Пиразоламидное соединение и его применения в медицине

Изобретение относится к соединению формулы [I], где n составляет 1 или 2, или к его соответствующим фармацевтически приемлемым солям. Изобретение также относится к соединениям, представленным формулами [II], [IIh] и [III]. Данные соединения являются ингибитором PDHK (PDHK1 и/или PDHK2). Описывается также фармацевтическое применение этих соединений. 10 н. и 5 з.п. ф-лы, 2 ил., 6 табл., 2 пр.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение предлагает пиразоламидное соединение и его фармацевтическое применение. Более конкретно, в настоящем изобретении предлагаются пиразоламидное соединение или соответствующая фармацевтически приемлемая соль, проявляющие активность в качестве ингибитора пируватдегидрогеназкиназы (далее сокращенно называется PDHK), содержащая ее фармацевтическая композиция, содержащее ее средство для профилактики или лечения таких заболеваний, как диабет (диабет первого типа, диабет второго типа и т.д.), синдром инсулинорезистентности, метаболический синдром, гипергликемия, гиперлактацидемия, диабетические осложнения (диабетическая невропатия, диабетическая ретинопатия, диабетическая нефропатия, катаракта и т.д.), сердечная недостаточность (острая сердечная недостаточность, хроническая сердечная недостаточность), кардиомиопатия, ишемия миокарда, инфаркт миокарда, стенокардия, дислипидемия, атеросклероз, болезнь периферических артерий, перемежающаяся хромота, хроническое обструктивное заболевание легких, ишемия головного мозга, апоплексия головного мозга, митохондриальное заболевание, митохондриальная энцефаломиопатия, рак, легочная гипертензия или болезнь Альцгеймера (Alzheimer) и т.д.

Уровень техники

В тканях для реакций с использованием энергии, таких как биосинтез, активный транспорт, сокращение мышц и т.д., источником энергии является гидролиз аденозинтрифосфата (ATP). ATP производится посредством окисления метаболического топлива, которое производит много энергии, такого как глюкоза и свободные жирные кислоты. В окисляющих тканях, таких как мышцы, ATP производится, главным образом, из ацетил-CoA, который вступает в цикл лимонной кислоты или цикл Кребса (Krebs). Ацетил-CoA производится в результате окисления глюкозы по гликолитическому пути или в результате бета-окисления свободной жирной кислоты. Ферментом, который играет ключевую роль в регулировании производства ацетил-CoA из глюкозы, является пируватдегидрогеназа (далее сокращенно называется PDH). PDH катализирует восстановление никотинамидадениндинуклеотида (NAD) до NADH, одновременно с окислением пировиноградной кислоты до ацетил-CoA и диоксид углерода (см., например, непатентные документы 1, 2).

PDH представляет собой мультиферментный комплекс, который составляют три ферментных компонента (E1, E2 и E3) и несколько субъединиц, расположенных в митохондриальном матриксе. Компоненты E1, E2 и E3 обеспечивают декарбоксилирование пировиноградной кислоты, производство ацетил-CoA и восстановление NAD до NADH соответственно.

К PDH присоединяются ферменты двух классов, которые выполняют регулирующую функцию. Одним из них является PDHK, который представляет собой протеинкиназу, имеющую специфичность по отношению к PDH. Ее роль заключается в том, чтобы инактивировать субъединицу E1α комплекса посредством фосфорилирования. Другим ферментом является PDH-фосфатаза, представляющая собой специфическую протеинфосфатазу, которая активирует PDH посредством дефосфорилирования субъединицы E1α. Пропорция PDH в ее активном (дефосфорилированном) состоянии определяется балансом активности киназы и активности фосфатазы. Активность киназы регулируется относительной концентрацией метаболических субстратов. Например, активность киназы возрастает при увеличении соотношений NADH/NAD, ацетил-CoA/CoA и ATP/аденозиндифосфат (ADP) и ингибируется под действием пировиноградной кислоты (см., например, непатентный документ 3).

В тканях млекопитающих различаются изоферменты PDHK четырех типов. В частности, PDHK2 проявляет экспрессию в тканях широкого круга, включая печень, скелетные мышцы и жировые ткани, которые принимают участие в метаболизме глюкозы. Кроме того, поскольку PDHK2 проявляет сравнительно высокую чувствительность к активации при увеличении соотношений NADH/NAD или ацетил-CoA/CoA и ингибирование пировиноградной кислотой, предполагается участие в краткосрочном регулировании метаболизма глюкозы (см., например, непатентный документ 4).

Кроме того, экспрессию PDHK1 проявляет в больших количествах сердечные мышцы, скелетные мышцы, бета-клетки поджелудочной железы и т.д. Кроме того, поскольку экспрессия PDHK1 индуцируется посредством активации индуцируемого гипоксией фактора (HIF) 1 в ишемическом состоянии, предполагается ее участие в ишемических заболеваниях и раковых заболеваниях (см., например, непатентный документ 5).

При таких заболеваниях, как инсулинозависимый диабет (первого типа), инсулиннезависимый диабет (второго типа) и т.д., окисление липидов активируется одновременным сокращением потребления глюкозы. Это сокращение потребления глюкозы представляет собой один факторов, которыми вызывается гипергликемия. Когда окислительный метаболизм глюкозы уменьшается при диабете первого типа и диабете второго типа, а также при ожирении, активность PDH также уменьшается. Это предполагает участие сокращенной активности PDH в сокращении потребления глюкозы при диабете первого типа и диабете второго типа (см., например, непатентные документы 6, 7).

С другой стороны, в случае диабета первого типа и диабета второго типа усиливается печеночный гликонеогенез, который также представляет собой один из факторов, вызывающих гипергликемию. При уменьшении активности PDH увеличивается концентрация пировиноградной кислоты, что, в свою очередь, повышает доступность молочной кислоты в качестве субстрата для печеночного гликонеогенеза. Предполагается возможное участие сокращения активности PDH в усилении гликонеогенеза при диабете первого типа и диабете второго типа (см., например, непатентные документы 8, 9). Когда PDH активируется посредством ингибирования PDHK, предполагается повышение скорости окисления глюкозы. В результате этого усиливается потребление глюкозы в организме, и подавляется печеночный гликонеогенез, и, в свою очередь, предполагается улучшение состояния гипергликемии при диабете первого типа и диабете второго типа (см., например, непатентные документы 10, 11, 12). Следующий фактор, который способствует диабету, представляет собой нарушение секреции инсулина, которое, как известно, связано со снижением активности PDH в бета-клетках поджелудочной железы и с введением PDHK1, 2 и 4 (см., например, непатентные документы 13, 14). Кроме того, устойчивая гипергликемия вследствие диабета, как известно, вызывает осложнения, такие как диабетическая невропатия, диабетическая ретинопатия, диабетическая нефропатия и т.д. Тиамин и альфа-липоевая кислота способствуют активации PDH в качестве коферментов. Показано, что тиамин и альфа-липоевая кислота, или производное тиамина и производное альфа-липоевой кислоты оказывают перспективное воздействие на лечение диабетических осложнений. Таким образом, предполагается, что активация PDH улучшает состояние при диабетических осложнениях (см., например, непатентные документы 15, 16).

При ишемических состояниях ограниченное снабжение кислородом сокращает окисление глюкозы и жирных кислот и уменьшает количество ATP, производимого посредством окислительного фосфорилирования в тканях. При отсутствии кислорода в достаточном количестве уровень ATP поддерживается за счет ускоренного анаэробного гликолиза. В результате этого повышается концентрация молочная кислота, и снижается внутриклеточный уровень pH. Даже несмотря на усилия организма по поддержанию гомеостаза иона посредством расхода энергии, аномально низкий уровень ATP и нарушенная клеточная осмолярность приводят к гибели клеток. Кроме того, активирующая аденозинмонофосфат киназа, активируемая в течение ишемии, фосфорилирует и, таким образом, инактивирует ацетил-CoA-карбоксилазу. Суммарные уровни малонил-CoA в ткани снижаются, таким образом, повышает свою активность карнитин-пальмитоилтрансфераза-I, что благоприятствует окислению жирных кислот по сравнению с глюкозой посредством обеспечения переноса ацил-CoA в митохондрии. Окисление глюкозы способно производить больше ATP в расчете на молекулу кислорода, чем окисление жирных кислот. Таким образом, при ишемических состояниях, когда энергетический метаболизм становится определяемым окислением глюкозы посредством активации PDH, предполагается усиление способности поддержания уровня ATP (см., например, непатентный документ 17).

Кроме того, поскольку активация PDH вызывает окисление пировиноградной кислоты, производимой в результате гликолиза, а также сокращение производства молочной кислоты, считается, что в ишемических тканях снижается чистое содержание протонов. Соответственно, ожидается, что активация PDH посредством ингибирования PDHK будет оказывать защитное действие при ишемических заболеваниях, такие как ишемия сердечной мышцы (см., например, непатентные документы 18, 19).

Считается, что лекарственное средство, которое активирует PDH посредством ингибирования PDHK, снижает производство лактата, поскольку оно активирует пируватный метаболизм. Следовательно, ожидается, что такое лекарственное средство должно быть пригодным для применения в лечении гиперлактацидемии, такой как митохондриальное заболевание, митохондриальная энцефаломиопатия и сепсис (см., например, непатентный документ 20).

В раковых клетках экспрессия PDHK1 или 2 увеличивается. Кроме того, в раковых клетках снижается производство ATP посредством окислительного фосфорилирования в митохондриях, и увеличивается производство ATP посредством анаэробного гликолиза в цитоплазме. Предполагается, что активация PDH посредством ингибирования PDHK способствует окислительному фосфорилированию в митохондриях и увеличивает производство активного кислорода, который будет индуцировать апоптоз раковых клеток. Таким образом, активация PDH посредством ингибирования PDHK является пригодным для применения в лечении раковых заболеваний (см., например, непатентный документ 21).

Легочная гипертензия характеризуется высоким артериальным давлением, вызываемым частичным сужением легочной артерии вследствие ускоренной клеточной пролиферации внутри нее. Таким образом, при легочной гипертензии предполагается, что активация PDH в клетках легочной артерии должна ускорять окислительное фосфорилирование в митохондриях, увеличивать производство активного кислорода и индуцировать апоптоз клеток легочной артерии. Таким образом, активация PDH посредством ингибирования PDHK считается пригодной для применения в лечении легочной гипертензии (см., например, непатентный документ 22).

При болезни Альцгеймера снижается производство энергия и метаболизм глюкозы в головном мозге, а также уменьшается активность PDH. Когда уменьшается активность PDH, снижается производство ацетил-CoA. Ацетил-CoA используется для производства ATP в системе переноса электронов посредством цикла лимонной кислоты. Кроме того, ацетил-CoA представляет собой исходный материал для синтеза ацетилхолина, который является одним из нейромедиаторов. Таким образом, считается, что снижение активности PDH головного мозга при болезни Альцгеймера вызывает гибель нервных клеток вследствие уменьшения производства ATP. Кроме того, считается, что ингибируется синтез ацетилхолина, который является медиатором для холинергического нерва, что индуцирует расстройство памяти и т.д. Предполагается, что активация PDH в головном мозге повышает производство энергии и синтез ацетилхолина при болезни Альцгеймера. Таким образом, активация PDH посредством ингибирования PDHK считается пригодной для применения в лечении болезни Альцгеймера (см., например, непатентные документы 23, 24).

Было показано, что дихлоруксусная кислота, которая представляет собой лекарственное средство и своим действием активирует PDH, производит перспективные эффекты в лечении таких заболеваний, как диабет, ишемия миокарда, инфаркт миокарда, стенокардия, сердечная недостаточность, гиперлактацидемия, ишемия головного мозга, апоплексия головного мозга, болезнь периферических артерий, хроническое обструктивное заболевание легких, раковое заболевание и легочная гипертензия (см., например, непатентные документы 10, 18, 20, 22, 25, 26, 27).

На основании вышеупомянутых обнаруженных фактов считается, что ингибитор PDHK является пригодным для применения в профилактике или лечении заболеваний, связанных с расстройством усвоения глюкозы, например, таких как диабет (диабет первого типа, диабет второго типа и т.д.), синдром инсулинорезистентности, метаболический синдром, гипергликемия, гиперлактацидемия, диабетические осложнения (диабетическая невропатия, диабетическая ретинопатия, диабетическая нефропатия, катаракта и т.д.). Кроме того, считается, что ингибитор PDHK является пригодным для применения в профилактике или лечении заболеваний, вызываемых ограниченным поступлением источников энергии в ткани, например, таких как сердечная недостаточность (острая сердечная недостаточность, хроническая сердечная недостаточность), кардиомиопатия, ишемия миокарда, инфаркт миокарда, стенокардия, дислипидемия, атеросклероз, болезнь периферических артерий, перемежающаяся хромота, хроническое обструктивное заболевание легких, ишемия головного мозга и апоплексия головного мозга.

Таким образом, считается, что ингибитор PDHK является пригодным для применения в лечении или профилактике таких заболеваний, как диабет (диабет первого типа, диабет второго типа и т.д.), синдром инсулинорезистентности, метаболический синдром, гипергликемия, гиперлактацидемия, диабетические осложнения (диабетическая невропатия, диабетическая ретинопатия, диабетическая нефропатия, катаракта и т.д.), сердечная недостаточность (острая сердечная недостаточность, хроническая сердечная недостаточность), кардиомиопатия, ишемия миокарда, инфаркт миокарда, стенокардия, дислипидемия, атеросклероз, болезнь периферических артерий, перемежающаяся хромота, хроническое обструктивное заболевание легких, ишемия головного мозга, апоплексия головного мозга, митохондриальное заболевание, митохондриальная энцефаломиопатия, рак, легочная гипертензия или болезнь Альцгеймера.

Список литературы

Непатентные документы

Непатентный документ 1: L. J. Reed, M. L. Hackert, «Соотношения структуры и функций дигидролипоамидацилтрансфераз», J. Biol. Chem., 05 июня 1990 г., т. 265. № 16, с. 8971-4.

Непатентный документ 2: M. S. Patel, T. E. Roche, «Молекулярная биология и биохимия комплексов пируватдегидрогеназы, FASEB J., 04 ноября 1990 г., т. 4, № 14, с. 3224-33.

Непатентный документ 3: M. C. Sugden, M. J. Holness, «Последние достижения в исследовании механизмов, регулирующих окисление глюкозы на уровне комплекса пируватдегидрогеназы под действием PDK», Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab., май 2003 г., т. 284, № 5, с. E855-62.

Непатентный документ 4: M. M. Bowker-Kinley, W. I. Davis, P. Wu, R. A. Harris, K. M. Popov, «Доказательство существования специфического для тканей регулирования комплекса пируватдегидрогеназы млекопитающих», Biochem. J., 01 января 1998 г., т. 329, часть 1, с. 191-6.

Непатентный документ 5: J. W. Kim, I. Tchernyshyov, G. L. Semenza, C. V. Dang, «Активируемая HIF-1 экспрессия пируватдегидрогеназкиназы: метаболическое переключение, требуемое для клеточной адаптации к гипоксии», Cell Metab., март 2006 г., т. 3, № 3, с. 177-85.

Непатентный документ 6: K. Morino, K. F. Petersen, S. Dufour, D. Befroy, J. Frattini, N. Shatzkes и др., «Снижение плотности митохондрий и усиление фосфорилирования IRS-1 серина в мышцах инсулинореистентного потомства родителей, страдающих диабетом второго типа», J. Clin. Invest., декабрь 2005 г., т. 115, № 12, с. 3587-93.

Непатентный документ 7: I. D. Caterson, S. J. Fuller, P. J. Randle, «Влияние 2-тетрадецилглицидной кислоты как ингибитора окисление жирных кислот на активность комплекса пируватдегидрогеназы у голодающих и страдающих аллоксановым диабетом крыс», Biochem. J., 15 октября 1982 г., т. 208, № 1, с. 53-60.

Непатентный документ 8: G. Boden, X. Chen, T. P. Stein, «Гликонеогенез у умеренно и серьезно гипергликемических пациентов, страдающих сахарным диабетом второго типа», Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab., январь 2001 г., т. 280, № 1, с. E23-30.

Непатентный документ 9: R. E. Shangraw, D. M. Fisher, «Фармакокинетика и фармакодинамика дихлорацетата у пациентов, страдающих циррозом», Clin. Pharmacol. Ther., 20 октября 1999 г., т. 66, № 4, с. 380-90.

Непатентный документ 10: P. W. Stacpoole, G. W. Moore, D. M. Kornhauser, «Метаболические эффекты дихлорацетата у пациентов, страдающих сахарным диабетом и гиперлипопротеинемией», N. Engl. J. Med., 09 марта 1978 г., т. 298, № 10, с. 526-30.

Непатентный документ 11: R. M. Mayers, B. Leighton, E. Kilgour, «Ингибиторы PDH-киназы: новая терапия диабета второго типа?», Biochem. Soc. Trans., апрель 2005 г., т. 33 (часть 2), с. 367-70.

Непатентный документ 12: N. H. Jeoung, Y. Rahimi, P. Wu, W. N. Lee, W. N. Harris, «Голодание индуцирует кетоацидоз и гипотермию у мышей с двойным нокаутом PDHK2/PDHK4», Biochem. J., 01 мая 2012 г., т. 443, № 3, с. 829-39.

Непатентный документ 13: Y. P. Zhou, P. O. Berggren, V. Grill, «Индуцированное жирной кислотой уменьшение активности пируватдегидрогеназы как важный фактор дисфункции бета-клеток у страдающих диабетом и ожирением мышей db/db», Diabetes, май 1996 г., т. 45, № 5, с. 580-6.

Непатентный документ 14: J. Xu, J. Han, P. N. Epstein, Y. Q. Liu, «Регулирование PDK мРНК высоким содержанием жирной кислоты и глюкозы в панреаптических островках», Biochem. Biophys. Res. Commun., 09 июня 2006 г., т. 344, № 3, с. 827-33.

Непатентный документ 15: «Бенфотиамин. Монография», Altern. Med. Rev. сентябрь 2006 г., т. 11, № 3, с. 238-42.

Непатентный документ 16: N. Vallianou, A. Evangelopoulos, P. Koutalas, «Альфа-липоевая кислота и диабетическая невропатия», Rev. Diabet. Stud., зима 2009 г., т, 6, № 4, с. 230-6.

Непатентный документ 17: J. R. Ussher, G. D. Lopaschuk, «Ось малонил-CoA как потенциальная цель для лечения ишемической болезни сердца», Cardiovasc. Res., 15 июля 2008 г., т. 79, № 2, с. 259-68.

Непатентный документ 18: T. J. Wargovich, R. G. MacDonald, J. A. Hill, R. L. Feldman, P. W. Stacpoole, C. J. Pepine, «Миокардные метаболические и гемодинамические эффекты дихлорацетата при заболевании коронарных артерий», Am. J. Cardiol., 01 января 1988 г., т. 61, № 1, с. 65-70.

Непатентный документ 19: M. Taniguchi, C. Wilson, C. A. Hunter, D. J. Pehowich, A. S. Clanachan, G. D. Lopaschuk, «Дихлорацетат повышает эффективность сердца после ишемии независимо от изменений утечки протонов в митохондриях», Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol., апрель 2001 г., т. 280, № 4, с H1762-9.

Непатентный документ 20: P. W. Stacpoole, N. V. Nagaraja, A. D. Hutson, «Эффективность дихлорацетата как снижающего уровень лактата лекарственного средства», J. Clin. Pharmacol., июль 2003 г., т. 43, № 7, с. 683-91.

Непатентный документ 21: S. Bonnet, S. L. Archer, J. Allalunis-Turner, A. Haromy, C. Beaulieu, R. Thompson и др., «Ось канала митохондрия-K⁺ подавляется при раке, и ее нормализация ускоряет апоптоз и ингибирует рост рака», Cancer Cell., январь 2007 г., т. 11, № 1, с. 37-51.

Непатентный документ 22: M. S. McMurtry, S. Bonnet, X. Wu, J. R. Dyck, A. Haromy, K. Hashimoto и др., «Дихлорацетат предотвращает и лечит легочную гипертензию посредством индукции апоптоза клеток гладких мышц легочной артерии», Circ. Res., 145 октября 2004 г., т. 95, № 8, с. 830-40.

Непатентный документ 23: U. Saxena, «Нарушение биоэнергетики при болезни Альцгеймера: цели для новых видов терапии», Int. J. Physiol. Pathophysiol. Pharmacol., 2011 г., т. 3, № 2, с. 133-9.

Непатентный документ 24: P. W. Stacpoole, «Комплекс пируватдегидрогеназы как цель терапии связанных с возрастом заболеваний», Aging Cell., июнь 2012 г., т. 11, № 3, с. 371-7.

Непатентный документ 25: P. J. Marangos, C. C. Turkel, Z. E. Dziewanowska, A. W. Fox, «Дихлорацетат и лечение ишемии головного мозга», Expert Opin. Investig. Drugs, апрель 1999 г., т. 8, № 4, с. 373-82.

Непатентный документ 26: L. D. Calvert, R. Shelley, S. J. Singh, P. L. Greenhaff, J. Bankart, M. D. Morgan и др., «Дихлорацетат повышает эффективность и снижает уровень лактата крови в течение цикла упражнений с максимальной нагрузкой при хроническом обструктивном заболевании легких», Am. J. Respir. Crit. Care Med., 14 мая 2008 г., т. 177, № 10, с. 1090-4.

Непатентный документ 27: D. F. Flavin, «Купирование неходжкинской лимфомы дихлорацетатом», J. Oncol. Hindawi Publishing Corporation Journal of Oncology, т. 2010, статья № 414726, 4 страницы, doi:10,1155/2010/414726.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение определяется следующим образом:

1) соединение, представленное формулой [I]:

в которой n составляет 1 или 2,

или соответствующая фармацевтически приемлемая соль;

2) соединение, представленное формулой [II] или [IIh]:

3) соединение по предшествующему пункту 2, которое представлено формулой [II]:

4) соединение по предшествующему пункту 2, которое представлено формулой [IIh]:

5) соединение, представленное формулой [III]:

6) фармацевтическая композиция, содержащая соединение по любому из предшествующих пунктов 1-5, или соответствующая фармацевтически приемлемая соль, и фармацевтически приемлемый носитель;

7) ингибитор PDHK, содержащий соединение по любому из предшествующих пунктов 1-5 или соответствующую фармацевтически приемлемую соль;

8) ингибитор PDHK1, содержащий соединение по любому из предшествующих пунктов 1-5 или соответствующую фармацевтически приемлемую соль;

9) ингибитор PDHK2, содержащий соединение по любому из предшествующих пунктов 1-5 или соответствующую фармацевтически приемлемую соль;

10) гипогликемическое средство, содержащее соединение по любому из предшествующих пунктов 1-5 или соответствующая фармацевтически приемлемую соль;

11) снижающее уровень молочной кислоты средство, содержащее соединение по любому из предшествующих пунктов 1-5 или соответствующую фармацевтически приемлемую соль;

12) средство для профилактики или лечения таких заболеваний, как диабет, синдром инсулинорезистентности, метаболический синдром, гипергликемия, гиперлактацидемия, диабетические осложнения, сердечная недостаточность, кардиомиопатия, ишемия миокарда, инфаркт миокарда, стенокардия, дислипидемия, атеросклероз, болезнь периферических артерий, перемежающаяся хромота, хроническое обструктивное заболевание легких, ишемия головного мозга, апоплексия головного мозга, митохондриальное заболевание, митохондриальная энцефаломиопатия, рак или легочная гипертензия, которое содержит соединение по любому из предшествующих пунктов 1-5 или соответствующую фармацевтически приемлемую соль;

12’) средство по любому из предшествующих пунктов для профилактики или лечения таких заболеваний, как диабет, синдром инсулинорезистентности, метаболический синдром, гипергликемия, гиперлактацидемия, диабетические осложнения, сердечная недостаточность, кардиомиопатия, ишемия миокарда, инфаркт миокарда, стенокардия, дислипидемия, атеросклероз, болезнь периферических артерий, перемежающаяся хромота, хроническое обструктивное заболевание легких, ишемия головного мозга, апоплексия головного мозга, митохондриальное заболевание, митохондриальная энцефаломиопатия, рак, легочная гипертензия или болезнь Альцгеймера, которое содержит соединение по любому из предшествующих пунктов 1-5 или соответствующую фармацевтически приемлемую соль;

13) профилактическое или лекарственное средство по предшествующему пункту 12, в котором диабет представляет собой диабет первого типа или диабет второго типа;

14) профилактическое или лекарственное средство по предшествующему пункту 12, в котором диабетические осложнения выбираются из группы, которую составляют диабетическая невропатия, диабетическая ретинопатия, диабетическая нефропатия и катаракта;

15) профилактическое или лекарственное средство по предшествующему пункту 12, в котором сердечная недостаточность представляет собой острую сердечную недостаточность или хроническую сердечную недостаточность;

16) фармацевтическая композиция, содержащая:

(a) соединение по любому из предшествующих пунктов 1-5 или соответствующую фармацевтически приемлемую соль; и

(b) по меньшей мере, еще одно лекарственное средство, эффективное для профилактики или лечения заболеваний, выбранных из группы, которую составляют диабет (диабет первого типа, диабет второго типа), синдром инсулинорезистентности, метаболический синдром, гипергликемия, гиперлактацидемия, диабетические осложнения (диабетическая невропатия, диабетическая ретинопатия, диабетическая нефропатия, катаракта), сердечная недостаточность (острая сердечная недостаточность, хроническая сердечная недостаточность), кардиомиопатия, ишемия миокарда, инфаркт миокарда, стенокардия, дислипидемия, атеросклероз, болезнь периферических артерий, перемежающаяся хромота, хронические обструктивные заболевания легких, ишемия головного мозга, апоплексия головного мозга, митохондриальное заболевание, митохондриальная энцефаломиопатия, рак и легочная гипертензия;

16’) фармацевтическая композиция, содержащая:

(a) соединение по любому из предшествующих пунктов 1-5, или соответствующая фармацевтически приемлемая соль; и

(b) по меньшей мере, еще одно лекарственное средство, эффективное для профилактики или лечения заболеваний, выбранных из группы, которую составляют диабет (диабет первого типа, диабет второго типа), синдром инсулинорезистентности, метаболический синдром, гипергликемия, гиперлактацидемия, диабетические осложнения (диабетическая невропатия, диабетическая ретинопатия, диабетическая нефропатия, катаракта), сердечная недостаточность (острая сердечная недостаточность, хроническая сердечная недостаточность), кардиомиопатия, ишемия миокарда, инфаркт миокарда, стенокардия, дислипидемия, атеросклероз, болезнь периферических артерий, перемежающаяся хромота, хронические обструктивные заболевания легких, ишемия головного мозга, апоплексия головного мозга, митохондриальное заболевание, митохондриальная энцефаломиопатия, рак, легочная гипертензия и болезнь Альцгеймера;

17) комбинированное лекарственное средство, содержащее

(a) соединение по любому из предшествующих пунктов 1-5 или соответствующую фармацевтически приемлемую соль; и

(b) по меньшей мере, еще одно лекарственное средство, эффективное для профилактики или лечения заболеваний, выбранных из группы, которую составляют диабет (диабет первого типа, диабет второго типа), синдром инсулинорезистентности, метаболический синдром, гипергликемия, гиперлактацидемия, диабетические осложнения (диабетическая невропатия, диабетическая ретинопатия, диабетическая нефропатия, катаракта), сердечная недостаточность (острая сердечная недостаточность, хроническая сердечная недостаточность), кардиомиопатия, ишемия миокарда, инфаркт миокарда, стенокардия, дислипидемия, атеросклероз, болезнь периферических артерий, перемежающаяся хромота, хроническое обструктивное заболевание легких, ишемия головного мозга, апоплексия головного мозга, митохондриальное заболевание, митохондриальная энцефаломиопатия, рак и легочная гипертензия, которое принимается одновременно, отдельно или непрерывно;

17’) комбинированное лекарственное средство, содержащее:

(a) соединение по любому из предшествующих пунктов 1-5 или соответствующую фармацевтически приемлемую соль и

(b) по меньшей мере, еще одно лекарственное средство, эффективное для профилактики или лечения заболеваний, выбранных из группы, которую составляют диабет (диабет первого типа, диабет второго типа), синдром инсулинорезистентности, метаболический синдром, гипергликемия, гиперлактацидемия, диабетические осложнения (диабетическая невропатия, диабетическая ретинопатия, диабетическая нефропатия, катаракта), сердечная недостаточность (острая сердечная недостаточность, хроническая сердечная недостаточность), кардиомиопатия, ишемия миокарда, инфаркт миокарда, стенокардия, дислипидемия, атеросклероз, болезнь периферических артерий, перемежающаяся хромота, хроническое обструктивное заболевание легких, ишемия головного мозга, апоплексия головного мозга, митохондриальное заболевание, митохондриальная энцефаломиопатия, рак, легочная гипертензия и болезнь Альцгеймера, которое принимается одновременно, отдельно или непрерывно;

18) способ ингибирования PDHK у млекопитающих, включающий введение фармацевтически эффективного количества соединения по любому из предшествующих пунктов 1-5 или соответствующей фармацевтически приемлемой соли вышеупомянутому млекопитающему;

19) способ ингибирования PDHK1 у млекопитающих, включающий введение фармацевтически эффективного количества соединения по любому из предшествующих пунктов 1-5 или соответствующей фармацевтически приемлемой соли вышеупомянутому млекопитающему;

20) способ ингибирования PDHK2 у млекопитающих, включающий введение фармацевтически эффективного количества соединения по любому из предшествующих пунктов 1-5 или соответствующей фармацевтически приемлемой соли вышеупомянутому млекопитающему;

21) способ профилактики или лечения таких заболеваний, как диабет (диабет первого типа, диабет второго типа), синдром инсулинорезистентности, метаболический синдром, гипергликемия, гиперлактацидемия, диабетические осложнения (диабетическая невропатия, диабетическая ретинопатия, диабетическая нефропатия, катаракта), сердечная недостаточность (острая сердечная недостаточность, хроническая сердечная недостаточность), кардиомиопатия, ишемия миокарда, инфаркт миокарда, стенокардия, дислипидемия, атеросклероз, болезнь периферических артерий, перемежающаяся хромота, хроническое обструктивное заболевание легких, ишемия головного мозга, апоплексия головного мозга, митохондриальное заболевание, митохондриальная энцефаломиопатия, рак или легочная гипертензия у млекопитающих, включающий введение фармацевтически эффективного количества соединения по любому из предшествующих пунктов 1-5 или соответствующей фармацевтически приемлемой соли вышеупомянутому млекопитающему;

21’) способ профилактики или лечения таких заболеваний, как диабет (диабет первого типа, диабет второго типа), синдром инсулинорезистентности, метаболический синдром, гипергликемия, гиперлактацидемия, диабетические осложнения (диабетическая невропатия, диабетическая ретинопатия, диабетическая нефропатия, катаракта), сердечная недостаточность (острая сердечная недостаточность, хроническая сердечная недостаточность), кардиомиопатия, ишемия миокарда, инфаркт миокарда, стенокардия, дислипидемия, атеросклероз, болезнь периферических артерий, перемежающаяся хромота, хроническое обструктивное заболевание легких, ишемия головного мозга, апоплексия головного мозга, митохондриальное заболевание, митохондриальная энцефаломиопатия, рак, легочная гипертензия или болезнь Альцгеймера у млекопитающих, включающий введение фармацевтически эффективного количества соединения по любому из предшествующих пунктов 1-5 или соответствующей фармацевтически приемлемой соли вышеупомянутому млекопитающему;

22) способ снижения уровня глюкозы в крови у млекопитающих, включающий введение фармацевтически эффективного количества соединения по любому из предшествующих пунктов 1-5 или соответствующей фармацевтически приемлемой соли вышеупомянутому млекопитающему;

23) способ снижения уровня лактата у млекопитающих, включающий введение фармацевтически эффективного количества соединения по любому из предшествующих пунктов 1-5 или соответствующей фармацевтически приемлемой соли вышеупомянутому млекопитающему;

24) применение соединения по любому из предшествующих пунктов 1-5 или соответствующей фармацевтически приемлемой соли для производства ингибитора PDHK;

25) применение соединения по любому из предшествующих пунктов 1-5 или соответствующей фармацевтически приемлемой соли для производства ингибитора PDHK1;

26) применение соединения по любому из предшествующих пунктов 1-5 или соответствующей фармацевтически приемлемой соли для производства ингибитора PDHK2;

27) применение соединения по любому из предшествующих пунктов 1-5 или соответствующей фармацевтически приемлемой соли для производства средства, снижающего уровень глюкозы в крови;

28) применение соединения по любому из предшествующих пунктов 1-5 или соответствующей фармацевтически приемлемой соли для производства средства, снижающего уровень лактата;

29) применение соединения по любому из предшествующих пунктов 1-5 или соответствующей фармацевтически приемлемой соли для производства средства для профилактики или лечения таких заболеваний, как диабет (диабет первого типа, диабет второго типа), синдром инсулинорезистентности, метаболический синдром, гипергликемия, гиперлактацидемия, диабетические осложнения (диабетическая невропатия, диабетическая ретинопатия, диабетическая нефропатия, катаракта), сердечная недостаточность (острая сердечная недостаточность, хроническая сердечная недостаточность), кардиомиопатия, ишемия миокарда, инфаркт миокарда, стенокардия, дислипидемия, атеросклероз, болезнь периферических артерий, перемежающаяся хромота, хроническое обструктивное заболевание легких, ишемия головного мозга, апоплексия головного мозга, митохондриальное заболевание, митохондриальная энцефаломиопатия, рак или легочная гипертензия;

29’) применение соединения по любому из предшествующих пунктов 1-5 или соответствующей фармацевтически приемлемой соли для производства средства для профилактики или лечения таких заболеваний, как диабет (диабет первого типа, диабет второго типа), синдром инсулинорезистентности, метаболический синдром, гипергликемия, гиперлактацидемия, диабетические осложнения (диабетическая невропатия, диабетическая ретинопатия, диабетическая нефропатия, катаракта), сердечная недостаточность (острая сердечная недостаточность, хроническая сердечная недостаточность), кардиомиопатия, ишемия миокарда, инфаркт миокарда, стенокардия, дислипидемия, атеросклероз, болезнь периферических артерий, перемежающаяся хромота, хроническое обструктивное заболевание легких, ишемия головного мозга, апоплексия головного мозга, митохондриальное заболевание, митохондриальная энцефаломиопатия, рак, легочная гипертензия или болезнь Альцгеймера;

30) использование по любому из предшествующих пунктов 24-29 в сочетании, по меньшей мере, с еще одним средством, эффективным для профилактики или лечения заболевания, выбранного из группы, которую составляют диабет (диабет первого типа, диабет второго типа), синдром инсулинорезистентности, метаболический синдром, гипергликемия, гиперлактацидемия, диабетические осложнения (диабетическая невропатия, диабетическая ретинопатия, диабетическая нефропатия, катаракта), сердечная недостаточность (острая сердечная недостаточность, хроническая сердечная недостаточность), кардиомиопатия, ишемия миокарда, инфаркт миокарда, стенокардия, дислипидемия, атеросклероз, болезнь периферических артерий, перемежающаяся хромота, хроническое обструктивное заболевание легких, ишемия головного мозга, апоплексия головного мозга, митохондриальное заболевание, митохондриальная энцефаломиопатия, рак и легочная гипертензия; и

30’) использование по любому из предшествующих пунктов 24-29, в сочетании, по меньшей мере, с еще одним средством, эффективным для профилактики или лечения заболевания, выбранного из группы, которую составляют диабет (диабет первого типа, диабет второго типа), синдром инсулинорезистентности, метаболический синдром, гипергликемия, гиперлактацидемия, диабетические осложнения (диабетическая невропатия, диабетическая ретинопатия, диабетическая нефропатия, катаракта), сердечная недостаточность (острая сердечная недостаточность, хроническая сердечная недостаточность), кардиомиопатия, ишемия миокарда, инфаркт миокарда, стенокардия, дислипидемия, атеросклероз, болезнь периферических артерий, перемежающаяся хромота, хроническое обструктивное заболевание легких, ишемия головного мозга, апоплексия головного мозга, митохондриальное заболевание, митохондриальная энцефаломиопатия, рак, легочная гипертензия и болезнь Альцгеймера, и т.д.

Эффект изобретения

Соединение согласно настоящему изобретению или соответствующая фармацевтически приемлемая соль ингибирует активность PDHK и является пригодным для применения в качестве средства для лечения или профилактики таких заболеваний, диабет (диабет первого типа, диабет второго типа), синдром инсулинорезистентности, метаболический синдром, гипергликемия, гиперлактацидемия, диабетические осложнения (диабетическая невропатия, диабетическая ретинопатия, диабетическая нефропатия, катаракта), сердечная недостаточность (острая сердечная недостаточность, хроническая сердечная недостаточность), кардиомиопатия, ишемия миокарда, инфаркт миокарда, стенокардия, дислипидемия, атеросклероз, болезнь периферических артерий, перемежающаяся хромота, хроническое обструктивное заболевание легких, ишемия головного мозга, апоплексия головного мозга, митохондриальное заболевание, митохондриальная энцефаломиопатия, рак, легочная гипертензия или болезнь Альцгеймера, и т.д.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 представляет воздействие исследуемых соединений на активность PDH печени (процентное соотношение активности активного вещества PDH печени и суммарной активности PDH печени) у неголодающих крыс линии SD(IGS) (среднее значение ± среднеквадратическое отклонение (n=3)).

Фиг. 2 представляет воздействие исследуемых соединений на активность PDH жировой ткани (процентное соотношение активности активного вещества PDH жировой ткани и суммарной активности PDH жировой ткани) активность PDH) у неголодающих крыс линии SD(IGS) (среднее значение ± среднеквадратическое отклонение (n=3)).

Описание вариантов осуществления

Настоящее изобретение подробно разъясняется в следующем описании.

Соединение согласно настоящему изобретению является соединением, которое представляет формула [I]:

в которой n составляет 1 или 2,

(далее оно также упоминается как соединение (1)), или представляет собой соответствующую фармацевтически приемлемую соль.

Соединение согласно настоящему изобретению является соединением, которое представляет формула [II]:

(2-{4-[(9R)-9-гидрокси-2-(3-гидрокси-3-метилбутилокси)-9-(трифторметил)-9H-флуорен-4-ил]-1H-пиразол-1-ил}-2-метилпропанамид) (далее оно также упоминается как соединение (2)).

Соединение согласно настоящему изобретению является соединением, которое представляет формула [IIh]:

(моногидрат 2-{4-[(9R)-9-гидрокси-2-(3-гидрокси-3-метилбутилокси)-9-(трифторметил)-9H-флуорен-4-ил]-1H-пиразол-1-ил}-2-метилпропанамида) (далее оно также упоминается как соединение (2h)).

Соединение согласно настоящему изобретению является соединением, которое представляет формула [III]:

(2-{4-[(9R)-9-гидрокси-2-(4-гидрокси-4-метилпентилокси)-9-(трифторметил)-9H-флуорен-4-ил]-1H-пиразол-1-ил}-2-метилпропанамид) (далее оно также упоминается как соединение (3)).

Фармацевтически приемлемая соль соединения согласно настоящему изобретению может представлять собой любую соль, при том условии, что она образует нетоксичную соль с соединением согласно настоящему изобретению. Соответствующие примеры включают соли неорганических кислот, соли органических кислот, соли аминокислот и т.д.

Примеры солей неорганических кислот включают соли, которые образуют хлористоводородная кислота, азотная кислота, серная кислота, фосфорная кислота, бромистоводородная кислота и т.д.

Примеры солей органических кислот включают соли, которые образуют щавелевая кислота, малеиновая кислота, лимонная кислота, фумаровая кислота, молочная кислота, яблочная кислота, янтарная кислота, винная кислота, уксусная кислота, трифторуксусная кислота, глюконовая кислота, аскорбиновая кислота, метансульфоновая кислота, бензолсульфоновая кислота, п-толуолсульфоновая кислота и т.д.

Примеры солей аминокислот включают соли, которые образуют лизин, аргинин, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота и т.д.

Фармацевтически приемлемая соль соединения согласно настоящему изобретению предпочтительно представляет собой соль неорганической кислоты.

Кроме того, соединение согласно настоящему изобретению или соответствующая фармацевтически приемлемая соль может содержать изотопную метку (например, ³H, ¹⁴C, ³⁵S и т.д.).

В качестве соединения согласно настоящему изобретению или соответствующей фармацевтически приемлемой соли предпочтительным является соединение (1) или соответствующая фармацевтически приемлемая соль, причем в каждом случае обеспечивается значительная степень очистки. Более предпочтительным является соединение согласно настоящему изобретению или соответствующая фармацевтически приемлемая соль, причем в каждом случае степень очистки составляет не менее чем 80%.

Соединение формулы [I] или соответствующая фармацевтически приемлемая соль может существовать в форме сольвата. Термином «сольват» обозначается соединение формула [I] или соответствующая фармацевтически приемлемая соль, с которыми связываются молекулы растворителя, а также данным термином обозначаются гидраты. Такие сольваты предпочтительно представляют собой фармацевтически приемлемые сольваты. Такие сольваты включают, например, гидрат, сольват этанола, сольват диметилсульфоксида и т.д., которые образует соединение формулы [I] или соответствующая фармацевтически приемлемая соль.

Конкретные примеры включают полугидрат, моногидрат, дигидрат или моно(этанол)сольват соединения формулы [I] или моногидрат соединения формулы [I], 2/3(этанол)сольват соответствующего дигидрохлорида и т.д. Такие сольваты можно изготавливать, осуществляя традиционные способы.

Примерные «фармацевтические композиции» представляют собой пероральные препараты, такие как таблетка, капсула, гранула, порошок, пастилка, сироп, эмульсия, суспензия и т.д., а также парентеральные средства, такие как препараты для наружного применения, суппозитории, препараты для инъекций, глазные капли, назальные препараты, легочные препараты и т.д.

Фармацевтическую композицию согласно настоящему изобретению изготавливают, осуществляя способ, общеизвестный в области техники фармацевтических препаратов, и смешивая соединение согласно настоящему изобретению или соответствующую фармацевтически приемлемую соль с подходящим количеством фармацевтически приемлемого носителя, по меньшей мере, одного типа и т.д., насколько это целесообразно. Хотя содержание соединения согласно настоящему изобретению или соответствующей фармацевтически приемлемой соли в фармацевтической композиции изменяется в зависимости от дозированной формы, дозы и т.д., оно составляет, например, от 0,1 до 100 мас.% по отношению к полной массе композиции.

Примерный «фармацевтически приемлемый носитель» представляют собой разнообразные органические или неорганические вещества-носители, которые традиционно используются в качестве материалов для препаратов, например, наполнитель, разрыхлитель, связующее вещество, повышающее сыпучесть вещество, смазочный материал и т.д. для твердых препаратов, а также растворитель, солюбилизирующее вещество, суспендирующее вещество, создающее изотоничность вещество, буферное вещество, смягчающее вещество и т.д. для жидких препаратов. Кроме того, когда это необходимо, используются добавки, такие как консервант, антиоксидант, краситель, подсластитель и т.д.

Примерный «наполнитель» представляют собой лактоза, сахароза, D-маннит, D-сорбит, кукурузный крахмал, декстрин, микрокристаллическая целлюлоза, кристаллическая целлюлоза, кармеллоза, кальциевая соль кармеллозы, натриевая соль карбоксиметилкрахмала, низкозамещенная гидроксипропилцеллюлоза, аравийская камедь и т.д.

Примерный «разрыхлитель» представляют собой кармеллоза, кальциевая соль кармеллозы, натриевая соль кармеллозы, натриевая соль карбоксиметилкрахмала, натриевая соль кроскармеллозы, кросповидон, низкозамещенная гидроксипропилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, кристаллическая целлюлоза и т.д.

Примерное «связующее вещество» представляют собой гидроксипропилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, повидон, кристаллическая целлюлоза, сахароза, декстрин, крахмал, желатин, кармеллоза натрия, аравийская камедь и т.д.

Примерное «повышающее сыпучесть вещество» представляют собой легкая безводная кремниевая кислота, стеарат магния и т.д.

Примерный «смазочный материал» представляют собой стеарат магния, стеарат кальция, тальк и т.д.

Примерный «растворитель» представляют собой очищенная вода, этанол, пропиленгликоль, макрогол, кунжутное масло, кукурузное масло, оливковое масло и т.д.

Примерное «солюбилизирующее вещество» представляют собой пропиленгликоль, D-маннит, бензилбензоат, этанол, триэтаноламин, карбонат натрия, цитрат натрия и т.д.

Примерное «суспендирующее вещество» представляют собой хлорид бензалкония, кармеллоза, гидроксипропилцеллюлоза, пропиленгликоль, повидон, метилцеллюлоза, моностеарат глицерина и т.д.

Примерное «создающее изотоничность вещество» представляют собой глюкоза, D-сорбит, хлорид натрия, D-маннит и т.д.

Примерное «буферное вещество» представляют собой гидрофосфат натрия, ацетат натрия, карбонат натрия, цитрат натрия и т.д.

Примерное «смягчающее вещество» представляют собой бензиловый спирт и т.д.

Примерный «консервант» представляют собой этилпарагидроксибензоат, хлорбутанол, бензиловый спирт, дегидроацетат натрия, сорбиновая кислота и т.д.

Примерный «антиоксидант» представляют собой сульфит натрия, аскорбиновая кислота и т.д.

Примерный «краситель» представляют собой пищевые красители (например, красный пищевой краситель № 2 или № 3, желтый пищевой краситель № 4 или № 5 и т.д.), бета-каротин и т.д.

Примерные «подсластитель» представляют собой натриевая соль сахарина, двухзамещенный глицирризинат калия, аспартам и т.д.

Фармацевтическую композицию согласно настоящему изобретению можно вводить перорально или парентерально (включая, например, местное, внутримышечное, подкожное, ректальное, внутривенное введение и т.д.) человеку, а также млекопитающим, отличным от человека (таким как, например, мышь, крыса, хомяк, морская свинка, кролик, кошка, собака, свинья, корова, лошадь, овца, обезьяна и т.д.). Доза изменяется в зависимости от вида пациента, заболевания, симптома, дозированной формы, пути введения и т.д. Например, суточная доза для перорального введения взрослому пациенту, у которого масса тела составляет приблизительно 60 кг), как правило, находится приблизительно в интервале от 1 мг до 1 г в расчете на соединение (1) в качестве активного ингредиента. Данное количество можно вводить в виде одной или нескольких порций.

Поскольку соединение согласно настоящему изобретению или соответствующая фармацевтически приемлемая соль проявляет активность в качестве ингибитора PDHK (PDHK1 и/или PDHK2), они считаются предпочтительными для лечения или профилактики заболеваний, связанных с нарушением усвоения глюкозы, например, диабет (диабет первого типа, диабет второго типа и т.д.), синдром инсулинорезистентности, метаболический синдром, гипергликемия, гиперлактацидемия, диабетические осложнения (диабетическая невропатия, диабетическая ретинопатия, диабетическая нефропатия, катаракта и т.д.). Кроме того, ингибитор PDHK считается предпочтительными для лечения или профилактики заболеваний, в которых является ограниченным поступление источника энергии в ткань, например, таких как сердечная недостаточность (острая сердечная недостаточность, хроническая сердечная недостаточность), кардиомиопатия, ишемия миокарда, инфаркт миокарда, стенокардия, дислипидемия, атеросклероз, болезнь периферических артерий, перемежающаяся хромота, хроническое обструктивное заболевание легких, ишемия головного мозга и апоплексия головного мозга. Кроме того, ингибитор PDHK считается предпочтительными для лечения или профилактики таких заболеваний, как митохондриальное заболевание, митохондриальная энцефаломиопатия, рак легочная гипертензия или болезнь Альцгеймера, и т.д.

Диабет представляет собой, например, диабет первого типа или диабет второго типа.

Примерные диабетические осложнения представляют собой диабетическая невропатия, диабетическая ретинопатия, диабетическая нефропатия и катаракта.

Сердечная недостаточность представляет собой, например, острую сердечную недостаточность или хроническую сердечную недостаточность.

«Ингибирование PDHK» означает ингибирование функции PDHK и устранение или снижение ее активности. «Ингибирование PDHK» предпочтительно означает ингибирование PDHK человека. «Ингибитор PDHK» предпочтительно означает «ингибитор PDHK человека».

«Ингибирование PDHK1» означает ингибирование функции PDHK1 и устранение или снижение ее активности. Например, это означает ингибирование функции в качестве PDHK1 на основе условий представленного ниже экспериментального примера 1. «Ингибирование PDHK1» предпочтительно означает ингибирование PDHK1 человека. «Ингибитор PDHK1» предпочтительно означает «ингибитор PDHK1 человека». Более предпочтительным является «ингибитор PDHK1 для целевого органа человека».

«Ингибирование PDHK2» означает ингибирование функции PDHK2 и устранение или снижение ее активности. Например, это означает ингибирование функции в качестве PDHK2 на основе условий представленного ниже экспериментального примера 1. «Ингибирование PDHK2» предпочтительно означает ингибирование PDHK2 человека. «Ингибитор PDHK2» предпочтительно означает «ингибитор PDHK2 человека». Более предпочтительным является «ингибитор PDHK2 для целевого органа человека».

«Активирование PDH» означает активирование PDH в целевом органе (таком как, например, печень, скелетная мышца, жировая ткань, сердце, головной мозг) и т.д., раковой опухоли и т.д.

«Снижение уровня глюкозы в крови» означает уменьшение концентрации глюкозы в крови (включая сыворотку и плазму), предпочтительно снижение высокого уровня глюкозы в крови, предпочтительнее снижение уровня глюкозы в крови до терапевтически эффективного нормального уровня для человека.

«Снижение уровень молочной кислоты» означает уменьшение концентрации молочной кислоты в крови (включая сыворотку и плазму), предпочтительно снижение высокого уровня молочной кислоты, предпочтительнее снижение уровня молочной кислоты до терапевтически эффективного нормального уровня для человека.

Соединение согласно настоящему изобретению или соответствующая фармацевтически приемлемая соль могут быть использованы в сочетании с одним или несколькими другими лекарственными средствами (далее они также упоминается как сопутствующие лекарственные средства) согласно способу, который обычно используется в данной области медицины (далее упоминается как комбинированное применение).

Период введения соединения согласно настоящему изобретению или соответствующей фармацевтически приемлемой соли, а также сопутствующего лекарственного средства не является ограниченным, и их можно вводить пациенту в форме комбинированного препарата, или можно вводить несколько препаратов одновременно или с заданными интервалами. Кроме того, фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению и сопутствующее лекарственное средство могут быть использованы в качестве лекарственного средства в форме набора. Доза сопутствующего лекарственного средства является аналогичной используемой в клинических условиях дозе, и ее можно выбирать соответствующим образом, принимая во внимание пациента, заболевание, симптом, дозированную форму, путь введения, время введения, сочетание и т.д. Форма введения сопутствующего лекарственного средства не ограничивается определенным образом, и требуется только сочетание с соединением согласно настоящему изобретению или соответствующей фармацевтически приемлемой солью.

Примерные комбинированные лекарственные средства представляют собой средства для лечения и/или средства для профилактики таких заболеваний, как диабет (диабет первого типа, диабет второго типа и т.д.), синдром инсулинорезистентности, метаболический синдром, гипергликемия, гиперлактацидемия, диабетические осложнения (диабетическая невропатия, диабетическая ретинопатия, диабетическая нефропатия, катаракта), сердечная недостаточность (острая сердечная недостаточность, хроническая сердечная недостаточность), кардиомиопатия, ишемия миокарда, инфаркт миокарда, стенокардия, дислипидемия, атеросклероз, болезнь периферических артерий, перемежающаяся хромота, хроническое обструктивное заболевание легких, ишемия головного мозга, апоплексия головного мозга, митохондриальное заболевание, митохондриальная энцефаломиопатия, рак, легочная гипертензия или болезнь Альцгеймера, и т.д., причем одно или более соответствующих веществ и соединение согласно настоящему изобретению или соответствующая фармацевтически приемлемая соль могут быть использованы в сочетании.

Примерные «средства для лечения и/или профилактики диабета» представляют собой препарат инсулина, сульфонилмочевина как гипогликемическое средство, метформин, ингибитор дипептидилпептидазы-4 (DPP-4), снижающее инсулинорезистентность средство (например, производное тиазолидина), агонист рецепторов глюкагоноподобного пептида 1 (GLP-1) и т.д.

Примеры

Способ изготовления соединения согласно настоящему изобретению или соответствующей фармацевтически приемлемой соли конкретно разъясняется в следующих примерах. Однако настоящее изобретение не огранивается данными примерами.

Даже если в настоящем документе отсутствует описание соответствующего способа изготовления, стадии можно модифицировать для эффективного производство, включая, например, введение защитной группы в функциональную группу, если это необходимо, со снятием защиты на последующей стадии, использование функциональной группы в форме предшественника на каждой стадии с последующим превращением в желательную функциональную группу на подходящей стадии, изменение последовательности технологических процессов и стадий и т.д.

Обработку после реакции на каждой стадии можно осуществлять традиционным способом, причем выделение и очистку можно осуществлять, если это необходимо, согласно способу, соответствующим образом выбранному из традиционных способов, таких как кристаллизация, перекристаллизация, дистилляция, разделение, силикагельная хроматография, препаративная ВЭЖХ и т.д., или их сочетание. Все реагенты и растворители соответствовали качеству имеющихся в продаже продуктов и были использованы без очистки.

Массовое процентное соотношение обозначается «мас.%». Другие сокращения, используемые в разделе примеров, представляют собой следующие:

с: синглет

д: дублет

т: триплет

к: квартет

м: мультиплет

ш: широкий

дд: дублет дублетов

тд: дублет триплетов

ддд: триплет дублетов

J: константа спин-спинового взаимодействия

CDCl₃: дейтерированный хлороформ

DMSO-D₆: дейтерированный диметилсульфоксид

ЯМР ¹H: протонный ядерный магнитный резонанс

ВЭЖХ: высокоэффективная жидкостная хроматография

DPPA: дифенилфосфорилазид

Спектры ЯМР ¹H снимали в CDCl₃ или DMSO-D₆, используя тетраметилсилан в качестве внутреннего стандарта, и все значения δ приведены в миллионных долях (м. д.).

Фосфатный буферный раствор 10 мМ (pH 2,0)

Для получения данного буферного раствора дигидрофосфат натрия (3,60 г) растворяли в воде (3000 мл), и уровень pH доводили до 2,0, используя фосфорную кислоту.

Условия анализа методом ВЭЖХ

Условия анализа 1

Измерительное устройство: высокоэффективная жидкостная хроматографическая система Prominence от компании Shimadzu Corporation

Колонка: DAICEL CHIRALCEL OD-3R, диаметр 4,6 мм, длина 150 мм

Температура колонки: 40°C

Подвижная фаза: фосфатный буферный раствор 10 мМ (pH 2,0) (раствор A), ацетонитрил (раствор B)

Состав подвижной фазы (соотношение раствора A и раствора B) линейно изменялся от 50:50 до 20:80 в течение 20 минут, а затем оставался на уровне 20:80 в течение 5 минут.

Скорость потока: 0,5 мл/мин

Детектор: ультрафиолетовый (220 нм)

Условия анализа 2

Измерительное устройство: высокоэффективная жидкостная хроматографическая система Prominence от компании Shimadzu Corporation

Колонка: DAICEL CHIRALCEL OD-RH, диаметр 4,6 мм, длина 150 мм

Температура колонки: 40°C

Подвижная фаза: фосфатный буферный раствор 10 мМ (pH 2,0) (раствор A), ацетонитрил (раствор B)

Состав подвижной фазы (соотношение раствора A и раствора B) линейно изменялся от 70:30 до 40:60 в течение 20 минут, а затем оставался на уровне 40:60 в течение 10 минут.

Скорость потока: 0,5 мл/мин

Детектор: ультрафиолетовый (220 нм)

Условия анализа 3

Измерительное устройство: высокоэффективная жидкостная хроматографическая система Prominence от компании Shimadzu Corporation

Колонка: DAICEL CHIRALCEL AD-3R, диаметр 4,6 мм, длина 150 мм

Температура колонки: 40°C

Подвижная фаза: фосфатный буферный раствор 10 мМ (pH 2,0) (раствор A), ацетонитрил (раствор B)

Состав подвижной фазы (соотношение раствора A и раствора B) линейно изменялся от 50:50 до 20:80 в течение 20 минут, а затем оставался на уровне 20:80 в течение 5 минут.

Скорость потока: 0,5 мл/мин

Детектор: ультрафиолетовый (220 нм)

Пример 1

Синтез 2-{4-[(9R)-9-гидрокси-2-(3-гидрокси-3-метилбутилокси)-9-(трифторметил)-9H-флуорен-4-ил]-1H-пиразол-1-ил}-2-метилпропанамида (соединение (2))

Стадия 1

Этил 2’-хлор-4’-метоксибифенил-2-карбоксилат

В атмосфере аргона 1-бром-2-хлор-4-метоксибензол (44,3 г) растворяли в толуоле (220 мл), добавляли этил-2-(4,4,5,5-тетраметил[1,3,2]диоксаборолан-2-ил)бензоат (60,8 г), воду (132 мл), гидрокарбонат натрия (33,6 г) и дихлорид бис(трифенилфосфин)палладия(II) (2,8 г), и смесь перемешивали на масляной бане при температуре 120°C в течение 7 часов. В реакционную смесь добавляли этил-2-(4,4,5,5-тетраметил[1,3,2]диоксаборолан-2-ил)бензоат (5,2 г), и перемешивание смеси продолжали в течение 2 часов. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры, добавляли толуол (100 мл) и воду (200 мл), и смесь перемешивали в течение ночи. В реакционную смесь добавляли активированный уголь (3 г), и перемешивание смеси продолжали в течение 1 часов. Нерастворимый материал отфильтровывали через целит, и нерастворимый материал промывали толуолом (100 мл) и водой (200 мл). Полученные фильтраты объединяли и выдерживали для разделения слоев. Полученный органический слой промывали водой (100 мл), и растворитель испаряли, чтобы получить целевое соединение (67,7 г).

ЯМР ¹H (400 МГц, DMSO-D₆) δ: 7,88-7,86 (1H, м), 7,63 (1H, тд, J=7,6, 1,4 Гц), 7,51 (1H, тд, J=7,6, 1,4 Гц), 7,27 (1H, дд, J=7,6, 0,9 Гц), 7,18 (1H, д, J=8,6 Гц), 7,06 (1H, д, J=2,6 Гц), 6,95 (1H, дд, J=8,6, 2,6 Гц), 4,01 (2H, м), 3,80 (3H, с), 0,96 (3H, т, J=7,1 Гц).

Стадия 2

2’-Хлор-4’-метоксибифенил-2-карбоновая кислота

Этил-2’-хлор-4’-метоксибифенил-2-карбоксилат (67,7 г) растворяли в этаноле (100 мл), добавляли водный раствор 4 н гидроксида натрия (100 мл), и смесь перемешивали на масляной бане при температуре 110°C в течение 4,5 часов. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры, добавляли воду (200 мл) и толуол (100 мл), и смесь перемешивали в течение ночи. В реакционную смесь добавляли активированный уголь (3,6 г), и перемешивание смеси продолжали в течение 1 часов. Нерастворимый материал отфильтровывали через целит, и нерастворимый материал промывали толуолом (30 мл) и водой (300 мл). Полученные фильтраты объединяли и выдерживали для разделения слоев. Полученный водный слой промывали толуолом (100 мл), водный слой подкисляли концентрированной хлористоводородной кислотой (40 мл) и перемешивали при комнатной температуре в течение одного часа. Твердый осадок собирали путем фильтрования. Полученное твердое вещество высушивали на воздухе в течение 3 часов, а затем высушивали при пониженном давлении и температуре 60°C в течение ночи, чтобы получить целевое соединение (50,2 г).

ЯМР ¹H (400 МГц, DMSO-D₆) δ: 12,57 (1H, с), 7,90-7,88 (1H, м), 7,60 (1H, тд, J=7,6, 1,3 Гц), 7,49 (1H, тд, J=7,6, 1,3 Гц), 7,24 (1H, дд, J=7,6, 1,0 Гц), 7,19 (1H, д, J=8,4 Гц), 7,06 (1H, д, J=2,4 Гц), 6,95 (1H, дд, J=8,5, 2,4 Гц), 3,81 (3H, с).

Стадия 3

4-Хлор-2-метокси-9H-флуорен-9-он

В атмосфере аргона в 2’-хлор-4’-метоксибифенил-2-карбоновую кислоту (65,4 г) добавляли реагент Итона (Eaton) (330 мл раствора оксида фосфора(V) и метансульфоновой кислоты в массовом соотношении 1:10), и смесь перемешивали на масляной бане при температуре 100°C в течение одного часа. Реакционную смесь охлаждали льдом, воду (650 мл) медленно добавляли каплями, и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение одного часа. Твердый осадок собирали путем фильтрования и промывали водой (500 мл). Полученное твердое вещество высушивали на воздухе в течение ночи, чтобы получить целевое соединение (92,0 г).

ЯМР ¹H (400 МГц, DMSO-D₆) δ: 8,01 (1H, д, J=7,4 Гц), 7,64-7,60 (2H, м), 7,36 (1H, тд, J=7,4, 0,9 Гц), 7,17 (2H, дд, J=8,4, 2,3 Гц), 3,85 (3H, с).

Стадия 4

4-Хлор-2-гидрокси-9H-флуорен-9-он

В атмосфере аргона в 4-хлор-2-метокси-9H-флуорен-9-он (92,0 г) добавляли N-метилпирролидон (120 мл) и пиридингидрохлорид (144 г). Реакционную смесь перемешивали на масляной бане при температуре 200°C в течение 3 часов, удаляя воду с помощью аппарата Дина-Старка (Dean-Stark). Реакционную смесь охлаждали до 90°C, воду (600 мл) добавляли каплями, и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов. Твердый осадок собирали путем фильтрования и промывали водой (400 мл). Полученное твердое вещество высушивали на воздухе в течение 3 суток, добавляли 300 мл смешанного растворителя, содержащего гексан и этилацетат (соотношение гексана и этилацетата составляло 1:1), и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение одного часа. Твердый собирали путем фильтрования и промывали, используя 500 мл смешанного растворителя, содержащего гексан и этилацетат (соотношение гексана и этилацетата составляло 1:1). Полученное твердое вещество высушивали при пониженном давлении и температуре 50°C в течение 3 часов, чтобы получить целевое соединение (48,6 г).

ЯМР ¹H (400 МГц, DMSO-D₆) δ: 10,56 (1H, с), 7,96 (1H, д, J=8,4 Гц), 7,61-7,57 (2H, м), 7,32 (1H, тд, J=7,4, 0,9 Гц), 6,97 (1H, д, J=2,2 Гц), 6,94 (1H, д, J=2,2 Гц).

Стадия 5

Этил-4-(4-хлор-9-oxo-9H-флуорен-2-илокси)бутират

4-Хлор-2-гидрокси-9H-флуорен-9-он (48,6 г) растворяли в N,N-диметилформамиде (150 мл), добавляли карбонат калия (58,3 г) и этил-4-бромбутират (33,5 мл), и смесь перемешивали при 60°C в течение 2 часов. Реакционную смесь охлаждали до 40°C, добавляли толуол (300 мл) и воду (300 мл) и выдерживали для разделения слоев. Полученный водный слой повторно экстрагировали толуолом (100 мл). Полученные органические слои объединяли, дважды промывали водой (100 мл), добавляли безводный сульфат натрия и активированный уголь (2,5 г), и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 5 минут. Нерастворимый материал отфильтровывали через целит, и растворитель в фильтрате испаряли. В полученный осадок добавляли гексан (220 мл), и смесь перемешивали при 50°C в течение 10 минут и при комнатной температуре в течение одного часа. Твердый осадок собирали путем фильтрования и промывали гексаном. Полученное твердое вещество высушивали при пониженном давлении, чтобы получить целевое соединение (66,9 г). Кроме того, растворитель в полученном фильтрате испаряли, в осадок добавляли этилацетат (5 мл) и гексан (20 мл), и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение одного часа. Твердый осадок собирали путем фильтрования и промывали гексаном. Полученное твердое вещество высушивали при пониженном давлении, чтобы получить целевое соединение (2,5 г).

ЯМР ¹H (400 МГц, DMSO-D₆) δ: 8,01 (1H, д, J=7,6 Гц), 7,65-7,61 (2H, м), 7,37 (1H, т, J=7,6 Гц), 7,17-7,14 (2H, м), 4,13-4,05 (4H, м), 2,47 (2H, т, J=7,3 Гц), 2,02-1,95 (2H, м), 1,19 (3H, тд, J=7,2, 0,7 Гц).

Стадия 6

Этил-4-[(9R)-4-хлор-9-гидрокси-9-(трифторметил)-9H-флуорен-2-илокси]бутират

В атмосфере аргона этил-4-(4-хлор-9-oxo-9H-флуорен-2-илокси)бутират (69,4 г) растворяли в тетрагидрофуране (THF) (700 мл), и добавляли 4-метоксифеноксид N-(4-трет-бутилбензил)цинхонидиния (6,4 г). В реакционную смесь добавляли каплями раствор, содержащий триметил(трифторметил)силан (52,0 мл) в THF (140 мл), при -16°C, и смесь перемешивали при той же температуре в течение 15 минут. В реакционную смесь последовательно добавляли уксусную кислоту (23,0 мл) и раствор 1 М фторида тетрабутиламмония в THF (222 мл), и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение одного часа. Растворитель в реакционной смеси испаряли, и в полученный осадок добавляли толуол (500 мл) и насыщенный водный раствор гидрокарбоната натрия (200 мл), а затем выдерживали для разделения слоев. Полученный органический слой промывали последовательно насыщенным водным раствором гидрокарбоната натрия (дважды по 150 мл), водным раствором 1 н гидроксида натрия (100 мл), водой (100 мл), водным раствором 1 н хлористоводородной кислоты (100 мл), водой (100 мл) и насыщенным солевым раствором (100 мл). В полученный органический слой добавляли безводный сульфат магния и силикагель (150 г), и смесь перемешивали в течение 10 минут. Нерастворимый материал отфильтровывали, и нерастворимый материал промывали последовательно толуолом (300 мл) и этилацетат (800 мл). Полученный фильтрат и толуол после промывания объединяли, и растворитель испаряли, чтобы получить целевое соединение (72,1 г). Кроме того, растворитель в этилацетате после промывания испаряли, в полученный осадок добавляли силикагель (40 г) и 300 мл смешанного растворителя, содержащего гексан и этилацетат (соотношение этилацетата и гексана составляло 2:1), и смесь перемешивали при комнатной температуре. Нерастворимый материал отфильтровывали, и нерастворимый материал промывали, используя 300 мл смешанного растворителя, содержащего гексан и этилацетат (соотношение этилацетата и гексана составляло 2:1). Растворитель в полученном фильтрате испаряли, чтобы получить целевое соединение (20,3 г).

ЯМР ¹H (400 МГц, DMSO-D₆) δ: 8,14 (1H, д, J=7,7 Гц), 7,66 (1H, д, J=7,5 Гц),7,53 (1H, т, J=7,6 Гц), 7,42-7,38 (2H, м), 7,14 (2H, с), 4,11-4,05 (4H, м), 2,47 (2H, т, J=7,5 Гц), 2,03-1,96 (2H, м), 1,19 (3H, тд, J=7,1, 0,8 Гц).

Абсолютная конфигурация

Определение абсолютной конфигурации 4-хлор-2-метил-9-(трифторметил)-9H-флуорен-9-ола на представленной далее стадии 10 подтвердило, что целевое соединение, полученное на этой стадии, представляет собой форму (R). Оптическая чистота (как энантиомерный избыток) составляла 52,9%.

Оптическую чистоту определяли методом ВЭЖХ в условиях анализа 1. Время удерживания формы (S) составляло 19,6 минут, а время удерживания формы (R) составляло 23,0 минуты.

Стадия 7

4-[(9R)-4-Хлор-9-гидрокси-9-(трифторметил)-9H-флуорен-2-илокси]масляная кислота

Этил-4-[(9R)-4-хлор-9-гидрокси-9-(трифторметил)-9H-флуорен-2-илокси]бутират (92,2 г) растворяли в этаноле (100 мл), 4N водный гидроксид натрия (100 мл) добавляли, и смесь перемешивали при 80°C в течение ночи. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры, вода (200 мл) добавляли, и смесь дважды промывали толуолом (100 мл). Полученный водный слой нейтрализовали концентрированной хлористоводородной кислотой (40 мл) и дважды экстрагировали этилацетатом (300 мл). Полученный этилацетатный экстракт промывали последовательно водой (дважды по 100 мл) и насыщенным солевым раствором (100 мл), добавляли безводный сульфат магния и активированный уголь (4,2 г), и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 10 минут. Нерастворимый материал отфильтровывали, и растворитель в фильтрате испаряли. В полученный осадок добавляли хлороформ (80 мл), и смесь нагревали до 50°C. Гексан (400 мл) добавляли каплями, и смесь перемешивали при той же температуре в течение 30 минут, а затем при комнатной температуре в течение 2 часов. Твердый осадок собирали путем фильтрования, промывали, используя 50 мл смешанного растворителя, содержащего гексан и хлороформ (соотношение гексана и хлороформа составляло 9:1), и высушивали при пониженном давлении и температуре 80°C в течение 2 часов, чтобы получить целевое соединение (72,5 г).

ЯМР ¹H (400 МГц, DMSO-D₆) δ: 12,17 (1H, ш.с), 8,14 (1H, д, J=7,7 Гц), 7,66 (1H, д, J=7,5 Гц), 7,54 (1H, тд, J=7,7, 1,2 Гц), 7,42-7,30 (2H, м), 7,18-7,15 (2H, м), 4,09 (2H, т, J=6,4 Гц), 2,41 (2H, т, J=7,3 Гц), 2,00-1,93 (2H, м).

Стадия 8

Соль (1S)-1-(4-метилфенил)этиламина и 4-[(9R)-4-хлор-9-гидрокси-9-(трифторметил)-9H-флуорен-2-илокси]масляной кислоты

В атмосфере азота (1S)-1-(4-метилфенил)этиламин (19,5 г) растворяли в этилацетате (720 мл), и добавляли 4-[(9R)-4-хлор-9-гидрокси-9-(трифторметил)-9H-флуорен-2-илокси]масляную кислоту (72,5 г). Реакционную смесь перемешивали при 60°C в течение 2 часов, и при комнатной температуре в течение ночи. Твердый осадок собирали путем фильтрования и промывали этилацетатом (100 мл). Полученное твердое вещество высушивали при пониженном давлении и температуре 60°C в течение 5 часов, чтобы получить целевое соединение (68,6 г). Кроме того, 4-[(9S)-4-хлор-9-гидрокси-9-(трифторметил)-9H-флуорен-2-илокси]масляная кислота может быть получена из фильтрата.

Оптическая чистота

Оптическую чистоту 4-[(9R)-4-хлор-9-гидрокси-9-(трифторметил)-9H-флуорен-2-илокси]масляной кислоты определяли методом ВЭЖХ в условиях анализа 1 (оптическая чистота (как энантиомерный избыток) составляла 90,2%). Время удерживания формы (R) составляло 12,9 минут, время удерживания формы (S) составляло 10,4 минут.

ЯМР ¹H (400 МГц, DMSO-D₆) δ: 8,14 (1H, д, J=7,7 Гц), 7,66 (1H, д, J=7,7 Гц), 7,53 (1H, тд, J=7,6, 1,1 Гц), 7,40 (1H, тд, J=7,6, 1,0 Гц), 7,26 (2H, д, J=7,9 Гц), 7,16-7,10 (4H, м), 10 4,08 (2H, т, J=6,5 Гц), 4,01 (1H, к, J=6,7 Гц), 2,32 (2H, т, J=7,3 Гц), 2,26 (3H, с), 1,98-1,91 (2H, м), 1,26 (3H, д, J=6,7 Гц).

Стадия 9

4-[(9R)-4-Хлор-9-гидрокси-9-(трифторметил)-9H-флуорен-2-илокси]масляная кислота

В соль (1S)-1-(4-метилфенил)этиламина и 4-[(9R)-4-хлор-9-гидрокси-9-(трифторметил)-9H-флуорен-2-илокси]масляной кислоты (68,6 г) добавляли этилацетат (500 мл) и раствор 2 н хлористоводородной кислоты (300 мл), и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 10 минут. Смесь выдерживали для разделения слоев. Полученный органический слой промывали последовательно водой (250 мл) и насыщенным солевым раствором (200 мл). Полученный органический слой высушивали над безводным сульфатом магния, нерастворимый материал отфильтровывали, и растворитель в фильтрате испаряли, чтобы получить целевое соединение (60,0 г).

ЯМР ¹H (400 МГц, DMSO-D₆) δ: 12,17 (1H, ш.с), 8,14 (1H, д, J=7,7 Гц), 7,66 (1H, д, J=7,5 Гц), 7,54 (1H, тд, J=7,7, 1,2 Гц), 7,42-7,30 (2H, м), 7,18-7,15 (2H, м), 4,09 (2H, т, J=6,4 Гц), 2,41 (2H, т, J=7,3 Гц), 2,00-1,93 (2H, м).

Стадия 10

(9R)-4-Хлор-9-(трифторметил)-9H-флуорен-2,9-диол

В 4-[(9R)-4-хлор-9-гидрокси-9-(трифторметил)-9H-флуорен-2-илокси]масляную кислоту (50 г) добавляли N-метилпирролидон (200 мл) и пиридингидрохлорид (298 г), и смесь перемешивали на масляной бане при температуре 200°C в течение 2 суток. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры, разбавляли этилацетатом (500 мл), и дважды промывали водой. Полученный водный слой повторно экстрагировали этилацетатом (300 мл). Объединенный органический слой промывали последовательно водой, раствором 1 н хлористоводородной кислоты и насыщенным солевым раствором. В полученный органический слой добавляли безводный сульфат магния и активированный уголь (10 г), и смесь перемешивали при комнатной температуре. Нерастворимый материал отфильтровывали через целит. Растворитель в полученном органическом слое испаряли, гексан добавляли в осадок, и смесь перемешивали при комнатной температуре. Твердый осадок собирали путем фильтрования, и высушивали при пониженном давлении при комнатной температуре. Полученный неочищенный продукт растворяли в этилацетате (500 мл), трижды промывали водой, высушивали над безводным сульфатом магния. Нерастворимый материал отфильтровывали, и растворитель в фильтрате испаряли. В осадок добавляли гексан, и смесь перемешивали при комнатной температуре. Твердый осадок собирали путем фильтрования, высушивали при пониженном давлении при комнатной температуре, чтобы получить целевое соединение (22,4 г).

ЯМР ¹H (400 МГц, DMSO-D₆) δ: 10,37 (1H, ш.с), 8,09 (1H, д, J=5 7,5 Гц), 7,63 (1H, д, J=7,5 Гц), 7,50 (1H, тд, J=7,6, 1,0 Гц), 7,36 (1H, тд, J=7,6, 1,0 Гц), 7,32 (1H, ш.с), 7,06 (1H, с), 6,91 (1H, ш.д, J=2,0 Гц).

Абсолютная конфигурация

Абсолютную конфигурацию целевого соединения определяли методом ВЭЖХ, используя оптически активную колонку, содержащую соединение (100A) и соединение (100B), изготовленные на следующих стадиях (стадия A-1, стадия A-2 и стадия B-1).

Стадия A-1

4-Хлор-2-метил-9H-флуорен-9-он подвергали трифторметилированию, реакции с этилбромацетатом и гидролизу, получая [4-хлор-2-метил-9-(трифторметил)-9H-флуорен-9-илокси]уксусную кислоту. Это соединение оптически разделяли, использование (1R)-1-фенилэтиламин, и абсолютную конфигурацию определяли как (R), осуществляя рентгеноструктурный анализ монокристалла полученной соли (1R)-1-фенилэтиламина (100AA).

Стадия A-2

(9R)-4-Хлор-2-метил-9-(трифторметил)-9H-флуорен-9-ол (соединение (100A)) синтезировали из соединения 100AA посредством обработки кислотой и т.д.

Стадия B-1

Гидроксильную группу в положении 2 молекулы 4-хлор-9-(трифторметил)-9H-флуорен-2,9-диола, полученного на стадии 10, превращали в метильную группу вышеупомянутым способом, получая 4-хлор-2-метил-9-(трифторметил)-9H-флуорен-9-ол (соединение (100B)).

Анализ методом ВЭЖХ с использованием оптически активной колонки

Оба энантиомера соединения (100) разделяли методом ВЭЖХ с использованием оптически активной колонки (ВЭЖХ в условиях анализа 3). Анализ методом ВЭЖХ соединения (100A) подтвердил, что время удерживания формы (R) составляло 18,4 минут, и время удерживания формы (S) составляло 17,0 минут. Соединение (100A) и соединение (100B) анализировали в условиях ВЭЖХ и находили, что время удерживания совпадает.

Считается, что абсолютная конфигурация асимметричного атома углерода не изменяется в процессе изготовления вышеупомянутого соединения (100A) и соединения (100B). Результаты подтвердили, что 4-хлор-9-(трифторметил)-9H-флуорен-2,9-диол, полученный на стадии 10, имеет абсолютную конфигурацию (R).

Стадия 11

(9R)-4-Хлор-2-(3-гидрокси-3-метилбутилокси)-9-(трифторметил)-9H-флуорен-9-ол

В атмосфере азота (9R)-4-хлор-9-(трифторметил)-9H-флуорен-2,9-диол (55,5 г) растворяли в N,N-диметилформамиде (550 мл), добавляли 3-гидрокси-3-метилбутилтолуол-4-сульфонат (49,6 г) и карбонат калия (39,5 г), и смесь перемешивали на масляной бане при температуре 70°C в течение ночи. В реакционную смесь добавляли раствор 3-гидрокси-3-метилбутилтолуол-4-сульфоната (4,0 г) в N,N-диметилформамиде (5 мл), и смесь дополнительно перемешивали при той же температуре в течение 9,5 часов. Реакционную смесь охлаждали льдом, добавляли воду (800 мл), и смесь экстрагировали этилацетатом (900 мл). Полученный органический слой промывали водой (трижды по 500 мл) и насыщенным солевым раствором (500 мл). Полученный органический слой высушивали над безводным сульфатом натрия, нерастворимый материал отфильтровывали, и растворитель в фильтрате испаряли. Полученный осадок очищали методом силикагельной колоночной хроматографии (смесь гексана и этилацетата использовали в качестве элюирующего растворителя, элюируя сначала смесью, содержащей гексан и этилацетат) при соотношении компонентов, составляющем 3:1, а затем смесью при соотношении компонентов, составляющем 2:1, и далее смесью при соотношении компонентов, составляющем 3:2), чтобы получить целевое соединение (49,5 г).

ЯМР ¹H (400 МГц, DMSO-D₆) δ: 8,12 (1H, д, J=7,6 Гц), 7,64 (1H, д, J=7,4 Гц), 7,52 (1H, тд, J=7,6, 0,9 Гц), 7,40-7,36 (2H, м), 7,15-7,13 (2H, м), 4,41 (1H, с), 4,16 (2H, т, J=7,1 Гц), 1,85 (2H, т, J=7,1 Гц), 1,17 (6H, с).

Стадия 12

Этил-2-{4-[(9R)-9-гидрокси-2-(3-гидрокси-3-метилбутилокси)-9-(трифторметил)-9H-флуорен-4-ил]-1H-пиразол-1-ил}-2-метилпропионат

В атмосфере аргона (9R)-4-хлор-2-(3-гидрокси-3-метилбутилокси)-9-(трифторметил)-9H-флуорен-9-ол (49,5 г) растворяли в толуоле (445 мл), добавляли этил-2-метил-2-[4-(4,4,5,5-тетраметил[1,3,2]диоксаборолан-2-ил)-1H-пиразол-1-ил]пропионат (59,2 г), воду (149 мл), трехзамещенный фосфат калия (54,3 г), ацетат палладия (2,9 г) и 2-дициклогексилфосфино-2’,6’-диметоксибифенил (SPhos) (10,5 г), и смесь перемешивали на масляной бане при температуре 100°C в течение 3,5 часов. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры, и добавляли воду (300 мл). Нерастворимый материал отфильтровывали через целит, и нерастворимый материал промывали толуолом (150 мл) и вода (50 мл). Полученные фильтраты объединяли и выдерживали для разделения слоев. Полученный органический слой промывали последовательно водой (500 мл) и насыщенным солевым раствором (500 мл). Полученный органический слой высушивали над безводным сульфатом натрия, нерастворимый материал отфильтровывали, и растворитель в фильтрате испаряли. Полученный осадок очищали методом силикагельной колоночной хроматографии (смесь, содержащую гексан и этилацетат, использовали в качестве элюирующего растворителя, сначала элюируя смесью, содержащей гексан и этилацетат при соотношении компонентов, составляющем 2:1, а затем смесью при соотношении компонентов, составляющем 1:1, и далее смесью при соотношении компонентов, составляющем 1:2), а затем очищали методом силикагельной колоночной хроматографии (смесь, содержащую гексан и ацетон, использовали в качестве элюирующего растворителя, сначала элюируя смесью, содержащей гексан и ацетон при соотношении компонентов, составляющем 2:1, а затем смесью при соотношении компонентов, составляющем 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 2:3, и далее смесью при соотношении компонентов, составляющем 1:2), чтобы получить целевое соединение (68,4 г).

ЯМР ¹H (400 МГц, DMSO-D₆) δ: 8,18 (1H, с), 7,65 (1H, с), 7,59-7,57 (1H, м), 7,25-7,21 (4H, м), 7,13 (1H, ш. д, J=1,6 Гц), 6,84 (1H, д, J=2,3 Гц), 4,38 (1H, с), 4,16-4,11 (4H, м), 1,86 (2H, т, J=7,1 Гц), 1,84 (6H, с), 1,16 (6H, с), 1,13 (3H, т, J=7,0 Гц).

Стадия 13

2-{4-[(9R)-9-Гидрокси-2-(3-гидрокси-3-метилбутилокси)-9-(трифторметил)-9H-флуорен-4-ил]-1H-пиразол-1-ил}-2-метилпропионовая кислота

Этил-2-{4-[(9R)-9-гидрокси-2-(3-гидрокси-3-метилбутилокси)-9-(трифторметил)-9H-флуорен-4-ил]-1H-5 пиразол-1-ил}-2-метилпропионат (68,4 г) растворяли в этаноле (256 мл), добавляли водный раствор 4 н гидроксида натрия (128 мл), и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2,5 часов. Реакционную смесь охлаждали льдом, добавляли каплями раствор 2 н хлористоводородной кислоты (333 мл), и смесь экстрагировали этилацетатом (500 мл). Полученный органический слой промывали последовательно водой (дважды по 400 мл) и насыщенным солевым раствором (400 мл). Полученный органический слой высушивали над безводным сульфатом натрия, нерастворимый материал отфильтровывали, и растворитель в фильтрате испаряли, чтобы получить целевое соединение (70,0 г).

ЯМР ¹H (400 МГц, DMSO-D₆) δ: 13,06 (1H, ш.с), 8,14 (1H, с), 7,62 (1H, с), 7,57 (1H, дд, J=6,4, 0,6 Гц), 7,27-7,19 (4H, м), 7,12 (1H, с), 6,84 (1H, д, J=2,3 Гц), 4,38 (1H, с), 4,14 (2H, т, J=7,2 Гц), 1,85 (2H, т, J=7,2 Гц), 1,82 (3H, с), 1,81 (3H, с), 1,16 (6H, с).

Стадия 14

2-{4-[(9R)-9-Гидрокси-2-(3-гидрокси-3-метилбутилокси)-9-(трифторметил)-9H-флуорен-4-ил]-1H-пиразол-1-ил}-2-метилпропанамид (соединение (2))

В атмосфере азота 2-{4-[(9R)-9-гидрокси-2-(3-гидрокси-3-метилбутилокси)-9-(трифторметил)-9H-флуорен-4-ил]-1H-пиразол-1-ил}-2-метилпропионовую кислоту (66,7 г) растворяли в N,N-диметилформамиде (480 мл), добавляли моногидрат 1-гидроксибензотриазола (HOBt) (27,6 г), гидрохлорид 1-этил-3-(3’-диметиламинопропил)карбодиимида (WSC) (34,6 г) и водный раствор 28% аммиака (24,5 мл), и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Реакционную смесь охлаждали льдом, добавляли каплями воду (630 мл) и раствор 2 н хлористоводородной кислоты (330 мл), и смесь экстрагировали этилацетатом (800 мл). Полученный водный слой повторно экстрагировали этилацетатом (500 мл). Полученные органические слои объединяли, и промывали последовательно водой (500 мл, дважды), насыщенный водный раствор гидрокарбоната натрия (500 мл), и насыщенный солевой раствор (500 мл). Полученный органический слой высушивали над безводным сульфатом натрия, нерастворимый материал отфильтровывали, и растворитель в фильтрате испаряли, чтобы получить целевое соединение (60,0 г).

ЯМР ¹H (400 МГц, DMSO-D₆) δ: 8,08 (1H, с), 7,66 (1H, с), 7,58-7,56 (1H, м), 7,32-7,30 (1H, м), 7,25-7,22 (4H, м), 7,12 (1H, ш.с), 6,96 (1H, ш.с), 6,87 (1H, д, J=2,3 Гц), 4,38 (1H, с), 4,14 (2H, т, J=7,2 Гц), 1,85 (2H, т, J=7,2 Гц), 1,78 (3H, 25 с), 1,78 (3H, с), 1,17 (6H, с).

Стадия 15

2-{4-[(9R)-9-Гидрокси-2-(3-гидрокси-3-метилбутилокси)-9-(трифторметил)-9H-флуорен-4-ил]-1H-пиразол-1-ил}-2-метилпропанамид моногидрат (соединение (2h))

2-{4-[(9R)-9-Гидрокси-2-(3-гидрокси-3-метилбутилокси)-9-(трифторметил)-9H-флуорен-4-ил]-1H-пиразол-1-ил}-2-метилпропанамид (соединение (2)) (60,0 г), полученный на предшествующей стадии, растворяли в этилацетате (109 мл), добавляли воду (2 мл), и смесь нагревали до 50°C. В эту смесь последовательно добавляли каплями гексан (226 мл) и 150 мл смешанного растворителя, содержащего гексан и этилацетат при соотношении гексана и этилацетата, составляющем 2:1, и эту смесь выдерживали для охлаждения до комнатной температуры и перемешивали в течение ночи. Твердый осадок собирали путем фильтрования и промывали, используя 190 мл смешанного растворителя, содержащего гексан и этилацетат при соотношении гексана и этилацетата, составляющем 2:1. Полученное твердое вещество высушивали при пониженном давлении при комнатной температуре в течение ночи, чтобы получить целевое соединение (52,2 г), имеющего оптическую чистоту (энатнтиомерный избыток) 98,6%. Оптическую чистоту определяли методом ВЭЖХ в условиях анализа 2. Время удерживания формы (R) составляло 11,3 минут, а время удерживания формы (S) составляло 13,9 минут.

Удельное оптическое вращение [α]_D составляло +37,9° (c=1,01 MeOH при 25°C).

ЯМР ¹H (400 МГц, DMSO-D₆) δ: 8,08 (1H, с), 7,66 (1H, с), 7,58-7,56 (1H, м), 7,32-7,30 (1H, м), 7,25-7,22 (4H, м), 7,12 (1H, ш.с), 6,96 (1H, ш.с), 6,87 (1H, д, J=2,3 Гц), 4,38 (1H, с), 4,14 (2H, т, J=7,2 Гц), 1,85 (2H, т, J=7,2 Гц), 1,78 (3H, с), 1,78 (3H, с), 1,17 (6H, с).

Осуществление элементного анализа

Результаты элементного анализа хорошо согласовывались с теоретическими вычисленными значениями для соединения (2h).

Вычислено: C 59,88; H 5,80; N 8,06 (в расчете на моногидрат).

Найдено: C 59,86; H 5,74; N 8,00.

Стадия 16

2-{4-[(9R)-9-Гидрокси-2-(3-гидрокси-3-метилбутилокси)-9-(трифторметил)-9H-флуорен-4-ил]-1H-пиразол-1-ил}-2-метилпропанамид (соединение (2))

В моногидрат 2-{4-[(9R)-9-гидрокси-2-(3-гидрокси-3-метилбутилокси)-9-(трифторметил)-9H-флуорен-4-ил]-1H-пиразол-1-ил}-2-метилпропанамида (соединение (2h)) (22,63 г), полученный на предшествующей стадии, добавляли толуол (340 мл). Реакционную смесь перемешивали на масляной бане при температуре 130°C в течение 2 часов в атмосфере азота, удаляя воду с помощью аппарата Дина-Старка. Реакционную смесь дополнительно перемешивали на масляной бане при температуре 70°C в течение 1,5 часов, выдерживали для охлаждения до комнатной температуры и перемешивали в течение ночи. Твердый осадок собирали путем фильтрования и промывали толуолом (100 мл). Полученное твердое вещество высушивали при пониженном давлении при комнатной температуре в течение 3 суток, а затем высушивали при пониженном давлении и температуре 60°C в течение суток, чтобы получить целевое соединение (21,5 г).

ЯМР ¹H (400 МГц, DMSO-D₆) δ: 8,08 (1H, с), 7,66 (1H, с), 7,58-7,56 (1H, м), 7,32-7,30 (1H, м), 7,25-7,22 (4H, м), 7,12 (1H, ш.с), 6,96 (1H, ш.с), 6,87 (1H, д, J=2,3 Гц), 4,38 (1H, с), 4,14 (2H, т, J=7,2 Гц), 1,85 (2H, т, J=7,2 Гц), 1,78 (3H, с), 1,78 (3H, с), 1,17 (6H, с).

Осуществление элементного анализа

Результаты элементного анализа хорошо согласовывались с теоретическими вычисленными значениями для соединения (2).

Вычислено: C 62,02; H 5,61; N 8,35 (в расчете на безводное соединение)

Найдено: C 62,17; H 5,60; N 8,47.

Стадия C-1

Изготовление бромида N-(4-трет-бутилбензил)цинхонидиния

Цинхонидин (10,6 г) растворяли в тетрагидрофуране (200 мл), добавляли 4-трет-бутилбензилбромид (10,1 г) и йодид тетрабутиламмония (0,66 г), и смесь перемешивали при 70°C в течение ночи. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры, твердое вещество собирали путем фильтрования и промывали этилацетатом (50 мл). Полученное твердое вещество высушивали при пониженном давлении в течение ночи, чтобы получить целевое соединение (18,5 г).

ЯМР ¹H (400 МГц, DMSO-D₆) δ: 8,99 (1H, д, J=4,4 Гц), 8,27 (1H, д, J=8,2 Гц), 8,11 (1H, дд, J=8,5, 1,0 Гц), 7,89-7,79 (2H, м), 7,78-7,71 (1H, м), 7,63 (2H, д, J=8,4 Гц), 7,59 (2H, т, J=8,4 Гц), 6,72 (1H, д, J=4,2 Гц), 6,57-6,51 (1H, ш.с), 5,67 (1H, ддд, J=17,0, 10,4, 6,4 Гц), 5,14 (1H, д, J=17,2 Гц), 5,08 (1H, д, J=12,6 Гц), 5,00-4,90 (2H, м), 4,30-4,18 (1H, м), 3,91 (1H, т, J=8,7 Гц), 3,74-3,64 (1H, м), 3,35-3,18 (2H, м), 2,76-2,65 (1H, м), 2,18-1,94 (3H, м), 1,90-1,78 (1H, м), 1,40-1,22 (1H, м), 1,34 (9H, с).

Стадия C-2

Изготовление 4-метоксифеноксида N-(4-трет-бутилбензил)цинхонидиния

Смешивали бромид N-(4-трет-бутилбензил)цинхонидиния (18,5 г), AMBERLYST (зарегистрированный товарный знак) A26 (сильноосновная ионообменная смола, содержащая матрицу из сополимера стирола и дивинилбензола) (18,5 г) и метанол (280 мл), и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Нерастворимый материал отфильтровывали через целит, и промывали метанолом (100 мл). В фильтрат добавляли 4-метоксифенол (4,8 г), и растворитель испаряли. Осадок азеотропно отпаривали трижды толуолом (100 мл), и добавляли толуол (20 мл). Затем каплями добавляли диизопропиловый эфир (200 мл), и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 часов. Твердый осадок собирали путем фильтрования, промывали диизопропиловым эфиром (50 мл), и смесь высушивали при пониженном давлении при комнатной температуре в течение ночи, чтобы получить целевое соединение (21,8 г).

ЯМР ¹H (400 МГц, DMSO-D₆) δ: 8,91 (1H, д, J=4,4 Гц), 8,17 (1H, д, J=8,2 Гц), 8,07 (1H, д, J=8,4 Гц), 7,89 (1H, д, J=4,4 Гц), 7,79 (1H, т, J=7,6 Гц), 7,64 (1H, т, J=7,5 Гц), 7,57-7,52 (5H, м), 6,56-6,55 (2H, м), 6,43-6,42 (3H, м), 5,67-5,59 (1H, м), 5,28 (1H, д, J=12,1 Гц), 5,12 (1H, д, J=17,2 Гц), 4,92 (1H, д, J=10,6 Гц), 4,84 (1H, д, J=12,1 Гц), 4,65-4,53 (1H, м), 3,80 (1H, т, J=8,8 Гц), 3,65-3,63 (1H, м), 3,57 (3H, с), 3,25 (1H, т, J=11,6 Гц), 3,10-3,07 (1H, м), 2,67 (1H, ш.с), 2,07-2,02 (2H, м), 1,95 (1H, ш.с), 1,79-1,76 (1H, ш. м), 1,33 (9H, с), 1,16-1,11 (1H, м).

Стадия D

Изготовление 3-гидрокси-3-метилбутилтолуол-4-сульфоната

В атмосфере азота 3-метилбутан-1,3-диол (300 г) растворяли в пиридине (900 мл), и раствор 4-метилбензолсульфонилхлорида (500 г) в толуоле (900 мл) и ацетонитриле (125 мл) добавляли каплями в течение 2 часов. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 4 часов, добавляли толуол (500 мл) и воду (1800 мл) и выдерживали для разделения слоев. Полученный органический слой промывали последовательно водным раствором серной кислоты и водой (дважды). Растворитель в полученном органическом слое испаряли, и осадок азеотропно отпаривали толуолом (500 мл), чтобы получить целевое соединение (535 г).

ЯМР ¹H (400 МГц, CDCl₃) δ: 7,81-7,76 (2H, м), 7,36-7,31 (2H, м), 4,20 (2H, тд, J=6,8, 1,6 Гц), 2,44 (3H, с), 1,85 (2H, тд, J=6,8, 1,6 Гц), 1,33 (1H, с), 1,21 (6H, с).

Пример 2

Синтез 2-{4-[(9R)-9-гидрокси-2-(4-гидрокси-4-метилпентилокси)-9-(трифторметил)-9H-флуорен-4-ил]-1H-пиразол-1-ил}-2-метилпропанамида (соединение (3))

Стадия 1

Этил-4-[(9R)-4-хлор-9-гидрокси-9-(трифторметил)-9H-флуорен-2-илокси]бутират

(9R)-4-Хлор-9-(трифторметил)-9H-флуорен-2,9-диол (200 мг), полученный на стадии 10 примера 1, растворяли в N,N-диметилформамиде (2 мл), добавляли карбонат калия (185 мг) и этил-4-бромбутират (105 мкл), и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 7 часов. В реакционную смесь добавляли воду, и смесь экстрагировали дважды этилацетатом. Полученный органический слой промывали последовательно водой (дважды) и насыщенным солевым раствором. Полученный органический слой высушивали над безводным сульфатом магния, нерастворимый материал отфильтровывали, и растворитель в фильтрате испаряли. Полученный осадок очищали методом силикагельной колоночной хроматографии (смесь, содержащую гексан и этилацетат, использовали в качестве элюирующего растворителя, сначала элюируя смесью гексана и этилацетата при соотношении компонентов, составляющем 5:1, затем последовательно смесью при соотношении тех же компонентов, составляющем 3:1, и далее смесью при соотношении тех же компонентов, составляющем 2:1), чтобы получить целевое соединение (197 мг).

ЯМР ¹H (400 МГц, CDCl₃) δ: 8,19 (1H, д, J=7,7 Гц), 7,66 (1H, д, J=7,7 Гц), 7,46 (1H, тд, J=7,6, 1,0 Гц), 7,32 (1H, тд, J=7,6, 1,0 Гц), 7,16 (1H, ш.с), 6,93 (1H, д, J=2,1 Гц), 4,14 (2H, к, J=7,1 Гц), 4,05 (2H, т, J=7,1 Гц), 2,82 (1H, с), 2,50 (2H, т, J=7,1 Гц), 2,15-2,06 (2H, м), 1,25 (3H, т, J=7,1 Гц).

Стадия 2

(9R)-4-Хлор-2-(4-гидрокси-4-метилпентилокси)-9-(трифторметил)-9H-флуорен-9-ол

В атмосфере азота этил-4-[(9R)-4-хлор-9-гидрокси-9-(трифторметил)-9H-флуорен-2-илокси]бутират (197 5 мг) растворяли в THF (2 мл), и раствор метиллития в диэтиловом эфире (1,07 М, 2,2 мл) добавляли каплями при 0°C. Реакционную смесь перемешивали при той же температуре в течение 2 часов, вода добавляли, и смесь экстрагировали этилацетатом (дважды). Полученный органический слой промывали последовательно водой (дважды) и насыщенным солевым раствором. Полученный органический слой высушивали над безводным сульфатом магния, нерастворимый материал отфильтровывали, и растворитель в фильтрате испаряли. Полученный осадок очищали методом силикагельной колоночной хроматографии (смесь, содержащую гексан и этилацетат, использовали в качестве элюирующего растворителя, сначала элюируя смесью гексана и этилацетата при соотношении компонентов, составляющем 3:1, затем смесью при соотношении тех же компонентов, составляющем 2:1), чтобы получить целевое соединение (169 мг).

ЯМР ¹H (400 МГц, CDCl₃) δ: 8,19 (1H, д, J=7,7 Гц), 7,66 (1H, д, J=7,7 Гц), 7,47 (1H, тд, J=7,7, 1,0 Гц), 7,32 (1H, тд, J=7,7, 1,0 Гц), 7,17 (1H, ш.с), 6,93 (1H, д, J=2,3 Гц), 4,02 (2H, т, J=6,4 Гц), 2,82 (1H, с), 1,92-1,85 (2H, м), 1,65-1,62 (2H, м), 1,26 (3H, с), 1,25 (3H, с).

Стадия 3

Этил-2-{4-[(9R)-9-гидрокси-2-(4-гидрокси-4-метилпентилокси)-9-(трифторметил)-9H-флуорен-4-ил]-1H-пиразол-1-ил}-2-метилпропионат

В атмосфере аргона (9R)-4-хлор-2-(4-гидрокси-4-метилпентилокси)-9-(трифторметил)-9H-флуорен-9-ол (169 мг) растворяли в 1,4-диоксане (1,5 мл), добавляли этил-2-метил-2-[4-(4,4,5,5-тетраметил[1,3,2]диоксаборолан-2-ил)-1H-пиразол-1-ил]пропионат (194 мг), воду (0,5 мл), трехзамещенный фосфат калия (178 мг), ацетат палладия (9 мг) и SPhos (33 мг), и смесь перемешивали при 100°C в течение 4,5 часов. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры, вода добавляли, и смесь экстрагировали этилацетатом (дважды). Полученный органический слой промывали последовательно водой (дважды) и насыщенным солевым раствором. Полученный органический слой высушивали над безводным сульфатом магния, нерастворимый материал отфильтровывали, и растворитель в фильтрате испаряли. Полученный осадок очищали методом силикагельной колоночной хроматографии (смесь, содержащую гексан и этилацетат при соотношении компонентов, составляющем 1:1 (гексан:этилацетат) использовали в качестве элюирующего растворителя), чтобы получить целевое соединение (218 мг).

ЯМР ¹H (400 МГц, CDCl₃) δ: 7,69 (1H, с), 7,63-7,62 (2H, м), 7,21-7,19 (4H, м), 6,81 (1H, д, J=2,3 Гц), 4,21 (2H, к, J=7,1 Гц), 4,04 (2H, т, J=6,3 Гц), 2,82 (1H, с), 1,92 (3H, с), 1,91 (3H, с), 1,89-1,88 (2H, м), 1,66-1,64 (2H, м), 1,26 (6H, с), 1,26-1,23 (3H, м).

Стадия 4

2-{4-[(9R)-9-Гидрокси-2-(4-гидрокси-4-метилпентилокси)-9-(трифторметил)-9H-флуорен-4-ил]-1H-пиразол-1-ил}-2-метилпропионовая кислота

Этил-2-{4-[(9R)-9-гидрокси-2-(4-гидрокси-4-метилпентилокси)-9-(трифторметил)-9H-флуорен-4-ил]-1H-пиразол-1-ил}-2-метилпропионат (218 мг) растворяли в этаноле (2,2 мл), добавляли водный раствор 4 н гидроксида натрия (320 мкл), и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Реакционную смесь нейтрализовали, используя раствор 1 н хлористоводородной кислоты, и экстрагировали этилацетатом (дважды). Полученный органический слой промывали последовательно водой (дважды) и насыщенным солевым раствором. Полученный органический слой высушивали над безводным сульфатом магния, нерастворимый материал отфильтровывали, и растворитель в фильтрате испаряли, чтобы получить целевое соединение (179 мг).

ЯМР ¹H (400 МГц, CDCl₃) δ: 7,73 (1H, с), 7,68 (1H, с), 7,63-7,62 (1H, м), 7,23-7,09 (4H, м), 6,78 (1H, д, J=2,6 Гц), 4,02 (2H, т, J=6,3 Гц), 1,93 (6H, с), 1,89-1,86 (2H, м), 1,65-1,61 (2H, м), 1,25 (6H, с).

Стадия 5

2-{4-[(9R)-9-Гидрокси-2-(4-гидрокси-4-метилпентилокси)-9-(трифторметил)-9H-флуорен-4-ил]-1H-пиразол-1-ил}-2-этилпропанамид (соединение (3))

В атмосфере азота 2-{4-[(9R)-9-гидрокси-2-(4-гидрокси-4-метилпентилокси)-9-(трифторметил)-9H-флуорен-4-ил]-1H-пиразол-1-ил}-2-метилпропионовая кислота (89 мг) растворяли в N,N-диметилформамиде (I мл), добавляли хлорид аммония (28 мг), N,N-диизопропилэтиламин (148 мкл) и гексафторфосфат 1-[бис(диметиламино)метилен]-1H-1,2,3-триазоло [4,5-b]пиридин-1-ий-3-оксида (HATU) (99 мг), и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. В реакционную смесь добавляли воду, и смесь экстрагировали этилацетатом (дважды). Полученный органический слой промывали последовательно разбавленным солевым раствором (дважды) и насыщенным солевым раствором. Полученный органический слой высушивали над безводным сульфатом магния, нерастворимый материал отфильтровывали, и растворитель в фильтрате испаряли. Полученный осадок очищали методом силикагельной тонкослойной хроматография (смесь, содержащую хлороформ и метанол при соотношении компонентов, составляющем 9:1 (хлороформ:метанол) использовали в качестве элюирующего растворителя), чтобы получить целевое соединение (48 мг, оптическая чистота (энантиомерный избыток 96,9%). оптическая чистота определяли методом ВЭЖХ в условиях анализа 2. Время удерживания формы (R) 13,0 минут, время удерживания формы (S) составляло 14,4 минут. Удельное оптическое вращение [α]_D составляло +37,5° (c=1,04 MeOH при 25°C).

ЯМР ¹H (400 МГц, DMSO-D₆) δ: 8,07 (1H, с), 7,66 (1H, с), 7,57-7,55 (1H, м), 7,34-7,31 (1H, м), 7,24-7,23 (3H, м), 7,18 (1H, с), 7,11 (1H, ш.с), 6,94 (1H, ш.с), 6,86 (1H, д, J=2,3 Гц), 4,16 (1H, с), 4,03 (2H, т, J=6,5 Гц), 1,80 (3H, с), 1,79 (3H, с), 1,80-1,75 (2H, м), 1,51-1,47 (2H, м), 1,11 (6H, с).

Пример изготовления кристаллов соединения (3)

В соединение (3) (40 мг), синтезированное на стадиях приведенного выше примера, добавляли 0,5 мл смеси, содержащей метанол (MeOH) и воду при объемном соотношении 1:3. После этого в данный раствор добавляли кристалл (0,5 мг) соединения (2h), и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 суток. Твердый осадок собирали путем фильтрования, получая кристалл (41 мг) соединения (3).

Изготовление соединений (A), (B), (C) и (D)

Соединение (A), соединение (B), соединение (C) и соединение (D), которые представляют следующие формулы, в каждом случае получали в оптически активной форме, осуществляя способ изготовления, описанный в международной патентной заявке WO 2010/041748.

Соединение (A)

2-(4-{(9R)-9-Гидрокси-2-[2-(3-гидроксиадамантан-1-ил)этокси]-9-(трифторметил)-9H-флуорен-4-ил}-1H-пиразол-1-ил)ацетамид

Соединение (B)

(9R)-2-(2-Гидрокси-2-метилпропокси)-4-(1-метил-1H-пиразол-4-ил)-9-(трифторметил)-9H-флуорен-9-ол

Соединение (C)

(9R)-4-[1-(2-Гидроксиэтил)-1H-пиразол-4-ил]-2-(2-гидрокси-2-метилпропокси)-9-(трифторметил)-9H-флуорен-9-ол

Соединение (D)

2-{4-[(9R)-2-Фтор-9-гидрокси-9-(трифторметил)-9H-флуорен-4-ил]-1H-пиразол-1-ил}-2-метилпропанамид

В качестве примерной композиции согласно настоящему изобретению, может быть упомянута следующая композиция. Однако настоящее изобретение не ограничивается данными примерными композициями.

Примерная композиция 1 (изготовление капсулы)

1) соединение согласно примеру 1 (соединение (2))	30 мг
2) микрокристаллическая целлюлоза	10 мг
3) лактоза	19 мг
4) стеарат магния	1 мг

Материалы 1), 2), 3) и 4) смешиваются и заполняют желатиновую капсулу.

Примерная композиция 2 (изготовление таблетки)

1) соединение согласно примеру 1 (соединение (2)) 10 г
2) лактоза
3) кукурузный крахмал
4) кармеллоза кальция
5) стеарат магния

Все количество материалов 1), 2), 3) и 30 г материала 4) смешивают с водой, высушивают в вакууме и просеивают. Просеянный порошок смешивают с 14 г материала 4) и 1 г материала 5), и из смеси штампуют таблетки, используя соответствующее устройство. Таким образом, получают 1000 таблеток, каждая из которых содержит 10 мг соединения согласно примеру 1 (соединение (2)).

Экспериментальный пример 1: ингибирующее действие в отношении активности PDHK в лабораторных условиях

Ингибирующее действие в отношении активности PDHK оценивали косвенно посредством измерения остаточной активности PDH после реакции киназы в присутствии исследуемого соединения.

Ингибирующее действие в отношении активности PDHK1

В случае PDHK1 человека (hPDHK1, учетный номер в генетическом банке L42450.1) содержащий 1,3 тысяч пар нуклеотидов фрагмент, кодирующий данный белок, выделяли из комплементарной ДНК печени человека посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР). Модифицированную комплементарную ДНК hPDHK1, в которой последовательность маркера FLAG присоединялась к концевому атому N, изготавливали посредством ПЦР и клонировали в вектор (pET17b-Novagen). Рекомбинантную структуру преобразовывали в кишечную палочку (Escherichia coli) (DH5α-TOYOBO). Рекомбинантные клоны идентифицировали, и плазмидную ДНК выделяли и подвергали анализу последовательности ДНК. Один клон, который имел ожидаемую последовательность нуклеиновых кислот, был выбран для исследования экспрессии.

Для экспрессии активности hPDHK1 клетки штамма BL21(DE3) Escherichia coli (Novagen) преобразовывали, используя содержащую вектор pET17b комплементарную ДНК модифицированного hPDHK1. Клетки Escherichia coli выращивали до оптической плотности 0,6 (600 нмоль/л) при 30°C. Экспрессию белка индуцировали посредством добавления 500 мкмоль/л изопропил-β-тиогалактопиранозида. Escherichia coli культивировали при 30°C в течение 5 часов и выделяли посредством центрифугирования. Повторное суспендирование пасты Escherichia coli нарушали, используя микрофлюидайзер. Содержащий маркер FLAG белок очищали, используя аффинный гель FLAG (Sigma).

Гель промывали раствором 20 ммоль/л HEPES-NaOH (N-(2-гидроксиэтил)пиперазин-N’-2-этансульфоновая кислота - гидроксида натрия), 500 ммоль/л хлорида натрия, 1% этиленгликоля и 0,1% блок-сополимера полиоксиэтилена и полиоксипропилена (Pluronic F-68, pH 8,0), и связующий белок элюировали раствором 20 ммоль/л HEPES-NaOH, 100 мкг/мл пептида FLAG, 500 ммоль/л хлорида натрия, 1% этиленгликоля и 0,1% Pluronic F-68 (pH 8,0).

Элюированные фракции, включающие содержащий маркер FLAG белок, объединяли, подвергали диализу против раствора 20 ммоль/л HEPES-NaOH, 150 ммоль/л хлорид натрия, 0,5 ммоль/л этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA), 1% этиленгликоля и 0,1% Pluronic F-68 (pH 8,0) и сохраняли при -80°C. При исследовании концентрация фермента hPDHK1 находилась на минимальном уровне, показывая ингибирование активности PDH более чем на 90%.

Смешивали 0,05 Е/мл PDH (комплекс PDH сердца свиньи, Sigma P7032) и 1,0 мкг/мл hPDHK1 в буферном растворе (50 ммоль/л 3-морфолинопропан сульфоновой кислоты (pH 7,0), 20 ммоль/л гидрофосфата калия, 60 ммоль/л хлорида калия, 2 ммоль/л хлорида магния, 0,4 ммоль/л EDTA, 0,2% Pluronic F-68, 2 ммоль/л дитиотреитола), и смесь инкубировали при 4°C в течение ночи, чтобы получить комплекс PDH/hPDHK1.

Исследуемые соединения разбавляли диметилсульфоксидом (DMSO). Комплекс PDH/hPDHK1 (20 мкл), исследуемое соединение (1,5 мкл) и 3,53 мкмоль/л ATP (разбавленный буферным раствором, 8,5 мкл) помещали на половину площади 96-луночного прозрачного для ультрафиолетового излучения микропланшета (Corning 3679), и реакцию PDHK осуществляли при комнатной температуре в течение 45 минут. В контрольные лунки вместо исследуемого соединения помещали DMSO (1,5 мкл). Чтобы определить максимальную скорость реакции PDH, в холостые лунки вместо исследуемого соединения помещали DMSO (1,5 мкл) добавляли при отсутствии hPDHK1.

После этого добавляли 10 мкл субстратов (5 ммоль/л пирувата натрия, 2 ммоль/л кофермента A, 12 ммоль/л NAD, 5 ммоль/л тиаминпирофосфата, разбавленного буферным раствором). Смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 90 минут, и измеряли остаточную активность PDH.

Поглощение при 340 нм до и после реакции PDH измеряли, используя устройство для считывания микропланшета, чтобы определить NADH, образующийся в результате реакции PDH. степень ингибирования hPDHK1 (%) для исследуемого соединения вычисляли по формуле [{(активность PDH для исследуемого соединения - активность PDH для контроля)/активность PDH для холостого образца - активность PDH для контроля)}×100]. значение IC₅₀ вычисляли по концентрациям исследуемого соединения в двух точках, включающих 50% ингибирование активности hPDHK1.

Результаты, полученные с использованием соединения (2), соединения (2h) и соединения (3) в качестве исследуемых соединений, представлены в следующей таблице 1.

Ингибирующее действие в отношении активности PDHK2

В случае PDHK2 человека (hPDHK2, учетный номер в генетическом банке BC040478.1), модифицированную комплементарную ДНК hPDHK2, в котором последовательность маркера FLAG присоединялась к концевому атому N клона комплементарной ДНК hPDHK2 (pReceiver-M01/PDK2-GeneCopoeia) изготавливали посредством ПЦР и клонировали в вектор (pET17b-Novagen). Рекомбинантная структура преобразовывалась в Escherichia coli (DH5α-TOYOBO). Были определены рекомбинантные клоны, и плазмидную ДНК выделяли и подвергали анализу последовательности ДНК. Один клон, который имел ожидаемую последовательность нуклеиновой кислоты, был выбран для исследования экспрессии.

Для экспрессии активности hPDHK2 клетки штамма BL21(DE3) Escherichia coli (Novagen) преобразовывали, используя вектор pET17b, содержащий модифицированную комплементарную ДНК hPDHK2. Клетки Escherichia coli выращивали до оптической плотности 0,6 (600 нмоль/л) при 30°C. Экспрессию белка индуцировали добавлением 500 мкмоль/л изопропил-β-тиогалактопиранозида. Escherichia coli культивировали при 30°C в течение 5 часов и выделяли путем центрифугирования.

Повторное суспендирование пасты Escherichia coli нарушали, используя микрофлюидайзер. Содержащий маркер FLAG белок очищали, используя аффинный гель FLAG. Гель промывали раствором 20 ммоль/л HEPES-NaOH, 500 ммоль/л хлорида натрия, 1% этиленгликоля и 0,1% Pluronic F-68 (pH 8,0), и связующий белок элюировали раствором 20 ммоль/л HEPES-NaOH, 100 мкг/мл пептида FLAG, 500 ммоль/л хлорида натрия, 1% этиленгликоля и 0,1% Pluronic F-68 (pH 8,0). Элюированные фракции, включающие содержащий маркер FLAG белок, объединяли, подвергали диализу против раствора 20 ммоль/л HEPES-NaOH, 150 ммоль/л хлорида натрия, 0,5 ммоль/л EDTA, 1% этиленгликоль и 0,1% Pluronic F-68 (pH 8,0) и сохраняли при -80°C. При исследовании концентрация фермента hPDHK2 находилась на минимальном уровне, показывая ингибирование активности PDH более чем на 90%.

Смешивали 0,05 Е/мл PDH и 0,8 мкг/мл hPDHK2 в буферном растворе (50 ммоль/л 3-морфолинопропансульфоновой кислоты (pH 7,0), 20 ммоль/л гидрофосфата калия, 60 ммоль/л хлорида калия, 2 ммоль/л хлорида магния, 0,4 ммоль/л EDTA и 0,2% Pluronic F-68, 2 ммоль/л дитиотреитола), и смесь инкубировали при 4°C в течение ночи, чтобы получить комплекс PDH/hPDHK2. Исследуемые соединения разбавляли DMSO. Комплекс PDH/hPDHK2 (20 мкл), исследуемое соединение (1,5 мкл) и 3,53 мкмоль/л ATP (разбавленный буферным раствором, 8,5 мкл) помещали на половину площади 96-луночного прозрачного для ультрафиолетового излучения микропланшета (Corning 3679), и реакцию PDHK осуществляли при комнатной температуре в течение 45 минут. В контрольные лунки вместо исследуемого соединения помещали DMSO (1,5 мкл). Чтобы определить максимальную скорость реакции PDH, в холостые лунки вместо исследуемого соединения помещали DMSO (1,5 мкл) добавляли при отсутствии hPDHK2. После этого добавляли 10 мкл субстратов (5 ммоль/л пирувата натрия, 2 ммоль/л кофермента A, 12 ммоль/л NAD, 5 ммоль/л тиаминпирофосфата, разбавленного буферным раствором). Смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 90 минут, и измеряли остаточную активность PDH. Поглощение при 340 нм до и после реакции PDH измеряли, используя устройство для считывания микропланшета, чтобы определить NADH, образующийся в результате реакции PDH. степень ингибирования hPDHK2 (%) для исследуемого соединения вычисляли по формуле [{(активность PDH для исследуемого соединения - активность PDH для контроля)/активность PDH для холостого образца - активность PDH для контроля)}⋅100]. значение IC₅₀ вычисляли по концентрациям исследуемого соединения в двух точках, включающих 50% ингибирование активности hPDHK2.

Результаты, полученные с использованием соединения (2), соединения (2h), соединения (3), соединения (A), соединения (B), соединения (C) и соединения (D) в качестве исследуемых соединений, представлены в следующей таблице 1.

Таблица 1
Соединение	hPDHK1 IC50 (мкмоль/л)	hPDHK2 IC50 (мкмоль/л)
Соединение (2)	0,0047	0,0046
Соединение (2h)	0,0066	0,0049
Соединение (3)	0,0035	0,0042
Соединение (A)	- (не исследовано)	0,0051
Соединение (B)	- (не исследовано)	0,0074
Соединение (C)	- (не исследовано)	0,0067
Соединение (D)	- (не исследовано)	0,0051

Экспериментальный пример 2: исследование активации PDH вне организма

Методика эксперимента

Оценивали воздействие исследуемого соединения на активность PDH ткани. Образование NADH определяли, используя сопряженную систему п-йоднитротетразолия фиолетового (INT), чтобы измерять активность PDH.

Здоровых самцов крыс линии Спрага-Доули (Sprague-Dawley) случайным образом распределяли в группу, получающую растворитель, и в группы, получающие исследуемые соединения. Крысам перорально вводили растворитель (водный раствор 0,5% метилцеллюлозы, 5 мл/кг) или исследуемое соединение. Через 5 или 20 часов после введения крыс усыпляли внутриперитонеальной инъекцией пентобарбитала натрия (60 мг/кг) и получали срезы печени и эпидидимальные жировые ткани.

К срезам печени быстро добавляли 9-кратный объем охлажденного льдом гомогенизационного буферного раствора (0,25 моль/л сахарозы, 5 ммоль/л трис(гидроксиметил)аминометангидрохлорида (pH 7,5), 2 ммоль/л EDTA), и смеси гомогенизировали, используя гомогенизатор Polytron. Продукты гомогенизации центрифугировали при ускорении 600 g и температуре 4°C в течение 10 минут, чтобы получить надосадочную жидкость. Надосадочные жидкости (1 мл) центрифугировали при ускорении 16000 g и температуре 4°C в течение 10 минут, чтобы получить осадки. Осадки промывали посредством повторного суспендирования в гомогенизационном буферном растворе (1 мл) и центрифугировали в таких же условиях. Осадки замораживали жидким азотом и хранили при -80°C в качестве митохондриальной фракции печени.

К жировым тканям быстро добавляли 3-кратный объем охлажденного льдом гомогенизационного буферного раствора, и смеси гомогенизировали, используя гомогенизатор Polytron. Продукты гомогенизации центрифугировали при ускорении 600 g и температуре 4°C в течение 10 минут, чтобы получить надосадочную жидкость. Надосадочные жидкости (1 мл) центрифугировали при ускорении 16000 g и температуре 4°C в течение 10 минут, чтобы получить осадки. Осадки промывали посредством повторного суспендирования в гомогенизационном буферном растворе (1 мл) и центрифугировали в таких же условиях. Осадки замораживали жидким азотом и хранили при -80°C в качестве митохондриальной фракции жировой ткани.

Митохондриальные фракции размораживали и суспендировали в буферном растворе для образцов (0,25 моль/л сахарозы, 20 ммоль/л трис(гидроксиметил)аминометангидрохлорида (pH 7,5), 50 ммоль/л хлорида калия и 1 мл/л 4-(1,1,3,3-тетраметилбутил)фенилполиэтиленгликоля (Triton X-100)). Измеряли активность активных веществ в отношении PDH (активность PDHa) и суммарную активность PDH (активность PDHt), чтобы оценить активность PDH. Для измерения активности PDHt смешивали в равных количествах митохондриальную суспензию и активирующий буферный раствор (0,25 моль/л сахарозы, 20 ммоль/л трис(гидроксиметил)аминометангидрохлорида (pH 7,5), 50 ммоль/л хлорида калия, 1 мл/л Triton X-100, 4 ммоль/л хлорида кальция, 40 ммоль/л хлорида магния, 10 ммоль/л дихлорацетата натрия), и смеси инкубировали при 37°C в течение 10 минут. По 40 мкл митохондриальных суспензий разбавляли буферным раствором для образцов и помещали в 96-луночный микропланшет для измерения активности и холостого измерения. После этого в каждую лунку помещали по 180 мкл реакционной смеси (0,056 ммоль/л буферного раствора на основе фосфата калия (pH 7,5), 5,6 ммоль/л DL-карнитина, 2,8 ммоль/л NAD, 0,22 ммоль/л тиаминпирофосфата, 0,11 ммоль/л кофермента A, 1,1 мл/л Triton X-100, 1,1 ммоль/л хлорида магния, 1,1 г/л бычьего сывороточного альбумина, 0,67 ммоль/л INT, 7,2 мкмоль/л феназинметосульфата, 28 ммоль/л оксамата натрия), а затем добавляли по 20 мкл раствора 50 ммоль/л пирувата натрия для измерения активности или воды для холостого измерения. Смеси инкубировали при комнатной температуре в условиях затенения. Поглощение в диапазоне от 500 до 750 нм, который соответствовал восстановлению INT как конечного акцептора электронов, измеряли с течением времени, используя устройство для считывания микропланшета, и вычисляли изменение поглощения. Активность PDH вычисляли, вычитая изменение поглощения холостой лунки из изменение поглощения лунки для измерения активности. Вычисляли процентное соотношение активности PDHa и активности PDHt, которое принимали в качестве показателя активации PDH.

Результаты, полученные с использованием соединения (2h), соединения (3), соединения (A), соединения (B), соединения (C) и соединения (D) в качестве исследуемых соединений, представлены в следующей таблице 2, на фиг. 1 (печень) и фиг. 2 (жировая ткань). Кроме того, результаты, полученные с использованием соединения (2), представлены в следующей таблице 3.

Таблица 2
Соединение	Активность PDHa (% активности PDHt)
	Печень	Жировая ткань
	5 часов	20 часов	5 часов	20 часов
Растворитель	3 мг/кг	Растворитель	3 мг/кг	Растворитель	3 мг/кг	Растворитель	3 мг/кг
Соединение (2h)	13±3	59±6	13±3	31±5	31±10	59±2	31±10	44±12
Соединение (3)	13±3	56±8	13±3	32±9	31±10	70±9	31±10	42±3
Соединение (A)	13±3	35±6	13±3	16±10	31±10	32±14	31±10	24±7
Соединение (В)	13±3	43±7	13±3	10±3	31±10	59±5	31±10	30±4
Соединение (С)	13±3	44±5	13±3	13±3	31±10	53±4	31±10	28±7
Соединение (D)	13±3	41±15	13±3	20±1	31±10	43±7	31±10	24±3
Среднее значение ± среднеквадратическое отклонение (n=3)

Таблица 3
Соединение	Активность PDHa (% активности PDHt)
	Печень	Жировая ткань
	5 часов	20 часов	5 часов	20 часов
Растворитель	3 мг/кг	Растворитель	3 мг/кг	Растворитель	3 мг/кг	Растворитель	3 мг/кг
Соединение (2)	28±6	74±12	28±6	50±16	42±4	88±11	42±4	61±15
Среднее значение ± среднеквадратическое отклонение (n=3)

Экспериментальный пример 3: воздействие повторного введение исследуемого соединения на HbA1с крыс ZDF

Методика эксперимента

Страдающие диабетом жирные крысы линии Zucker (ZDF, самцы в возрасте 7 недель, Charles River Laboratories Japan Inc.) в качестве модельных животных для исследования диабета второго типа, которые получали очищенную диету (диета с содержанием 5,9% жира, Oriental Yeast Co., Ltd.), были распределены в получающую растворитель группу и группы исследуемых соединений таким образом, что отсутствовали отклонения уровней глюкозы и инсулина в плазме, уровней гликированного гемоглобина (HbA1c) и массы тела. Повторные пероральные дозы исследуемого соединения (1 мг/кг/5 мл) вводили крысам один раз в сутки за 3 часа до начала темного периода. Водный раствор 0,5% метилцеллюлозы перорально вводили таким же образом крысам получающей растворитель группы. На 14 день после введения отбирали образцы крови из хвостовой вены, и измеряли уровень HbA1c (%). Статистический анализ осуществляли, используя критерий Даннетта (Dunnett). Величины p<0,05 считались статистически значимыми.

Результаты, полученные с использованием соединения (2) и соединения (3) в качестве исследуемых соединений, представлены в следующей таблице 4.

Таблица 4
Соединение	HbA1c (%)
Растворитель	1 мг/кг
Соединение (2)	3,6±0,3	3,2±0,1*
Соединение (3)	3,7±0,2	3,4±0,1*
На 14 день после введения Среднее значение ± среднеквадратическое отклонение (n=10) *p<0,05 по сравнению с получающей растворитель группой (критерий Даннетта)

Экспериментальный пример 4: исследование цельноклеточной фиксации потенциала hERG (ген альфа-субъединицы калиевого канала сердца человека)

Методика эксперимента

Используя трансфицированные hERG (ген альфа-субъединицы калиевого канала сердца человека) клетки HEK293 (Cytomyx Limited), воздействие на ток hERG исследовали методом цельноклеточной фиксации потенциала. Трансфицированные hERG клетки HEK293 пересеивали, используя углекислотный инкубатор (BNA-111, Tabai Espec Corp.) в условиях температуры 37°C, содержания 5% CO₂ и насыщенной влажности. Используемые для культуры контейнеры представляли собой покрытая коллагеном первого типа колба объемом 75 см² (4123-010, AGC Techno Glass Co., Ltd.) и покрытая коллагеном первого типа чашка для культивирования диаметром 35 мм (4000-010, AGC Techno Glass Co., Ltd.). Используемую для культивирования среду представляла собой E-MEM (минимальная эссенциальная среда Игла (Eagle) (соли Эрла (Earle), биомедицинская лаборатория Nikken), в которую добавляли 10% FCS (эмбриональная телячья сыворотка, BioWest, L.L.C.) и раствор 1% заменимых аминокислот MEM (NEAA, Invitrogen Corporation). В смесь добавляли генетицин для выбора проявляющих экспрессию гена hERG клеток в концентрации 400 мкг/мл. В качестве клеток для измерения 3×10⁴ трансфицированных hERG клеток HEK293 помещали на чашку для культивирования диаметром 35 мм и выдерживали в течение от 4 до 7 суток перед измерением тока hERG. Чашка для культивирования, изготовленная для измерения, содержала вышеупомянутую среду для культивирования без генетицина (Invitrogen Corporation).

Максимальную оценочную концентрацию каждого соединения определяли по максимальной концентрации, при которой не обнаруживался осадок в стандартной межклеточной жидкости (раствор, содержащий 140 ммоль/л NaCl, 2,5 ммоль/л KCl, 2 ммоль/л MgCl₂, 2 ммоль/л CaCl₂, 10 ммоль/л HEPES, 10 ммоль/л глюкозы и доведенный до pH 7,4 основанием Tris). Что касается способа нанесения, каждый наносимый раствор выпускали из вилкообразной трубки, у которой наконечник имел диаметр, составляющий приблизительно 0,25 мм, и находился от клеток на расстоянии, составляющем приблизительно 2 мм, и наносили на клетки. Скорость выпуска составляла приблизительно 0,4 мл/мин.

Эксперимент осуществляли при комнатной температуре, используя фазово-контрастный микроскоп. Клетки помещали в чашку для культивирования диаметром 35 мм, которую устанавливали на измерительный прибор, и стандартную межклеточную жидкость непрерывно наносили на клетки из вилкообразной трубки. Стеклянный электрод для измерения заполняла внутриклеточная жидкость (раствор, содержащий 130 ммоль/л глюконата калия, 20 ммоль/л KCl, 1 ммоль/л MgCl₂, 5 ммоль/л ATP-Mg:,3,5 ммоль/л этиленгликольтетрауксусной кислоты (EGTA),10 ммоль/л HEPES и доведенный до pH 7,2 основанием Tris). Клетки исследовали, используя традиционный способ цельноклеточной фиксации потенциала, и рабочий электрический потенциал составлял -80 мВ. В условиях фиксированного электрического потенциала цельноклеточный ток усиливали, используя для фиксации потенциала усилитель (AXOPATCH-200B, Axon Instruments, Inc.), и данные загружали в компьютер (IMC-P642400, Intermedical Co., Ltd.), используя программное обеспечение для анализа собираемых данных (pCLAMP 9,2, Axon Instruments, Inc.).

Измерение тока hERG осуществляли на следующих двух стадиях. В обоих случаях ток hERG инициировали, задавая управляющий потенциал (рабочий электрический потенциал -80 мВ, подготовительный импульс +20 мВ, 1,5 с, испытательный импульс -50 мВ, 1,5 с).

Стадия (1): вышеупомянутый управляющий потенциал задавали при 0,1 Гц в течение 2 минут.

Стадия (2): вышеупомянутый управляющий потенциал подвергали вычету P/3 по программе pCLAMP 9.2, чтобы устранить ток утечки. Эту операцию повторяли три раза, и полученное среднее значение принимали как ток hERG.

После стадии (1) осуществляли стадию (2) (в течение приблизительно 3 минут), и максимальный следовой ток, полученный путем приложения испытательного импульса к току hERG, полученному посредством стадии (2), принимали в качестве значения тока hERG. После этого операции (1) и (2) поочередно повторяли до завершения эксперимента и измеряли значение тока hERG.

Устойчивое значение тока hERG регистрировали три раза (в течение приблизительно 10 минут), и стандартную межклеточную жидкость немедленно заменяли каждой наносимой жидкостью. Значение тока hERG измеряли три раза (в течение приблизительно 10 минут) одинаковым способом в процессе перфузии наносимой жидкости, и значение тока, полученное в результате третьего измерения, принимали в качестве значения тока hERG после перфузии наносимой жидкости.

Данные для каждой клетки преобразовывали в относительное значение, используя среднее из трех значений тока hERG, измеренных в течение приблизительно 10 минут перед перфузией наносимой жидкости (предварительное значение) как 100%. Это значение измеряли для двух клеток, и вычисляли соответствующее среднее значение как относительный ток (%).

Относительный ток (%)=100×A/B

A: значение тока hERG после перфузии наносимой жидкости

B: среднее из трех значений тока hERG, измеренных в течение приблизительно 10 минут перед перфузией наносимой жидкости (предварительное значение)

Кроме того, степени подавления для группы DMSO вычисляли по следующей формуле:

Степень подавления (%)=100-(C/D)×100

C: средние значения относительного тока (%) для соответствующих групп, получающих исследуемые соединения

D: среднее значение относительного тока (%) в группе, получающей DMSO

Результаты, полученные с использованием соединения (2), соединения (3), соединения (A), соединения (B), соединения (C) и соединения (D) в качестве исследуемых соединений, представлены в следующей таблице 5.

Таблица 5
Исследуемое соединение	Концентрация(a) (мкмоль/л)	Степень ингибирования (%)	Значение IC50 (мкмоль/л)
Соединение (2)	30	24,4	>30
Соединение (3)	30	27,3	>30
Соединение (A)	10	11,8	>10
Соединение (B)	1	17,4	3,6
10	72,9
Соединение (C)	3	11,5	13,2
30	69,0
Соединение (D)	3	9,4	14,2
30	67,5
(a) Максимальную оценочную концентрацию каждого соединения устанавливали по максимальной концентрации, при которой не обнаруживалось осаждение в стандартной межклеточной жидкости.

Экспериментальный пример 5: исследование метаболической устойчивости в микросоме печени

Методика эксперимента

Микросому печени человека (производитель Xenotech, H0620, конечная концентрация (после разбавления), 0,2 мг белка/мл) суспендировали в буферном растворе 100 мМ фосфата калия (pH 7,4), содержащем 1,3 мМ β-никотинамидадениндинуклеотидфосфата, 3,3 мМ D-глюкоза-6-фосфата, 3,3 мМ хлорида магния, 0,45 Е/мл глюкоза-6-фосфатдегидрогеназы), а затем смешивали с исследуемым соединением, растворенным в смеси MeCN/DMSO (95/5) (конечная концентрация 5 мкл). Смесь инкубировали при 37°C в течение 10 минут и 60 минут, добавляли ацетонитрил, содержащий муравьиную кислоту (конечная концентрация 0,1%), и смесь центрифугировали. Исследуемое соединение (немодифицированное) в надосадочной жидкости измеряли, используя жидкостной хроматомасс-спектрометр высокого разрешения (ЖХ/МС), жидкостной хроматограф Acquity UPLC, масс-спектрометр, с квадрупольным детектором SQ или детектором TQ (производитель Waters). Используя полученные измеренные значения, вычисляли остаточное соотношение (%).

Результаты, полученные с использованием соединения (2), соединения (3), соединения (A), соединения (B), соединения (C) и соединение (D) в качестве исследуемых соединений, представлены в следующей таблице 6.

Таблица 6
Исследуемое соединение	Устойчивость в микросоме печени (остаточное соотношение %)
	человек	крыса
10 минут	60 минут	10 минут	60 минут
Соединение (2)	98,8	96,5	98,8	100,0
Соединение (3)	98,4	85,9	102,7	95,8
Соединение (A)	34,8	0,0	24,8	0,0
Соединение (B)	98,0	88,2	101,1	92,1
Соединение (C)	94,0	75,1	94,2	85,3
Соединение (D)	105,4	101,5	105,2	105,1

Промышленная применимость

Поскольку соединение согласно настоящему изобретению или соответствующая фармацевтически приемлемая соль проявляет активность в качестве ингибитора PDHK, они являются пригодными для применения в качестве активного ингредиента средства для профилактики или лечения таких заболеваний, как диабет (диабет первого типа, диабет второго типа и т.д.), синдром инсулинорезистентности, метаболический синдром, гипергликемия, гиперлактацидемия, диабетические осложнения (диабетическая невропатия, диабетическая ретинопатия, диабетическая нефропатия, катаракта и т.д.), сердечная недостаточность (острая сердечная недостаточность, хроническая сердечная недостаточность), кардиомиопатия, ишемия миокарда, инфаркт миокарда, стенокардия, дислипидемия, атеросклероз, болезнь периферических артерий, перемежающаяся хромота, хроническое обструктивное заболевание легких, ишемия головного мозга, апоплексия головного мозга, митохондриальное заболевание, митохондриальная энцефаломиопатия, рак, легочная гипертензия или болезнь Альцгеймера.

1. Соединение, представленное формулой [I]:

в которой n составляет 1 или 2,

или соответствующая фармацевтически приемлемая соль.

2. Соединение, представленное формулой [II] или [IIh]

3. Соединение по п. 2, которое представлено формулой [II]:

4. Соединение по п. 2, которое представлено формулой [IIh]:

5. Соединение, представленное формулой [III]:

6. Фармацевтическая композиция, ингибирующая PDHK, содержащая соединение по любому из пп.1-5 или соответствующую фармацевтически приемлемую соль и фармацевтически приемлемый носитель.

7. Ингибитор PDHK, содержащий соединение по любому из пп.1-5 или соответствующую фармацевтически приемлемую соль.

8. Ингибитор PDHK1, содержащий соединение по любому из пп.1-5 или соответствующую фармацевтически приемлемую соль.

9. Ингибитор PDHK2, содержащий соединение по любому из пп.1-5 или соответствующую фармацевтически приемлемую соль.

10. Гипогликемическое средство, содержащее соединение по любому из пп.1-5 или соответствующую фармацевтически приемлемую соль.

11. Снижающее уровень молочной кислоты средство, содержащее соединение по любому из пп.1-5 или соответствующую фармацевтически приемлемую соль.

12. Средство для профилактики или лечения таких заболеваний, как диабет, синдром инсулинорезистентности, метаболический синдром, гипергликемия, гиперлактацидемия, диабетические осложнения, сердечная недостаточность, кардиомиопатия, ишемия миокарда, инфаркт миокарда, стенокардия, дислипидемия, атеросклероз, болезнь периферических артерий, перемежающаяся хромота, хроническое обструктивное заболевание легких, ишемия головного мозга, апоплексия головного мозга, митохондриальное заболевание, митохондриальная энцефаломиопатия, рак или легочная гипертензия, которое содержит соединение по любому из пп.1-5 или соответствующую фармацевтически приемлемую соль.

13. Профилактическое или лекарственное средство по п. 12, в котором диабет представляет собой диабет первого типа или диабет второго типа.

14. Профилактическое или лекарственное средство по п. 12, в котором диабетические осложнения выбираются из группы, которую составляют диабетическая невропатия, диабетическая ретинопатия, диабетическая нефропатия и катаракта.

15. Профилактическое или лекарственное средство по п.12, в котором сердечная недостаточность представляет собой острую сердечную недостаточность или хроническую сердечную недостаточность.