Производные 13(1)-n-{2-[n-(клозо-монокарбадодекаборан-1-ил)-метил]аминоэтил}амид-15(2),17(3)-диметилового эфира хлорина e6, проявляющие свойства фотосенсибилизатора

Изобретение относится к производным 13(1)-N-{2-[N-(клозо-монокарбадодекаборан-1-ил)-метил]аминоэтил}амид-15(2),17(3)-диметилового эфира хлорина е₆ общей формулы

где M=Cs, Na, проявляющим свойства фотосенсибилизатора. Заявляемые соединения могут быть использованы в медицине в качестве агентов для борнейтронозахватной терапии (БНЗТ) и фотодинамической терапии (ФДТ) злокачественных новообразований. 1 табл., 2 ил.

 

Изобретение относится к новому соединению, а именно к производному 13(1)-N-{2-[N-(клозо-монокарбадодекаборан-1-ил)-метил]аминоэтил}амид-15(2),17(3)-диметилового эфира хлорина е₆ общей формулы

где

М=Cs (Ia), Na (I,),

проявляющему свойства фотосенсибилизатора.

Указанное соединение, его свойства и способ получения в литературе не описаны.

Известен ((13(1)-N-(2-(N-(1-о-карборанил)-метил)аминоэтил)-амид-15(2),17(3)-диметиловый эфир хлорина e₆) (соединение формулы II), (Кучин А.В., Ольшевская В.А., Мальшакова М.В., Белых Д.В., Петровский П.В., Иванов О.Г., Штиль А.А., Калинин В.Н. / Новые карборановые производные хлорина е₆. // ДАН, 2006, т.409, №4, с.493-496).

Соединение II получают путем алкилирования аминопроизводного хлорина е₆ (13(1)-N-(2-аминоэтил)-амид-15(2),17(3)-диметиловый эфир хлорина е₆) карборанилметилтрифлатом с образованием соответствующего карборанового производного II (13(1)-N-(2-(N-(1-о-карборанил)-метил)аминоэтил)-амид-15(2),17(3)-диметиловый эфир хлорина е₆). 13(1)-N-(2-Аминоэтил)-амид-15(2),17(3)-диметиловый эфир хлорина e₆ получают раскрытием экзоцикла метилфеофорбида с этилендиамином (D.V.Belykh, L.P.Karmanova, L.V.Spirikhin, A.V.Kutchin / Synthesis of chlorin e₆ amide derivatives // Mendeleev Commun., 2002, 12(2), 77-78) Карборанилметилтрифлат был получен из 1-гидроксиметил-о-карборана и трифлатного ангидрида (V.N.Kalinin, V.A.Ol'shevskaya, E.G.Rus, A.A.Tyutyunov, Z.A.Starikova, A.A.Korlyukov, D.D.Sung, A.B.Ponomaryov, P.V.Petrovskii and E.Hey-Hawkins / The first triflates: synthesis and reactivity of 1-trifluoromethanesulfonylmethyl- and 1,2-bis(trifluoromethanesulfonylmethyl)-o-carborane // Dalton Trans., 2005, p.903-908).

Известно соединение формулы III (тринатровая соль хлорина e₆, (препарат фотолон)), использующееся для фотодинамической терапии злокачественных новообразований (В.М.Царенков, А.Л.Мещерякова, О.Н.Альбицкая, В.И.Тюрин, М.В.Саржевская, М.А.Каплан, Н.Д.Кочубеева, И.Н.Журавкин, П.Т.Петров / Средство для фотодинамической терапии злокачественных новообразований - фотолон // Патент Белорусии BY 19990767).

Задачей настоящего изобретения является создание борированного производного хлорина е₆, обладающего фототоксической активностью, который может быть использован в качестве агента для борнейтронозахватной терапии (БНЗТ) и фотодинамической терапии (ФДТ) злокачественных новообразований.

Поставленная задача достигается производными 13(1)-N-{2-[N-(клозо-монокарбадодекаборан-1-ил)метил]аминоэтил}амид-15(2),17(3)-диметилового эфира хлорина e₆ (Ia и Iб), проявляющими свойства фотосенсибилизатора.

Соединение Ia получают алкилированием аминогруппы 13(1)-N-(2-аминоэтил)-амид-15(2),17(3)-диметилового эфира хлорина e₆ анионным 1-трифторметансульфонилметил-клозо-монокарбадодекаборанил цезием в присутствии N,O-бис-(триметилсилил)-ацетамида (BSA) в тетрагидрофуране в качестве растворителя. Выделенный и очищенный карборанилхлорин Ia растворяют в ацетонитриле, затем пропускают дважды через ионообменную смолу и выделяют готовый продукт (Iб) путем отгонки растворителя в вакууме. Реакции проводят в атмосфере инертного газа, такого как аргон или азот. Выходы заявляемых соединений Ia и Iб составляют 71% и 99.5% соответственно.

Реакцию осуществляют по следующей схеме:

Исходные вещества, растворители и реагенты, необходимые для синтеза заявляемых соединений, производятся промышленностью или являются коммерчески доступными, например, тетрагидрофуран (Т5267, Sigma), N,O-Бис(триметилсилил)ацетамид (BSA) (Fluka, 15241), ионообменная смола DOWEX 50 WX8-200 (Aldrich, 44514).

13(1)-N-(2-Аминоэтил)-амид-15(2),17(3)-диметиловый эфир хлорина е₆ получают по методике, описанной в работе (D.V. Belykh, L.P. Karmanova, L.V. Spirikhin, A.V. Kutchin / Synthesis of chlorin e₆ amide derivatives // Mendeleev Commun., 2002, 12(2), 77-78).

1-Трифторметансульфонилметил-клозо-монокарбадодекаборанил цезий получают по методике, описанной в работе (V.A.Ol'shevskaya, A.N.Savchenko, A.V.Zaitsev, E.G.Kononova, P.V.Petrovskii, A.A.Ramonova, V.V.Tatarskiy Jr., O.V.Uvarov, M.M.Moisenovich, V.N.Kalinin, A.A.Shtil / Novel metal complexes of boronated chlorin e₆ for photodynamic therapy//J. Organomet. Chem. 2008 DOI: 10.1016/j.jorganchem.2008.11.013)

Изобретение иллюстрируется конкретными примерами его осуществления, приведенными ниже.

Пример 1

Получение цезиевой соли 13(1)-N-{2-[N-(клозо-монокарбадодекаборан-1-ил)-метил]аминоэтил}амид-15(2),17(3)-диметилового эфира хлорина е₆(Ia)

К раствору 200 мг (0,3 ммоль) 13(1)-N-(2-аминоэтил)амид-15(2),17(3)-диметилового эфира хлорина е₆ и 184 мг (0,42 ммоль) 1-трифторметансульфонилметил-клозо-монокарбадодекаборанил цезия в 10 мл безводного ТГФ добавляют 2 мл BSA и перемешивают при комнатной температуре в течение 1 ч. В реакционную смесь добавляют 50 мл хлороформа, промывают водой, сушат над безводным сульфатом натрия. Растворитель отгоняют в вакууме, остаток очищают хроматографией на колонке с силикагелем (2×20 см), элюент-хлороформ-метанол(9:1). Выход 203 мг (71%).

ИК-спектр (КВr), ν (см^-1): 2530 (ВН), 1722 (С=O, сложный эфир), 1609 (хлориновая полоса), 1656 (амид I), 1520 (амид II).

Электронный спектр (ДМСО), λ_max, нм, (ε·10^-3): 404 (51,4), 501 (9,40), 610 (2,6), 663 (35,9).

Спектр ЯМР ¹Н ((CD₃)₂)СО), δ, м.д.: 9,79 (с, 1Н, 10-Н); 9,76 (с, 1H, 5-Н); 9,11 (с, 1Н, 20-Н); 8,24 (дд, 1Н, J=17,3 и 11,5 Гц, 3(1)-Н); 6,42 (д, 1H, J=18,3 Гц, 3(2)-Н(транс)); 6,16 (д, 1H, J=12,4 Гц, 3(2)-Н(цис)); 15(1)-СН₂: 5,53 (д, 1Н, J=18,5 Гц) и 5,36 (д, 1Н, J=18,7 Гц); 4,67 (кв, 1Н, J=7,5 Гц, 18-Н); 4,51 (уш.д., 1H, J=8,6 Гц, 17-Н); 4,13 (уш.с, 1Н, 13(1)-NH); 3,80 (кв, 2Н, J=7,5 Гц, 8(1)-СН₂); 3,75 (м, 4Н, 13(2)-СН₂, 13(3)-СН₂); 3,70 (с, 3Н, 15(3)-СН₃); 3,61 (с, 3Н, 17(4)-СН₃); 3,60 (с, 3Н, 12(1)-СН₃); 3,53 (с, 3Н, 2(1)-СН₃); 3,32 (с, 3Н, 7(1)-СН₃); 2.82 (с, 1Н, 13(3)-NH); 2.52 (с, 2Н, NH-СН ₂-С(карборан)); 2,35-2,21 (м, 4Н, 17(1)-СН₂ и 17(2)-СН₂)); 3.0-1.4 (уш.м., 11H, ВН), 1,71 (д, 3Н, J=7,1 Гц, 18(1)-СН₃), 0,88 (т, 3Н, J=7,5 Гц, 8(2)-СН₃); - 1,53 (уш.с, 1H, NH); - 1,82 (уш. с, 1H, NH).

Спектр ЯМР¹¹ В ((CD₃)₂CO), δ, м.д.: - 9,02 (д, 1B, J=136 Гц, В(12)); - 13,15 (д, 5В, J=130 Гц, В(2-6)); - 14,37 (д, 5В, J=154 Гц, В(7-11)).

Масс-спектр, (m/z): 821 [M-Cs]⁺; 954 [М⁺].

Пример 2

Получение натриевой соли 13(1)-N-{2-N-(клозо-монокарбадодекаборан-1ил)метил]аминоэтил}амид-15(2),17(3)диметилового эфира хлорина е₆(Iб)

Растворяют 40 мг (0,04 ммоль) соединения (Ia) в 100 мл ацетонитрила и пропускают через колонку (2×5 см) с ионообменной смолой DOWEX 50 WX8-200. Растворитель отгоняют в вакууме, остаток растворяют в 100 мл ацетонитрила и пропускают через ионообменную смолу. Растворитель отгоняют в вакууме. Выход 35,2 мг (99,5%).

ИК-спектр (KBr), ν (см^-1): 2528(ВН), 1721 (С=О, сложный эфир), 1606 (хлориновая полоса), 1657 (амид I), 1519(амид II).

Электронный спектр (ДМСО), λ_max, нм, (ε·10^-3): 406 (58,0), 503 (10,6), 610 (2,9), 663 (40,5).

Спектр ЯМР¹Н ((CD₃)₂CO), δ, м.д.: 9,78 (с, 1Н, 10-Н); 9,75 (с, 1Н, 5-Н); 9,10 (с, 1Н, 20-Н); 8,23 (дд, 1Н, J=17,3 и 11,5 Гц, 3(1)-Н); 6,43 (д, 1H, J=18,3 Гц, 3(2)-Н(транс)); 6.16, (д, 1H, J=12,4 Гц, 3(2)-Н(цис)); 15(1)-СН₂: 5,51 (д, 1Н, J=18,4 Гц) и 5,34 (д, 1Н, J=18.6 Гц); 4,67 (кв, 1Н, J=7.5 Гц, 18-Н); 4,51 (уш.д., 1H, J=8,6 Гц, 17-Н); 4,13 (уш.с, 2Н, 13(1)-NH); 3,81 (кв, 2Н, J=7,5 Гц, 8(1)-СН₂); 3,75 (м, 4Н, 13(2)-СН₂, 13(3)-СН₂); 3,74 (с, 3Н, 15(3)-СН₃); 3,61 (с, 3Н, 17(4)-СН₃); 3,60 (с, 3Н, 12(1)-СН₃); 3,52 (с, 3Н, 2(1)-СН₃); 3,32 (с, 3Н, 7(1)-СН₃); 2.82 (с, 1Н, 13(3)-NH); 2.52 (с, 2Н, 1H-CH ₂-С (карборан)); 2,35-2,21 (м, 4Н, 17(1)-СН₂ и 17(2)-СН₂)); 3.0-1.4 (уш.м., 11H, ВН), 1,71 (д, 3Н, J=7,1 Гц, 18(1)СН₃), 0,87 (т, 3Н, J=7,4 Гц, 8(2)СН₃); 1,55 (уш.с., 1H, NH); - 1,84 (уш.с, 1H, NH).

Спектр ЯМР¹¹ В ((CD₃)₂CO), δ, м.д.: - 9,00 (д, 1B, J=136 Гц, В(12)); - 13,13 (д, 5В, J=131 Гц, В(2-6)); - 14,35 (д, 5В, J=155 Гц, В(7-11)).

Масс-спектр, (m/z): 821[M-Na]⁺. 844 [М⁺].

Изучение токсических и специфических свойств соединений Ia и Iб

Изучение темновой токсичности соединений Ia и Iб показало, что заявляемые соединения не вызывают гибель культивируемых клеток человека (линии НСТ116 - эпителий кишки, MCF-7 - эпителий молочной железы, а также лимфоциты, выделенные из периферической крови здоровых доноров) в концентрациях до 50 мкМ в течение 72 часов инкубации. Эти результаты означают отсутствие темновой цитотоксичности у исследуемых соединений.

Для изучения гибели опухолевых клеток при фотоактивации клетки линии НСТ116 обрабатывали соединениями Ia и Iб (1 мкМ) в течение 30 минут, после чего клетки освещали светом с применением красных светофильтров (20 минут). Гибель клеток регистрировали по включению пропидия иодида (PI) признак необратимого повреждения плазматической мембраны - в проточной цитофлуориметрии. Установлено, что через 30 минут после окончания освещения клеток процент PI-положительных клеток составлял 100%, т.е. все клетки получили летальное фотоповреждение.

Для детального анализа механизма гибели при фотоактивации новых соединений клетки инкубировали 30 минут в присутствии PI, диацетата дихлорофлуоресцеина (маркер свободных форм кислорода, 1 мкМ), митохондриального красителя MitoTracker (маркер трансмембранного электрического потенциала митохондрий, 1 мкМ) и исследуемых соединений Ia или Iб (каждое в конечных концентрациях 10 нМ, 100 нМ или 1 мкМ). Перед микроскопией удаляли среду с вышеуказанными веществами. Для активации фотосенсибилизаторов использовали полосу 633 нм HeNe лазера конфокального микроскопа Axiovert 200М LSM510 МЕТА, после чего выявляли внутриклеточное распределение красителей. Установлена последовательность молекулярных событий: через 30 секунд после инициирующего освещения увеличивалось количество свободных форм кислорода в клетках, через 1 мин отмечалось падение электрического потенциала митохондрий и резкое изменение их формы, через 2 мин начиналось изменение формы клеток - из полигональных они становились округлыми. Спустя 15 мин после начала освещения в клетки входит PI, что свидетельствует о летальном повреждении плазматической мембраны (некрозе). Таким образом, быстрый (в течение первых минут после фотоактивации) некроз - механизм гибели клеток при действии заявляемых соединений. Сравнительный анализ данных по фотосенсибилизации заявляемыми соединениями Ia и Iб с фотосенсибилизацией клиническим препаратом фотолоном (III) показал, что в данной экспериментальной системе фотолон вызывает схожие внутриклеточные события только в концентрации 1 мкМ, при концентрации фотолона 100 нМ скорость гибели клеток снижалась. При использовании 10 нМ фотолона не наблюдалось поступления PI в клетки, т.е. при концентрации 10 нМ фотолон не вызывал фотонекроз.

Исследование острой токсичности заявляемого соединения Iб на белых беспородных мышах показало, что препарат обладает весьма низкой токсичностью: LD₅₀ составляет: LD₁₆=540 мг/кг, LD₅₀=705 мг/кг, LD₈₄=950 мг/кг, LD₁₀₀=1140 мг/кг.

При проведении фотодинамической терапии саркомы М-1 у крыс через 1,5 часа после внутрибрюшинного введения соединения Iб в дозе 10,0 мг/кг и облучения лазером с плотностью мощности 0,42 Вт/см² и плотностью энергии 300 Дж/см² была получена полная регрессия опухоли (Фиг.1). Более низкие дозы заявляемого соединения Iб (5,0 мг/кг и 2,5 мг/кг) при тех же условиях лазерного излучения также оказывали на опухоль ингибирующий эффект, способствующий полной ее регрессии. Изменение плотности мощности, которая составляла 0,25 Вт/см², и плотности энергии, соответствующей 150 Дж/см², при дозе соединения 16 5,0 мг/кг практически не повлияло на результаты ФДТ. И в этих случаях наблюдался полный некроз опухоли (Фиг.1).

Проведение ФДТ с соединением 1б в дозе 5,0 мг/кг и 10,0 мг/кг при плотности мощности 0,25 и 0,44 Вт/см², плотности энергии 150 и 300 Дж/см² у мышей с меланомой В-16 приводило к существенному, статистически значимому, торможению роста опухоли вплоть до полной ее регрессии. Наиболее эффективными условиями проведения ФДТ меланомы оказались в группе мышей, у которых применяли лазерное излучение при дозе 1б 10,0 мг/кг массы животного, плотность энергии 150 Дж/см² и плотность мощности 0,44 Вт/см² (Фиг.2).

Данные, полученные в результате проведения фотодинамической терапии с внутрибрюшинным введением соединения 1б на двух штаммах опухолей, свидетельствуют о высоких фотоактивных свойствах препарата.

Сравнение результатов наших исследований по использованию соединения 1б в качестве фотосенсибилизатора для ФДТ при лечении меланомы В-16 с данными наших более ранних исследований с фотолоном (соединением III) (Каплан М.А.Б Мардынская В.П., Сокол Н.И., Малыгина А.И., Никитина Р.Г., Боргуль О.В., Михайловская А.А. Экспериментальная ФДТ меланомы В-16 с производными хлорина е₆ // Ж."Физическая медицина". - 2006. - №2. - С.9-14) показало, что при дозах фотолона 9,0 и 12,0 мг/кг массы животного, плотностях мощности 0,38 Вт/см² и 0,25 Вт/см² наблюдалось лишь значительное снижение коэффициента абсолютного прироста опухоли. Полная регрессия меланомы в течение 21 суток наблюдалась при проведении ФДТ с дозой фотолона (соединение III) - 12,0 мг/кг, при плотности энергии 150 Дж/см² и плотности мощности 0,25 Вт/см² лишь у 2-х из восьми животных и у одного из 12 животных при введении фотолона в дозе 9,0 мг/кг, плотности энергии 150 Дж/см² и плотности мощности 0,38 Вт/см². Это свидетельствует о явном преимуществе соединения Iб по сравнению с фотолоном - препаратом, который используется в настоящее время (Таблица 1).

Таблица 1
Сравнение эффективности соединения 1б с эффективностью фотолона при ФДТ меланомы В-16
Соединение	Доза соединения, мг/кг	Плотность мощности излучения Вт/см2	Плотность энергии излучения, Дж/см2	% животных, у которых наблюдалась полная регрессия опухоли (21 сутки после облучения)
Фотолон (III)	9	0,38	150	25
12	0,25	150	8,3
Iб	5	0,25	150	90
	5	0,44	150	60
	5	0,25	300	100
	5	0,44	300	100
	10	0,25	150	85
10	0,44	150	100

Преимуществами заявляемых соединений формулы I являются их высокая фототоксическая активность (превышающая активность широко используемого в настоящее время препарата) в сочетании с низкой токсичностью, а также растворимость в воде (соединение 1б), что делает возможным использование заявляемых соединений в медицине для БНЗТ и ФДТ злокачественных новообразований.

Заявляемые соединения можно легко получать простым технологичным синтезом, который осуществляют без выделения промежуточного продукта (в одном сосуде) из доступных исходных веществ с выходами 71% и 95.5%. Способ не требует применения жестких условий, специального оборудования, высоких и низких температур.

Производные 13(1)-N-{2-[N-(клозо-монокарбадодекаборан-1-ил)-метил]аминоэтил}амид-15(2), 17(3)-диметилового эфира хлорина е₆ общей формулы

где M=Cs, Na,
проявляющие свойства фотосенсибилизатора.