Способ получения селективного иммуносорбента для удаления антител-igg к десмоглеину 3 типа из сыворотки крови больных пузырчаткой

Изобретение относится к медицине, в частности к иммунохимии, а именно к способу получения материала для биологического связывания с помощью сорбирующих колонок. Сущность изобретения заключается в том, что разработан способ получения селективного иммуносорбента для удаления антител - IgG к десмоглеину 3 типа из сыворотки крови больных пузырчаткой с использованием твердофазного носителя, заключающийся в том, что для его получения рекомбинантый человеческий десмоглеин 3 типа (Dsg3) иммобилизируют путем ковалентного связывания с твердофазным носителем, в качестве которого применяют агарозный сорбент, несущий на своей поверхности N-гидроксисукцинимидные группы: NHS-активированную агарозу. При использовании изобретения получают иммуносорбент, обладающий высокой селективной сорбционной способностью по отношению к аутоантителам - IgG к десмоглеину 3 типа. Полученный предлагаемым способом иммуносорбент может использоваться для лечения больных пузырчаткой в качестве адъювантного метода терапии. Его применение улучшает качество терапии, позволяет уменьшить дозы и длительность системных глюкокортикостероидных препаратов, снизить частоту развития побочных эффектов вследствие иммуносупрессивной терапии. 2 ил., 1 табл., 2 пр.

 

Область техники, к которой относится изобретение. Изобретение относится к медицине, в частности к иммунохимии, а именно к материалам для биологического связывания с помощью сорбирующих колонок. Полученный иммуносорбент может быть использован при проведении экстракорпорального воздействия при кожных заболеваниях, для лечения аутоиммунных буллезных дерматозов, а именно пузырчатки.

Уровень техники.

Иммуноглобулины (Ig) - гетеродимерные белки, которые подразделяют на классы в зависимости от структуры, свойств и антигенных особенностей их тяжелых цепей. Легкие цепи в молекулах иммуноглобулинов представлены двумя изотипами - лямбда (λ) и каппа (κ), которые различаются по химическому составу как вариабельных, так и константных участков. Тяжелые цепи иммуноглобулинов подразделены на 5 изотипов (γ, μ, α, δ, ε), которые определяют их принадлежность к одному из пяти классов иммуноглобулинов: G, M, A, D, Ε соответственно.

Иммуноглобулины класса G (IgG) составляют около 80% сывороточных иммуноглобулинов и подразделяются на четыре подкласса IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4, каждый со своими биологическими свойствами. IgG образуются на высоте первичного иммунного ответа и при повторном введении антигена (вторичный ответ). Наиболее часто встречается IgG1 (67%), реже IgG2 и IgG3 (22 и 7% соответственно), самым редким является подкласс IgG4 (4%). При аутоимунных буллезных дерматозах вырабатываются аутоантитела, обладающие высокой тканевой специфичностью и относящиеся к IgG. [Schroeder H.W. Jr., Cavacini L. Structure and function of immunoglobulins // J Allergy Clin Immunol. - 2010. - Vol. 125(2 Suppl 2). - P. S41-52].

Пузырчатка (пемфигус) - тяжелое аутоиммунное буллезное заболевание, характеризующееся образованием пузырей и эрозий на коже и/или слизистых оболочках, [Дерматовенерология, 2010. (Клинические рекомендации / Российское общество дерматовенерологов) / [под ред. А.А. Кубановой]. - М: ДЭКС-Пресс, 2010. - 428 с.; Grando S.A. Pemphigus autoimmunity: hypotheses and realities// Autoimmunity. - 2012. - Vol.45. - №1. - P. 7-35].

Патогенетическую роль в формировании пузырей при пузырчатке играют циркулирующие аутоантитела, обладающие высокой тканевой специфичностью, относящиеся к классу иммуноглобулинов G (IgG) и вызывающие разрушение десмосом вследствие выделения протеолитических ферментов, что приводит к акантолизу [Матушевская Е.В., Кубанова А.А., Самсонов В.А. и др. Аутоантитела и аутоантигены при пузырчатке и пемфигоиде // Вестник дерматологии и венерологии. - 1995. - №5. - С. 28-33; Joly P., Bernard P., Bedane С. et al. Pemphigus. Guidelines for the diagnosis and treatment. Centres de reference des maladies huileuses auto-immunes. Societe Française de Dermatologie // Ann Dermatol Venereol. - 2011. - Vol. 138. - P. 252-258.]. У больных пузырчаткой выявлены все 4 субкласса IgG, с преобладанием в стадию обострения IgG4, а в стадию ремиссии - IgG1 [Bhol К., Mohimen Α., Ahmed A.R. Correlation of subclasses of IgG with disease activity in pemphigus vulgaris // Dermatology. - 1994. - Vol.189 Suppl 1. - P. 85-89].

Основными структурами, к которым вырабатываются аутоантитела при вульгарной пузырчатке, являются белки десмосомального аппарата - десмоглеины 3 типа (Dsg 3) [Stanley J.R., Yaar M., Hawley-Nelson P. et al. Pemphigus antibodies identify a cell surface glycoprotein synthesized by human and mouse keratinocytes // J. Clin. Invest. - 1982. - Vol. 70. - P. 281-288; Stanley J. R., Koulu L., and Thivolet C. Distinction between epidermal antigensbinding pemphigus vulgaris and pemphigus foliaceus autoantibodies // J. Clin. Invest. - 1984. - Vol. 74.- P. 313-320; Ohyama M., Ota T., Aoki M. et al. Suppression of the immune response against exogenous desmoglein 3 in desmoglein 3 knockout mice: an implication for gene therapy // J Invest Dermatol. - 2003 Apr. - Vol. 120(4). - P. 610-615]. Установлена связь между уровнем IgG к Dsg3 и тяжестью поражения при пузырчатке [Cozzani Ε, Di Zenzo G., Riva S. et al. Are clinical phenotype and autoantibody profile always concordant in pemphigus? A study in a cohort of pemphigus patients // Eur J Dermatol. - 2013 Jan-Feb. - Vol.23(l). - Р. 40-48].

Десмосомы состоят из белков клеточной адгезии, относящихся к семейству кадгеринов и соединительных (адапторных) белков, которые соединяют их с промежуточными филаментами. Белки клеточной адгезии, формирующие десмосомы - десмоглеины и десмоколлины. Эти кальцийзависимые гликозилированные протеины состоят из экстрацеллюлярного амино-терминального участка, трансмембранного домена и внутриклеточного карбокситерминального участка. Известны три формы десмоколлина (1-3 типы) и четыре десмоглеина (1-4 типы) [Махнева Н.В., Белецкая Л.В. Молекулярно-биологическая характеристика десмосом как системы межклеточного соединения // Вестник дерматологии и венерологии. - 2009. - №2. - С. 25-381.; Garrod D.R., Merritt A.J., Nie Ζ. Desmosomal cadherins // Curr. Opin. Cell Biol. - 2002. - Vol. 14. - P. 537-545].

В последние десятилетия для лечения пузырчатки используются эфферентные методы терапии: гемосорбция, плазмаферез, энтеросорбция, иммуносорбция.

Для иммуносорбции используется 3 вида сорбентов: неселективные, с низкой селективностью и с высокой степенью селективности. Неселективные сорбенты (декстрансульфат, триптофан, фенилаланинсодержащие и другие) способны сорбировать такие компоненты плазмы крови, как фибриноген, альбумин, липиды, иммуноглобулины. Сорбенты с низкой селективностью (с иммобилизованным стафилококковым протеином А, антителами к Ig человека и другими) имеют сродство к определенной фракции протеинов плазмы. Сорбенты с высокой степенью селективности извлекают только определенные протеины без изменения концентрации других компонентов плазмы пациента.

Одним из наиболее эффективных и безопасных методов лечения аутоиммунных заболеваний является экстракорпоральный метод терапии с использованием специфических иммуносорбентов [Keller F., Wagner К., Faber U. et al. Elimination kinetics of plasma exchange // Klin, Wochen schr. - 1983. - V. 61, N22. - P. 1115-1122].

Известен способ получения углеродного гемосорбента в сорбционных колонках [Грандо С.Α., Глухенький Б.Т., Романенко А.Б. и соавт. Механизмы терапевтического действия экстракорпоральной детоксикации при аутоиммунных буллезных дерматозах // Вестник дерматологии и венерологии. - 1988. - №7. - С. 6-11.; Eming R., Hertl M. Immunoadsorption in pemphigus // Autoimmunity. - 2006. - Vol. 39 (7). - P. 609-616]. Гемоперфузия проводится по вено-венозному контуру через углеродный гемосорбент в сорбционных колонках, предназначенных для очистки и фильтрации крови вне организма (СКН) со скоростью кровотока 80-120 мл/мин в объеме 1,5 объема циркулирующей плазмы. Положительный эффект иммуносорбции связывают с удалением из крови больных пузырчаткой циркулирующих аутоантител и иммунных комплексов. Однако, при использовании данных сорбентов, вследствие элиминации из сыворотки больных аутоантител и циркулирующих иммунных комплексов, без дифференциации к удалению определенных комплексов с IgG, обуславливающей более быстрое наступление клинического эффекта, наблюдался феномен рикошета (экзацербация патологического кожного процесса, сопровождающаяся резким повышением титра иммуноглобулинов в сыворотке крови больных), что является недостатком данного метода [Гребенников В.Α., Белявский А.Д., Каминский М.Ю. Изучение иммунокорригирующего и детоксицирующего воздействия гемосорбции, плазмафереза и энтеросорбции при пузырчатке // Вестник дерматологии. - 1990. - №5. - С. 33-38].

Известен способ получения триптофансодержащих сорбентов [Lüftl М., Stauber A, Mainka A, Klingel R, Schuler G, Hertl M. Successful removal of pathogenic autoantibodies in pemphigus by immunoadsorption with a tryptophan-linked polyvinylalcohol adsorber // Br J Dermatol. - 2003, Sep. - Vol.149(3). - P. 598-605]. Триптофановые столбы состояли из поливиниловых шариков, сшитых алкоголь-гелем, которые иммобилизировали гидрофобной аминокислотой и триптофаном в качестве лиганда. В исследованиях in vitro было продемонстрировано, что триптофановые столбы более эффективно удаляют все классы аутоантител при пузырчатке, чем декстрановые, преимущество которых в избирательном удалении аффинных белков. К тому же триптофановые столбцы более дешевые. Недостаток данного метода: триптофановые столбы сорбируют необходимые для жизнедеятельности компоненты плазмы крови (фибриноген, альбумин, липиды, все классы иммуноглобулинов), к тому же синтез триптофановых столбов является довольно сложным процессом.

Ближайшим аналогом-прототипом в лечении больных пузырчаткой является иммуноадсорбент с использованием стафилококкового протеина А (protein A affinity resin), представляющий собой рекомбинантный белок А Staphylococcus aureus, иммобилизованный на CNBr-активированной сефарозе FF (GEHealthcare). Преимущества данного иммуносорбента: колонки с протеином А более эффективны при элиминациии IgG, чем триптофанновые колонны; метод не требует замены компонентов плазмы [Samuelsson G. Extracorporeal immunoadsorption with protein A: technical aspects and clinical results. J Clin Apher 2001; 16: 49-52].

Однако при проведении иммуносорбции с использованием данного иммуносорбента снижается количество иммуноглобулинов всех подклассов, уменьшается концентрация антител к ДНК, человеческому лейкоцитарному антигену [Samuelsson G. Extracorporeal immunoadsorption with protein A: technical aspects and clinical results. J Clin Apher 2001; 16: 49-52].

Кроме того, после проведения иммуноадсорбции с использованием стафилококкового протеина А у больных пузырчаткой риск развития инфекционных заболеваний остается высоким, так как наряду с патогенетически значимыми аутоантителам IgG при пузырчатке во время процедуры выводятся иммуноглобулины всех подклассов (IgA, IgM, IgE), циркулирующие иммунные комплексы, иммунные комплексы другой специфичности. К тому же стоимость данного сорбента значительно выше других [Schmidt Ε., Klinker Ε., Opitz Α. et al. Protein A immunoadsorption: a novel and effective adjuvant treatment of severe pemphigus // Br J Dermatol. - 2003. - Vol. 148. - P. 1222-1229].

Заявляемый способ отличается от прототипа тем, что вместо иммунносорбентов, неспецифически связывающих белки и низкомолекулярные продукты, в качестве сорбента использована крупнозернистая агарозная матрица с ковалентно иммобилизованным рекомбинантным десмоглеином 3 типа человека, специфически связывающая антитела к десмоглеину 3 типа, в результате чего выводятся только пемфигусные, патогенетически значимые, аутоатитела к десмоглеинам 3 типа, a IgA, IgM, IgE и иммунные комплексы другой специфичности, отвечающие за иммунный ответ на вирусные и бактериальные агенты, сохраняются, уменьшая частоту развития инфекционных осложнений. В связи с этим данный вид терапии является высокоэффективным. Сорбенты с высокой степенью селективности для удаления антител - IgG, строго специфичных именно к Dsg3, из доступных источников научной и научно-технической информации не известны.

Задачей изобретения является создание способа получения иммуносорбента для селективного удаления антител - IgG к десмоглеину 3 типа из сыворотки крови больных пузырчаткой.

Целью изобретения является селективная (избирательная) степень очистки крови от антител - IgG к десмоглеину 3 типа из сыворотки крови больных пузырчаткой.

Сущность изобретения.

Технический результат, на достижение которого направлено изобретение, заключается в удалении антител - IgG к десмоглеину 3 типа из сыворотки крови больных пузырчаткой селективным иммуносорбентом. Селективный иммуносорбент может использоваться для лечения больных пузырчаткой в качестве адъювантного метода терапии.

Указанный технический результат обеспечивается способом получения иммуносорбента для селективного связывания антител - IgG к десмоглеину 3 типа, который представляет собой агарозу с N-гидроксисукцинимидными группами (NHS-активированную сефарозу) (Pierce, США), на которой иммобилизирован рекомбинантный десмоглеин 3 типа (R&D Systems, США). Высокоэффективность данного сорбента заключается в том, что используется определенный вид твердой фазы.

Осуществление изобретения.

Для получения селективного иммуносорбента для удаления антител - IgG к десмоглеину 3 типа из сыворотки крови больных пузырчаткой рекомбинантый десмоглеин 3 типа (Dsg3) (R&D Systems, США) иммобилизируется путем ковалентного связывания с твердофазным носителем, в качестве которого применяется агарозный сорбент, несущий на своей поверхности N-гидроксисукцинимидные группы: NHS-активированная агароза (Biorad, США). Выделение антител - IgG к Dsg3 из сыворотки крови человека проводится методом иммунохроматографической очистки (при прохождении растворов через сорбент путем центрифугирования с использованием центрифужных микроколонок, заполненных NHS-активированной агарозой (Pierce, США)).

Для приготовления раствора Dsg3 33 мкг рекомбинантного Dsg3 разводят в 400 мкл в охлажденном до 4°С буфере связывания/промывки - (0,1М фосфатный буфер, содержащий 0,15М NaCl, рН 7.2). Микропробирку с раствором рекомбинантного десмоглеина 3 типа осторожно встряхивают, не допуская вспенивания. В пустую центрифужную микроколонку (Pierce, США) добавляют 33 мг сухой NHS-активированной агарозы. Вносят раствор Dsg3 в микроколонку с сорбентом, закрывают верхнюю крышку и инкубируют при 4°С в течение ночи, перемешивая на лабораторном шейкере. По окончании инкубации снимают верхнюю и нижнюю крышки микроколонки, помещают микроколонку в пробирку-приемник и центрифугируют при 4°С при 1000 g в течение 1 мин в центрифуге с охлаждением Hettich Micro 24R (Hettich, Германия); фильтрат отбирают. Для отмывки от несвязавшихся белков в колонку добавляют 200 мл буфера для промывки (0,1М фосфатный буфер содержащий 0,15М NaCl, рН 7.2) и центрифугируют при 4°С при 1000 g в течение 1 мин. Повторяют процедуру отмывки, фильтраты после отмывок отбирают. В фильтратах после иммобилизации и отмывки определяют концентрацию Dsg3 по методу Бредфорд для установления эффективности иммобилизации Dsg3.

Для блокирования остаточных активных групп сорбента добавляют 100 мл раствора для блокирования (1М этаноламин) и заменяют пробирку-приемник микроколонки на нижнюю крышку, закрывают микроколонку крышкой. Инкубируют на шейкере при комнатной температуре в течение 20 мин. По окончании инкубации снимают верхнюю и нижнюю крышки микроколонки и центрифугируют при 4°С при 1000 g в течение 1 мин, фильтрат удаляют. Для отмывки от буфера для блокирования в колонку добавляют 200 мл раствора для промывки и центрифугируют при 4°С при 1000 g в течение 1 мин. Готовый сорбент используют для иммунохроматографического выделения аутоантител к Dsg3 или, если эксперимент по выделению аутоантител будет проводится позже, добавляют консервирующий раствор (0,1 M фосфатный буфер содержащий 0,05% азида натрия)) и помещают сорбент на хранение при 4°С.

Практическая применимость заявляемого селективного иммуносорбента для удаления антител - IgG к десмоглеину 3 типа из сыворотки крови больных пузырчаткой подтверждается, но не исчерпывается следующими примерами.

Пример 1. Сорбция антител - IgG к десмоглеину 3 типа из сыворотки крови больных пузырчаткой in vitro с использованием селективного иммуносорбента для удаления антител (IgG) к десмоглеину 3 типа из сыворотки крови больных пузырчаткой

Для проведения исследований по определению условий эффективного функционирования селективного иммуносорбента для удаления антител -IgG к десмоглеину 3 типа из сыворотки крови больных пузырчаткой получены сыворотки крови 15 больных пузырчаткой и 10 здоровых лиц, которые были объединены в пулы сывороток больных пузырчаткой и пул сывороток здоровых лиц соответственно. Взятие образца крови у пациента производили натощак, в утренние часы или не ранее 5-6 часов после приема пищи. Кровь для исследования брали в количестве 4,5 мл при соблюдении правил асептики. Сыворотку крови получали путем центрифугирования крови в течение 10 минут при охлаждении до 4°С в центрифуге при скорости вращения ротора 3000 оборотов в минуту.

В последующем из пулов сывороток крови больных пузырчаткой и здоровых лиц выделены циркулирующие в сыворотках крови (несвязанные) антитела - IgG и получены препараты IgG - суммарные препараты антител - IgG. Часть иммунных комплексов (связанных антител IgG) фиксируются в коже и/или слизистых оболочках, что приводит к развитию клинической картины пузырчатки.

Выделение препаратов IgG производилось стандартным способом из пула сывороток крови больных пузырчаткой, содержавшаго антитела к Dsg3 (наличие антител к Dsg3 определялось методом ИФА с помощью наборов Anti-Desmoglein 3 ELISA, Euroimmun AG, ФРГ) и здоровых добровольцев методом аффиной хроматографии на колонке с белок G - сефарозой (сефароза с иммобилизованным белком G) (Биалекса, Россия).

Колонку с G-сефарозой (сефароза с иммобилизованным белком G) уравновешивали буфером для промывки (5-10 объемов колонки). Далее вносили сыворотку крови больного пузырчаткой из расчета 2 мл сыворотки на 1 мл G-сефарозы, промывали колонку буфером для промывки, периодически измеряя оптическую плотность фракций в спектрофотометре с длиной волны 280 нм, до тех пор, пока уровень оптической плотности фракций не сравняется с оптической плотностью чистого буфера для промывки. При промывке фракции собирали в отдельную емкость, формируя т.н. «проскок».

Затем колонку промывали буфером для элюции. Элюат собирали в пробирки с трис-буфером в соотношении 1 часть трис-буфера на 4 части элюата (процедура проводилась для нейтрализации рН элюата). Длительность элюции контролировали путем измерения оптической плотности вытекающего из колонки элюата на спектрофотометре с длиной волны 280 нм. Элюцию заканчивали, когда оптическая плотность элюата снижалась до уровня оптической плотности буфера для элюции.

После хроматографии производилась проверка качества выделения антител (элюата и "проскока") методом электрофореза по Лэммли (Остерман Л.Α., 1981). При обнаружении IgG в проскоке проскок заново наносился на колонку и очистка повторялась,

Фракции элюата, содержащие атитела - IgG, для концентрирования IgG объединяли и центрифугировали в центрифужных фильтрах Amicon (Millipore, США) с пределом фильтрации 100 kDa. В процессе центрифугирования в фильтры добавляли изотонический буфер, в результате чего получали концентрированный раствор IgG в буфере.

Готовый концентрированный раствор количественно переносили в пробирки типа "эппендорф" и измеряли оптическую плотность раствора методом спектрофотометрии при длине волны 280 нм. Коэффициент экстинкции IgG был принят равным 1,4. Готовые препараты антител хранили при +4°С.

75 мг препарата IgG, полученного из пула сывороток крови 15 больных пузырчаткой, было пропущено через селективный иммуносорбент для удаления антител IgG к десмоглеину 3 типа из сыворотки крови больных пузырчаткой. После очистки от антидесмоглеиновых антител IgG на селективном иммуносорбенте препарат IgG концентрировался путем центрифугирования в течение 10 минут при 4°С в фильтрах Amicone (Millipore, Франция).

В результате иммуносорбции антител к десмоглеину 3 типа из 75 мг препарата, содержащего IgG больных пузырчаткой, было получено 65 мг очищенного от антител к десмоглеину 3 типа препарата IgG (в дальнейшем - очищенные IgG). В них еще могут быть остатки специфических антител, но большая часть специфических - удалена. 10 мг антидесмоглеиновых IgG, выделенные из пула сывороток крови больных пузырчаткой, пропущенные через колонку с селективным иммуносорбентом, связались с используемым иммуносорбентом. Из пула сывороток крови 10 здоровых лиц выделено 10 мг препарата суммарных IgG.

Из 65 мг препарата IgG, очищенного от антител к десмоглеину 3 типа, 5 мг антител в последующем были использованы для оценки эффективности иммуносорбента по степени сорбции антител к десмоглеину 3 типа из сыворотки крови больных пузырчаткой in vitro методом ИФА. Активность раствора IgG после прохождения иммуносорбента методом ИФА сравнивалась с активностью раствора суммарных IgG до прохождения иммуносорбента.

Для оценки эффективности иммуносорбента по степени сорбции антител к десмоглеину 3 типа из сыворотки крови больных пузырчаткой in vitro определяли содержание антител к Dsg3 в образцах пулов сыворотки крови больных пузырчаткой (до и после селективной иммуносорбции) и здоровых лиц методом ИФА с набором реагентов «Anti-Desmoglein 3 ELISA (IgG)» (Euroimmun AG, Германия). Активность препарата IgG после прохождения иммуносорбента сравнивалась с активностью препарата IgG до прохождения селективного иммуносорбента и активностью препарата IgG, полученного от здоровых лиц, методом ИФА. С помощью фотометра методом ИФА оценивали оптическую плотность препаратов, содержащих циркулирующие IgG к десмоглеину 3 типа.

Обследованы следующие образцы препаратов.

1. Препарат суммарных IgG, выделенный из пула сывороток крови больных пузырчаткой - Атвыд.

2. Препарат суммарных IgG, выделенный из пула сывороток крови больных пузырчаткой, пропущенный через хроматографическую колонку с используемым иммуносорбентом, твердофазным агарозным сорбентом, несущим на своей поверхности N-гидроксисукцинимидные группы: NHS-активированная агароза, частично очищенный от антител-IgG к десмоглеину 3 типа и не связавшийся с иммуносорбентом - Аточищ.

3. Препарат суммарных IgG, выделенный из пула сывороток крови здоровых лиц.

Препарат суммарных IgG, выделенный из пула сывороток крови больных пузырчаткой (Атвыд), препарат суммарных IgG, выделенный из пула сывороток крови больных пузырчаткой, пропущенный через хроматографическую колонку с используемым иммуносорбентом и очищенный от антител (не связавшихся с иммуносорбентом) (Аточищ), и препарат суммарных IgG, выделенный из пула сывороток здоровых лиц, были взяты в одинаковой концентрации - 1 мг/мл, что позволило провести сравнительный анализ оптической плотности растворов, содержащих антидесмоглеиновые антитела IgG (табл. 1).

Как следует из таблицы, оптическая плотность препарата, содержащего антитела - IgG к десмоглеину 3 типа, полученного от больных пузырчаткой (0,892), в 6,8 раза больше, чем в препаратах, полученных от здоровых лиц (0,132) (минимальная оптическая плотность, при которой результат считается положительным и приводит к развитию пузырчатки, согласно инструкции к набору - 0,174). После прохождения через селективный иммуносорбент оптическая плотность препарата, содержащего антитела - IgG к десмоглеину 3 типа, полученного от больных пузырчаткой, уменьшилась до 0,439 (разница по сравнению с оптической плотностью препаратов IgG, полученных от здоровых лиц, уменьшилась до 3,3 раза).

Изменение активности антител - IgG рассчитывали по формуле

где D(Aтвыд) - оптическая плотность препарата антител - IgG, выделенного из пула сывороток крови больных пузырчаткой,

D(Aточищ) - оптическая плотность препарата антител - IgG, пропущенного через используемый твердофазный агарозный сорбент, несущий на своей поверхности N-гидроксисукцинимидные группы: NHS-активированная агароза, и очищенного от антител к десмоглеину 3 типа и не связавшихся с иммуносорбентом.

Как следует из расчетов по формуле, изменение активности антител - IgG в препаратах, выделенных из пула сывороток крови больных пузырчаткой до и после прохождения испытуемого иммуносорбента, равно 0,51, что свидетельствует о значительном снижении активности антител в препаратах антител - IgG после прохождения через испытуемый иммуносорбент.

Образец, полученный путем элюирования связавшихся антител к десмоглеину 3 типа с иммуносорбентом, был положительным, что свидетельствует о связывании антител к десмоглеину 3 типа с твердофазным агарозным сорбентом, несущим на своей поверхности N-гидроксисукцинимидные группы: NHS-активированная агароза, который ковалентно связан с рекомбинантым человеческим десмоглеином 3 типа, при прохождении через него препарата суммарных IgG.

Таким образом, из результатов, представленных выше, следует, что предложенный селективный иммуносорбент для удаления антител (IgG) к десмоглеину 3 типа из сыворотки крови больных пузырчаткой обладает хорошей способностью связывать антитела к десмоглеину 3 типа из препарата IgG, полученного от больных пузырчаткой, позволит снизить тяжесть заболевания и добиться ремиссии у больных пузырчаткой.

Пример 2. Эффективность селективного иммуносорбента для удаления антител (IgG) к десмоглеину 3 типа из сыворотки крови больных пузырчаткой in vivo на экспериментальной модели.

Проводились экспериментальные исследования по определению эффективности селективного иммуносорбента для удаления антител (IgG) к десмоглеину 3 типа из сыворотки крови больных пузырчаткой in vivo с использованием 15 лабораторных животных (новорожденных мышей линии BALB/c).

Мыши были разделены на 3 группы: 1 группе (5 мышей) - вводили по 30 мг препарата IgG, выделенного из сыворотки крови больных пузырчаткой (не очищенного на иммуносорбенте) (основная группа); 2 группе (5 мышей) - вводили по 30 мг препарата IgG, выделенного из сыворотки крови здоровых лиц (контрольная группа); 3 группе (5 мышей) - вводили по 30 мг препарата IgG, полученного из сыворотки крови больных пузырчаткой и очищенных на селективном иммуносорбенте от антител к десмоглеину 3 типа. Время экспонирования - 48 часов. По истечении времени производили забор биопсийного материала для получения биопсийного материала для гистологического исследования и метода реакции непрямой иммунофлюоресценции.

Мышам вводили 150 мкл раствора IgG в стерильном фосфатно-солевом буфере (рН 7,2) инсулиновым шприцом на 1 мл с иглой 27G и меньше (один шприц на животное).

После введений IgG от больных пузырчаткой у мышей наблюдались эрозии в абдоминальной области, по 3-бальной шкале оцениваемые как 1+ (т.е. три или менее поражений кожи) (Фиг. 1. Экспериментальная модель (препараты IgG от больного пузырчаткой). Эрозии на коже мыши), положительный симптом Никольского.

При патоморфологическом исследовании аутопсийного материала выявлены признаки акантолиза (Фиг. 2А. Гистологическая картина (субкорнеальная полость, содержащая акантолитические клетки) х50. Окр. гем. эоз.); при исследовании фиксированных IgG методом нРИФ определялась фиксация IgG в межклеточных промежутках эпидермиса (Фиг. 2Б. Реакция иммунофлюоресценции (конфокальная лазерная сканирующая микроскопия, КЛСМ х20). Фиксация IgG в межклеточных промежутках эпидермиса).

При введении препарата IgG от здоровых добровольцев не зафиксировано патологических изменений при клиническом осмотре, патоморфологическом исследовании и проведении нРИФ препаратов кожи мышей.

При введении препарата IgG, полученного от больных пузырчаткой и очищенных на предложенном иммуносорбенте от антител к десмоглеину 3 типа, не выявлены клинические, патоморфологические и иммунологические признаки пузырчатки у мышей.

Данный пример свидетельствует об эффективности удаления антител из сыворотки крови больных пузырчаткой твердофазным агарозным сорбентом, несущим на своей поверхности N-гидроксисукцинимидные группы: NHS-активированную агарозу.

Проведенные эксперименты выявили, что селективный иммуносорбент для удаления антител (IgG) к десмоглеину 3 типа из сыворотки крови больных пузырчаткой позволяет избирательно повысить степень сорбции IgG. Применение такого вида иммунсорбента у больных пузырчаткой может улучшить качество проводимой терапии, позволяет уменьшить дозы и длительность системных глюкокортикостероидных препаратов, снизить частоту развития побочных эффектов вследствие иммуносупрессивной терапии.

Способ получения селективного иммуносорбента для удаления антител - IgG к десмоглеину 3 типа из сыворотки крови больных пузырчаткой с использованием твердофазного носителя, заключающийся в том, что для его получения рекомбинантый человеческий десмоглеин 3 типа (Dsg3) иммобилизируют путем ковалентного связывания с твердофазным носителем, в качестве которого применяют агарозный сорбент, несущий на своей поверхности N-гидроксисукцинимидные группы: NHS-активированную агарозу.



 

Похожие патенты:

Группа изобретений относится к области диагностики, а именно к устройству для выявления аналитов, включающему пластиковую подложку, частично или полностью непосредственно покрытую связывающими полимерами, фиксированными на подложке нековалентно, при этом указанные связывающие полимеры содержат полисахаридный остов, снабженный: ароматическими группами формы -X-CONH-Z, группами карбоновой кислоты формы -Х-СООН и реакционно-способными группами F, имеющими форму -X-CONH-Z′, где X означает неразветвленную или разветвленную, замещенную или незамещенную алкильную цепь, содержащую от 1 до 6 атомов углерода, Z означает арильную функцию, Z′ означает группу, которая способна связываться с другой молекулой, а также к способам производства указанного устройства, кроме того, к связывающему полимеру и к способу его получения.

Изобретение относится к области медицины и биотехнологии и касается способа анализа сахаридных вакцин без взаимовлияния. .
Изобретение относится к иммунобиотехнологии и может быть использовано в производстве высокочувствительных тест-систем для (качественного и количественного) определения антигенов, антител и других иммунореактивных соединений, а также в технологии изготовления безинструментальных и надежных диагностикумов для генно-гибридизационного и лиганд-рецепторного анализа.

Изобретение относится к медицине, а именно к аллергологии, и может быть использовано для оценки гиперчувствительности по высвобождению гистамина из лейкоцитов цельной крови.

Изобретение относится к области методов клинико-лабораторной диагностики и касается способа прогнозирования рецидивирующего вульвовогинального кандидоза (ВВК). Сущность способа: проводят генотипирование пациентки по полиморфным локусам генов IL4:-33 С>Т [rs2070874]; CCL2:2493(-2578) A>G [rs1024611]; IL1B:-598(-1552) A>G [rs16944] с применением ПЦР в режиме реального времени и определяют долю лактобацилл в составе вагинальной микрофлоры при помощи комплекта реагентов "Фемофлор 16", после чего полученные данные включают в функцию Z=1,063*IL1B+1,112*IL4+1,483*CCL2-0,044*Lact+1,326, где 1,326 - некоторая константа, IL1B - количество аллелей G в локусе IL1B:-598(-1552) A>G [rs16944] гена IL1B, IL4 - количество аллелей С в локусе IL4:-33 С>Т [rs2070874] гена IL4, CCL2 - количество аллелей G в локусе CCL2:2493(-2578) A>G [rs1024611] гена CCL2, Lact - доля лактобацилл (%) в составе вагинальной микрофлоры.
Изобретение относится к медицине, а именно к гематологии, и предназначено для прогнозирования течения иммунной тромбоцитопении после спленэктомии. Для осуществления изобретения определяют массу удаленной селезенки, выполняют гистологическую проводку образцов послеоперационного материала общепринятым способом с приготовлением парафиновых блоков.

Изобретение относится к области педиатрии, а конкретно к аллергологии и диетологии раннего возраста, и может быть использовано аллергологами и/или диетологами для прогнозирования формирования толерантности при аллергии к белку коровьего молока у детей раннего возраста.

Группа изобретений относится к области медицины, в частности к клинической и биологической психиатрии. Регистрируют электроэнцефалограмму (ЭЭГ) до начала терапии больных приступообразной шизофренией с маниакально-бредовыми расстройствами.
Изобретение относится к медицине и касается способа прогнозирования угрозы невынашивания при гриппе A(H3N2) у женщин в первом триместре беременности. Сущность способа заключается в том, что у женщин в первом триместре гестации при гриппе A(H3N2) в период разгара заболевания в первой сыворотке крови определяют величину титра противовирусных антител (А), оценивают уровень TNF-α (пг/мл) (В).
Изобретение относится к медицине и касается способа прогнозирования выкидыша на первом триместре гестации при действии у беременной цитомегаловирусной инфекции в период обострения.

Заявленное изобретение относится к области ветеринарии. Способ включает серологическое исследование крови серонегативных животных на лейкоз с применение РИД в течение 5 дней после учета и оценки реакции на ППД-туберкулин для млекопитающих.

Заявленное изобретение относится к области ветеринарии. Способ включает серологическое исследование крови серонегативных животных на лейкоз с применение РИД в течение 5 дней после учета и оценки реакции на ППД-туберкулин для млекопитающих.
Изобретение относится к медицине, а именно к неврологии, эндокринологии, и может быть использовано для ранней диагностики когнитивных нарушений у больных с сахарным диабетом 2 типа.
Изобретение относится к области медицины и представляет собой способ прогнозирования развития тяжелого поражения центральной нервной системы при клещевом энцефалите с помощью анализа ликвора, отличающийся тем, что в ликворе больного определяют уровень серотонина, при его значении более 20 нг/мл прогнозируют среднетяжелое поражение центральной нервной системы с развитием непаралитической менингеальной формы, менее 20 нг/мл - прогнозируют тяжелое поражение центральной нервной системы с формированием паралитических очаговых форм. Изобретение обеспечивает высокую точность и специфичность исследования, сокращение времени на диагностику. 2 пр.

Изобретение относится к области медицины и касается способа ранней диагностики бронхиальной астмы у детей в возрасте 5 лет и младше. Сущность способа заключается в том, что проводят анализ данных анамнеза, оценку клинических симптомов, изучение аллергологического статуса, которое проводят с использованием общего анализа крови, в котором определяют уровень эозинофилов и уровень общего иммуноглобулина Е в сыворотке крови, проведение цитологического исследования индуцированной мокроты, для определения в ней процентного содержания эозинофилов. Дополнительно анализируют Индекс Риска Астмы (API) и при его положительном значении и уровне эозинофилов в мокроте, равном или больше 2,5%, диагностируют бронхиальную астму. Причем при уровне эозинофилов в мокроте меньше 2,5% проводят повторное исследование и при выявлении повышения уровня эозинофилов мокроты не менее чем в 2 раза диагностируют бронхиальную астму, при этом повторное исследование проводят не менее одного раза в 6 месяцев, а при появлении респираторных симптомов - более одного раза в 6 месяцев. Использование способа позволяет с высокой точностью диагностировать бронхиальную астму на ранних стадиях у детей в возрасте 5 лет и младше. 1 з.п. ф-лы, 8 табл., 3 пр.

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для прогнозирования течения онкологических заболеваний. В периферической крови больного определяют количество Т-лимфоцитов CD3+, 10*9/л, и их субпопуляций: лимфоцитов CD4+ и CD8+, 10*9/л, %, кроме того, вычисляют значение частного от деления количества субпопуляций лимфоцитов CD4+ на количество CD8+. После окончания курса первичного лечения в периферической крови больного определяют абсолютное количество Т-лимфоцитов CD3+, 10*9/л, синтезирующих спонтанно и стимулированно провоспалительные цитокины, фактор некроза опухоли (TNF-α), интерлейкин - 2 (IL-2), интерферон γ (INF-γ). После чего оценивают реактивность влияния на течение опухолевого процесса каждого вида цитокина путем вычисления коэффициента реакции для каждого из них по формуле: Кр=nCD3+стим/nCD3+спонт, где Кр - коэффициент реакции влияния на течение опухолевого процесса для соответствующего провоспалительного цитокина, а именно: TNF-α, INF-γ, IL-2; nCD3+стим - количество клеток Т-лимфоцитов (CD3+) в периферической крови, синтезирующих соответствующий цитокин в тест-системе после стимуляции; CD3+спонт - количество клеток Т-лимфоцитов CD3+ в периферической крови, синтезирующих соответствующий цитокин спонтанно. Затем вычисляют значение частного от деления количества субпопуляций лимфоцитов CD4+ на количество CD8+ и при значении частного от деления равном 1 и выше, при значении коэффициента реакции в заданных пределах хотя бы для двух цитокинов, а именно: для TNF-α в пределах от 80 до 120, для IL-2 от 80 до 120, для INF-γ от 150 до 250, развитие заболевания прогнозируют как нормореактивное, прогноз благоприятный; при значении частного от деления количества субпопуляций CD4+ на количество лимфоцитов CD8+ меньше 1, при значении коэффициента реакции хотя бы для двух цитокинов выше верхнего предела, а именно: для TNF-α и для IL-2 выше 120, для INF-γ выше 250, развитие заболевания прогнозируют как гиперреактивное, прогноз благоприятный; при значении коэффициента реакции хотя бы для двух цитокинов ниже нижнего предела, а именно: для TNF-α и для IL-2 ниже 80, для INF-γ ниже 150, развитие заболевания прогнозируют как гипореактивное, прогноз неблагоприятный; при значении частного от деления количества лимфоцитов CD4+ на количество лимфоцитов CD8+ больше 1, при значении коэффициента реакции хотя бы для двух цитокинов выше верхнего предела, а именно: для TNF-α и для IL-2 выше 120, для INF-γ выше 250, развитие заболевания прогнозируют как гиперреактивное, прогноз неблагоприятный; при значении коэффициента реакции хотя бы для двух цитокинов ниже нижнего предела, а именно: для TNF-α и для IL-2 ниже 80, для INF-γ ниже 150, развитие заболевания прогнозируют как гипореактивное, прогноз благоприятный. Использование данного способа позволяет прогнозировать течение онкологических заболеваний путем оценки взаимосвязи между соотношением субпопуляций лимфоцитов и влиянием на течение опухолевого процесса цитокинов- TNF-α, IL-2 и INF-γ. 10 пр., 6 табл.

Изобретение относится к аналитической химии и представляет собой способ проведения иммунохроматографического анализа. Предложенный способ проведения иммунохроматографического анализа отличается тем, что при изготовлении тест-полоски используют прозрачную подложку. После контакта тест-полоски с пробой и завершения движения реагентов вдоль мембран на нитроцеллюлозную мембрану наносят вещество, растворяющее нитроцеллюлозу, но не нарушающее структуру подложки, например ацетонитрил. После высыхания растворителя на поверхности подложки образуется стекловидная прозрачная масса. Детекция на просвет оставшегося в зонах связывания маркера дает возможность его полной (100%-ной) регистрации при малом уровне неспецифического окрашивания вне зон связывания, что, в конечном итоге, повышает достоверность регистрации результатов анализа и позволяет выявлять наличие в пробах контролируемого соединения в более низких концентрациях. 2 ил., 1 табл., 1 пр.

Изобретение относится к области биохимии. Описаны антиген-связывающие фрагменты (Fab), селективно связывающиеся с ботулиническим нейротоксином С, в частности гуманизированные Fab. Представлены клетки дрожжей, продуцирующие указанные гуманизированные Fab. Предложен способ получения описанных гуманизированных Fab. Также предложены способ детекции ботулинического нейротоксина С и набор для детекции ботулинического нейротоксина С. Изобретение позволяет получить реагенты для детекции ботулинического нейротоксина С, обладающие высокой специфичностью связывания с указанным нейротоксином. 8 н. и 1 з.п. ф-лы, 12 ил., 6 табл., 9 пр.
Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использован для выявления предраковых изменений в молочной железе. Для этого определяют концентрацию интерлейкина 8 (ИЛ-8) в супернатанте пробы клеток крови пациента, инкубированных с раково-эмбриональным антигеном (РЭА) и без РЭА. После чего вычисляют индекс влияния (ИВ) раково-эмбрионального антигена (ИВ РЭА) на продукцию ИЛ-8 (ИВ РЭА ИЛ-8) по формуле: ИВ РЭА ИЛ-8=А/Б, где А - уровень продукции цитокина под влиянием РЭА, Б - уровень спонтанной продукции цитокина. При величине ИВ РЭА ИЛ-8, не превышающей 14, выявляют предраковые изменений в молочной железе (склерозирующий аденоз или пролиферат молочной железы). Использование данного способа позволяет выявлять предраковые изменения в молочной железе, что позволяет своевременно начать адекватное лечение. 4 пр.

Изобретение относится к области медицины, конкретно к онкологии, и касается способов прогнозирования безрецидивной выживаемости у больных раком молочной железы. Сущность способа: определяют уровень экспрессии YKL-39 по технологии ТaqMan с помощью специфичных праймеров и пробы Sense 5’-aacaacaaggttatcatcaaggac-3’, AntiSense 5’-tttgggattcttggttttgag-3’, Probe FAM-5’-agtgaagtgatgctctaccagaccat-3’-BHQ1, далее проводят ПЦР-анализ экспрессии гена белка YKL-39, оценивают относительную экспрессию гена белка YKL-39 с помощью метода Pfaffl в условных единицах (УЕ) относительно гена рефери GAPDH, причем в качестве калибратора используют нормальную ткань молочной железы, в которой при проведении исследования аналогичным вышеописанному способом уровень экспрессии гена белка YKL-39 составляет 1 УЕ. При уровне экспрессии YKL-39 более 1 УЕ прогнозируют высокую, а при уровне экспрессии гена белка YKL-39 менее 1 УЕ - низкую вероятность длительного периода безметастатической выживаемости. 1 табл.

Изобретение относится к области анализа биологических проб. Способ анализа проб включает в себя анализ клинико-химических и иммунологических параметров, а также включает установку картриджей для реагентов в приемное устройство, установку сосуда для пробы в пробоприемник, определение клинико-химических и иммунологических параметров с применением измерительной кюветы, промывку или извлечение использованных измерительных кювет, извлечение использованных картриджей для реагентов и сосуда для проб. При этом для каждого определяемого клинико-химического или иммунологического параметра в приемное устройство вставляют отдельный картридж для реагентов, который содержит ячейки с необходимыми для анализа реагентами-индикаторами, причем в картриджи для реагентов для анализа клинико-химических параметров помещают по меньшей мере один реагент-индикатор, а в картриджах для анализа иммунологических параметров, предусматривают первую ячейку с конъюгатом, вторую ячейку с субстратным раствором и твердую фазу. Изобретение обеспечивает возможность одновременного определения клинико-химических и иммунологических параметров пробы. 10 з.п. ф-лы, 3 ил.

Изобретение относится к медицине, в частности к иммунохимии, а именно к способу получения материала для биологического связывания с помощью сорбирующих колонок. Сущность изобретения заключается в том, что разработан способ получения селективного иммуносорбента для удаления антител - IgG к десмоглеину 3 типа из сыворотки крови больных пузырчаткой с использованием твердофазного носителя, заключающийся в том, что для его получения рекомбинантый человеческий десмоглеин 3 типа иммобилизируют путем ковалентного связывания с твердофазным носителем, в качестве которого применяют агарозный сорбент, несущий на своей поверхности N-гидроксисукцинимидные группы: NHS-активированную агарозу. При использовании изобретения получают иммуносорбент, обладающий высокой селективной сорбционной способностью по отношению к аутоантителам - IgG к десмоглеину 3 типа. Полученный предлагаемым способом иммуносорбент может использоваться для лечения больных пузырчаткой в качестве адъювантного метода терапии. Его применение улучшает качество терапии, позволяет уменьшить дозы и длительность системных глюкокортикостероидных препаратов, снизить частоту развития побочных эффектов вследствие иммуносупрессивной терапии. 2 ил., 1 табл., 2 пр.

Наверх