.
Получение препарата PS данного изобретения, обогащенного омега-3/омега-6, можно осуществить ферментативными или химическими способами или способами молекулярной биологии. Коротко, PS можно обогатить группами омега-3 или омега-6 ферментативными способами, например, такими как обогащение природного фосфолипида/лецитина жирными кислотами омега-3 ферментативной переэтерификацией/этерификацией с последующим превращением концевой группы в серин (с использованием ферментов PLD) с получением конъюгата PS-омега-3/омега-6. По другому ферментативному способу необходимо получить источник лецитина или фосфолипида, который по природе обогащен кислотами омега-3, такой как фосфолипиды криля, и превратить их концевые группы в серин. Следует отметить, что композиция жирных кислот PS, полученного таким способом, имеет композицию омега-3, которая предопределена выбранным источником (рыба, криль, водоросли и т.д.). Такие способы хорошо описаны в одновременно рассматриваемой заявке РСТ авторов данной заявки, притязающей на приоритет IL158553.
Содержащий омега-3/омега-6 PS-ингредиент по настоящему изобретению также можно получить химическими способами переэтерификации/этерификации, при которых положения sn-1 и -2 будут обогащаться ацильными остатками омега-3 или омега-6. Такие способы получения PS-омега-3 и PS-омега-6 описываются в одновременно рассматриваемой заявке РСТ авторов данной заявки, притязающей на приоритет IL158553.
С другой стороны, PS-ингредиент по настоящему изобретению можно получить методами GMO (генетически модифицированных организмов)/биотехнологии, например, обеспечивая продуцирующие фосфолипиды организмы жирными кислотами омега-3 или омега-6 для получения фосфолипидов PS, обогащенных омега-3 или омега-6. Для того чтобы избежать использования животных источников, предпочтительным может быть использование растений или микроорганизмов, созданных генной инженерией.
PS данного изобретения может иметь композицию жирных кислот омега-3 или омега-6 специфического лецитинового сырья, относительно богатого жирными кислотами омега-3 или омега-6, обогащенную PS с образованием PS-ингредиента с повышенными уровнями жирных кислот омега-3 или омега-6 по сравнению с PS сои. Это имеет место в случае, например, когда в качестве исходного материала используют фосфолипиды из криля, как описано выше.
В предпочтительном воплощении PS, обогащенный омега-3 или омега-6, может представлять собой PS сои или другой PS из растительного или животного источника, например криля, или из микроорганизмов. В другом предпочтительном воплощении обогащение омега-3 или омега-6 может быть осуществлено на лецитине, который, в свою очередь, обогащают PS перефосфатидилированием.
Целью данного изобретения является новый PS-ингредиент, обогащенный жирными кислотами омега-3, что приводит к ингредиенту с улучшенной эффективностью по сравнению с ингредиентами, встречающимися в природе или просто обогащенными PS.
Улучшенный препарат PS данного изобретения проявляет усиленную активность в улучшении и лечении когнитивных и психических состояний и расстройств, а также сохранении нормальных функций систем и процессов, связанных с головным мозгом. К ним относятся, но не ограничиваются перечисленным, ADHD, рассеянный склероз (MS), дислексия, депрессия, способность к обучению, интенсивность энцефалограммы, стресс, умственные и психические расстройства, гормональные нарушения, сосредоточенность и внимание, настроение, утилизация глюкозы головным мозгом и общее когнитивное и психическое состояние.
Новый липидный препарат данного изобретения проявляет усиленную активность в улучшении когнитивных функций, что подробно описывается ниже, по сравнению с липидами омега-3 или омега-6 как таковыми или PS сои. Кроме того, при некоторых состояниях или в случае всех или конкретных расстройств липидный препарат изобретения эффективен в дозировке менее 100 мг/сутки. Это ниже, чем рекомендованная на сегодня суточная дозировка PS сои (100-300 мг/сутки) или липидов омега-3 (приблиз. 1-2 г/сутки или больше), доступных в настоящее время на рынке. Тем не менее дозировки 100-600 мг/сутки предпочтительны для усиленной эффективности липидного препарата изобретения.
Важным преимуществом препарата PS изобретения является то, что он проявляет многофункциональную активность. Такая многофункциональность проявляется в улучшении когнитивных и психических функций вместе с улучшением при других расстройствах или состояниях здоровья.
Усиленная активность такого PS-ингредиента, а также его многофункциональность могут проистекать из уникальной структуры данного ингредиента и ее влияния на физические и химические свойства клеточных мембран в тканях головного мозга, а также других органах и тканях.
Усиленная активность такого PS-ингредиента, а также его многофункциональность могут быть приписаны усиленной биологической доступности жирных кислот омега-3 из-за их включения в скелет PS. Таким образом, жирные кислоты омега-3 могут доставляться к головному мозгу через гематоэнцефалический барьер, будучи частью молекулы PS, которая легко проходит через такой барьер. PS функционирует как средство доставки для жирных кислот, связанных с ним, к различным органам и тканям, причем посредством этого усиливается их биологическая доступность.
К другим расстройствам здоровья или состояниям, на которые влияет многофункциональный препарат PS изобретения, относятся, но не ограничиваются перечисленным, высокие уровни холестерина в крови, высокие уровни триглицеридов, высокие уровни фибриногена в крови, отношение HDL/LDL, диабет, метаболический синдром, состояния, связанные с менопаузой, или постклимактерические состояния, расстройства, связанные с гормонами, расстройства зрения, воспалительные расстройства, иммунные расстройства, болезни печени, хронический гепатит, себорея, фосфолипидная недостаточность, перокисление липидов, аритмия регенерации клеток, дестабилизация клеточных мембран, ишемическая болезнь сердца, высокое кровяное давление, рак, гипертензия, старение, болезнь почек, кожные болезни, отек, желудочно-кишечные заболевания, болезни периферической сосудистой системы, аллергии, заболевания дыхательных путей, нейродегенеративные и психические заболевания.
Новые ингредиенты по изобретению можно доставлять и использовать в различных продуктах. К таким продуктам относятся пищевые добавки, функциональные пищевые продукты, фармацевтические системы доставки и т.д.
Получение фармацевтических композиций хорошо известно в технике и описано во многих статьях и книгах, см, например, Gennaro A.R, ed. (1990), Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, и в особенности cc. 1521-1712 в указанном труде.
В качестве пищевых добавок препараты по изобретению можно использовать в форме мягких гелевых капсул, таблеток, сиропов и других обычных систем доставки пищевых добавок.
В качестве функциональных пищевых продуктов препараты по изобретению можно включать и использовать в различных пищевых продуктах, таких как молочные продукты, мороженое, хлебобулочные изделия, сухое печенье, соевые продукты, мучные кондитерские изделия и хлеб, соусы, приправы, масла и жиры, маргарин, пасты, крупы, напитки и коктейли, детские смеси, продукты детского питания (печенье, протертые овощи и фрукты, каши), концентраты, сухие завтраки, продукты, содержащие шоколад.
Как фармацевтические продукты препараты по изобретению можно доставлять перорально, внутривенно или любым другим обычным или особым способом введения.
Новые препараты изобретения могут находиться в форме текучего масла, порошков, гранул, восков, пасты, масляных или водных эмульсий и любых других формах, которые позволяют их применять для целевых применений.
Фармацевтические или нутрацевтические композиции, содержащие препарат PS изобретения, могут включать физиологически приемлемые свободно текучие вещества, другие добавки, эксципиенты, осушающие вещества и разбавители, красители, ароматизирующие и вкусовые ингредиенты и любые ингредиенты, которые регулируют физические, органолептические и другие свойства, а также дополнительные активные ингредиенты, например минеральные вещества, витамины, другие питательные добавки.
Использование липидов омега-3 при многих применениях, в особенности в качестве ингредиента функциональных пищевых продуктов, сдерживается из-за их характерного запаха рыбы. Таким образом, еще одним преимуществом ингредиентов изобретения, обогащенных омега-3 фосфолипидов, является то, что у них менее выраженный запах или вкус групп омега-3 из-за ковалентного связывания указанных групп с остовом PS. При этом повышается давление паров указанных веществ, причем вследствие этого ослабевает их характерный запах. Таким образом, ковалентное присоединение жирных кислот омега-3 к фосфолипидному остову, в особенности PS, изменяет и улучшает их вкусовые свойства. Кроме того, PS-ингредиент по изобретению также обладает улучшенной устойчивостью чувствительных к окислению жирных кислот омега-3. Известно, что фосфолипиды вообще и PS в частности действуют как антиоксиданты и стабилизаторы.
Указанные преимущества делают липидный препарат изобретения весьма благоприятным и важным при различных применениях, в особенности в функциональных пищевых продуктах, где устойчивость, запах и вкус являются основными требованиями.
Кроме того, указанные новые ингредиенты можно ввести в составы с другими липидами для еще большего усиления биологической функциональности и эффективности.
Производные полярных липидов PUFA, такие как производные PS-PUFA, использованные в клинических испытаниях настоящего изобретения, показали высокую устойчивость как препараты и, дополнительно, при некоторых применениях в пищевых продуктах. Устойчивость указанных чувствительных соединений возникает из ковалентных связей фосфолипидов, о которых было ранее известно, что они применяются в качестве консервантов, и неустойчивых групп PUFA.
Новые ингредиенты по изобретению можно доставлять и использовать в разнообразных продуктах. К таким продуктам относятся пищевые добавки, функциональные пищевые продукты, фармацевтические системы доставки и т.д.
Из раскрытого и описанного следует понимать, что данное изобретение не ограничивается конкретными примерами, стадиями процессов и материалами, раскрытыми в данном описании, так как стадии такого процесса и материалы могут иногда изменяться. Также следует иметь в виду, что терминология, используемая в данном описании, используется в целях описания только определенных воплощений и не подразумевается ее ограничение, так как объем настоящего изобретения будет ограничиваться только пунктами прилагаемой формулы изобретения и их эквивалентами.
Следует отметить, что используемые в данном описании и прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа (“a”, “an”, “the”) включают соответствующие формы множественного числа, если содержание не указывает ясно на иное.
В данном описании и в последующей формуле изобретения, если контекст не требует иного, слово “включать” и его варианты, такие как “включает”, “включающий”, следует понимать как обозначение включения указанного целого или части или группы целых или стадий, но не как исключение любого другого целого или стадии или группы целых или стадий.
Приведенные далее примеры представляют собой характерные методы, используемые авторами изобретения при осуществлении аспектов настоящего изобретения. Следует иметь в виду, что хотя указанные методы являются примерами предпочтительных воплощений для практического осуществления изобретения, специалистам в данной области техники в свете данного раскрытия будет ясно, что можно осуществить многочисленные модификации без отхода от сущности и предполагаемого объема изобретения.
Примеры
Пример 1
Методы
Животные и корм
Самцов крысы Wistar, происходящих из одних и тех же колоний, получали от Harlen. Пятьдесят крыс произвольно делят на группы по пищевым добавкам в дополнение к их обычному корму: (i) группа, питавшаяся 0,1 г среднецепочечных триглециридов (МСТ)/1 мл основы добавки (группа МТС); (ii) группа, питавшаяся 0,1 г триглицеридов DHA/EPA (20/30% общей композиции жирных кислот, разбавленной МСТ для получения 30% (мас./мас.) соединения LC-PUFA)/1 мл основы добавки (группа LC-PUFA); (iii) группа, питавшаяся 0,1 г PS, полученного из лецитина сои (20% SB-PS, мас./мас.)/1 мл основы добавки (группа SB-PS); (iv) группа, питавшаяся 0,1 г PS-ω3 (20% PS, мас./мас. и 30% всей композиции LC-PUFA)/1 мл основы добавки (группа PS). Основы добавок хранят при -20°С и крыс каждый день кормят свежими порциями. Со всеми добавками обращаются так, чтобы свести к минимуму окисление жирных кислот. Крысы потребляют корм и воду ad libitum. Всех крыс содержат в условиях стандартной окружающей среды, в которой поддерживают температуру 24±0,5°С и поддерживают относительную влажность 65±5%, при 12-часовом периоде чередования света и темноты. Массу тела измеряют в начале и в конце периода обработки.
Соединение PS-ω3, используемое в данном исследовании, имитирует композицию жирных кислот PS головного мозга млекопитающих в отношении содержания в нем DHA (20%). Как правило, в животных клетках композиция жирных кислот PS изменяется от ткани к ткани, но не оказывается схожей с фосфолипидами предшественников или из-за селективной утилизации специфических видов молекул для биосинтеза или из-за ремоделирования липида через реакции деацилирования-повторного ацилирования. В плазме человека преобладают группы 1-стеароил-2-олеоил и 1-стеароил-2-арахидоноил, но в головном мозгу и многих других родственных тканях весьма распространены группы 1-стеароил-2-докозагексаеноил [O'Brien et al. (1964), J. Lipid Res., 5(3):329-38]. В ранней работе Yabuuchi et al. [Yabuuchi et al. (1968), J. Lipid Res., 9(l):65-7] установлено, что содержание DHA в сером веществе коровы достигает 30% от общей композиции жирных кислот; большая часть общего количества DHA размещена в положении sn-2 (60%). Как сообщили в начале 1980 г. Toffano и Bruni, PS головного мозга коровы является фармакологически активным соединением, которое противодействует связанным с возрастом изменениям в центральной нервной системе [Toffano et al. (1980), Pharmacol. Res. Commun., 12:829-845].
Поведенческое испытание
В испытании в водном лабиринте, разработанном Morris [Stewart, СА. and Morris, RG. (1993), The water maze. Behavioural Neuroscience: A Practical Approach., Vol.1 (Saghal A., ed.), pp.107-122. Oxford University Press, New York, NY], используют круглую емкость (диаметр 37 см, высота 35 см), сконструированную из непрозрачного белого пластика. Емкость заполняют водой (21-22°С) на глубину 28 см и делают воду непрозрачной, добавляя растворимую нетоксичную белую латексную краску. В месте изгиба лабиринта крыса разрабатывает пространственную карту сигналов вне лабиринта, которую она затем использует для обнаружения платформы. Таким образом, расстояние, проплываемое до платформы, и также время, потраченное на это действие, должны сокращаться по мере сеансов испытания (дни), так как крыса узнает место размещения платформы. Кроме того, ожидается, что если крыса узнала место размещения платформы относительно сигналов вне лабиринта, ее начальной реакцией в испытании с датчиком будет плыть прямо в квадрант, в котором она ожидает найти платформу. Таким образом, проплываемое расстояние (и затраченное время) в целевом квадранте должны быть больше, чем в других двух квадрантах (за исключением исходного квадранта). Расстояние, проплываемое до платформы, а также латентный период для достижения платформы контролируют с использованием системы наблюдения на основе видеокамеры. Поведенческое испытание проводят во время темного периода цикла, когда крысы обычно наиболее активны.
Группу размещают в испытательной камере, в которой имеется несколько пространственных сигналов вне лабиринта. В первые три дня крысам требуется обнаружить скрытую платформу (15,5 см × 15,5 см), расположенную на 1 см ниже поверхности воды. Имеется два сеанса испытания на обнаружение в сутки с четырьмя испытаниями за сеанс. При каждом испытании крысу помещают мордой к стенке в одном из четырех квадрантов емкости и позволяют плыть в течение максимум 60 секунд. Как только крыса находит платформу, она остается на ней в течение 5 секунд до того, как ее возвращают в клетку, в которой поддерживают тепло, нагревая пол. Если крыса не находит платформу за указанное время, ее помещают на нее на 5 секунд перед тем, как вернуть в клетку. Каждое из восьми испытаний, проводимых каждые сутки, начинают с разных квадрантов, определяя порядок изменения псевдопроизвольно (не начиная два раза с одного и того же квадранта) и изменяя его каждый день. Интервал между испытаниями (ITI) составляет 120 секунд, отсчитываемый от конца одного испытания до начала следующего испытания. На четвертые сутки после вышеописанного сеанса платформу удаляют из емкости и проводят испытание с датчиком, помещая крысу в квадрант, противоположный квадранту с платформой, и затем позволяя крысе плавать в течение 60 секунд. На следующие сутки после испытания с датчиком крыс проверяют в сеансе, в котором состояние лабиринта такое, как описано ранее, с последующим сеансом, в котором платформу возвращают в центр противоположного квадранта. Регистрируют латентный период обнаружения платформы в каждом испытании. Скополамин (1 мг/кг) вводят интраперитонеально (i.p.) за 30 минут до указанных испытаний.
Экстрагирование липидов и анализ методом ЯМР
По окончании поведенческого испытания крысам дают наркоз галотаном и затем умерщвляют. Ткани печени и головного мозга быстро удаляют и хранят (при -80°С). Липидную фракцию тканей крысы экстрагируют с использованием модифицированного варианта метода, описанного Bligh и Dyer в 1959 г. [Bligh and Dyer (1959), Can. J. Biochem. Physiol, 37, 911-917]. Коротко, 500-700 мг и 300-1200 мг тканей печени и головного мозга соответственно гомогенизируют в растворе CDCl3, метанола и CS-ЭДТА (1:2:2, об./об./об.). Затем гомогенаты перемешивают с использованием ультразвуковой ванны (10 мин, 80°С), а затем еще энергично встряхивают (20 мин). Относительное соотношение фосфолипидов в гомогенатах измеряют с использованием 31Р-ЯМР высокого разрешения при 121 МГц с использованием спектрометра 7.06 Tesla General Electric.
Затем полученные гомогенаты анализируют на распределение в них жирных кислот. Сначала экстракты липидов обессоливают хроматографией с обращенной фазой с использованием колонки RP-18 [Williams et al. (1980), J. Neurochem., 35,
366-269], перед загрузкой в колонку добавляют дигептадеканоилфосфатидилхолин в качестве внутреннего стандарта. Фосфолипиды отделяют от нейтральных липидов, таких как холестерин, на силикагелевых пластинах (Merck 60), проявляемых в смеси изогексан : эфир : муравьиная кислота, 80:20:2 (об./об./об.). Фосфолипидное пятно визуализируют обрызгиванием раствором примулина и проводят сравнение с аутентичными фосфолипидными стандартами. Добавляют метиловый эфир гениказоновой кислоты (С21:0) в качестве 2-го внутреннего стандарта и фосфолипиды превращают в метиловые эфиры умеренным кислотным гидролизом 1% метанольным раствором H2SO4 в течение ночи при 50°С. Профиль жирных кислот различных образцов определяют методом газожидкостной хроматографии.
Результаты
Действие против деменции полученного из коры головного мозга коровы PS (ВС-PS) показано в нескольких исследованиях с двойным контролем плацебо, см. обзор Kidd Р. (1996), Alt. Med. Rev., 1(2):70-84. В прошлом десятилетии показано, что как ВС-PS, так и перефосфатидилировнный PS лецитина сои (SB-PS) восстанавливает вызванную скополамином амнезию у грызунов, хотя композиции жирных кислот в этих соединениях существенно различаются [Zanotti A. et al. (1986), Psychopharmacology (Berl), 90(2):274-5; Carlo F. et al. (1999), Physiol. Behav., 67(4):551-4; Sakai M. (1996), Nutr. Sci. Vitaminol. (Tokyo), 42(l):47-54; Furushiro M. et al. (1997), Jpn. J. Pharmacol., 75(4):447-50]. Способ введения PS в указанных работах был преимущественно внутривенным или интраперитонеальным, хотя Furushiro et al. также описали пероральное введение SB-PS, противодействующего амнезийному действию скополамина. Однако в последней работе авторы использовали сравнительно высокую дозу SB-PS, колеблющуюся от 60 до 240 мг/кг.
В данном исследовании вышеуказанные добавки (корма i, ii, iii, iv и v) добавляют в корм для крыс в течение трех месяцев до проведения испытания в лабиринте. В стадии обнаружения (фиг.1A-1D) имеется ожидаемое и заметное увеличение длительности латентного периода по поиску платформы после введения скополамина (1 мг/кг) во всех группах. Хотя кривые латентного периода в группах МСТ и PS-ω3 схожи, имеется статистически небольшое отличие в изменении латентного периода, вызванное скополамином, в группе PS-ω3 относительно латентного периода, показанного группой МСТ (величина Р<0,07 против величины Р<0,0007 соответственно). Подобным образом, группы, обработанные SB-PS или LC-PUFA, показывают ослабленное действие скополамина на их кривые узнавания относительно группы МСТ (см. фиг.1A-1D). При схожей скорости решения задачи во всех группах имеется сходство с результатами, представленными Blockland et al. [Blockland et al. (1999), Nutrition, 15(10):778-83], которые показали отсутствие различия между PS, полученными из различных источников и чистого носителя в испытании в водном лабиринте.
Особенностью настоящего испытания является ускоренное решение задачи под воздействием скополамина. Ранее это не было показано [Furushiro et al. (1997), цит. выше; Suzuki et al. (2000), Jpn. J. Pharmacol., 84, 86-8]. Следует отметить, что в указанных работах грызун встречается с другой задачей (пассивное уклонение). В работе Suzuki et al., 2001 (J. Nutr., 131:2951-6) авторы использовали значительно более взрослых крыс (возраст 24-25 месяцев), чем подопытные крысы в настоящем испытании. Латентный период на стадии обнаружения было существенно длиннее у более взрослых крыс по сравнению с молодыми крысами, которых подвергали испытанию (восьминедельные). Представляет интерес то, что хотя латентный период в данном испытании у крыс, не подвергавшихся воздействию седативного средства, иногда сравним с показателями для более молодых крыс, подвергавшихся испытаниям в работе Suzuki et al. [Suzuki et al. (2001), цит. выше], латентный период амнезии, вызванной скополамином, в группе МТС сходен с периодом, полученным в описанной работе для более взрослых крыс. В итоге, скополамин вызывает сравнительно длительный латентный период в контрольной группе (МСТ). Такой эффект продлевается в разной степени длительной обработкой крыс или PS или LC-PUFA.
В испытании с датчиком крысы, обработанные PS-ω3, показывают явно большую склонность, чем обработанные МСТ (Р<0,085), находиться в зоне, в которой платформа располагалась во время решения задачи обнаружения (фиг.2), что указывает, что крысы знают пространственное местоположение платформы. Кроме того, крысы, обработанные PS-ω3, показывают пониженную склонность (Р<0,08) плавать в периферической зоне, но предпочитают находиться в центральной зоне. Такие последние показатели, представленные группой PS-ω3, соотносятся с характеристикой большей смелости и иногда могут коррелировать с результатами поведенческого испытания в открытом поле. Представляет интерес, что в работе Blockland et al. [Blockland et al. (1999), цит. выше] мыши, обработанные ВС-PS, показали несущественную, но явную склонность к уменьшенному риску в поведенческом испытании в открытом поле, проводя меньше времени в центральной области. Что касается заметных способностей к узнаванию, демонстрируемых крысами, обработанными PS-ω3, интересно сравнить их поведение в водном лабиринте Морриса в испытании с пространственным датчиком с поведением животных, обработанных SB-PS, в работе Suzuki et al. [Suzuki et al., (2001), цит. выше]. Хотя процент времени, проводимого в квадранте, где находилась платформа, схож (~45%), заметно, что дозировка в данном исследовании составляет только одну треть от уровней, вводимых в работе Suzuki et al., 2001 (20 мг/кг против 60 мг/кг соответственно). Действительно, в данном исследовании нет существенного изменения во времени, какое крысы, обработанные SB-PS (20 мг/кг), проводят в данном квадранте при сравнении с величинами, полученными для группы, обработанной МСТ [фиг.1С и фиг.1А соответственно]. В итоге, способности к узнаванию группы, обработанной PS-ω3, заметно выше, чем в контрольной группе, при сравнительно низком уровне введения PS. Кроме того, крысы, обработанные PS-ω3, менее осторожны и более смелы при исследовании лабиринта в отсутствие платформы.
Наконец, наиболее выдающимся и характерным результатом, полученным в настоящем исследовании, является реакция на возвращение платформы. Все группы, находящиеся под воздействием скополамина, показывают более короткий латентный период поиска платформы в первом сеансе при сравнении с периодом, полученным в группе, обработанной МСТ (фиг. 3A-3D). Такие данные наводят на мысль, что LC-PUFA и в большей степени PS могут смягчать амнезию, вызванную скополамином, как показано ранее в других исследованиях (см. ссылки, приведенные выше).
Неожиданно во втором сеансе не оказалось различий в латентном периоде поиска платформы после ее возвращения между всеми группами, за исключением группы, обработанной PS-ω3. Действительно, оказалось, что при всех обработках, кроме PS-ω3, не существует процесса узнавания позиции платформы. Группа, обработанная PS-ω3, заметно отличается по поведению; оказалось, что не существует задержки в узнавании возвращенной платформы у крысы, обработанной антимускариновым лекарственным средством. Оказалось, что способность крыс группы, обработанной PS-ω3, отыскивать платформу после ее возвращения противоречит результату, полученному ранее в испытании с пространственным датчиком (фиг.2), где указанные крысы отдавали предпочтение третьему квадранту. Pearсе с сотрудниками [Pearсе et al. (1998), Nature, 396:75-77] попытались разрешить данное несоответствие, описывая два способа запоминания специфического пространственного расположения. В одном используется когнитивная карта, кодирующая информацию примерного геометрического соотношения между объектом и некоторыми ориентирами (метод когнитивной карты), а в другом используется направляющие векторы, которые точно определяют направление и расстояние от отдельного ориентира до объекта (метод направляющих векторов). В настоящем испытании крысы могут обнаружить платформу по вышеуказанным сигналам и/или расстоянию и направлению относительно стенок. При обнаружении и испытании с пространственным датчиком оба метода вносят вклад в успех в поиске платформы. Однако в испытании с возвращением когнитивные способности, связанные с методом направляющих векторов, и кратковременная память (оперативная память) обнаруживают различие. Метод направляющих векторов, поскольку возвращение не влияет на расстояние от стенки (только квадрант), и оперативная память из-за благоприятствования запоминанию участков уже использовались, что дает возможность эффективного поиска в данной группе.
Ранее сообщалось, что механизм, по которому PS смягчает действие скополамина, можно приписать не только благоприятному действию на холинергическую схему, но также возможности PS оказывать действие на серотонергическую нейронную систему [Furushiro et al. (1997), цит. выше]. Оказывается, что представленные результаты могут являться результатом изменений нескольких нейронных систем, возможно, и допаминергической. В более ранней работе [Drago et al. (1981), Neurobiol. Aging, 2(3):209-13] предполагалось, что изменение в полученном изменении поведения между обработанными ВС-PS взрослыми крысами и их контролем можно приписать не только изменениям в холинергической и серотонергической трансмиссиях, как описано выше, но также воздействию на катехоламинергическую (подобную допамину) систему. В данном исследовании облегченное обнаружение из поведения с активным уклонением, как в ситуациях в испытаниях в ящике-челноке и с частой сменой полюсов, и сохранение рефлексов активного и пассивного уклонения улучшались у крыс, обработанных PS. Tsakiris [Tsakiris S. (1984), Z. Naturforsch., [С], 39(11-12): 1196-8] сообщает о косвенном влиянии PS на связанную с допамином аденилатциклазу через механизм текучести мембран. Интересно, что также сообщается [Chalon et al. (1998), J. Nutr., 128(12):2512-9], что корм, обогащенный большим количеством PUFA (n-3), может оказать действие на корковую допаминергическую функцию. Понятно, что наличие LC-PUFA на остове фосфолипидов весьма благоприятно в смысле такого мультинейротрансмиттерного механизма.
Биохимические анализы полученных результатов в тканях печени (фиг.4А) показывают, что у крыс, получавших PS в течение трех месяцев (SB-PS и PS-ω3), имеется заметное повышение уровней основных фосфолипидов, т.е. фосфатидилхолина (PC). Такие данные согласуются с наблюдениями, сделанными ранее, касающимися печени и ее основной роли в поглощении фосфолипидов и первичном метаболизме большинства жирных кислот.Wijendran с сотрудниками [Wijendran et al. (2002), Pediatr. Res., 51:265-272] описывают исследование, в котором бабуинов кормили кормом с меченой LC-PUFA на остове PC и триглицеридов, и показано, что уровни внедрения LC-PUFA в печени в остове фосфолипидов выше, чем степень встраивания LC-PUFA в остов триглицеридов. Кроме того, оценивали уровни PS в случае корма крыс с PS-ω3 в анализах коркового вещества на распределение фосфолипидов (фиг.4В) по сравнению с МСТ. Интересно, что профиль жирных кислот в фосфолипидах указанных корковых веществ (см. таблицу) показывает заметное повышение содержания DHA в случае корма крыс с PS-ω3 (Р=0,007). Подобное повышение отмечалось для корма крыс с LC-PUFA, однако в меньшей степени по сравнению с обработкой PS-ω3 (14,6 против 17,5 соответственно, Р=0,03) и МСТ (14,6 против 12,3 соответственно, Р=0,02). Такое различие в уровнях DHA между группами омега-3 может вызвать предположение об усиленной биологической доступности DHA, когда она образует эфир с остовом фосфолипидов, а не триглицеридов. Подобные выводы сделаны Lemaitre-Delaunay с сотрудниками [Lemaitre-Delaunay et al. (1999), J. Lipid Res., 40:1867-1874], когда они исследовали кинетику и путь метаболизма меченой DHA в триглицеридах при сравнении с обогащением ею лизофосфатидилхолина, и Wijendran et al. [Wijendran et al., цит. выше] в вышеуказанной работе с бабуинами.
Интересно, что такое возрастание содержания DHA в корковом веществе крыс, питавшихся как PS-ω3, так и LC-PUFA, сопровождается статистически значимым снижением в фосфолипидных фракциях уровней олеиновых кислот и иногда в меньшей степени снижением содержания линолевой кислоты (см. таблицу). Подобные изменения в соотношениях в профиле жирных кислот показано другими исследователями при кормлении грызунов кормами, обогащенными LC-PUFA [например, Yamamoto et al. (1987), J. Lipid Res., 28:144-151]. Группа SB-PS показывает профиль, весьма схожий с профилем для группы МСТ.
В итоге, улучшенное поведение крыс, обработанных PS-ω3, находящихся под воздействием скополамина, в испытании в водном лабиринте Морриса существенно подтверждает возможности PS-ω3 как действенного средства против деменции и связанного с возрастом ухудшения памяти. Такое когнитивное усиление также подтверждается биохимическими данными о повышенном содержании фосфолипидов в тканях печени и головного мозга (фиг.4А-4В) и повышенном содержании DHA, присоединенной к фосфолипидам, в корковом веществе крыс, которых кормили PS-ω3.
Таблица суммирует действие пищевого LC-PUFA из разных источников на профиль жирных кислот в фосфолипидах головного мозга у крыс Wistar преклонного возраста. Жирные кислоты из очищенных фосфолипидных фракций анализируют методом газожидкостной хроматографии. Содержание основных жирных кислот выражают в % от общего содержания жирных кислот в фосфолипидах. Величины представляют среднее ± станд.откл. для четырех крыс на обработку. Статистическая значимость между различными добавками и группой МСТ приводится как * Р<0,05;
** Р<0,01.
| Жирные кислоты | МСТ | LC-PUFA | SB-PS | PS-ω3 |
| С16:0 | 12,9±1,4 | 14,6±4,7 | 13,7±4,7 | 13,6±4,4 |
| С16:1 | 1,0±0,7 | 1,0±0,3 | 1,5±0,4 | 1,5±0,8 |
| С18:0 | 17,9±1,0 | 20,1±1,3* | 17,2±2,8 | 18,0±5,5 |
| С18:1 (п-9) | 36,5±1,8 | 32,0±2,8* | 37,0±6,8 | 30,7±4,1* |
| С18:1 (п-7) | 3,7±0,5 | 4,3±0,2* | 4,0±0,3 | 4,8±1,5 |
| С18:2 | 7,2±0,7 | 4,5±0,6** | 7,1±2,6 | 5,1±2,7 |
| С20:1 | 2,5±0,5 | 2,9±0,8 | 2,1±0,4 | 2,3±0,3 |
| С22:6 | 12,3±1,7 | 14,6±0,6* | 12,4±3,2 | 17,5±2,4** |
| С24:1 | 3,4±1,0 | 3,3±1,3 | 2,8±0,9 | 2,0±1,2* |
| Остальные | 2,7±0,1 | 2,8±0,4 | 2,1±0,9 | 4,5±3,0 |
Пример 2. PS-омега-3 в лечении детей с ADHD
Расстройство дефицит внимания/гиперактивность (ADHD) охватывает обширную группу проблем поведения и обучения, и его определение и диагноз остаются спорными [Kamper (2001), J. Pediatr., 139:173-4; Richardson et al. (2000), Prostaglandins Leukot. Essent. Fatty Acids, 63(1-2):79-87]. Общепризнано, что этиология ADHD является как сложной, так и многофакторной. Традиционно ADHD является диагнозом, используемым для описания детей, которые являются невнимательными, импульсивными и/или гиперактивными. Приблизительно 20-25% детей с ADHD показывают одно или несколько проявлений неспособности к обучению в игре, обучению чтению или письму [Barkley R.A. (1990), Attention-deficit hyperactivity disorder: a handbook for diagnosis and treatment. New York: Guilford Press]. Детям с ADHD часто трудно сосредоточиться и направить внимание, и они имеют низкую самооценку. По скромным оценкам, 3-5% детей школьного возраста имеет ADHD [American Psychiatric Association. Diagnostic and statistical manual of mental disorders. 4th ed. (DSM-IV), Washington, DC: American Psychiatric Association, 1994]. Лечение ADHD включает поведенческую терапию и лекарственную терапию, главным образом, метилфенидатом (риталин™). Психостимулирующие лекарственные средства и антидепрессанты часто используют как успокоительные для детей с ADHD со степенью эффективности ~75% (Swanson et al., Except Child., 1993, 60:154-61). Преимущества применения таких лекарственных средств включают быструю реакцию, легкость применения, эффективность и относительную безопасность. Недостатками являются возможное побочное действие, в том числе пониженный аппетит и ослабленный рост, инсонмия, повышенная чувствительность и возвратная гиперактивность, когда прекращается прием лекарственных средств [Ahmann et al. (1993), Pediatrics, 91:1101-6]. Более того, указанные лекарственные средства не направлены на глубинные причины ADHD. Таким образом, исследования по выяснению возможных факторов, вносящих вклад в поведенческие проблемы при ADHD, могут привести к более эффективным лечебным стратегиям для некоторых детей.
Жирные кислоты омега-3 специфически вовлекаются в поддержание функции центральной нервной системы. Недостаток жирных кислот ω-3 у крыс и обезьян связан с поведенческой, сенсорной и неврологической дисфункцией [Yehuda et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:10345-9; Reisbick et al. (1994), Physiol. Behav., 55:231-9; Enslen et al. (1991), Lipids; 26:203-8]. Некоторые исследования сосредоточены на метаболизме незаменимых жирных кислот у детей с ADHD [Colquhoun et al. (1981), Med. Hypothesis, 7:673-679]. Сообщается, что дети с гиперактивностью хотят пить чаще, чем здоровые дети, и имеют симптомы экземы, астмы и других аллергий [Mitchell et al. (1987), Clin. Pediatr., 26:406-11]. Например, в поперечном углубленном исследовании 6-12-летних мальчиков, выбранных в центральной Индиане, показано, что 53 ребенка с ADHD имеют существенно меньшие доли ключевых жирных кислот в полярных липидах в плазме [арахидоновой кислоты (АА, 20:4n-6), эйкозапентаеновой кислоты (ЕРА; 20:5n-3) и докозагексаеновой кислоты (DHA; 22:6n-3)] и общих липидах эритроцитов (20:4n-6 и 22:4n-6), чем 43 контрольных ребенка [Stevens et al. (1995), Am. J. Clin. Nutr., 62:761-8]. Однако в недавних работах [Hirayama et al. (2004), Eur. J. Clin. Nutr., 58(3):467-73; Voigt et al. (2001), J. Pediatr., 139(2): 189-96], в которых исследовалось, будет ли добавление DHA приводить к ослаблению симптомов у детей с ADHD, предполагается, что пристальное внимание следует уделять тому, как использовать жирную(ые) кислоту(ы). В указанных работах показано только незначительное, если оно вообще имеется, благоприятное действие от добавления DHA.
Недавно сделано предположение, что одним из возможных решений при дефиците питательных веществ, который обычен при ADHD, может быть добавление PS [Kidd (2000), Altern. Med. Rev., 5(5):402-28].
Метод
Субъекты и питание
Детям в возрасте 8-13 лет (90 человек), которым согласно DSM-IV поставлен диагноз ADHD, произвольно назначают, в двойном контрольном опыте, прием PS-ω3 (300 мг/день; содержит в целом 450 мг/день DHA/EPA), 450 мг/день DHA/EPA или масла канола (30 на группу) в течение двух месяцев, причем без приема в то же время стимулирующих лекарственных препаратов или других добавок. Характеристика ребенка как имеющего ADHD включает оценку ниже -1,8 в Test of Variables of Attention.
Анализ данных
В итоге испытания детей с ADHD оценивали согласно оценкам родителей по шкале оценок поведения (шкала оценок Коннора).
Результаты и обсуждение
Использование дополняющего лечения особенно распространено среди пациентов с хроническими, неизлечимыми или часто рецидивирующими состояниями. Например, применение дополняющей и альтернативной лекарственной терапии (САМ) обычно для детей с раковым заболеванием, астмой и кистозным фиброзом. Родители или пациенты, которые прибегают к САМ, типично поступают так, поскольку такое лечение более согласуется с их представлениями, они ему больше доверяют и оно воспринимается как более естественное и менее опасное, чем обычное лечение. Большинство таких пациентов не отказывается от основного лечения, но используют травы и другие формы САМ как вспомогательное лечение. Только меньшая часть (<40%) говорит со своими педиатрами о применении ими САМ. Из-за репутации и побочного действия, которые сопровождают применение стимуляторов, многие семьи для лечения ADHD обращаются к САМ. Типично, только 70% детей реагируют на стимуляторы, такие как риталин™, и из них приблизительно половина сообщают о побочном действии таких лекарственных средств. При осмотре в Австралии в многопрофильном специализированном Центре исследования АДНД из 290 семей 64% попробовало, по меньшей мере, одно “другое лечение”, чаще всего - ограничение питания, прием поливитаминов и трудовую терапию [Stubberfield et al. (1999), J. Paediatr. Child Health, 35:450-3].
В данном исследовании различные добавки вводят в состав популярной шоколадной массы (см. ниже). Использование такой основы позволяет родителям давать лечебные средства своим детям в нестандартной форме и обеспечивает ослабленное органолептическое действие, характерное для соединений, полученных из морепродуктов (см. ниже).
Отчет родителей об оценках по окончании периода лечения состоял из оценок дефицита внимания, гиперактивности и импульсивности детей, а также агрессии согласно оценкам родителей, учителей, братьев и сестер и сверстников. Результаты показывают явно значительный эффект плацебо. Такой эффект иногда снижается, если также рассматривать детей с ADHD, принимавших плацебо, которые не завершили исследование из-за серьезного ухудшения поведения. Оказывается, что большинство таких детей настаивало на возвращении назначения риталина™. Однако приведенные данные также ясно показывают, что PS-ω3 является сильным средством. В целом 70% родителей детей с ADHD, лечившихся PS-ω3, показали некоторое улучшение оценки поведения их детей, в то время как 50% таких родителей дали четкие показания о разностороннем благоприятном действии добавки на поведение их детей. Такое заметное действие в 2,2 раза превышает улучшение, полученное от плацебо (~30%). Сравнение родительских оценок влияния LC-PUFA на поведение детей с ADHD с параллельными оценками, которые последовали после трехмесячного приема PS-ω3, указывают на последний как имеющий более высокую оценку. Хотя оба соединения показали схожую степень незначительного улучшения, PS-ω3 имеет заметно большую степень существенного улучшения (47% против 35% соответственно) с наименьшими показателями отсутствия действия или ухудшения (21% и 11% против 26% и 17% соответственно). Указанные действия добавки PS-ω3 можно приписать как усиленной биологической доступности жирных кислот омега-3, так и лучшему документированию действий PS на настроение при стрессе и тревоге.
Пример 3. Влияние потребления PC-DHA на мышей АроЕo
Методы
Питание животных
Мышам с дефицитом аполипопротеина Е (АроЕo) [Hayek Т. et al. (1994), Biochem. Biophys. Res. Commun., 201:1567-1574) в возрасте 8 недель назначают произвольно (5 мышей на каждую группу) обогащенный LC-PUFA лецитин (30% омега-3 от всей композиции жирных кислот; группа PC-DHA) или плацебо. Мышей кормят, кроме регулярного обильного кормления, один раз в каждые три дня или 25 мкл PC-DHA или PBS через желудочный зонд в течение 10 недель.
Каждая мышь потребляет приблизительно 5 мл воды/сутки и 5 г корма/сутки.
Перекисное окисление липидов сыворотки
Сыворотку разбавляют PBS 1:4. Чувствительность сыворотки к окислению определяют, инкубируя образец сыворотки с 100 мМ соединения, генерирующего свободные радикалы, гидрохлорида 2',2'-азо-бис-2'-амидинопропана (ААРН), который является водорастворимым азосоединением, разлагающимся термически с образованием пероксидных радикалов с постоянной скоростью. Образование соединений, реагирующих с тиобарбитуратом (TBARS), и пероксидов липидов определяют и сравнивают с сывороткой, которую инкубируют в тех же условиях, но без ААРН.
Результаты и обсуждение
Мышей АроЕ° широко используют в качестве животной модели атеросклероза, так как у них развивается тяжелая гиперхолестеринемия и атеросклеротические повреждения от обильного корма. Кроме того, ускоренный атеросклероз у указанных мышей ассоциируется с повышенным перокислением липидов липопротеинов плазмы и артериальных клеток [Hayek Т. et al. (1994), цит. выше; Keidar S. (1998), Life Sci., 63:1-11].
Фиг.6 показывает, каким образом длительное потребление PC-DHA мышами АроЕo приводит к явной тендеции (Р<0,10) к снижению чувствительности сыворотки к окислению, вызываемому ААРН, на 16% (по сравнению с плацебо).
Органолептические проблемы
Использование липидов омега-3 при многих применениях, и в особенности в качестве ингредиента функциональных пищевых продуктов, сдерживается из-за их характерного запаха рыбы. Таким образом, еще одним преимуществом ингредиентов изобретения - обогащенных омега-3 фосфолипидов - является то, что у них менее выраженный запах или вкус ацильных групп омега-3 из-за ковалентного связывания указанных групп с остовом PS. При этом повышается давление паров указанных веществ, причем вследствие этого ослабевает их характерный запах. Таким образом, ковалентное связывание жирных кислот омега-3 с фосфолипидным остовом, в особенности PS, изменяет и улучшает их вкусовые свойства. Кроме того, PS-ингредиент изобретения также обладает улучшенной устойчивостью чувствительных к окислению жирных кислот омега-3. Известно, что фосфолипиды вообще, и PS в частности, действуют как антиоксиданты и стабилизаторы.
Указанные преимущества делают данный новый липидный препарат изобретения весьма выгодным и важным при различных применениях, в особенности в функциональных пищевых продуктах, где устойчивость, запах и вкус являются основными требованиями.
Кроме того, указанные новые ингредиенты можно ввести в составы с другими липидами для еще большего усиления биологической функциональности и эффективности.
Исходное соединение, используемое в вышеописанном клиническом испытании в случае больных с ADHD, представляет собой обогащенный LC-PUFA PS, смешанный с рыбьим жиром. Изначально данный продукт и контрольный рыбий жир вводили в состав пищевых продуктов, подобных высококалорийным плиткам; однако ответы от групп экспертов были категорически отрицательные, что указывало на серьезные органолептические проблемы. Для того чтобы преодолеть такой вкусовой барьер, продукт изобретения с PS-ω3 обезжиривали. Конечный продукт такого способа представляет собой пасту, которую затем при введении в композицию или с инертными или с доминирующими по органолептическим показателям насыщенными жирами можно легко ввести в состав шоколада в плитках, шоколадного масла, кукурузных хлопьев, покрытых шоколадом, молочных продуктов с низким содержанием жиров или сгущенного молока без сахара. Каждая из таких композиций вызывает явно ослабленные возражения в связи с органолептическими свойствами как групп экспертов, так и добровольцев в испытаниях.
Производные полярных липидов PUFA, такие как производные PS-PUFA, показывают высокую устойчивость как препараты и, кроме того, при некоторых применениях в пищевых продуктах, используемых в клинических испытаниях данного изобретения. Такая устойчивость указанных чувствительных соединений возникает из ковалентных связей фософлипидов, о которых ранее было известно, что они используются в качестве консервантов, и нестабильных групп PUFA.
Устойчивость коммерчески полученного рыбьего жира (жирная кислота омега-3) для лабораторного питания грызунов [Lytle et al. (1992), Nutr. Cancer, 17(2):187-94] или как обогащающего ингредиента в пастообразных жирах [Kolanowski et al. (2001), Int. j. Food Sci. Nutr., 52(6):469-76] освещалась в некоторых исследованиях с целью усиления информированности общества о благоприятном воздействии LC-PUFA. Основные усилия направляются на поддержание устойчивости рыбьего жира к окислению, так как такие жирные кислоты подвергаются быстрому и/или обширному окислению и другим химическим изменениям под воздействием воздуха, света или тепла во время переработки или при хранении в течение периодов времени различной продолжительности. Обычным решением, представляемым в таких работах, является добавление к основе рыбьему жиру антиоксидантов, подобных бутилированному гидрокситолуолу, бутилированному гидроксихинону и альфа-токоферолу, или, с другой стороны, разбавление концентрированного рыбьего жира до предела в 1% насыщенными жирами. Однако Song с сотрудниками [Song et al. (1997), Biosci. Biotechnol. Biochem., 61(12):2085-8] уже оценили устойчивость к перокислению жиров, содержащих DHA в форме фосфолипидов, триглицеридов и этиловых эфиров, при хранении без тары в течение 10 недель в темноте при 25°С. Они показали, что в фазе хранения без тары жир, содержащий DHA в форме фосфолипидов, более устойчив к окислительному разложению DHA, чем жир с DHA в форме триглицеридов и этиловых эфиров.
Вышеописанные продукты, содержащие PS-ω3, используемые для клинических исследований, проверяли на срок их годности и устойчивость при комнатной температуре. Сгущенное молоко с сахаром, обогащенное PS-ω3 (1 г продукта на 10 мл молока) анализировали методом 31Р-ЯМР на устойчивость в циклах замораживание-оттаивание в течение недели и обнаружили, что оно устойчиво. На следующем этапе PS-ω3 в основе - шоколадной массе (0,75 г продукта на 20 г шоколадного масла) - проверяли на устойчивость после двухнедельного хранения при комнатной температуре. Такая композиция также показывает устойчивый процент PS в анализе методом 31Р-ЯМР. В заключение установлено, что фосфолипиды, содержащие PS-ω3, высокоустойчивы при комнатной температуре, а также в циклах замораживание-оттаивание, в отличие от ω3-содержащих триглицеридов, о которых известно, что они быстро портятся после израсходования антиоксидантов.
1. Применение препарата, включающего смесь конъюгатов серина глицерофосфолипида с ЕРА и DHA, в которой каждый конъюгат глицерофосфолипида представлен формулой (I)
где R” является серином;
где каждый R и R' могут являться идентичными или различными и могут быть атомом водорода, ацильной группой ЕРА или ацильной группой DHA;
где количество ЕРА и DHA в препарате составляет 10-50% по массе от общего содержания жирных кислот в указанном препарате, и
где смесь не является идентичной естественному PS головного мозга человека или млекопитающего,
для производства продукта для лечения синдрома дефицита внимания и сосредоточенности, проблем с поведением или обучением, или когнитивных или умственных состояний или нарушений.
2. Применение по п.1, в котором когнитивные или умственные состояния или нарушения выбраны из группы, включающей нарушение памяти, расстройство обучения, снижение когнитивной способности, общего когнитивного и умственного состояния.
3. Применение по п.2, в котором когнитивные или умственные состояния или нарушения выбраны из группы, включающей: деменция, болезнь Альцгеймера, сенильная деменция, депрессия, болезнь Паркинсона, рассеянный склероз (MS), дислексия, интенсивность энцефалограммы, утилизация глюкозы головным мозгом, стресс, тревога, умственные и психические расстройства, расстройства настроения, неврологические расстройства, гормональные расстройства, старение, нарушение зрения и нейродегенеративные болезни.
4. Применение по п.1, в котором количество ЕРА и DHA в препарате составляют 20-50% по массе от общего содержания жирных кислот в указанном препарате.
5. Применение по п.1, в котором проблемой с поведением или обучением является расстройство - дефицит внимания и гиперактивность (ADHD).
6. Применение по п.1, в котором указанный конъюгат глицерофосфолипида получают ферментативным перефосфатидилированием липида из липидного источника, предпочтительно любого растительного или животного источника или микроорганизма.
7. Применение по п.1, в котором продуктом является фармацевтическая композиция.
8. Применение по п.7, где фармацевтическая композиция дополнительно содержит, по меньшей мере, одну фармацевтически приемлемую добавку, разбавитель или наполнитель.
9. Применение по п.7, где фармацевтическая композиция дополнительно содержит, по меньшей мере, один дополнительный фармацевтически активный агент.
10. Применение по п.7, где фармацевтическая композиция доставляется перорально или внутривенно.
11. Применение по п.1, в котором продуктом является нутрицевтическая композиция.
12. Применение по п.11, где упомянутая нутрицевтическая композиция находится в форме мягких капсул, таблеток, сиропов или другой системы доставки биологически активной добавки.
13. Применение по п.1, в котором продуктом является функциональный продукт.
14. Применение по п.13, где функциональный продукт является молочным продуктом, мороженым, сухим печеньем, соевым продуктом, хлебобулочным изделием, мучным кондитерским изделием, хлебом, соусом, супом, готовым блюдом, замороженным продуктом, приправой, кондитерским изделием, маслом, жиром, маргарином, спрэдом, начинкой, зерновым продуктом, быстрорастворимым продуктом, напитком, коктейлем, детской молочной смесью, продуктом детского питания, батончиком, снеком, конфетой или шоколадным продуктом.
15. Применение по п.5, где ADHD присутствует у детей.
