Способ сбора только зрелых яиц (in vitro) от самок возбудителя гельминтозооноза trichostrongylus colubriformis

Изобретение относится к области ветеринарии и предназначено для сбора зрелых яиц in vitro от самок возбудителя гельминтозооноза Trichostrongylus colubriformis. Способ заключается в том, что матриксы из тонких кишок спонтанно зараженных трихостронгилюсами при исследовании гельминтологическими методами на вскрытии мелких жвачных предварительно обрабатывают в изотоническом растворе (0,9%) хлорида натрия при t = 37°C. Затем проводят отбор 250 и более живых, активных, половозрелых 250 и более самок вида Trichostrongylus colubriformis. Отбор проводят в отдельные бактериологические чашки с раствором Ringer по 9 самок в каждую чашку. Затем их экспонируют при t = 25°C в течение 3-х часов в условиях термостата, после чего получают чистую культуру зрелых яиц Trichostrongylus colubriformis, выделенных живыми самками. Заявленный способ позволяет получить до 100% сбора только зрелых яиц от самок возбудителя гельминтозооноза Trichostrongylus colubriformis. 1 пр.

 

Изобретение относится к области ветеринарной медицины, а более конкретно - к паразитологии (= гельминтологии) к «Способу сбора зрелых яиц in vitro от самок возбудителя гельминтозооноза: Trichostrongylus colubrifomis», предназначенный для гельминтологических сборов только зрелых яиц от живых, половозрелых самок возбудителя гельминтозооноза вида: Trichostrongylus colubriformis, собранных при гельминтологических вскрытиях по методу академика К.И. Скрябина - [9] на мясокомбинатах, убойных пунктах, зоопарках, цирках, заповедниках, спонтанно зараженных трихостронгилюсами домашних или/и диких (снежных баранов, архаров, косуль и др.) мелких жвачных для проведения паразитологических лабораторных исследований.

Возбудителями трихостронгилезов жвачных являются многочисленные виды рода Trichostrongylus Looss, 1905: Trichostrongylus axei (Cobbold, 1879), Trichostrongylus colubriformis (Giles, 1892) Trichostrongylus probolurus (Railliet, 1896), Trichostrongylus vitrinus Looss, 1905 et al. [К.И. Скрябин, Н.П. Шихобалова, Р.С. Шульц - 10; К.И. Скрябин, А.М. Петров - 11; В.Е. Пасечник и др. - 4; В.Е. Пасечник - 5; А.П. Тощев - 12]

Трихостронгилюсы имеют весьма широкое распространение, и ими почти поголовно заражены все овцы, крупный рогатый скот во всех странах света. [К.И. Скрябин, А.М. Петров - 11]

Хозяева: домашние (овцы, козы, крупный рогатый скот, верблюды) и дикие парнокопытные (антилопы, олени, бизоны, зубры и др.), лошади и человек: Trichostrongylus orientalis, Tr. probolurus, Tr. vitrinus, Tr. skrjabini, Tr. axei, Tr. colubriformis и др. [К.И. Скрябин, Н.П. Шихобалова, Р.С. Шульц - 10; К.И. Скрябин, А.М. Петров - 11; В.Е. Пасечник и др. - 4; В.Е. Пасечник - 5; В.П. Подъяпольская - 7; Н.П. Романова - 8; А.П. Тощев - 12].

Известно, что трихостронгилюсы - самые мелкие гельминты семейства Trichostrongylidae Leiper, 1912. Длина их 3-7 мм. Характеризуются отсутствием зуба в ротовой полости, головной везикулы и шейных сосочков. Спикулы относительно короткие. [К.И. Скрябин, Н.П. Шихобалова, Р.С. Шульц - 10; К.И. Скрябин, А.М. Петров - 11; В.Е. Пасечник и др. - 4]

Известны способы сбора яиц гельминтов методами копроовоскопии: флотации, комбинированные, седиментации [Г.А. Котельников - 1, В.Е. Пасечник и др. - 4] Эти способы (= методы) сбора яиц от гельминтов имеют недостаток:

неизвестен вид (диагностика устанавливается гельминтоларвоскопическим методом по обнаружению инвазионных личинок паразитических нематод (а не яиц!) в фекалиях жвачных), так как известно, что у домашних и диких жвачных, паразитируют виды: Trichostrongylus axei (Cobbold, 1879) Raillet et Henry, 1909; Trichostrongylus capricola Ransom, 1907; Trichostrongylus colubriformis (Giles, 1892); Trichostrongylus probolurus (Railliet, 1896); Trichostrongylus vitrinus Looss, 1905 и др., а это значит, что исследователю необходимо разделить (= сепарировать) яйца этих гельминтов по каждому виду, но вышеназванными способами (= методами) осуществить это невозможно, что и вынудило нас из-за этого существенного недостатка этих известных способов (флотации, седиментации, комбинированный) к поиску другого способа сбора только зрелых яиц от самок возбудителя гельминтозооноза вида: Trichostongylus colubriformis (Giles, 1892).

Известен способ [В.Е. Пасечник - 2, 3] сбора яиц для лабораторных исследований, при котором исследователи для сбора яиц от гельминтов проводят разрушение половых органов самок.

Этот способ сбора яиц имеет следующие недостатки:

1) чтобы извлечь яйца гельминтов, необходимо вскрыть половые органы самок (вульву, вагину, матку) и следовательно убить гельминтов, а это вызывает очень сильное загрязнение яиц паразитов остатками тканей половых органов самок, что в процессе опыта вызывает гниение и разрушение яиц гельминтов;

2) другой недостаток, является то, что при этом способе сбора яиц получение 100% зрелых яиц невозможно, так как основная масса жизнеспособных яиц находится в дистальной части вагины и даже в вульве (во влагалище).

3) еще один из недостатков является присутствие большого количества незрелых яиц в сборе, что значительно затрудняет лабораторные исследования.

4) для проведения экспериментов исследователям нужны для изучения в лабораторных (заражение лабораторных животных и др.) опытах сборы до 100% и иногда тысячи зрелых яиц Trichostrongylus colubriformis;

5) Trichostrongylus colubriformis, настолько малы (3-7 мм длины), что получение их путем вскрытия самок слишком сложная работа, и кроме того не дает максимального числа зрелых яиц.

Известен способ прижизненного сбора оплодотворенных яиц (in vitro) от возбудителя паразитарного зооноза Trichuris (= Trichocephalus) vulpis [Пасечник В.Е. - 6], который имеет некоторые недостатки:

1. Trichuris (= Trichocephalus) vulpis является паразитом типичным для домашних и диких хищных, но не для домашних и диких жвачных (что было доказано нами проведенными перекрестными заражениями в предыдущие годы [В.Е. Пасечник - 2, 3], a Trichostrongylus colubriformis является типичным гельминтом домашних и диких жвачных [Г.А. Котельников - 1; В.Е. Пасечник и др. - 4; В.Е. Пасечник - 5; Н.П. Романова - 8; К.И. Скрябин, Н.П. Шихобалова, Р.С. Шульц - 10; К.И. Скрябин, А.М. Петров - 11; А.П. Тощев - 12]. Следовательно эти гельминты Т. vulpis (паразит плотоядных) и Tr. colubriformis (паразит жвачных) имеют разные условия паразитирования в хозяине: 1 й в организме хищных (= плотоядных), а 2-й в организме жвачных, поэтому и условия в лабораторной среде (применяемые растворы, температурный режим и время экспозиции) для этих 2-х видов самок гельминтов: Trichuris (= Trichocephalus) vulpis и Trichostrongylus colubriformis будут резко отличаться;

2. другой недостаток этого способа является необходимость использования пробирок, что значительно затрудняет посевы яиц Trichostrongylus colubriformis, для культивирования до инвазионной стадии и соответственно удлиняет рабочее время экспериментаторов;

3. еще один из недостатков является, то что, по указанному выше способу исследователь, применял официнальный изотонический раствор (0,9%) хлорида натрия и получал оплодотворенные яйца от самок возбудителя паразитарного зооноза хищных: Trichuris (= Trichocephalus) vulpis, однако применение в предлагаемом нами способе этого раствора к самкам жвачных Trichostrongylus colubriformis нецелесообразно, так как количество яиц при указанном выше известном способе сбора оплодотворенных яиц, значительно уступает предлагаемому нами способу;

4. температурный режим при этом известном способе прижизненного сбора оплодотворенных яиц (in vitro) от возбудителя паразитарного зооноза Trichuris (= Trichocephalus) vulpis, значительно выше (t=37,5 С - 39 С), а это так же является недостатком, и влияет существенно на количество получаемых яиц по предлагаемому нами способу от самок жвачных животных Trichostrongylus colubriformis, так как при t> выше 30 С в разы уменьшается количество яиц выделяемой живой, половозрелой самкой Trichostrongylus colubriformis в официнальный изотонический раствор (0,9%) хлорида натрия, что неприемлемо для проведения качественных исследований, так как часто экспериментаторам необходимы для заражения каждого экспериментального животного (ягненка, козленка) тысячи яиц с инвазионными личинками.;

5. еще одним из существенных недостатков этого известного способа является отсутствие предварительной обработки матриксов изотоническим раствором (0,9%) хлорида натрия при t = 37°C в период отбора из них гельминтов, а это имеет большое значение при сборе максимального количества (250 и более) живых и активных половозрелых самок жвачных Trichostrongylus colubriformis, что влияет на количество отбираемых в опыт самок Trichostrongylus colubriformis, что также неприемлемо для сбора только зрелых яиц от самок жвачных Tr. colubriformis по предлагаемому нами способу.

Следовательно, исследователю по указанным выше причинам собрать указанными выше способами в большом количестве до 100% только зрелые яйца от самок возбудителя гельминтозооноза вида: Trichostrongylus colubriformis, для проведения экспериментов в лабораторных условиях невозможно.

Целью изобретения является использование впервые разработанного нами «Способа сбора зрелых яиц in vitro от самок возбудителя гельминтозооноза: Trichostrongylus colubriformis», от домашних или/и диких мелких жвачных для экспериментов: культивирования до инвазионной стадии, проведения морфологических исследований для изучения микроструктуры, ультраструктуры яиц, для заражения лабораторных животных, с получением культуры только зрелых яиц в стерильных условиях, т.е. без загрязнений кусочками тканей матки, вагины, вульвы и без занесения секундарной микрофлоры из половых органов и внешней среды и самое главное получить максимальное количество in vitro до 100% только зрелые яйца от живых, половозрелых самок Trichostrongylus colubriformis, отобранных из матриксов при гельминтологических вскрытиях по методу академика К.И. Скрябина - [9] и предварительно идентифицированных до вида в лабораторных условиях из множества других видов гельминтов рода Trichostrongylus Looss, 1905.

Поставленная цель достигается тем, что при проведении сбора яиц от трихостронгилюсов, применяют разработанный нами впервые «Способ сбора зрелых яиц in vitro от самок возбудителя гельминтозооноза Trichostrongylus colubriformis», заключающийся в том, что матриксы из тонких кишок спонтанно зараженных трихостронгилюсами при исследовании гельминтологическими методами на вскрытии мелких жвачных предварительно обрабатывают в изотоническом растворе (0,9%) хлорида натрия при t = 37°C, затем проводят отбор 250 и более живых, активных, половозрелых 250 и более самок вида: Trichostrongylus colubriformis, отбор проводят в отдельные бактериологические чашки с раствором Ringer по 9 самок в каждую чашку, которые затем экспонируют при t = 25°C в течение 3-х часов в условиях термостата, после чего получают чистую культуру зрелых яиц Trichostrongylus colubriformis, выделенных живыми самками, отличающийся от:

1) известных копроовоскопических (флотации, седиментации, комбинированных) способов (= методов) сбора яиц, тем что:

известен вид самки паразита: Trichostrongylus colubriformis, а при копроовоскопических способах (= методах) сбора яиц вид гельминта неизвестен, так как у домашних и диких жвачных паразитируют различные виды трихостронгилюсов, и иногда с большой экстенсивностью и интенсивностью инвазии. Так в Иркутской и Читинской областях у овец и коз отмечались с интенсивностью инвазии ИИ = до 4273 экземпляров вида: Trichostrongylus probolurus, а у крупного рогатого скота в Иркутской области с интенсивностью инвазии ИИ = до 3241 экз. вида: Tr. colubriformis [А.П. Тощев - 12] и у архаров, поступивших в Московский зоопарк и вскрытых после гибели с интенсивностью инвазии ИИ = до 3732 экземпляров вида: Tr. colubriformis на 1 вскрытое животное [Н.П. Романова - 8].

Поэтому еще одним из существенных отличий предлагаемого способа от известных копроовоскопических является то, что при этих способах исследователям необходимо культивировать личинки до инвазионной стадии и уточнять виды паразитов и сепарировать их по видам, выбирая себе для проведения экспериментов определенный вид или виды гельминтов, что практически очень сложно и занимает иногда несколько рабочих дней, а это нецелесообразно;

отличающийся от известного способа сбора яиц путем разрушения половых органов самок (вульвы, вагины, матки) гельминтов тем, что:

отбираются из тонких кишок, только половозрелые, активные и живые самки: Trichostrongylus colubriformis (в отличие от известного метода сбора яиц путем разрушения половых органов самок, когда исследователь отбирает подряд самок и иногда погибших);

копулятивные органы самок Trichostrongylus colubriformis не разрушаются для получения яиц паразитов (в отличие от известного способа сбора яиц путем разрушения половых органов самок);

происходит естественная (= произвольная) откладка только зрелых яиц самками трихостронгилюсов (и без загрязнения материала частицами разрушенных половых органов самок паразитов: вагины, матки, вульвы) и секундарной микрофлорой и тем самым получают чистый сбор из 100% только зрелых яиц не разрушая половые органы самок Tr. colubriformis и не загрязняя секундарной микрофлорой экспериментальный материал и тем самым предотвращая гниение и разрушение полученной культуры яиц от самок возбудителя гельминтозооноза вида: Trichostrongylus colubriformis от домашних и/или диких мелких жвачных;

отличающийся от известного «Способа прижизненного сбора оплодотворенных яиц (in vitro) от возбудителя паразитарного зооноза Trichuris (= Trichocephalus) vulpis», тем, что:

1-е отличие: самки Trichostrongylus colubriformis собираются не в пробирки, а в бактериологические чашки, что позволяет непосредственно в бактериологических чашках культивировать и наблюдать развитие личинок Trichostrongylus colubriformis до инвазионной стадии под микроскопом, что значительно облегчает экспериментальные работы;

2-е отличие: оптимальный температурный режим для сбора яиц от живых, активных и половозрелых самок возбудителя гельминтозооноза вида Trichostrongylus colubriformis равен t = 25°C, что увеличивает до 100% сборы только зрелых яиц, а при температурном режиме по известному способу в t = 37°C и более, количество зрелых яиц откладываемых самками Tr. colubriformis в сборах уменьшается существенно, что неприемлемо для качественного проведения экспериментов;

3-е отличие: в предлагаемом нами способе сбора только зрелых яиц обязательным условием является необходимость предварительной обработки матриксов в период отбора самок Trichostrongylus colubriformis изотоническим раствором (0,9%) хлорида натрия при t = 37°C, что активизирует жизнеспособность самок Trichostrongylus colubriformis, а этот этап в проведении сборов по известному способу прижизненного сбора оплодотворенных яиц (in vitro) от возбудителя паразитарного зооноза Trichuris (= Trichocephalus) vulpis отсутствует, что в разы уменьшает количество собираемых зрелых яиц от самок Trichostrongylus colubriformis.

Собранные по нашему предлагаемому способу яйца Trichostrongylus colubriformis, являются только зрелыми до 100% случаев.

Сопоставительный анализ заявляемого технического решения с прототипом, известными способами сбора яиц: копроовоскопическими; секционирования (= разрушения) половых органов самок гельминтов, прижизненного сбора яиц (in vitro) от возбудителя паразитарного зооноза Trichuris (= Trichocephalus) vulpis, показывает, что заявляемый способ отличается от известных тем, что:

матриксы из тонких кишок спонтанно зараженных трихостронгилюсами при исследовании гельминтологическими методами на вскрытии мелких жвачных предварительно обрабатывают в изотоническом растворе (0,9%) хлорида натрия при t = 37°C, затем проводят отбор 250 и более живых, активных, половозрелых 250 и более самок вида: Trichostrongylus colubriformis, отбор проводят в отдельные бактериологические чашки с раствором Ringer по 9 самок в каждую чашку, которые затем экспонируют при t=25°С в течение 3-х часов в условиях термостата, после чего получают чистую культуру только зрелых яиц Trichostrongylus colubriformis, выделенных живыми самками.

Эти отличия позволяют сделать вывод о соответствии заявляемого технического решения критерию «новизна». Признаки, отличающие заявляемое техническое решение от прототипа, не выявлены в других технических решениях, и поэтому они обеспечивают заявляемому техническому решению соответствие критерию «существенные отличия».

технических решениях, и поэтому они обеспечивают заявляемому техническому решению соответствие критерию «существенные отличия».

Примеры конкретного выполнения предлагаемого способа.

Пример1. С мясокомбинатов, убойных пунктов Российской Федерации (Московская область), Республики Молдова, привозили тонкие отделы кишечника от 25 овец, 5-и коз, и кишечники от 3-х косуль (добытых охотниками в Р. Молдова), и из матриксов от этих животных были собраны более 500 живых, половозрелых самок Trichostrongylus colubriformis и получали яйца по двум способам:

1-й (опыт) по предлагаемому способу сбора яиц использовали 250 самок Trichostrongylus colubriformis, которые были собраны из тонкого отдела кишечника (овец, коз, косуль) при предварительной обработке матриксов изотоническим раствором (0,9%) хлорида натрия при t=37°C, и помещали по возможности быстрее, чтобы не потерять большое количество яиц по 9 живых, половозрелых и активных самок Trichostrongylus colubriformis в каждую бактериологическую чашку с раствором Ringer при t=25°C в течение 3-х часов в условиях термостата;

и 2-м (контроль) известным способом прижизненного сбора оплодотворенных яиц (in vitro) от возбудителя паразитарного зооноза Trichuris (= Trichocephalus) vulpis [по В.Е. Пасечнику - 6], который заключается в отборе 250 живых, половозрелых и активных самок Trichostrongylus colubriformis из матриксов мелких жвачных (овец, коз, косуль) и без предварительной обработке матриксов изотоническим раствором (0,9%) хлорида натрия в отдельные пробирки с официнальным изотоническим раствором (0,9%) хлорида натрия и экспозицией пробирок с самками при t=37,5°C в течение 5 часов в условиях термостата.

Через 5 часов были сравнены результаты эффективности этих двух способов сбора яиц от самок гельминтозооноза вида: Trichostrongylus colubriformis. В результате, было выяснено, что:

по известному способу (2-й контроль) то есть без предварительной обработки матриксов изотоническим раствором (0,9%) хлорида натрия в отдельные пробирки с официнальным изотоническим раствором (0,9%) хлорида натрия и экспозицией пробирок с самками вида: Trichostrongylus colubriformis количество яиц выделенных 250 самками в официнальный изотонический раствор (0,9%) хлорида натрия:

при t=37,5°C составило 2950 яиц при экспозиции 5 часов в условиях термостата.

А по предлагаемому нами способу (1-й опыт) отобранные 250 самок из предварительно обработанных матриксов изотоническим раствором (0,9%) хлорида натрия при t=37°C в раствор Ringer и помещенных по 9 живых, половозрелых самок вида: Trichostrongylus colubriformis в бактериологические чашки и экспозицией в термостате при t=25°C в течение 3-х и 5 часов:

при t=25°C составило 9925 яиц в течение 3-х часов и 21550 яиц в течение 5 часов.

Анализируя результаты сравнительных способов известного (2-й контроль) и предлагаемого (1-й опыт), отчетливо видно, что разработанный нами способ сбора яиц при отработанных параметрах отбора из матриксов (предварительная обработка матриксов изотоническим раствором (0,9%) хлорида натрия при t=37°С; сбора живых, половозрелых самок Trichostrongylus colubriformis, не в пробирки, а в бактериологические чашки - что позволяет исследователю сохранить большее количество зрелых яиц и непосредственно в бактериологических чашках проводить культивирование до получения инвазионных личинок Trichostrongylus colubriformis) инвазированных диких (снежных баранов, архаров, косуль и др) или/и домашних (овец, коз) мелких жвачных, соблюдение температурного режима (не при t=37,5°C, а при t=25°C) и применение другого раствора (не официнального изотонического раствора (0,9%) хлорида натрия, а раствора Ringer), и экспозиции (не в течение 5 часов, а в течение 3-х часов) имеет явное преимущество перед известным способом, что и было подтверждено экспериментально.

Количество яиц при использовании предлагаемого нами метода превышает известный метод в 7,3 раза по эффективности при экспозиции в течение 5 часов. Кроме того, полученные предлагаемым способом сбора яйца при экспозиции в течение 3-х часов более жизнеспособны (зрелые до 100%), а полученные известным способом (контроль) яйца Trichostrongylus colubriformis менее жизнеспособны, так как при экспозиции 5 часов и более, начинают выделяться уже незрелые яйца (до 50%) из матки самок гельминтов, что безусловно существенно влияет на возможность проведения качественных экспериментов и противоречит поставленной перед нами цели, а именно получения максимального количества только зрелых яиц от живых, половозрелых самок возбудителя гельминтозооноза: Trichostrongylus colubriformis.

Следовательно, предлагаемый нами способ сбора только зрелых яиц (in vitro) от самок возбудителя гельминтозооноза Trichostrongylus colubriformis, имеет явное преимущество перед известным способом прижизненного сбора оплодотворенных яиц (in vitro) от возбудителя паразитарного зооноза Trichuris (= Trichocephalus) vulpis, особенно если экспериментатору необходимо большое количество зрелых яиц с инвазионными личинками и учитывая что для заражения лабораторных животных требуется иногда большое количество тысячи и десятки тысяч зрелых яиц вида: Trichostrongylus colubriformis, то этот известный способ пригоден для сборов яиц от самок паразитов хищных (собак - Canis familiaris, хорьков - Mustela sp., лисиц - Vulpes vulpes) и практически непригоден для сбора зрелых яиц от самок возбудителя гельминтозооноза Trichostrongylus colubriformis, так как 2950 яиц собранные этим известным способом слишком мало и при экспозиции 5 часов и более сбор содержит большое количество незрелых яиц (до 50%), в отличие от предлагаемого впервые способа сбора только зрелых яиц (in vitro) от самок возбудителя гельминтозооноза Trichostrongylus colubriformis, для проведения качественных экспериментов в лабораторных условиях.

Пример 2. При исследовании на мясокомбинатах, убойных пунктах органов убитых домашних мелких жвачных (коз, овец), в Российской Федерации (Московская область), Республике Молдова, были собраны только живые, половозрелые 500 самок возбудителя гельминтозооноза вида: Trichostrongylus colubriformis. Собранные живые, половозрелые самки вида Tr. colubriformis были использованы для получения сборов яиц по двум способам:

1-й (опыт) по нашему предлагаемому способу сбора только зрелых яиц (in vitro) от самок возбудителя гельминтозооноза: Trichostrongylus colubriformis, заключающийся в отборе только живых, половозрелых 250 самок вида: Trichostrongylus colubriformis из тонких кишок спонтанно зараженных трихостронгилюсами от убитых и исследованных гельминтологическими методами на вскрытии мелких домашних или/и диких жвачных, с предварительной обработкой матриксов в изотоническом растворе (0,9%) хлорида натрия при t=37°C, что увеличивает жизнеспособность самок паразита, и помещают по 9 живых, активных самок в отдельные бактериологические чашки с раствором Ringer и экспозицией их при t=25°C в течение 3-х часов, в условиях термостата (в этих условиях и при таком температурном режиме, живые, половозрелые самки вида: Trichostrongylus colubriformis, становятся активными и более жизнеспособными и произвольно откладывают практически только зрелые яйца в бактериологические чашки с раствором Ringer в период экспозиции их при t=25°С в течение 3-х часов в условиях термостата).

и 2-м (контроль) известным способом сбора яиц путем секционирования (=разрушения) вульвы, вагины, матки 250 самок вида: Trichostrongylus colubriformis.

В последующем по 1500 яиц в опыте и контроле вида: Trichostrongylus colubriformis, (через 3 часа) культивировали в термостате при t=20°-25°С в течение 5-6 дней, и просматривали под микроскопом инвазионные личинки, которые вылупились из яиц и дозрели до инвазионной стадии, чтобы сравнить наш предлагаемый новый способ сбора яиц (1-й - опыт) и известный способ - путем разрушения (секционирования) женских половых органов гельминтов: матки, вагины, вульвы (2-й - контроль).

В результате выяснилось, что в сборе яиц по известному способу (2-й - контроль) яйца начали загнивать, а при нашем предлагаемом способе (1-й опыт) естественном сборе, яйца до 100% случаев были живыми и развивались без наличия секундарной микрофлоры.

Таким образом, результаты культивирования яиц собранные по разработанному нами способу (1-й - опыт) подтвердили данные, полученные при использовании предлагаемого «Способа сбора только зрелых яиц (in vitro) от самок возбудителя гельминтозооноза: Trichostrongylus colubriformis», от диких (снежные бараны, арахары, косули и др.) или/и домашних мелких (овец, коз) жвачных, которые были выявлены нами впервые.

Использование предлагаемого «Способа сбора зрелых яиц in vitro от самок возбудителя гельминтозооноза: Trichostrongylus colubriformis» от мелких жвачных, обеспечивает по сравнению с существующими: копроовоскопии (флотации, седиментации, комбинированные); способа сбора яиц путем разрушения женских половых органов (вульвы, вагины, матки) самок гельминтов; способа прижизненного сбора оплодотворенных яиц (in vitro) от возбудителя паразитарного зооноза Trichuris (= Trichocephalus) vulpis, следующие преимущества:

1) известен вид самки паразита (в данном случае вид: Trichostrongylus colubriformis) и соответственно от какого вида самок (вид: Tr. colubriformis) получены яйца (в отличие от известных методов (= способов) копроовоскопии: флотации, седиментации, комбинированные, при которых вид самки неизвестен, так как в огромной массе яиц различных родов и видов гельминтов (Род: Habertia Railliet et Henry, 1909; род: Bunostomum Railliet, 1902; род: Oesophagostomum Molin, 1861; род: Trichostrongylus Looss, 1905 (виды: Trichostrongylus axei (Cobbold, 1879) Railliet et Henry, 1909; Tr. colubriformis (Giles, 1892), Tr. probolurus (Railliet, 1896) Looss, 1905 et al); род: Ostertagia Ransom, 1907; присутствующих в пробах фекалий от домашних и диких жвачных, сепарировать именно этот вид паразитов: Trichostrongylus colubriformis, практически невозможно) В.Е. Пасечник и др. - [4];

2) сокращает время и снижает трудоемкость исследований за счет исключения необходимости проведения секционирования (= вскрытия = разрушения) женских половых органов: вульвы, вагины, матки Trichostrongylus colubriformis (в отличие от известного способа сбора яиц путем вскрытия женских половых органов гельминтов);

3) исключает загрязненность полученного сбора (= культуры) яиц обрывками частиц тканей женских половых органов от самок Trichostrongylus colubriformis (в отличие от известного способа сбора яиц путем вскрытия женских половых органов самок гельминтов);

4) исключает загнивание и развитие секундарной бактериальной инфекции в культуре полученной предлагаемым нами способа естественного сбора только зрелых яиц от самок возбудителя гельминтозооноза: Trichostrongylus colubriformis (в отличие от известного способа сбора яиц путем вскрытия половых органов самок гельминтов);

5) одним из очень важных преимуществ предлагаемого способа является то, что для поддержания активности и жизнедеятельности самок гельминтозооноза Trichostrongylus colubriformis, при сборе паразитов, матриксы предварительно обрабатывают изотоническим раствором (0,9%) хлорида натрия при t=37°C, что имеет большое значение для сбора 250 и более живых и активных самок Trichostrongylus colubriformis (в отличие от известного способа прижизненного сбора оплодотворенных яиц (in vitro) от возбудителя паразитарного зооноза Trichuris (= Trichocephalus) vulpis, при котором этот этап проведения сборов яиц отсутствует);

6) другое преимущество предлагаемого способа сбора яиц, это то, что живых, половозрелых самок собирают не в пробирки, а в бактериологические чашки и по 9 самок в каждую бактериологическую чашку, что позволяет исследователю культивировать полученные предлагаемым способом зрелые яйца непосредственно в бактериологических чашках и наблюдать под микроскопом развитие личинок до инвазионной стадии, что также повышает эффективность и количество сбора зрелых яиц от живых, активных самок возбудителя гельминтозооноза: Trichostrongylus colubriformis (в отличие от известного способа прижизненного сбора оплодотворенных яиц (in vitro) от возбудителя паразитарного зооноза: Trichuris (= Trichocephalus) vulpis, при котором применяют пробирки для сбора самок паразита из матриксов, а это снижает эффективность сбора, в результате потери большого количества яиц в процессе закладки их для культивирования до инвазионной стадии);

7) еще одним из преимуществ предлагаемого способа является температурный режим в 25°C, так как при t (выше) >30°C в разы уменьшается количество яиц выделяемые живыми, активными и половозрелыми самками Trichostrongylus colubriformis в официнальный изотонический раствор (0,9%) хлорида натрия, (в отличие от известного способа прижизненного сбора оплодотворенных яиц (in vitro) от возбудителя паразитарного зооноза Trichuris (= Trichocephalus) vulpis), что неприемлемо для проведения качественных исследований, так как часто исследователям необходимы для заражения каждого лабораторного (ягненка, козленка и др.) животного тысячи яиц с инвазионными личинками;

8) предлагаемый способ сбора зрелых яиц in vitro от самок возбудителя гельминтозооноза: Trichostrongylus colubriformis, легко осуществим в лабораторных условиях;

9) предлагаемый способ обеспечивает in vitro до 100% естественный сбор только зрелых, чистых яиц гельминта, без обрывков частиц тканей половых органов самок (и именно того вида самок из множества других видов рода Trichostrongylus Looss, 1905: Trichostrongylus axei (Cobbold, 1879) Railliet et Henry, 1909; Tr. capricola Ransom, 1907; Tr. colubriformis (Giles, 1892); Tr. orientalis Jimbo, 1914; Tr. probolurus (Railliet, 1896); Tr. rugatus 1925; Tr. vitrinus Looss, 1905, который был идентифицирован предварительно в лаборатории) возбудителя гельминтозооноза: Trichostrongylus colubriformis для экспериментальных паразитологических исследований в лабораторных условиях.

Источники информации, принятые во внимание при составлении заявки:

1. Котельников Г.А. Гельминтологические исследования животных и окружающей среды. // Справочник. - М.: Колос - 1984. - 208 с.

2. Пасечник В.Е. Перекрестное заражение трихоцефалами приотарных собак и овец в Молдавии. // Бюл. Всесоюзного института гельминтологии. - М. - 1984. - Вып. - 37. - С. 57.

3. Пасечник В.Е. Дисс. … кандидата ветеринарных наук. // М. - ВИГИС. - 2000. - 185 с.

4. Пасечник В.Е., Успенский А.В., Микулец Ю.И., Жданова В.Ю. Методические рекомендации по диагностике, профилактике и мерам борьбы с гельминтозами цирковых животных. // М. - Изд. Россельхозакадемии (РАСХН). - 2008. - С. 124-125.

5. Пасечник В.Е. Паразитозы редких и исчезающих видов парнокопытных в условиях зоопарка и цирка. // Сборник Материалов научной конференции «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями». - М. - 2010. - Вып. 11. - С. 348-351.

6 Пасечник В.Е. Способ прижизненного сбора оплодотворенных яиц (in vitro) от возбудителя паразитарного зооноза Trichuris (=Trichocephalus) vulpis // Бюллетень Федеральной службы по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам Российской Федерации. - М. - 2015. - №21. (Патент на изобретение №2557973).

7. Подъяпольская В.П. Обнаружение Trichostrongylus instabilis в кишечнике ребенка. // Русский журнал тропической медицины. - 1923. - №2. - С. 64-65.

8. Романова Н.П. Гельминтофауна архаров (Ovis polii karelini) Московского зоопарка. // Труды Московского зоопарка. - Т. V. - С. 270-272.

9. Скрябин К.И. Метод полных гельминтологических вскрытий позвоночных, включая человека. // Изд. 1-го Московского государственного университета. - М. - 1928.

10. Скрябин К.И., Шихобалова Н.П., Шульц Р.С. Трихостронгилиды животных и человека. // Изд Академии наук СССР. - М. - 1954. - Т. III - 683 с.

11. Скрябин К.И., Петров A.M. Основы ветеринарной нематодологии. Изд. - «Колос». - М. - 1964. - 527 с.

12. Тощев А.П. Гельминтологический статус домашних животных Восточной Сибири. // Дисс. кандидата ветеринарных наук - М. - ВИГИС. - 1948. - 147 с.

Способ сбора зрелых яиц in vitro от самок возбудителя гельминтозооноза Trichostrongylus colubriformis, заключающийся в том, что матриксы из тонких кишок спонтанно зараженных трихостронгилюсами при исследовании гельминтологическими методами на вскрытии мелких жвачных предварительно обрабатывают в изотоническом растворе (0,9%) хлорида натрия при t = 37°C, затем проводят отбор 250 и более живых, активных, половозрелых 250 и более самок вида Trichostrongylus colubriformis, отбор проводят в отдельные бактериологические чашки с раствором Ringer по 9 самок в каждую чашку, которые затем экспонируют при t = 25°C в течение 3-х часов в условиях термостата, после чего получают чистую культуру зрелых яиц Trichostrongylus colubriformis, выделенных живыми самками.