Приспособление и способ детекции поврежденных влагой индикаторных полосок для анализа мочи
Изобретение относится к медицине и описывает способ детекции поврежденных влажностью влагочувствительных реагентов, где указанные реагенты приводят в контакт с образцом, содержащим воду, и далее выявляется присутствие в образце анализируемого вещества, по его реакции с указанными влагочувствительными реагентами, причем указанный способ включает: (a) измерение отражения света при длине волны, характерной для продуктов указанной реакции указанных влагочувствительных реагентов с анализируемым веществом в двух заданных временных точках после контакта указанных реагентов с указанным образцом; (b) измерение в тех же двух заданных временных точках отражения света при длине волны, характерной для эталонного инфракрасного красителя, причем указанный краситель объединен с указанными влагочувствительными реагентами и имеет характерную длину волны, отличающуюся от длины волны, измеряемой в п.(a), по меньшей мере на 120 нм; (c) расчет соотношения показателей отражения, измеренных при длинах волн согласно пп.(a) и (b), и заключение о том, что реагенты имеют сниженную, чем ожидалось, активность и повреждены влажностью, на основании различия в указанном соотношении для указанных двух заданных временных точек. Способ обеспечивает более точное идентифицирование качества индикаторных полосок. 2 н. и 20 з.п. ф-лы, 3 табл., 1 ил.
Предпосылки создания изобретения
Настоящее изобретение в основном относится к улучшению рабочих качеств и функциональной надежности индикаторных полосок, содержащих влагочувствительные реагенты, в особенности таких, которые применимы для определения присутствия в образцах мочи анализируемых веществ, таких как альбумин, белок, креатинин, нитрат, уристатин, эстераза лейкоцитов (лейкоциты), скрытая кровь (эритроциты), кетоны, глюкоза, билирубин, уробилоген и другие известные специалистам вещества. Определение уровня протеаз и ингибиторов протеаз, таких как эстераза лейкоцитов (эластаза человека) или ингибитор трипсина в моче (бикунин, уристатин) особенно важно, поскольку они могут указывать на наличие инфекций в почке или в мочеполовом тракте. Действие таких индикаторных полосок на протеазы и ингибитор протеаз основано на гидролизе протеазами подходящих для протеолиза субстратов с образованием детектируемых сигналов. Поскольку для протекания биохимических реакций необходима вода, в частности для достижения ферментативного гидролиза, такие реакции характеризуются чувствительностью к влажности и могут в определенных условиях препятствовать образованию детектируемых сигналов за счет «фоновых» реакций.
Патент США № 5663044 включен в настоящее описание в качестве ссылки. В указанном патенте описывается достигнутый в данной области уровень, касающийся детекции лейкоцитов, эстеразы или протеазы, и в основном рассматривается применение композиции, включающей диазониевую соль, относящейся к группе сложных эфиров, подвергаемых протеолизу в присутствии лейкоцитов, эстеразы или протеазы и щелочноземельного металла. В патенте '044 описывается измерение отражающей способности света при длине волны примерно 570 нм для определения количества лейкоцитов в образце мочи. Полученное значение отражения при длине волны 570 нм далее сравнивают с результатом стандартного измерения отражения при длине волны 690 нм. В данном патенте отмечается, что присутствие щелочноземельного металла повышает стабильность диазониевой соли. Также высказывается предположение относительно того, что щелочноземельный металл поглощает влагу, которая может вызвать «фоновую» реакцию изменения цвета. Практическое применение показало, что эта система чувствительна к влажности и что указанные индикаторные полоски должны храниться в сухом месте до их использования. Содержание влаги в индикаторных полосках следует поддерживать на уровне 2 вес.%, с тем чтобы избежать процесса деградации. Однако измерение уровня влаги в индикаторных полосках представляет собой не очень точный процесс. Соответственно, имеется определенная потребность в разработке подхода, который позволял бы очень точно определять содержание влаги, с тем чтобы гарантировать, что применяемые индикаторные полоски будут стабильными при хранении в закрытых контейнерах в течение нескольких лет.
Другой пример использования чувствительных к влаге реагентов обсуждается в патентах США №№ 6770764; 6955921 и 7001737, включенных в настоящее описание в качестве ссылки. В рассматриваемых в этих документах реакциях, присутствие ингибиторов трипсина мочи в образце мочи определяют при добавлении образца к индикаторным полоскам, содержащим известное количество трипсина, субстрата трипсина, например сложных эфиров аргинина, гидролизуемых трипсином с образованием спирта, и соль диазония. Ингибиторы трипсина, если они присутствуют, ингибируют реакцию между трипсином и субстратом. Это ослабляет окрашивание, возникающее в результате взаимодействия диазониевой соли с фенолом, который образуется, когда субстрат трипсина вступает в реакцию с известным количеством трипсина. Измеряя интенсивность получаемого окрашивания, можно выявить присутствие ингибиторов трипсина.
В патенте США № 6316264 рассматривается вариант, включающий добавление инфракрасного (ИК) красителя, в определенной зоне, на индикаторные полоски для определения корректности положения полосок в приборе, используемом для детекции и/или для определения присутствия в нанесенном на полоску образце анализируемых веществ. Инфракрасный диапазон, в котором активен такой краситель, охватывает широкий интервал длин волн, от 700 до 2500 нм, однако рассматриваются как более предпочтительные те красители, который имеют сильное поглощение в диапазоне длин волн 825-855, а поглощение в видимой части спектра (400-700 нм) менее 20%.
Выше отмечалось, что способность более точно идентифицировать качество индикаторных полосок, используемых для анализа мочи, будет важным преимуществом, поскольку указанные полоски должны иметь низкий уровень влажности, с тем чтобы предупредить возможность их небезопасного применения и корректировать результаты, получаемых в условиях избыточной влаги. Поскольку реактивы, используемые для гидролиза протеолитических субстратов, особенно чувствительны к влажности, то если бы указанные реактивы сами могли применяться для выявления нежелательного уровня влажности, то это позволило бы достичь значительного улучшения в данной области. Настоящее изобретение относится к разработке такого способа, который подробно описан ниже.
Краткое описание сущности изобретения
Настоящее изобретение относится к влагочувствительным индикаторным полоскам, используемым для оценки гидролиза протеолитических субстратов, используемых для детекции протеазы или ингибиторов протеазы. Одним из примеров такого применения является детекция лейкоцитов, эстеразы или протеазы, как описано в патенте США № 5663044. Другой пример применения относится к детекции ингибиторов трипсина мочи, описанной в патентах США №№ 6770764; 6955921 и 7001737.
В основном, настоящее изобретение относится к способу детекции избыточного количества влаги в индикаторных полосках, в которых используются влагочувствительные реагенты. При измерении окрашивания или другого показателя реакции влагочувствительных реагентов, выявляемого сразу после нанесения образца, с последующим сравнением полученного результата с соответствующими известными показателями для эталонного инфракрасного красителя идентифицируются реактивы, поврежденные влажностью, и такой результат может быть особым образом помечен или отклонен.
Когда такое возникающее окрашивание измеряют по отражению света, величину коэффициента отражения (т.е. отношение показателя отражения реагентов к показателю отражения эталонного красителя) сразу после нанесения образца сравнивают со значением коэффициента отражения для образца, отобранного немного позже, и результат сравнения используют для определения эффекта избыточной влажности и для удаления реагентов с повышенной влажностью. Второй коэффициент отражения может быть измерен для того, чтобы определить, имеет ли образец необычное окрашивание и может ли такое окрашивание повлиять на результаты анализа.
В целом объектом изобретения является способ детекции поврежденных влажностью влагочувствительных реагентов, отличающийся тем, что указанные реагенты приводят в контакт с образцом, содержащим воду, и далее выявляется присутствие в образце анализируемого вещества, по его реакции с указанными влагочувствительными реагентами, причем указанный способ включает:
(a) измерение отражения света при длине волны, характерной для продуктов указанной реакции указанных влагочувствительных реагентов с анализируемым веществом в двух заданных временных точках после контакта указанных реагентов с указанным образцом;
(b) измерение в тех же двух заданных временных точках отражения света при длине волны, характерной для эталонного инфракрасного красителя, причем указанный краситель объединен с указанными влагочувствительными реагентами и имеет характерную длину волны, отличающуюся от длины волны, измеряемой в п.(a), по меньшей мере на 120 нм;
(c) расчет соотношения показателей отражения, измеренных при длинах волн согласно пп.(a) и (b), и заключение о том, что реагенты имеют сниженную, чем ожидалось, активность и повреждены влажностью, на основании различия в указанном соотношении для указанных двух заданных временных точек.
В одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, для детекции поврежденных влажностью реагентов на лейкоциты, используют реагенты, которые включают диазониевую соль, например DNSA (1-диазо-2-нафтол-4-сульфоновую кислоту), которая взаимодействует с гидролизуемым сложным эфиром, например РРТА (сложный эфир 2-гидрокси-5-фенилпиррол-N-тозил-L-аланина). Если в образце мочи присутствует эстераза лейкоцитов, образуемое окрашивание будет пропорционально количеству присутствующих лейкоцитов. Согласно данному варианту осуществления настоящего изобретения, показатель отражения при длине волны 520-570 нм сравнивают с показателем отражения при длине волны примерно 825, поскольку отражение при этой длине волны характерно для инфракрасного красителя.
Краткое описание чертежей
Единственный приведенный в описании чертеж представляет собой схему, иллюстрирующую способ определения содержания лейкоцитов в образце или отклонения полученных результатов из-за избыточной влажности реагентов.
Описание предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения
Настоящее изобретение относится к усовершенствованному способу оценки гидролиза протеолитических субстратов в образцах мочи, наносимых на индикаторные полоски. В основном, реагенты, действие которых основано на протеолитическом расщеплении субстратов, могут использоваться для детекции любой протеазы. Аминокислотная последовательность таких реагентов соответствует тому типу, который является предпочтительным для детектируемой протеазы, и такая аминокислотная последовательность присоединяется к фрагменту, способному создавать сигнальную молекулу, который образует этот сигнал в ходе гидролиза. Примером практического осуществления такого подхода является детекция эстеразы лейкоцитов, которая используется для выявления присутствия в образце лейкоцитов, как описано в патенте США № 5663044. Присутствие лейкоцитов коррелирует с отражением света при длине волны, характерной для реагентов, тогда как инфракрасный эталонный краситель отражает свет при характерной для него длине волны. Результат сравнения полученных при измерении значений отражения коррелирует с присутствием лейкоцитов после завершения периода инкубации в течение примерно от 20 секунд до 3 минут после добавления образца мочи к реагентам. Действие таких индикаторных полосок может быть ухудшено в условиях избыточной влажности, что может снизить активность реагентов и, соответственно, привести к появлению некорректного окрашивания, указывающего на присутствие лейкоцитов в образце мочи. При измерении отношения показателя отражения реагентов к показателю отражения инфракрасного эталонного красителя в течение первой минуты после добавления образца мочи к реагентам, способ по настоящему изобретению позволяет определить, снижена ли активность реагентов избыточной влажностью.
Реагенты, действие которых основано на протеолитическом расщеплении субстратов, могут также использоваться для детекции ингибитора протеазы. И здесь также аминокислотная последовательность соответствует тому типу, который предпочтителен для ингибитора протеазы, и в этом случае последовательность также присоединяется к фрагменту, способному создавать сигнальную молекулу, который в ходе гидролиза образует сигнал. Протеазу добавляют к реагенту и, если в образце нет ингибитора, создается сигнал. Если сигнал отсутствует, это указывает на то, что в образце присутствует ингибитор. Примером практического осуществления такого подхода является детекция ингибитора трипсина мочи, описанная в патентах США №№ 6770764; 6955921 и 7001737.
Гидролиз протеолитического субстрата не завершается за тот короткий промежуток времени менее нескольких минут, который необходим в случае использования полосок для диагностики или при наблюдении за пациентом. Реакции гидролиза продолжают создавать сигнал в течение некоторого времени и, в этой связи, обычно измеряют кинетику реакции, позволяющую иметь характеристики, не зависящие от времени работы оператора. Например, окрашивание, развивающееся в ходе реакции, используемой для выявления лейкоцитов мочи, может быть измерено в точках 20 и 60 секунд, и соотношение сигналов в обеих временных точках используется как результат кинетики реакции, который, соответственно, выражается в изменении цвета. Это освобождает оператора от необходимости ждать целых 3 минуты для получения результата.
Настоящее изобретение может применяться в разных форматах, включающих влагочувствительные реагенты. Это означает, что реагенты могут вступать в реакцию при наличии влаги и давать, соответственно, некорректный результат, указывающий на наличие в образце материала, которое фактически отсутствует в анализируемом образце. Примеры таких влагочувствительных материалов описаны выше. Особенно важной, по мнению авторов изобретения, является чувствительность реагентов, используемых для детекции лейкоцитов в образцах мочи на основе определения эстеразы лейкоцитов, как будет ниже описано применительно к одному предпочтительному варианту осуществления изобретения. Однако следует понимать, что способы по настоящему изобретению применимы также к другим влагочувствительным реагентам, включающим, без ограничения, другие реагенты, которые могут использоваться для определения присутствия лейкоцитов. Следует также понимать, что индикаторные полоски могут быть представлены в виде разных форм, включающих, без ограничения, импрегнированные полоски в форме стержней и картриджи с боковым отводом.
Химия реагентов, чувствительных к лейкоцитам
Реагенты на лейкоциты, используемые в настоящем изобретении, которые включены в способ определения содержания лейкоцитов в образцах мочи, описаны в патенте США № 5663044, как отмечалось выше. Предпочтительная композиция согласно изобретению была описана в таблице 4 указанного патента '044. Соединение аланина (PPTA; сложный эфир 2-гидрокси-5-фенилпиррол-N-тозил-L-аланина) служило субстратом для эстеразы лейкоцитов, которая гидролизует PPTA, после чего гидролизованный продукт вступает в реакцию с диазониевым индикатором (DNSA; 1-диазо-2-нафтол-4-сульфоновая кислота) с образованием окрашенного продукта. Интенсивность окрашивания определяли по отражению света при длине волны в диапазоне 520-570 нм (570 нм в патенте '044). Отражение света при дине волны 520-570 нм сравнивали с величиной отражения при стандартной длине волны 690 нм. Сравнение проводили с целью компенсации различий в фоновом белом окрашивании субстрата полоски, который представлял собой белую целлюлозу на белом полистироле с соответствующим коэффициентом отражения при длинах волн >60% и который выглядел бесцветным при длинах волн >~690 нм. Белый фон особенно чувствителен к влаге и небольшое количество влаги может вызвать заметное изменение в коэффициенте отражения. Белый фон также чувствителен к цвету мочи и небольшие изменения цвета могут вызвать заметные изменения в коэффициенте отражения. В результате, такой коэффициент отражения уже не может использоваться для точного измерения влажности после погружения полоски в образец мочи.
В настоящем изобретении, добавляли инфракрасный краситель, который имеет характерный ответ на свет с длиной волны, по меньшей мере на 120 нм выше, чем рассматриваемый диапазон 520-570 нм. Было показано, что характерная для ИК красителя длина волны и количество использованного ИК красителя влияют на точность измерений за счет снижения фоновой интерференции. Добавление ИК красителя к реагентам для детекции лейкоцитов приводит к ослаблению фонового цвета до показателя отражения ≤ 60% при длинах волн ≥700 и 2500 нм. Такой сниженный фон ослабляет влияние цвета мочи на коэффициент отражения, но не влияние влажности. Таким образом, получаемый коэффициент отражения может использоваться для точного измерения влажности после погружения образца в мочу.
Однако указанный сниженный фоновый цвет с показателем отражения ≤60% при длинах волн ≥700 и 2500 нм может снизить способность используемых реагентов выявлять гидролиз протеолитических субстратов. Этот эффект продемонстрирован в приведенной ниже таблице, из данных которой видно, что влияние фонового цвета реагента-субстрата снижается по мере повышения количества ИК красителя. Количество ИК красителя, к которому толерантен реагент, зависит от длины волны, используемой для измерения фонового уровня, сигнальной длины волны субстратов, чувствительности субстрата к влажности и чувствительности субстрата к протеазному гидролизу, а также от уровня фонового сигнала красителя при длине волны <700 нм. Толерантность любого рассматриваемого с целью возможного гидролиза субстрата может быть определена, как проиллюстрировано в Таблице 1, где желательное снижение фоновой интерференции относительно цвета образца происходит при его количестве на уровне более, чем 0,2 мг/дл или примерно 0,5 вес.% относительно эталонного красителя. Однако когда количество красителя повышают до 20 мг/дл, то коэффициент отражения поднимается до 1,6, а сигнал снижается от ~1,0 относительно ожидаемого сигнала. Таким образом, количество используемого красителя должно быть ограничено до уровня, необходимого для минимизации фоновой интерференции.
| Таблица 1 | ||
| Краситель (1) мг/дл | Коэффициент отражения при 570/690 нм (2) | Фоновая интерференция (3) |
| 20 | 1,649 | 3% |
| 2 | 1,042 | 4% |
| 0,2 | 0,976 | 5% |
| 0,02 | 0,967 | 22% |
| 0 | 0,964 | 45% |
| (1) DTO 141, который представляет собой краситель 3 в таблице 2 в патенте США № 6316264 и который имеет химическое название 3-(5-карбоксипентил)-2-[2-[3-[[3-(5-карбоксипентил)-1,3-дигидро-1,1-диметил-2H-бенз[e]индол-2-илиден]этилиден)-2-(н-гексилтио)-1-циклогексен-1-ил]этенил]-1,1-диметил-1H-бенз[c]индолия, внутренняя соль. (2) Реакция на присутствующие в моче лейкоциты в количестве 42 клеток/мкл, при среднем значении удельного веса мочи и при проведении определения на приборе CLINITEK Status® (Siemens Healthcare Diagnositics). (3) Различие между сильно окрашенной коричневой мочой больного и мочой с типичным желтым цветом. Оба варианта мочи не содержали лейкоциты и оценку их проводили с использованием прибора CLINITEK Status®. |
В указанном выше эксперименте, реагент на лейкоциты был получен в результате двух последовательных насыщений фильтровальной бумаги. Первое насыщение было проведено с использованием водной смеси, содержащей борную кислоту, Bio-Terge AS40, полимер ПВП и NaCl для контроля ионной силы. Величину pH в полученной смеси откорректировали до 8,8-9,3 с использованием гидроксида натрия или хлористоводородной кислоты. Второе насыщение проводили со смесью, в которой использовалась смесь ацетона/ДМСО и которая содержала DNSA, PPTA, деканол и борную кислоту. Функции каждого использованного ингредиента, предпочтительная концентрация и разрешенный диапазон показаны в приведенной ниже таблице. Смешанные растворы использовали для насыщения фильтровальной бумаги, и в этом случае использовали фильтровальную бумагу Ahlstrom 205C, бумагу сушили при температуре 121°C в течение 9 после первого насыщения и при температуре 100°C в течение 7 минут после второго насыщения. Полученные сухие реагенты наносили на индикаторные полоски, которые тестировали с использованием прибора CLINITEK Status®.
| Таблица 2 | |||
| Ингредиент | Функция | Предпочтительная используемая концентрация | Допустимый диапазон |
| 1-ое нанесение | |||
| Вода | Растворитель | 1000 мл | - |
| NaCl | Для поддержания ионной силы | 14,6 г | 1-30 г/л |
| Bio-Terge AS40 | Поверхностно-активное вещество | 2 г | 0-4 г/л |
| Борная кислота | Буфер | 24,7 г | 5-35 г/л |
| ПВП | Полимер | 20,0 г | 5-50 г/л |
| 2-ое нанесение | |||
| Ацетон | Растворитель | 955 мл | - |
| ДМСО | Растворитель | 30 мл | 10-60 мл |
| DNSA | Индикатор диазония | 0,174 г | 0,050-0,5 г/л |
| PPTA | Субстрат фермента | 0,422 г | 0,10-0,8 г/л |
| Деканол | Активатор фермента | 15 мл | 5-40 мл/л |
| Борная кислота | Буфер | 0,5 г | 0-3,0 г/л |
| DNSA = 1-диазо-2-нафтол-4-сульфоновая кислота | |||
| PPTA = сложный эфир 2-гидрокси-5-фенилпиррол-N-тозил-L-аланина |
Могут использоваться различные красители, в том числе те красители, которые были описаны в патенте США № 6316264, включенном в настоящую заявку, и которые имеют характерное поглощение в инфракрасном диапазоне от примерно 700 до примерно 2500 нм. Соответствующие примеры включают фталоцианиновые и нафталоцианиновые соединения, красители на основе комплекса металла (например, красители на основе комплекса дитиолена-металла) и полиметиновые красители, включающие цианиновые красители. Другие красители включают ди- и трифенилметановые красители, хиноновые красители, азокрасители, ионообменные красители и красители, действие которых основано на зарядном резонансе. Общей для них характеристикой является то, что они отражают свет при характерной для них длине волны, которая превышает по меньшей мере на 120 нм длину волны отражения для реагента. В контексте обсуждавшихся выше реагентов, используемых для детекции лейкоцитов, используемый краситель должен иметь характерное отражение при длине волны по меньшей мере 700 нм, предпочтительно выше 700 и менее чем 2500 нм.
Несмотря на то что эталонный краситель, используемый в сочетании с реагентами для детекции лейкоцитов, относится к предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения, его можно использовать также для целей сопоставления индикаторных полосок (патент США №6316264). Изменения, определяемые влажностью, которая возникает при контактах красителя с образцом, могут отличаться от тех изменений, которые имеют место, когда краситель находится внутри реагентов. Однако, специалисты в данной области в состоянии оценить такие различия и решить вызванную ими проблему.
Выявление излишней влажности в индикаторных полосках для детекции лейкоцитов
Как обсуждалось выше, влажность приводит к разложению реагентов, используемых для детекции лейкоцитов, сопровождающемуся некорректным изменением цвета. В этой ситуации, ферменты в лейкоцитах не имеют потребности гидролизовать протеолитический субстрат, например PPTA. Было показано, что реагенты чувствительны даже к столь малому содержанию влаги на прокладке для лейкоцитарных реагентов, как 0,1%. Степень изменения цвета, по существу, прямо пропорциональна количеству присутствующей воды. Важность контроля влажности становится очевидной, когда после 10-минутной экспозиции, в условиях относительной влажности на уровне >60, тест показывает некорректные результаты.
Указанная чувствительность к влажности используется в настоящем изобретении для определения, содержит ли прокладка с реагентами излишнее количество влаги. Изменение цвета определяют вначале примерно через 20 секунд после нанесения образца мочи. Если окрашивание развивается через 20 секунд, это говорит о возможном загрязнении, то есть может быть повышенное содержание влаги. И это предположение подтверждается, если интенсивность окрашивания значительно не усилится через 60 секунд, что будет свидетельствовать о снижении активности реагентов. Этот способ был подтвержден в эксперименте, согласно которому индикаторные полоски экспонировали при температуре 30°C в условиях влажности 80% в течение 10 минут, т.е. в условиях, которые, как известно, приводят к потере активности реагентов. Было показано, что двадцать три из двадцати четырех полосок потеряли активность, по результатам оценки коэффициента отношения показателя отражения света при длине волны 520 нм к показателю отражения света при длине волны 820 нм. Количество наносимого красителя DTO 141 составляло 0,2 мг/дл, относительно 42 мг/дл PPTA, используемого в составе реагентов для детекции лейкоцитов. Параллельный эксперимент, в котором измеряли отражение только при длине волны 520 нм, т.е. без красителя, не позволил выявить излишнее увлажнение в случае 42% полосок, и это было также справедливо для случая, когда использовали соотношение показателей отражения при длинах волн 520 нм/870 нм, но без красителя.
Влияние цвета образца мочи также оценивается по способу настоящего изобретения. Цвет образца измеряют по поглощению света при длине волны примерно 460 нм (в видимом диапазоне). Для учета влияния окрашивания на результаты измерения, которое создают реагенты на лейкоциты, определяют новый коэффициент, т.е. отношение, получаемое при делении показателя отражения при длине волны примерно 460 нм (применительно к цвету образца) на показатель отражения при длине волны примерно 625 нм. Использование этого коэффициента позволяет избежать тех ситуаций, когда темноокрашенные образцы мочи рассматривались в контексте их неподходящей влажности. Если указанный коэффициент (×1000) превышает 600, то образец имеет светлое окрашивание и отражение будет высокое. В этом случае, рассматриваемая индикаторная полоска будут считаться как неподходящая по уровню влажности, если коэффициенты отношения показателей отражения в точках 20 и 60 секунд показывают, что полоска реагирует в аномальном режиме. Если указанный коэффициент отношения ниже 600, то рассматриваемый образец имеет темное окрашивание, которое может повлиять на результаты тестирования, и в этом случае полоска будет считаться нормальной, если результаты в точках 20 и 60 секунд будут удовлетворительными.
Различие между коэффициентами отношения показателя отражения при длине волны 525 нм к показателю отражения при длине волны 825 нм, определяемыми в точках 20 и 60 секунд после нанесения образца, используют для определения, были ли реагенты повреждены избыточной влажностью. В основном, если первый результат (через 20 секунд) дает коэффициент отношения менее чем примерно 700 (коэффициент × 1000), это говорит о наличии избыточной влажности, поскольку отражение при длине волны 525 указывает на уже развившееся значительное окрашивание. Если рассматривают второй коэффициент, определяемый в точке 60 секунд, и сравнивают его с первым, и полученная разница будет меньше чем примерно 50 (коэффициент × 1000), то подтверждается избыточная влажность, поскольку реагенты потеряли свою нормальную активность.
Например, измеряют три показателя, когда реагенты включают PPTA и DNSA и эталонный краситель представляет собой DTO 141.
| Таблица 3 | ||||
| Коэффициент, нм | Время | Критическое значение коэффициента ×1000 | Значение | |
| L20 | 525/845 | 20 с | <700 | Высокая абсорбция Возможна избыточная влажность |
| L60 | 525/845 | 60 с | L20-L60<50 | Влажность, снижающая активность реагентов |
| H | 470/625 | 40 и 60 с | >600 | Высокое отражение Образец слабо окрашен |
Применение указанных значений к показателям тестирования по процедуре, проиллюстрированной на фиг.1, приводит к выводу о некорректности полученных результатов из-за вредного воздействия влажности или результатов выявления лейкоцитов в образце. В приведенном примере использовали прибор CLINITEK Status® для анализа образца мочи на наличие в нем лейкоцитов. Абсорбирующая полоска (например, фильтровальная бумага), насыщенная растворами реагента, как было описано выше в Таблице 2, содержала нанесенный на нее образец мочи, и возникающие при этом изменения цвета измеряли по отражению света в приборе CLINITEK Status® по процедуре настоящего изобретения.
Если измеренное значение L20-L6o меньше 50, возможно, что избыточная влажность снизила активность реагентов для детекции лейкоцитов. Если указанное значение выше 50, то величина L20-L60 может быть использована для расчета концентрации лейкоцитов в образце. Однако, даже если эта величина ниже 50, то коэффициент 525/845 нм все еще можно использовать для определения концентрации лейкоцитов. Учитывается начальное значение коэффициента 525/845 нм (L20). Если это значение ниже 700 (коэффициент × 1000), это указывает на высокое поглощение света при длине волны 525 нм, так что, возможно, в исследуемой прокладке имеется избыточная влажность. Объединение этого значения с полученным результатом для L20-L60 приводит к выводу о том, что реагенты для детекции лейкоцитов содержат, по всей видимости, избыточное количество влаги, что снижает их качество. Однако, поскольку на эти результаты мог повлиять необычно темный цвет образца, определяют соотношение показателей Н, 470/625 нм. Если полученный результат больше 600 (коэффициент × 1000), это говорит о высоком отражении, то есть исследуемый образец не очень сильно окрашен. Если это так, то считается, что реагенты для детекции лейкоцитов повреждены избыточной влажностью. Если исследуемый образец имеет темный цвет, т.е. критическое значение соотношения H меньше 600, но ранее было показано, что показатели L20-L60 и L20 имеют приемлемые значения, то образец рассматривается как подходящий и в нем определяют содержание лейкоцитов.
Следует понимать, что конкретные значения длин волн и времени измерения, приведенные в настоящем описании, применимы для определения присутствия лейкоцитов в образцах мочи в сочетании с указанными количествами реагентов. Однако данный способ имеет более широкое применение и может использоваться для многих других реагентов, которые являются влагочувствительными и применяются для анализа образцов, которые также содержат воду. Подходящие протоколы для проведения детекции могут быть легко адаптированы специалистами в данной области после ознакомления с описанием настоящего изобретения.
Как было показано выше, прибор Clinitek Status® используется при осуществлении способа по настоящему изобретению. Различные аспекты, касающиеся этого прибора, описаны в патентах США №№ 6239445; 5877863; 5477326 и 5408535, которые включены в настоящее описание в качестве ссылок. Указанный прибор Clinitek Status® представляет собой отражательный спектроскоп, в котором индикаторная полоска, содержащая образец, освещается источником света и свет, отраженный от индикаторной полоски, далее детектируется и используется для определения в образце наличия и количества анализируемых в нем материалов. Работа спектрофотометров также описана в указанном выше патенте США № 6316264. Согласно этому патенту, для осуществления способа по настоящему изобретению также может использоваться прибор типа камеры, который создает мультипиксельное изображение.
1. Способ детекции поврежденных влажностью влагочувствительных реагентов, отличающийся тем, что указанные реагенты приводят в контакт с образцом, содержащим воду, и далее выявляется присутствие в образце анализируемого вещества, по его реакции с указанными влагочувствительными реагентами, причем указанный способ включает:
(a) измерение отражения света при длине волны, характерной для продуктов указанной реакции указанных влагочувствительных реагентов с анализируемым веществом в двух заданных временных точках после контакта указанных реагентов с указанным образцом;
(b) измерение в тех же двух заданных временных точках отражения света при длине волны, характерной для эталонного инфракрасного красителя, причем указанный краситель объединен с указанными влагочувствительными реагентами и имеет характерную длину волны, отличающуюся от длины волны, измеряемой в п.(a), по меньшей мере на 120 нм;
(c) расчет соотношения показателей отражения, измеренных при длинах волн согласно пп.(a) и (b), и заключение о том, что реагенты имеют сниженную, чем ожидалось, активность и повреждены влажностью, на основании различия в указанном соотношении для указанных двух заданных временных точек.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что соотношение показателей отражения при длинах волн, измеренных в пп.(a) и (b) в первой из указанных двух заданных временных точек, используется для выявления потенциально поврежденных влажностью влагочувствительных реагентов.
3. Способ по п.2, отличающийся тем, что используют сочетание соотношения показателей отражения при указанных двух длинах волн, измеренных в первой из указанных двух заданных временных точек, и изменение в соотношении между результатами, полученными в указанных первой и второй заданных временных точках, для целей определения повреждения влажностью влагочувствительных реагентов.
4. Способ по п.3, включающий также стадию измерения отражения света при двух заданных длинах волн для выявления возможности влияния цвета образца на получаемые результаты.
5. Способ по п.1, отличающийся тем, что использование указанных влагочувствительных реагентов основано на их активности в отношении протеолитических субстратов, используемых для детекции протеаз.
6. Способ по п.1, отличающийся тем, что использование указанных влагочувствительных реагентов основано на их активности в отношении протеолитических субстратов, используемых для детекции ингибиторов протеаз.
7. Способ по п.5, отличающийся тем, что указанный образец представляет собой образец мочи, и указанный анализируемый материал представляет собой лейкоциты.
8. Способ по п.6, отличающийся тем, что указанный образец представляет собой образец мочи, и указанный анализируемый материал представляет собой ингибиторы трипсина мочи.
9. Способ по п.7, отличающийся тем, что указанные влагочувствительные реагенты включают диазониевую соль и сложный эфир, подвергаемый гидролизу в присутствии лейкоцитов.
10. Способ по п.1, включающий также удаление поврежденных влажностью влагочувствительных реагентов.
11. Способ измерения лейкоцитов в образцах мочи с использованием индикаторных полосок, указанные индикаторные полоски содержат реагенты, включающие диазониевую соль и сложный эфир, подвергаемый гидролизу в присутствии лейкоцитов, отличающийся тем, что, согласно указанному способу, рассчитывают количество лейкоцитов в образце мочи как функцию отражения света при длине волны, характерной для продукта реакции указанной диазониевой соли с гидролизуемым сложным эфиром, относительно отражения света при заданной стандартной длине волны, причем указанное отражение света измеряют в течение примерно 1-3 минут после нанесения образца на указанные реагенты, и характеризующийся тем, что включает детекцию поврежденных влажностью реагентов путем:
(a) добавления инфракрасного эталонного красителя к указанным индикаторным полоскам, причем указанный эталонный краситель имеет характерную длину волны отражения, которая отличается от характерной длины волны отражения указанного реакционного продукта по меньшей мере на 120 нм;
(b) измерения отражения света при дине волны, характерной для указанного продукта реакции, и при длине волны, характерной для эталонного красителя, во временных точках примерно 20 секунд и примерно 60 секунд после нанесения указанного образца мочи на указанные реагенты;
(c) расчета отношения измеренного показателя отражения света при длине волны, характерной для указанного продукта реакции, к измеренному показателю отражения света при длине волны, характерной для эталонного образца, определенного в п.(b), для каждой из временных точек 20 и 60 секунд, с обозначением указанных соотношений как L20 и L60;
(d) в том случае, когда L20-L60 меньше, чем первое заданное значение, и L20 ниже, чем второе заданное значение, делают вывод о том, что субстрат, содержащий композицию, был поврежден влажностью;
(e) измерения показателей отражения света при длинах волн примерно 470 нм и примерно 625 нм и расчета соотношения 470/625 нм;
(f) если соотношение 470/625 нм выше третьего заданного значения, то делают вывод о том, что образец мочи окрашен недостаточно сильно, с тем чтобы можно было изменить вывод, сделанный в п.(d); и
(g) признания некорректным рассчитанного значения концентрации лейкоцитов.
12. Способ по п.11, отличающийся тем, что длина волны отражения для указанного продукта реакции составляет примерно 520-570 нм.
13. Способ по п.11, отличающийся тем, что длина волны отражения для указанного эталонного красителя составляет примерно 825 нм.
14. Способ по п.11, отличающийся тем, что отношение указанного показателя для эталонного красителя к указанному показателю для гидролизуемого сложного эфира превышает примерно 0,5%, что ослабляет интерференцию фонового окрашивания указанного образца и указанной индикаторной полоски.
15. Способ по п.11, отличающийся тем, что указанный эталонный краситель выбирают из группы, состоящей из фталоцианиновых и нафталоцианиновых соединений, красителей на основе комплексов металлов, полиметиновых красителей, ди- и трифенилметановых красителей, хининовых красителей, азокрасителей, ионообменных красителей и красителей, основанных на зарядном резонансе.
16. Способ по п.15, отличающийся тем, что указанный эталонный краситель представляет собой DTO 141.
17. Способ по п.11, отличающийся тем, что указанный сложный гидролизуемый эфир представляет собой PPTA и указанная диазониевая соль представляет собой DSNA.
18. Способ по п.11, отличающийся тем, что L20-L60 умножено на 1000, и указанное перове заданное значение равно 50.
19. Способ по п.11, отличающийся тем, что L20 умножено на 1000, и указанное второе заданное значение равно 700.
20. Способ по п.11, отличающийся тем, что соотношение показателей при 470/625 нм умножено на 1000, и указанное третье заданное значение равно 600.
21. Способ по п.11, отличающийся тем, что указанный эталонный краситель объединен с указанными реагентами.
22. Способ по п.11, отличающийся тем, что указанный эталонный краситель помещен отдельно от указанных реагентов.
