Способ получения д-рибозы

 

О Л И С А Н И Е 25I504

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

Сок1а Советскиа

Социалистические

Ресоуелик

Зависимый от патента ¹â€”

Заявлено 15.V111.1964 (№ 917826,28-13) Кл. 891, 1/02 ба, 14

Приоритет

МПК С 131С

С 12k

УДК 663.11.091:547.963..32 (088.8) Коо1Итет йа деиаМ йвооретений и открытий ори Совете Министров

СССР

Опубликовано 26.V111 1969. Бюллетень Ъ 27

Дата опубликования описания 22.1.1970

Авторы изобрстеш1я

Инострайць1

Шукио Киношита, Кунизо 1Чизухара и Такео Сузуки (Япония) Иностранная фирма

«Каиова Хакко Когаио, Ко, Лимитед» (Япония) Заявитель

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ Д-РИБОЗЫ

Известен способ получения Д-рибозы, а также ее производных, заключающийся в том, что на питательной среде, содержащей источники углерода, азота, неорганические соединения (соли магния, марганца, железа, цинка, кальция) и активаторы роста, выращивают различные микроорганизмы, содержащие энзимы, превращающие данную питательную среду в Д-рибозу через различные промежуточные соединения, подвергаемые дальнейшей обработке.

Предлагаемый способ проще известного, так как он обеспечивает получение Д-рибозы одноступенчатой ферментацией, т. е. превращением питательной среды непосредственно в Д-рибозу. Это достигается использованием следующих микроорганизмов: Brevibacterium

ammoniagenes АТСС № б872, М1сгоссцз glutamicu АТСС № 15455 и Bacillus cereus АТСС № 9139.

При получении Д-рибозы по предлагаемому способу вышеуказанную питательную среду следует готовить таким образом, чтобы неорганические соединения, входящие в нее, содержали 0,01 — 0,2% по весу соли магния (в виде иона магния), 0,1 — 1,5 по весу соли калия (в виде иона калия) и 0,0001 — 1% (вес/объем) ионов марганца илн железа, или цинка плп их смеси.

Отношение вес/обьем выражает количество граммов вещества в 100 11л раствора. Для получения по предлагаемому способу производнои Д-рибозы — Д-рибозо-5-фосфата неорганические соедннения питательной среды следует подбирать из расчета содержания в ннх

0,2 — 2.0% по весу фосфата (в виде радикала

10 фосфорной кислоты), 0,01 — 0,2 по весу гали магния (в виде иона магния) и 0,1 — 1,5% по весу соли калия (в виде иона калия).

Предлагаемый способ получения Д-рибозы заключается в следующем.

15 На культуральной питательной среде, в которой имеются в необходимых количествах источники углевода (глюкоза, крахмал нлн его гидролизат, меласса), источники азота (мочевина, хлористый аммочпй, азотнокислый ам20 моний), неорганические соединения, предпочтительно содержащие 0,01 — 0,2% тто весу магния (в виде иона магния), 0,1 — 1,5% по весу соли калия (в виде иона калия) и 0,0001 — 1% (вес/объем) ионов марганца или железа или

25 цинка, или любых их смесей, активаторы роста (Воднын экстр а1 Г куIс1 p) ÇbI, дрожжевой экстракт), выращивают -микроорганизмы, превра

251504

65 щающие вышеуказанную питательную среду непосредственно в Д-риоозу.

К таким микроорганизмам относятся Brevibacterium ammoniagenes ЛТСС М 6872, М1сгоcoccus glu1amicus АТСС № 15455, Bacillus

cereus ЛТСС № 9139.

Ферментацпю ведут в присутствии кислорода, например, при взбалтыванпп плп аэрации, прп температуре питательной среды в пределах от 20 до 40 С. Период роста длится от 2 до 8 дней. Во время этого периода в ферментационной жидкости и в клетках образуется большое количество Д-рибозы.

После окончания процесса ферментации Дрибозу выделяют путем обработки ионообменной смолой, осаждения, экстракции и другими известными приемами, В случае получения производной Д-рибозы — Д-рибозо-5-фосфата берут питательную среду в основном указанного выше состава, но в нее вводят не соли таких металлов, как марганец, железо, цинк, а соединения фосфата, имеющие радикал в количестве предпочтительно составляющем 0,2 — 2 о, в остальном процесс ведут так же, как при получении Д-рибозы, Для пояснения предлагаемого способа нпжс приведены примеры получения Д-рибозо-5фосфата и Д-рибозы.

Пример 1. Для приготовления посевного материала 30 мл водной питательной среды, содержащей, /о. 2 глюкозы, 1 пептона, 1 дро>кжевого экстракта и 0,25 хлористого натрия, вносят в коническую колбу, стерилизуют и в этой среде выращивают Brevibacterium ammoniagenes, взбалтывая в тсченпе 24 час при

30 С. Отдельно в колбах емкостью в 250 мл приготавливают порциями по 20 мл ферментационцую среду, содержащую, oo. 10 г,чюкозы, 1,0 КН2РО, 1,0 мочевины, 1,0 К. IPOL, 1 !NgSO 71-1 0, 0,01 CaCI 2Н,.О, 30 у/л бпотина, стерилпзуют, инокулпруют приготовленным посевным материалом,,взбалтывают и выдерживают при 30 С. После стерилизации устанавливают рН, равным 8,0. Через 100 ча: в ферментационной жидкости накапливается

13,5 мг/мл Д-рибозо-5-фосфата, продукт накапливается и в клетках. Последние удаляют к фильтрату, добавляют гидроокись кальция, а затем путем центрифугования отделяют неорганический сульфат. Надосадочный слой жидкости пропускают через колонку с сильнокислой катионообменной смолой и Д-рибозо5-фосфат адсорбируют. Десорбируют е;о 1 и. водным раствором едкого патра. Полученную фракцию Д-рибозо-5-фосфорной кислоты пропускают через колонку с сильнощелочной анионообменной смолой, устанавливают р Н, равным 6,5, а затем концентрируют при пониженном давлении. Сконцентрпрованпый раствор обесцвечивают активированным углем,довсдят рН до 8 с помощью водного раствора едкого патра и добавляют необ: одпмое количество уксуснокислого бария. Затем спирт и

Зо

4 образующуюся бариевую соль Д-рибозо-5фосфата осаждают, Количество бариевой соли Д-рибозо-5-фосфата, полученной нз о адка после сушки, составляет 18,4 г.

П р и м с р 2, Вгеi ibacterium ammoniagenes

АТСС № 6872 выращивают .при 30 С в течение 24 час при взбалтыванпи в среде, содержащей, о/о. 2 глюкозы, 1 пептона, 1 дрожжевого экстракта, 0,25 хлористого натрия и налитой!no 30 мл в конические колбы емкостью

250 мл. Ферментационную среду, содержащую следующие вещества, г: 100 глюкозы, б мочевины, 10 КН Р04, 10 К НР04, 10 kgSOg 7HgO>

0,1 двухводного хлористого кальция, 2 г

Мд$04 4Н О и 30у биотина, растворенные в воде с получением при этом объема, равного

1 л, наливают порциями по 20 мл в конические колбы емкостью 250 мл. После этого в нее вносят вышеуказанную культуру. Ферментациснную среду взбалтывают при 30 С.

Спустя 120 час в ферментационной жидкости образуется 11 мг/мл Д-рибозы, накапливается она и в клетках. Их удаляют из ферментационной жидкости и, установив рН 5,0, жидкость пропускают через колонку с сильнощелочпой анионообменцой смолой. Затем колонку элюируют дистиллированной водой и собирают фракции, содержащие рибозу, которые пропускают через колонку с сильнокислой катионообменной смолой прп поддержании постоянного значения рН. Фракции, содержащие рибозу, объединяют, устанавливают рН, равным 6,5, и концентрируют при пониженном давлении и 50 С. Концентрированный раствор обесцвечивают порошкообразцым активированным углем прп добавлении спирта и выдерживают в спокойном состоянии в холодильной камере. В результате получают 8,6 г крисгаллической рибозы.

Предмет изобретения

1. Способ получения Д-рибозы путем выращивания продуцирующих ее микроорганизмов на питательной среде, содержащей источники углевода, азота, неорганические соединения — соли магния, марганца, железа, цинка, калия и активаторы роста, OTiluMLLLoLLIuuся тем, что, с целью упрощения процесса, в качестве продуцентов Д-рибозы используют штаммы

Brevibacterium ammoniagenes АТСС № 6872, vIicrococcus gIutam!cus ЛТСС Х 15455, Вас11lus cereus АТСС № 9139, ферменты которых превращают питательную среду непосредственно в Д-рпбозу.

2. Способ по и. 1, отличтощийся тем, что неорганические соединения питательной среды содер>кат 0,01 — 0,2О/о по весу соли магния (в виде иона магния), 0,1 — 1,5 /о по весу соли калия (в виде иона калия) и 0 0001 — 1 /о (вес/объем) ионов марганца или железа, или цинка, пли их смеси.

3. Способ по п. 1, отлича ощийся тем, что, с целью получения производных Д-рибозь1—

251504

Составитель М. Андреева

Текред Л. К. Малова

Редактор А. Бер

Корректоры: В. Петрова и Е. Ласточкина

Заказ 3781/18 Тираж 480 Подписио.

11НИИПИ Когиите1а ll0 делам изобретений и открытий при Совете Министров СССР

Москва Ж-35, Раушская иаб., и, 4/5

Типография, пр. Саптпова, 2

Д-рибозо-5-фосфата, неорганические соединения питательной среды содержат 0,2 — 2% по весу фосфата (в виде радикала фосфорной кислоты), 0,01 — 0,2% по весу соли магния (в виде иона магния) и О,1 — 1,5% по весу соли калия (в видс иона калия),