Способ производства 5'-инозиновой кислоты

 

ОП ИСАНИ Е

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

Вова Советских

Социалистических

Республик

11й

Зависимый от патента №

Кл. 6а, 14

МПК С 121с

УДК 663,11.091:547. .963.32 (088.8) Заявлено 16,VI I.1964 (№ 912271/28-13) Приоритет

Комитет по делан иаобретений и открытий при Совете Мииистрое

СССР

Опубликовано 10.Ч11.1969. Бюллетень № 23

Дата опубликования описания 15.XII.1969

Авторы изобретения

Иностранцы

Шукуо Киношита, Яошиаки Кавамори, Кунизо Мизухара, Яошинобу Мияамура и Такео Сузуки (Япония) Иностранная фирма

«Каиова Хакко Когаио Ко, Лимитед», (Япония) Заявитель

СПОСОБ ПРОИЗВОДСТВА 5 -ИНОЗИ НОВОЙ

КИСЛОТЫ

Известен, способ получения 5 -инозиновой кислоты путем выращивания микроорганизмов, продуцирующих ее составные части гипоксантин и D-рибозу.-5-фосфорную кислоту на питательной среде, содержащей источник углевода, необходимые минеральные соли и стимуляторы роста с последующим смешиванием этих составных частей .и .выделением

5 -инозино вой,кислоты из полученной смешанной культур альной жидкости одним из известных способов, например при помощи ионообменных смол.

Предлагаемый:способ позволяет увеличить выход 5 -инозиновой кислоты.

Для этого в качестве,продуцентов используют штамм Brevibacterium ammoniagenes № 7209-1 АТСС ¹ 15454 и АТСС № 15187, а в качестве продуцента D-рибозы-5-фосфорной кислоты — Brevibacterium ammoniagenes

АТСС № 6872, обладающий активностью нуклеотид,пирофосфорилазы.

Способ получения 5 -инозиновой кислоты заключается в том, что микроорганизм Brevibacterium ammoniagenes № 7209-1 (АТСС № 15454 или Brevibacterium ammoniagenes

АТСС № 15187) сначала выращивают в вод,ной питательной среде, содержащей источники углевода, например глюкозу, амилодекстрин, отходы мелассы; источники азота, например, мочввину, аммиак или аммиачные соли, источники фосфора, калия, например двухо-новный фосфат кальция, одноосновный фосфат кальция, сульфат магния, сульфат калил, хлорид натрия и хлорид кальция, а также

5 стимуляторы роста, например дрожжевой экстракт, казеин, гидролизат соевого жмыха,,пептон, биотин, аденин.

Культивирование происходит |в аэробных условиях при температуре 30 С в течение 16—

10 24 час. Затем выращенные клетки пересеивают в свежую питательную среду вышеописанного состава для накопления гппоксантина.

Культивирование производят в условиях

15 аэрации при температуре 28 — 40 С, рН среды

6,0 — 8,0 в течение 2 — 4 дней. Значение р1-1 среды устанавливают с помощью мочевш|ы или аммиака. Ферментацию проводят до тех

rtop, пока не накопится 3 — 8 ма гипоксантши на 1 мл среды.

Одновременно выращивают микроорганизм

Brevibacterium ammoniagenes АТСС М 6872, способный продуцировать D-рибозу-5-фосфор ную кислоту, обладающий активностью нук25 леотид пирофосфорилазы, также в две стадии, на такой же питательной среде, прп тех же условиях.

Максимальное накопление ферментов наблюдается тогда, когда содержание сахара

30 в питательной среде снижается с 4 до 2 о, 248566

0,4

Затем культур альную жидкость, содержащую гипоксантин,,при перемешивании смешивают с культуральной жидкостью, содержащей нуклеотид пирофосфорилазы и D-рибозу5-фосфорную кислоту в соотношении от 1: 1 до 2: 1, целесообразно 1: 1, в результате чего гипоксантин .вступает в реакцию с D-prtonзой-5-фосфорной кислотой в присутствии ферментов, при этом образуется 5-инозиновая кислота. Для стимулирования образования последней в полученную смесь можно дооавлять различные сахариды. Процесс длится B течение 24 — 36 час.

После максимального накопления кислоты клетки удаляют одним из известных способов, например центрифугированием, а 5 -инозиновую кислоту получают из центрифугата путем пропуска его через ионообменную смолу.

Пример 1.

Штамм Brevibactcrium ammoniagenes 7209-1 (АТСС _#_ 15454) выращивают на питательной среде, содержащей, /о .. глюкозы 3 дрожжевого экстракта 2 пептона 1 хлорида натрия 0,25

Среду стерплизуют при температуре 120 С в течение 15 лгин.

Культивирование проводят в течение 24 час при температуре 30 С и постоя ином .встряхивании. Полученную маточную культуру в количестве 300 мл пересеивают в стерильную питательную среду, содержащую, /о. глюкозы 10 дрожжевого экстракта 0,5 двухосповного фосфата калия 0,4 одноосновного фосфата ,калия 0,4 сульфата магния 0,4 хлорида кальция 0,012

В течение 3 дней с помощью аммиачной воды pEI среды доводят до 7,0. В питательной среде образуется 4,1 лгг/лгл гипоксантина.

Одновременно выращивают микроорганиз..

Brevibacterium ammoniagenes АТСС № 6872 в течение 24 час,при температуре 30 С и nocTоянном встряхивании на стерильной питательной среде, содержащей, /о .. глюкозы 3 дрожжевого экстракта 2 пентона 1 хлорида натрия 0,25

Затем полученную маточную культуру в количестве 300 лил пересеивают,в 3 л свежей стерильной питательной среды, содержащей, о/о. глюкозы дрожжевого экстракта двухос новного фосфата калия 0,4 одноосновного фосфата калия 0,4 сульфата, магния 0,04 хлорида кальция 0,01

Выращивание проводят в течение 3 суток при перемешивании, насыщении кислородом и значении рН среды 7,0.

Культур альные жидкости, полученные на второй стадии выращивания Brevibacterium

ammoniagenes 7209-1 (ATCC № 15454 и л№ 6872) по 1,5 г каждой смешивают и добавляют глюкозу в таком количестве, чтобы в смеси ее было 5 /о.

Ферментацию 5 -пнозиновой кислоты проводят в течение 3 суток, поддерживают рН среды 7,0 посредством аммиачной воды. 3атем смесь подогревают для коагуляции клеток и отделяют их центрифугированием.

Центрпфугат пропускают через ионообменную смолу Диа-ион STELA, после чего ионообменную смолу промывают водой.

Полученный раствор 5 -инозиновой кислоты с рН, равным 2, вновь пропускают через ионообменпую смолу Диа-ион 2AIA.

Таким образом получают 240 лгл раствора инозиновой кислоты, из которого выделяют

0,5 Х соляной кислотой 42,8 г кристаллического натрия 5 -инозината.

Для получения 5 -инозиновой кислоты используют штаммы Brevibacterium ammoniagenes М 7209-1 ATCC М 15454 и АТСС М 15187, продуцирующие гипоксантин и АТСС № 6872, продуцирующий D-рибозу-5-:фосфорную кислоту, обладающий активностью нуклеотид пирофосфорилазы.

Штаммы Brevibacterium ammoniagenes

7209-1 АТСС М 15454 и АТСС М 6872 характеризуются следующими морфологическими и культуральными признаками.

Оба штамма выделены из детского кала.

Морфология. Палочки с закругленными концами, размером 0,8 К 1,4 К 1,7 лк, одиночные, без капсул, неподвижные, грамположительные.

Минеральная среда. Агар, Колонии круглые, плоские гладкие, серого цвета. Иногда встречается слабо-желтый хромогенез.

1-1а косом агаре наблюдается умеренный рост. Колонии гладкие, плоские, светонепроницаемые, блестящие, консистенция сливочного масла, аморфные, без запаха.

Бульон: умеренное помутнение вблизи поверхности, пушистый осадок.

Желатин не разжижает.

Лакмусовое молоко слабо щелочное.

Индол не образует.

Отношение к нитратам. Переводит в нитриты.

Мочевину сбраживает с образованием аммиака.

Сыворотку крови не сжижает.

Аэроб, факультативный анаэроб.

Оптимальная температура развития 30 С, при 55 С.погибает за 10 лгин.

Оптимальный рН от 7,0 до 8,5.

Не патогенен.

Штамм Вге ibacterium ammoniagenes 7209-1

АТСС № 15187 получен путем обработки штамма № 6872 диэтилсульфатом.

248566

Предмет изобретения

Составитель Т. Полянская

Редактор Э. Н. Шибаева Техред А, A. Камышникова Корректор A. П. Васильева

Заказ 3250/16 Тираж 480 Подписное

ЦНИИПИ Комитета по делам изобретений и открытий при Совете Министров СССР

Москва К-35, Раушская наб., д. 4j5

Типография, пр. Сапунова, 2

Способ получения 5 -инозиновой кислоты путем, выращивания микроорганизмов, продуцирующих ее составные части — гипоксантин и D-рибозу-5-фосфорную кислоту на питательной среде, содержащей источник углевода, необходимые минеральные соли и стимуляторы роста с .последующим смешиванием этих составных частей и выделением 5 -инозиновой кислоты из полученной смешанной культуральной жидкости одним из известных способов,,например при помощи ионообменных смол, отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода 5 -инозиновой,кислоты, в

5 качестве продуцентов гипоксантина используют штаммы Brevibacterium ammoniageno..s № 7209-1, АТСС № 15454 или АТСС № 15187, а в качестве продуцента D-.ðèáîçû-5-фосфор,ной кислоты — Brevibacterium ammoniagenes

10 АТСС № 6872, обладающего активностью нуклеотид пирофосфорилазы.