Стандартный образец содержания анти-а и анти-в гемагглютининов в препаратах крови человека

Изобретение относится к медицине, а именно к трансфузиологии, и может быть использовано для определения содержания анти-А и анти-В гемагглютининов в препаратах крови человека в реакции прямой гемагглютинации и реакции непрямой гемагглютинации. Для этого набор содержит пять компонентов, представляющих собой растворы иммуноглобулинов человека. Положительный компонент А с аттестованным содержанием анти-А гемагглютининов в диапазоне от 1:16 до 1:64 и аттестованным содержанием белка не менее 30 мг/мл, полученный из плазмы крови доноров I(0) группы крови. Положительный компонент В с аттестованным содержанием анти-В гемагглютининов в диапазоне от 1:16 до 1:64 и аттестованным содержанием белка не менее 30 мг/мл, полученный из плазмы крови доноров I(0) группы крови. Отрицательный компонент с аттестованным содержанием анти-А и анти-В гемагглютининов в количестве, соответствующем разведению не более 1:2, и аттестованным содержанием белка не менее 30 мг/мл, полученный из плазмы крови доноров IV(АВ) группы крови. Компонент с лимитом содержания анти-А гемагглютининов с аттестованным содержанием анти-А гемагглютининов в количестве, соответствующем разведению 1:64, и аттестованным содержанием белка не менее 30 мг/мл, полученный из плазмы крови доноров I(0) группы крови. Компонент с лимитом содержания анти-В гемагглютининов с аттестованным содержанием анти-В гемагглютининов в количестве, соответствующем разведению 1:64, и аттестованным содержанием белка не менее 30 мг/мл, полученный из плазмы крови доноров I(0) группы крови. Использование данного изобретения позволяет получить стандартный образец содержания анти-А и анти-В гемагглютининов для применения в реакции прямой гемагглютинации и реакции непрямой гемагглютинации для оценки качества препаратов крови. 14 пр., 5 табл.

 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к стандартным образцам, предназначенным для определения содержания анти-А и анти-В гемагглютининов в препаратах крови человека.

Изобретение может быть использовано для определения методами прямой гемагглютинации и непрямой гемагглютинации содержания анти-А и анти-В гемагглютининов в препаратах крови человека для оценки их качества как при выпуске, так и в ходе исследований с целью подтверждения соответствия требованиям нормативной документации.

Препараты крови человека представляют собой лекарственные средства, содержащие концентрированный раствор соответствующей белковой фракции, выделенной из объединенной плазмы крови более чем 1000 доноров. Использование в технологическом процессе не только этапов спиртового фракционирования при температуре ниже 0°C, но и методов хроматографического выделения обуславливает высокую вероятность сохранения максимально полного спектра иммуноглобулинов класса G, в том числе антиэритроцитарных антител. Анти-А и анти-В гемагглютинины в составе иммунологически активной белковой фракции сохраняются при изготовлении препаратов иммуноглобулинов человека, а также могут быть выделены совместно с криопреципитатом при изготовлении препаратов факторов свертывания крови VIII и/или Виллебранда.

Инфузии пациентам (не I группы крови) больших объемов препаратов иммуноглобулинов человека (более 2 г/кг массы тела) или препаратов факторов свертывания крови VIII и/или Виллебранда могут вызвать гемолитические осложнения, связанные с содержанием в указанных препаратах гемагглютининов [1]. Показателем качества препаратов крови, характеризующим количественное содержание анти-А и анти-В гемагглютининов, является «Анти-А и анти-В гемагглютинины».

Содержание анти-А и анти-В гемагглютининов может быть выявлено методами прямой и непрямой гемагглютинации. В монографии Европейской фармакопеи 07/2011:20620 «Anti-А and anti-B haemagglutinins» описаны оба метода гемагглютинации «на плоскости». Для препаратов иммуноглобулинов человека рекомендуется использование реакции прямой гемагглютинации, для препаратов факторов свертывания крови VIII и/или Виллебранда - непрямой [4]. Общая фармакопейная статья «Определение анти-А и анти-В гемагглютининов в лекарственных препаратах иммуноглобулинов человека: ОФС.1.8.2.0005.15», включенная в Государственную фармакопею XIII выпуска, предусматривает метод непрямой гемагглютинации с использованием гелевой технологии и «на плоскости» [5].

Метод непрямой гемагглютинации как метод контроля качества препаратов крови человека имеет значительные недостатки: высокие концентрации гемагглютининов могут нейтрализовать антиглобулиновую сыворотку, а неправильно проведенная процедура «отмывания» сенсибилизированных эритроцитов приводит к повреждению структуры их поверхностных антигенов, что приводит к занижению получаемых результатов. Метод прямой гемагглютинации с использованием эритроцитов, обработанных папаином, также имеет недостатки: процедура обработки папаином эритроцитов включает процесс «отмывания» эритроцитов, нарушения которой могут привести к повреждению структуры их поверхностных антигенов, что снижает чувствительность эритроцитов; определение оптимального момента времени для оценки агглютинации и определение титров гемагглютининов затруднены в силу различности свойств используемых биологических реагентов. Вариабельность перечисленных параметров указывает на необходимость использования стандартного образца при определении содержания анти-А и анти-В гемагглютининов в препаратах крови человека. Положительный и отрицательный компоненты стандартного образца подтверждают достоверность полученных результатов в различных диапазонах значений, а компонент лимита содержания анти-А и/или анти-В гемагглютининов позволяет определить количественное содержание соответствующих гемагглютининов.

Ближайшими к заявляемому стандартному образцу являются:

1) Международный референс-реагент анти-А и анти-В антител в препаратах иммуноглобулинов для внутривенного введения: положительный и отрицательный контроли для метода гемагглютинации, первый референс-реагент, утвержденный в 2008 г. (WHO Reference Reagent, Anti-A and anti-B in IVIG: Positive control and Negative control for haemagglutination tests, NIBSC code: 07/306 & 07/308). Содержание гемагглютининов в нем определено в ходе совместных исследований Национального института биологических стандартов и контроля (National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC), Европейского директората по качеству лекарственных средств и здравоохранения (European Directorate for the Quality of Medicines (EDQM) и Центра биологических оценок и исследований Управления по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (Food and Drug Administration/Center for Biologics Evaluation and Research (FDA/CBER) в реакции прямой гемагглютинации с использованием эритроцитов фенотипов A₁ и В, обработанных папаином. В положительном контроле стандартного образца определено содержание анти-А гемагглютининов от 1:32 до 1:64, анти-В гемагглютининов - от 1:16 до 1:32. В отрицательном контроле гемагглютинины не определяются на уровне 1:2. Положительный контроль представляет собой лиофилизированный иммуноглобулин человека для внутривенного введения с содержанием белка 5%, расфасованный по 0,5 мл. Отрицательный контроль представляет собой лиофилизированный иммуноглобулин человека для внутривенного введения, полученный из плазмы крови доноров IV(AB) группы крови, с содержанием белка 5%, расфасованный по 0,5 мл [6].

2) Международный референс-реагент анти-А и анти-В антител в препаратах иммуноглобулинов для внутривенного введения: лимит содержания, первый референс-реагент, утвержденный в 2008 г. (WHO Reference Reagent, Anti-A and anti-B in IVIG: Limit Reference Preparation, NIBSC code: 07/310). Содержание гемагглютининов в нем определено в ходе совместных исследований Национального института биологических стандартов и контроля (National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC), Европейского директората по качеству лекарственных средств и здравоохранения (European Directorate for the Quality of Medicines (EDQM) и Центра биологических оценок и исследований Управления по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (Food and Drug Administration/Center for Biologics Evaluation and Research (FDA/CBER) в реакции прямой гемагглютинации с использованием эритроцитов фенотипов А₁ и В, обработанных папаином. Содержание анти-А и анти-В гемагглютининов составляет от 1:32 до 1:64. Международный референс-реагент анти-А и анти-В антител в препаратах иммуноглобулинов для внутривенного введения: лимит содержания NIBSC 07/310 представляет собой лиофилизированный иммуноглобулин человека для внутривенного введения с содержанием белка 5% с добавлением мышиных моноклональных антител класса G анти-А (BRIC 145) и анти-В (BGRL 1), расфасованный по 0,5 мл [7].

3) Референс-стандарт Европейской фармакопеи, Иммуноглобулин (содержание анти-А, анти-В антител) положительный контроль, биологический референс-препарат, серия 1, Y0001688 (European Pharmacopoeia Reference Standard, Immunoglobulin (anti-A, anti-B antibodies test) positive control, Biological Reference Preparation, batch 1, Y0001688), утвержденный Европейским директоратом по качеству лекарственных средств и здравоохранения (European Directorate for the Quality of Medicines (EDQM) в 2014 г. Стандарт представляет собой лиофилизированный препарат иммуноглобулина человека с содержанием белка 5%, расфасованный по 0,5 мл с содержанием анти-А и анти-В гемагглютининов на уровне 1:32 в реакции прямой гемагглютинации с использованием эритроцитов фенотипов А₁ и В, обработанных папаином, в соответствии с монографией Европейской фармакопеи 07/2011:20620 «Anti-А and anti-B haemagglutinins» (метод В) [4, 8].

4) Референс-стандарт Европейской фармакопеи, Иммуноглобулин (содержание анти-А, анти-В антител) отрицательный контроль, биологический референс-препарат, серия 1, Y0001689 (European Pharmacopoeia Reference Standard, Immunoglobulin (anti-A, anti-B antibodies test) negative control, Biological Reference Preparation, batch 1, Y0001689), утвержденный Европейским директоратом по качеству лекарственных средств и здравоохранения (European Directorate for the Quality of Medicines (EDQM) в 2014 г. Стандарт представляет собой лиофилизированный препарат иммуноглобулина человека с содержанием белка 5%, расфасованный по 0,5 мл с содержанием анти-А и анти-В гемагглютининов на уровне менее 1:2 в реакции прямой гемагглютинации с использованием эритроцитов фенотипов A₁ и В, обработанных папаином, в соответствии с монографией Европейской фармакопеи 07/2011:20620 «Anti-А and anti-B haemagglutinins» (метод В) [4, 9].

5) Референс-стандарт Европейской фармакопеи, Иммуноглобулин для анти-А, анти-В антител лимит содержания, биологический референс-препарат, серия 1, Y0001153 (European Pharmacopoeia Reference Standard, Immunoglobulin for anti-A, anti-B antibodies Limit test, Biological Reference Preparation, batch 1, Y0001153), утвержденный Европейским директоратом по качеству лекарственных средств и здравоохранения (European Directorate for the Quality of Medicines (EDQM) в 2012 г. (пересмотр в 2014 г.). Стандарт представляет собой лиофилизированный препарат иммуноглобулина человека с содержанием белка 5%, расфасованный по 0,5 мл с содержанием анти-А и анти-В гемагглютининов на уровне 1:64 в реакции прямой гемагглютинации с использованием эритроцитов фенотипов А₁ и В, обработанных папаином, в соответствии с монографией Европейской фармакопеи 07/2011:20620 «Anti-А and anti-B haemagglutinins» (метод В) [4, 10].

В настоящее время указанные стандарты используются при определении содержания анти-А и анти-В гемагглютининов в препаратах иммуноглобулинов человека. Перед использованием их растворяют в заданном объеме (0,5 мл) воды для инъекций. В результате получают раствор с содержанием иммуноглобулина примерно 50 мг/мл. Отсутствие возможности определить точное содержание белка в восстановленном растворе иммуноглобулина ввиду малого объема в дальнейшем не позволяет получить раствор с точным содержанием белка 30 мг/мл, что оказывает влияние на погрешность определения содержания в указанных стандартах гемагглютининов. Известный Международный референс-реагент анти-А и анти-В антител в препаратах иммуноглобулинов для внутривенного введения: положительный и отрицательный контроли для метода гемагглютинации (NIBSC code: 07/306 & 07/308) рекомендован для применения в реакции прямой гемагглютинации. В соответствии с инструкцией по применению его можно использовать в реакции непрямой гемагглютинации, однако аттестованные значения должны быть определены потребителем, что исключает значимость этого референс-реагента как международного стандарта в реакции непрямой гемагглютинации [6]. Международный референс-реагент анти-А и анти-В антител в препаратах иммуноглобулинов для внутривенного введения: лимит содержания (NIBSC code: 07/310) рекомендован для применения только в реакции прямой гемагглютинации, так как в реакции непрямой гемагглютинации с использованием антиглобулиновой сыворотки (сыворотка Кумбса) невозможно выявить мышиные моноклональные антитела [7]. Стандарты Европейской фармакопеи предназначены для использования только в реакции прямой гемагглютинации с использованием эритроцитов фенотипов А₁ и В, обработанных папаином, в соответствии с монографией Европейской фармакопеи 07/2011:20620 «Anti-А and anti-B haemagglutinins» (метод В) [4, 8, 9, 10].

Стандарты содержания анти-А и анти-В гемагглютининов в препаратах крови для метода непрямой гемагглютинации в международной практике отсутствуют. Допустимость применения методов непрямой и прямой гемагглютинации для оценки качества препаратов иммуноглобулинов человека не позволяет адекватно сравнивать их качество по содержанию гемагглютининов.

Задачей изобретения является создание стандартного образца содержания анти-А и анти-В гемагглютининов, применимого в реакции непрямой гемагглютинации и в реакции прямой гемагглютинации, имеющего упрощенную пробоподготовку и аттестованные характеристики для обоих методов, что улучшит воспроизводимость результатов определения содержания анти-А и анти-В гемагглютининов в препаратах крови человека.

Поставленная задача решается благодаря тому, что стандартный образец содержания анти-А и анти-В гемагглютининов в препаратах крови представляет собой набор из растворов иммуноглобулинов человека, полученных из плазмы крови доноров соответствующей группы крови и аттестованных по содержанию анти-А и анти-В гемагглютининов методами прямой и непрямой гемагглютинации с использованием гелевой технологии и «на плоскости», и по содержанию белка.

Стандартный образец содержания анти-А и анти-В гемагглютининов содержит:

1) положительный компонент А с аттестованным содержанием анти-А гемагглютининов в диапазоне от 1:16 до 1:64 и содержанием белка не менее 30 мг/мл, полученный из плазмы крови доноров I(0) группы крови;

2) положительный компонент В с аттестованным содержанием анти-В гемагглютининов в диапазоне от 1:16 до 1:64 и содержанием белка не менее 30 мг/мл, полученный из плазмы крови доноров I(0) группы крови;

3) отрицательный компонент стандартного образца с содержанием анти-А и анти-В гемагглютининов в количестве, соответствующем разведению не более 1:2, с содержанием белка не менее 30 мг/мл, полученный из плазмы крови доноров IV(AB) группы крови;

4) компонент лимит содержания анти-А гемагглютининов с содержанием анти-А гемагглютининов в количестве, соответствующем разведению не более 1:64, с содержанием белка не менее 30 мг/мл, полученный из плазмы крови доноров I(0) группы крови;

5) компонент лимит содержания анти-В гемагглютининов с содержанием анти-В гемагглютининов в количестве, соответствующем разведению не более 1:64, с содержанием белка не менее 30 мг/мл, полученный из плазмы крови доноров I(0) группы крови.

Заявляемый стандартный образец иммуноглобулина человека, используемый для определения содержания анти-А и анти-В гемагглютининов в препаратах крови, включает пять ампул из прозрачного нейтрального стекла, содержащих раствор иммуноглобулина человека с соответствующим содержанием гемагглютининов и белка, имеющих маркировку на внешней поверхности, отражающую информацию о названии стандартного образца, наименовании компонента с указанием содержания анти-А и/или анти-В гемагглютининов и белка, об изготовителе, дате изготовления, сроке годности, условиях хранения; инструкцию по применению; упакован в тару для хранения и транспортирования.

Между совокупностью существенных признаков заявленного стандартного образца и достигаемым техническим результатом существует причинно-следственная связь, а именно, использование компонентов с аттестованным содержанием белка:

- раствор иммуноглобулина человека с содержанием анти-А гемагглютининов в количестве, соответствующем разведению 1:32 (Me) с размахом варьирования от 1:32 до 1:32 (в реакции непрямой гемагглютинации); 1:16 (Me) с размахом варьирования от 1:16 до 1:32 (в реакции прямой гемагглютинации) для положительного компонента А;

- раствор иммуноглобулина человека с содержанием анти-В гемагглютининов в количестве, соответствующем разведению 1:16 (Me) с размахом варьирования от 1:16 до 1:32 (в реакции непрямой гемагглютинации); 1:16 (Me) с размахом варьирования от 1:16 до 1:16 (в реакции прямой гемагглютинации) для положительного компонента В;

- раствор иммуноглобулина человека с содержанием анти-А и анти-В гемагглютининов в количестве, соответствующем разведению менее 1:2 для отрицательного компонента;

- раствор иммуноглобулина человека с содержанием анти-А гемагглютининов в количестве, соответствующем разведению 1:64 (Me) с размахом варьирования от 1:64 до 1:64 (в реакции непрямой гемагглютинации); 1:64 (Me) с размахом варьирования от 1:32 до 1:64 (в реакции прямой гемагглютинации) для компонента лимит содержания анти-А гемагглютининов;

- раствор иммуноглобулина человека с содержанием анти-В гемагглютининов в количестве, соответствующем разведению 1:64 (Me) с размахом варьирования от 1:64 до 1:64 (в реакции непрямой гемагглютинации); 1:64 (Me) с размахом варьирования от 1:32 до 1:64 (в реакции прямой гемагглютинации) для компонента лимит содержания анти-В гемагглютининов,

позволяет улучшить воспроизводимость и повысить точность результатов определения содержания анти-А и анти-В гемагглютининов в препаратах крови человека методами прямой и непрямой гемагглютинации; исключить дополнительные стадии пробоподготовки, оказывающие влияние на погрешность определения содержания гемагглютининов.

Дополнительно стандартный образец иммуноглобулина человека для определения содержания анти-А и анти-В гемагглютининов аттестован по содержанию белка. Количество белка определяется технологией получения препаратов иммуноглобулинов человека.

Благодаря решению таких задач, как создание положительных компонентов и компонентов лимита содержания гемагглютининов из плазмы крови доноров I(0) группы крови, создание отрицательного компонента из плазмы крови доноров IV(AB) группы крови, получение аттестованных характеристик методами прямой и непрямой гемагглютинации, определение содержания белка, упрощение этапа пробоподготовки, изобретение позволяет улучшить воспроизводимость и повысить точность результатов определения содержания анти-А и анти-В гемагглютининов в препаратах крови человека.

Краткое описание чертежей и иных материалов (Приложения 1-5):

Табл. 1 Приготовление проб с компонентами заявляемого стандартного образца для определения содержания анти-А и анти-В гемагглютининов для применения в методе непрямой гемагглютинации.

Табл. 2 Приготовление проб с компонентами заявляемого стандартного образца для определения содержания анти-А и анти-В гемагглютининов для применения в методе прямой гемагглютинации.

Табл. 3 Среднее значение аттестуемых характеристик содержания анти-А и анти-В гемагглютининов (метод непрямой гемагглютинации) и содержание белка в компонентах стандартного образца содержания анти-А и анти-В гемагглютининов.

Табл. 4 Среднее значение аттестуемых характеристик содержания анти-А и анти-В гемагглютининов в компонентах стандартного образца содержания анти-А и анти-В гемагглютининов (метод прямой гемагглютинации).

Табл. 5 Изучение стабильности стандартного образца содержания анти-А и анти-В гемагглютининов.

Возможность осуществления заявляемого изобретения показана следующими примерами:

Пример 1. Подготовка суспензии стандартных эритроцитов.

Эритроциты человека группы крови A₁(II), резус-отрицательные (свежеприготовленные, не более 3 сут хранения) центрифугируют 10 мин при 260-470 g при комнатной температуре (20±5)°C, надосадочную жидкость сливают. Полученный осадок ресуспендируют в десятикратном объеме 0,9% раствора натрия хлорида и снова центрифугируют в течение 10 мин при 260-470 g при комнатной температуре (20±5)°C. Процедуру повторяют не менее 3 раз до получения прозрачной надосадочной жидкости. Для получения 5% суспензии 1 объем осадка эритроцитов ресуспендируют в 19 объемах 0,9% раствора натрия хлорида.

Эритроциты человека группы крови В(III), резус-отрицательные (свежеприготовленные, не более 3 сут хранения) центрифугируют 10 мин при 260-470 g при комнатной температуре (20±5)°C, надосадочную жидкость сливают. Полученный осадок ресуспендируют в десятикратном объеме 0,9% раствора натрия хлорида и снова центрифугируют в течение 10 мин при 260-470 g при комнатной температуре (20±5)°C. Процедуру повторяют не менее 3 раз до получения прозрачной надосадочной жидкости. Для получения 5% суспензии 1 объем осадка эритроцитов ресуспендируют в 19 объемах 0,9% раствора натрия хлорида.

Пример 2. Приготовление контрольных клеток Кумбса.

Контрольные клетки Кумбса представляют собой эритроциты человека группы крови 0(I), резус-положительные, сенсибилизированные антирезусным иммуноглобулином G (анти-D антителами).

Эритроциты человека группы крови 0(I), резус-положительные (свежеприготовленные, не более 3 сут хранения) центрифугируют 10 мин при 260-470 g при комнатной температуре (20±5)°C, надосадочную жидкость сливают. Полученный осадок ресуспендируют в десятикратном объеме 0,9% раствора натрия хлорида и снова центрифугируют в течение 10 мин при 260-470 g при комнатной температуре (20±5)°C. Процедуру повторяют не менее 3 раз до получения прозрачной надосадочной жидкости. В пробирку вносят 1 объем осадка отмытых эритроцитов, добавляют равный объем антирезусного иммуноглобулина или реагента, содержащего моноклональные анти-D (антирезусные) антитела, в титре 1:4. Смесь перемешивают и инкубируют при температуре (37±0,5)°C в течение 30 мин. В случае, если произошла агглютинация процедуру повторяют, используя более разбавленный антирезусный иммуноглобулин или реагент, содержащий моноклональные анти-D (антирезусные) антитела. После инкубации сенсибилизированные эритроциты отмывают не менее 3 раз в 0,9% растворе натрия хлорида до получения прозрачной надосадочной жидкости.

Для получения 5% суспензии 1 объем осадка эритроцитов ресуспендируют в 19 объемах 0,9% раствора натрия хлорида.

Для оценки пригодности контрольных клеток Кумбса в пробирку вносят 1 объем антиглобулиновой сыворотки (сыворотки Кумбса) и 2 объема 5% суспензии сенсибилизированных эритроцитов, осторожно перемешивают и через 5-10 мин оценивают агглютинацию.

При отсутствии агглютинации необходимо повторить процедуру сенсибилизации резус-положительных эритроцитов группы крови 0(I) менее разбавленным антирезусным иммуноглобулином или реагентом, содержащим моноклональные анти-D (антирезусные) антитела.

Пример 3. Определение содержания белка колориметрическим методом с биуретовым реактивом.

Для приготовления раствора компонента заявляемого стандартного образца в мерную колбу вместимостью 50 мл (при содержании белка 100 мг/мл) или вместимостью 25 мл (при содержании белка 50 мг/мл) вносят 1,0 мл компонента заявляемого стандартного образца, доводят объем раствора 0,9% раствором натрия хлорида до метки и перемешивают. Для приготовления раствора стандартного образца в мерную колбу вместимостью 50 мл вносят 1,0 мл стандартного образца содержания белка в иммуноглобулине (ОСО 42-28-340 «Отраслевой стандартный образец содержания белка в иммуноглобулине»), доводят объем раствора 0,9% раствором натрия хлорида до метки и перемешивают. В пробирку вносят 5,0 мл раствора компонента заявляемого стандартного образца, в другую пробирку вносят 5,0 мл раствора стандартного образца содержания белка в иммуноглобулине. Для приготовления раствора сравнения в третью пробирку вносят 5,0 мл 0,9% раствора натрия хлорида. Во все три пробирки добавляют по 5,0 мл биуретового реактива, перемешивают и выдерживают 30 мин при комнатной температуре (20±5)°C. После инкубации измеряют оптическую плотность растворов компонента заявляемого стандартного образца и стандартного образца содержания белка в иммуноглобулине на спектрофотометре в кюветах с толщиной слоя 10 мм при длине волны 540 нм по отношению к раствору сравнения.

Содержание белка в компоненте заявляемого стандартного образца (С) вычисляют по формуле:

, где

С - стандартный образец;

А - значение оптической плотности раствора компонента заявляемого стандартного образца;

Сст - содержание белка в стандартном образце содержания белка в иммуноглобулине, мг/мл;

Ркомп - разведение компонента заявляемого стандартного образца;

Аст - значение оптической плотности раствора стандартного образца содержания белка в иммуноглобулине;

Рст - разведение стандартного образца содержания белка в иммуноглобулине.

Результаты определения содержания белка в компонентах заявляемого стандартного образца колориметрическим методом с биуретовым реактивом представлены в Табл. 3.

Пример 4. Определение аттестуемой характеристики методом непрямой гемагглютинации «на плоскости».

Приготовление проб с компонентами заявляемого стандартного образца проводят в зависимости от аттестованного значения содержания белка, указанного в паспорте на стандартный образец. Пример приведен в Табл. 1.

В стеклянные пробирки или V-образные лунки 96-луночного планшета вносят равное количество соответствующей пробы с компонентами заявляемого стандартного образца и полученной по примеру 1 суспензии эритроцитов человека группы крови А₁(II) (первый ряд) или суспензии эритроцитов человека группы крови В(III) (второй ряд). Пробы осторожно перемешивают и инкубируют в течение 30 мин при температуре (37±0,5)°C. По окончании инкубации пробы центрифугируют при 260-470 g в течение 10 мин. Удаляют надосадочную жидкость, полученный осадок ресуспендируют в десятикратном объеме 0,9% раствора натрия хлорида и вновь центрифугируют при 260-470 g в течение 10 мин. Процедуру повторяют не менее 3 раз. Надосадочную жидкость удаляют, добавляют равный осадку эритроцитов объем поливалентной антиглобулиновой сыворотки (сыворотка Кумбса) и осторожно перемешивают. Пробы инкубируют при температуре (37±0,5)°C в течение 30 мин. По окончании инкубации под микроскопом или визуально исследуют пробы, отмечая наличие агглютинации эритроцитов.

Содержание гемагглютининов определяют как максимальное разведение пробы компонента заявляемого стандартного образца, при котором происходит агглютинация эритроцитов любой степени интенсивности. Разведение до содержания белка 30 г/л при определении титра не учитывают.

В каждую пробу, в которой не определяется агглютинация, вносят равное количество (по объему) приготовленных по примеру 2 контрольных клеток Кумбса, осторожно перемешивают и через 5-10 мин оценивают агглютинацию.

Результаты теста считают достоверными, если в пробах с отрицательным результатом (отсутствие агглютинации) после добавления контрольных клеток Кумбса наблюдается агглютинация.

В противном случае проводят повторный анализ.

Результаты определения содержания анти-А и анти-В гемагглютининов методом непрямой гемагглютинации в стандартном образце представлены в Табл. 3.

Из данных, представленных в Табл. 1, следует, что отсутствует необходимость растворения стандартного образца. Получение разведения до содержания белка 30 г/л проводится без предварительного подтверждения содержания белка с учетом данных, указанных в паспорте, при этом наблюдается положительный момент - упрощение пробоподготовки.

Из данных, представленных в Табл. 3, следует, что аттестуемое значение содержания анти-А и анти-В антител в компонентах стандартного образца содержания анти-А и анти-В гемагглютининов соответствует заявленным требованиям: положительный компонент А содержит анти-А гемагглютинины в количестве, соответствующем разведению 1:32 (Me) с размахом варьирования от 1:32 до 1:32; положительный компонент В содержит анти-В гемагглютинины в количестве, соответствующем разведению 1:16 (Me) с размахом варьирования от 1:16 до 1:32; отрицательный компонент содержит анти-А и анти-В гемагглютинины в количестве, соответствующем разведению менее 1:2; компонент лимит содержания анти-А гемагглютининов с содержанием анти-А гемагглютининов в количестве, соответствующем разведению 1:64 (Me) с размахом варьирования от 1:64 до 1:64; компонент лимит содержания анти-В гемагглютининов с содержанием анти-В гемагглютининов 1:64 (Me) с размахом варьирования от 1:64 до 1:64.

Пример 5. Определение аттестуемой характеристики методом непрямой гемагглютинации в геле.

Приготовление проб с компонентами заявляемого стандартного образца проводят в зависимости от аттестованного значения содержания белка, указанного в паспорте на стандартный образец. Пример приведен в Табл. 1.

Гелевый метод основан на использовании гелевой карты, представляющей собой пластиковый планшет с микропробирками, наполненными гелевыми колонками. Каждая микропробирка состоит из дозирующей/инкубационной камеры и колонки, содержащей полимеризованные микросферы декстрана в буферном растворе низкой ионной силы (LISS), смешанном с поливалентной антиглобулиновой сывороткой (сыворотка Кумбса).

В дозирующую/инкубационную камеру микропробирки вносят по 50 мкл 0,8% суспензии стандартных эритроцитов человека группы крови A₁(II) (первый ряд) или 0,8% суспензии стандартных эритроцитов человека группы крови В(III) (второй ряд) и по 25,0 мкл соответствующей пробы с компонентами заявляемого стандартного образца. Пробы инкубируют при температуре (37±0,5)°C в течение 15 мин. По окончании инкубации пробы центрифугируют на специальной центрифуге (для гелевых карт) в стандартных условиях (запрограммированный режим) и оценивают агглютинацию.

Содержание гемагглютининов определяют как максимальное разведение пробы компонента заявляемого стандартного образца, при котором наблюдают распределение агглютинированных эритроцитов в толще гелевой колонки или в ее верхней части. Неагглютинированные эритроциты оседают на дно микропробирки. Разведение до содержания белка 30 г/л при определении титра не учитывают.

Результаты определения содержания анти-А и анти-В гемагглютининов методом непрямой гемагглютинации в стандартном образце представлены в Табл. 3.

Из данных, представленных в Табл. 1, следует, что отсутствует необходимость растворения стандартного образца. Получение разведения до содержания белка 30 г/л проводится без предварительного подтверждения содержания белка с учетом данных, указанных в паспорте, при этом наблюдаются положительный момент - упрощение пробоподготовки.

Из данных, представленных в Табл. 3, следует, что аттестуемое значение содержания анти-А и анти-В антител в компонентах стандартного образца содержания анти-А и анти-В гемагглютининов соответствует заявленным требованиям: положительный компонент А содержит анти-А гемагглютинины в количестве, соответствующем разведению 1:32 (Me) с размахом варьирования от 1:32 до 1:32; положительный компонент В содержит анти-В гемагглютинины в количестве, соответствующем разведению 1:16 (Me) с размахом варьирования от 1:16 до 1:32; отрицательный компонент содержит анти-А и анти-В гемагглютинины в количестве, соответствующем разведению менее 1:2; компонент лимит содержания анти-А гемагглютининов с содержанием анти-А гемагглютининов в количестве, соответствующем разведению 1:64 (Me) с размахом варьирования от 1:64 до 1:64; компонент лимит содержания анти-В гемагглютининов с содержанием анти-В гемагглютининов 1:64 (Me) с размахом варьирования от 1:64 до 1:64.

Пример 6. Приготовление фосфатного буферного раствора.

В мерную колбу вместимостью 1000 мл вносят 8,0 г натрия хлорида, 0,76 г безводного натрия гидрофосфата, 0,2 г калия хлорида, 0,2 г калия дигидрофосфата. Добавляют 900 мл воды очищенной. Доводят рН до 7,4±0,1 1 М раствором натрия гироксида или 1 М раствором хлористоводородной кислоты, перемешивают и доводят объем раствора до метки водой очищенной, и вновь перемешивают. Возможно хранение раствора при температуре (5±3)°C в течение 30 сут.

Пример 7. Приготовление фосфатного буферного раствора, содержащего 2 г/л бычьего сывороточного альбумина.

К 1000 мл полученному согласно примеру 5 фосфатному буферному раствору добавляют 2,0 г бычьего сывороточного альбумина, тщательно перемешивают, избегая образования пены. Возможно хранение раствора при температуре (5±3)°C в течение 30 сут.

Пример 8. Подготовка раствора папаина.

Лиофилизат массой 25 мг растворяют в 2,5 мл полученного по примеру 5 фосфатного буферного раствора. Инкубируют при температуре (37±0,5)°C в течение 30 мин. Раствор используют свежеприготовленным. Возможно хранение раствора при температуре (5±3)°C в течение 5 сут или при температуре минус (21±1)°C в течение 6 мес. Раствор после оттаивания повторному замораживанию не подлежит.

Пример 9. Обработка стандартных эритроцитов папаином и подготовка суспензии стандартных эритроцитов.

Эритроциты человека группы крови A₁(II), резус-отрицательные (свежеприготовленные, не более 3 сут хранения) центрифугируют 10 мин при 260-470 g при комнатной температуре (20±5)°C, надосадочную жидкость сливают. Полученный осадок ресуспендируют в десятикратном объеме 0,9% раствора натрия хлорида и снова центрифугируют в течение 10 мин при 260-470 g при комнатной температуре (20±5)°C. Процедуру повторяют не менее 3 раз до получения прозрачной надосадочной жидкости.

В стеклянную пробирку вносят равные объемы промытых эритроцитов и приготовленного по примеру 7 раствора папаина, инкубируют в течение 15 мин при температуре (37±0,5)°C, а затем центрифугируют при 260-470 g в течение 10 мин при комнатной температуре (20±5)°C, после удаления надосадочной жидкости, осадок ресуспендируют в десятикратном объеме полученного по примеру 5 буферного раствора и центрифугируют при тех же условиях.

Для приготовления 3% суспензии 1 объем осадка эритроцитов, обработанных папаином, ресуспендируют в 32 объемах полученного по примеру 6 фосфатного буферного раствора, содержащего 2 г/л бычьего сывороточного альбумина. Возможно хранение суспензии эритроцитов при температуре (5±3)°C в течение 7 сут.

Для приготовления 0,8% суспензии 1 объем осадка эритроцитов, обработанных папаином, ресуспендируют в 125 объемах полученного по примеру 6 фосфатного буферного раствора, содержащего 2 г/л бычьего сывороточного альбумина. Возможно хранение суспензии эритроцитов при температуре (5±3)°C в течение 7 сут.

Эритроциты человека группы крови В(III), резус-отрицательные (свежеприготовленные, не более 3 сут хранения) центрифугируют 10 мин при 260-470 g при комнатной температуре (20±5)°C, надосадочную жидкость сливают. Полученный осадок ресуспендируют в десятикратном объеме 0,9% раствора натрия хлорида и снова центрифугируют в течение 10 мин при 260-470 g при комнатной температуре (20±5)°C. Процедуру повторяют не менее 3 раз до получения прозрачной надосадочной жидкости.

В стеклянную пробирку вносят равные объемы промытых эритроцитов и полученного по примеру 7 раствора папаина, инкубируют в течение 15 мин при температуре (37±0,5)°C, а затем центрифугируют при 260-470 g в течение 10 мин, после удаления надосадочной жидкости, осадок ресуспендируют в десятикратном объеме полученного по примеру 5 буферного раствора и центрифугируют при тех же условиях.

Для приготовления 3% суспензии 1 объем осадка эритроцитов, обработанных папаином, ресуспендируют в 32 объемах полученного по примеру 6 фосфатного буферного раствора, содержащего 2 г/л бычьего сывороточного альбумина. Возможно хранение суспензии эритроцитов при температуре (5±3)°C в течение 7 сут.

Для приготовления 0,8% суспензии 1 объем осадка эритроцитов, обработанных папаином, ресуспендируют в 125 объемах полученного по примеру 6 фосфатного буферного раствора, содержащего 2 г/л бычьего сывороточного альбумина. Возможно хранение суспензии эритроцитов при температуре (5±3)°C в течение 7 сут.

Пример 10. Определение аттестуемой характеристики методом прямой гемагглютинации «на плоскости» с использованием различных типов планшетов.

Приготовление проб с компонентами заявляемого стандартного образца проводят в зависимости от аттестованного значения содержания белка, указанного в паспорте на стандартный образец. Пример приведен в Табл. 2.

В лунки V-образного 96-луночного планшета вносят равное количество соответствующей пробы с компонентами заявляемого стандартного образца и полученной по примеру 8 3% суспензии обработанных папаином эритроцитов человека группы крови A₁(II) (первый ряд) или 3% суспензии обработанных папаином эритроцитов человека группы крови В(III) (второй ряд). Пробы осторожно встряхивают (на шейкере) в течение 10 с, затем центрифугируют в течение 1 мин при 360-650 g. Планшеты располагают под уголом 70° и оценивают визуально агглютинацию через 4-5 мин (но не более чем через 10 мин).

На поверхность плоского планшета для серологических исследований вносят 50 мкл соответствующей пробы с компонентами заявляемого стандартного образца и 25 мкл полученной по примеру 8 3% суспензии обработанных папаином эритроцитов человека группы крови А₁(II) (первый ряд) или 3% суспензии обработанных папаином эритроцитов человека группы крови В(III) (второй ряд). Пробы осторожно встряхивают и оценивают визуально агглютинацию через 10 мин.

Результаты определения содержания анти-А и анти-В гемагглютининов методом прямой гемагглютинации в стандартном образце представлены в Табл. 4.

Из данных, представленных в Табл. 2, следует, что отсутствует необходимость растворения стандартного образца. Получение разведения до содержания белка 25 г/л проводится без предварительного подтверждения содержания белка с учетом данных, указанных в паспорте, при этом наблюдается положительный момент - упрощение пробоподготовки.

Из данных, представленных в Табл. 4, следует, что аттестуемое значение содержания анти-А и анти-В антител в компонентах стандартного образца содержания анти-А и анти-В гемагглютининов, соответствует заявленным требованиям: положительный компонент А содержит анти-А гемагглютинины количестве, соответствующем разведению 1:16 (Me) с размахом варьирования от 1:16 до 1:32; положительный компонент В содержит анти-В гемагглютинины в количестве, соответствующем разведению 1:16 (Me) с размахом варьирования от 1:16 до 1:16; отрицательный компонент содержит анти-А и анти-В гемагглютинины в количестве, соответствующем разведению менее 1:2; компонент лимит содержания анти-А гемагглютининов с содержанием анти-А гемагглютининов количестве, соответствующем разведению 1:64 (Me) с размахом варьирования от 1:32 до 1:64; компонент лимит содержания анти-В гемагглютининов с содержанием анти-В гемагглютининов 1:64 (Me) с размахом варьирования от 1:32 до 1:64.

Пример 11. Определение аттестуемой характеристики методом прямой гемагглютинации в геле.

Приготовление проб с компонентами заявляемого стандартного образца проводят в зависимости от аттестованного значения содержания белка, указанного в паспорте на стандартный образец. Пример приведен в Табл. 2.

Гелевый метод основан на использовании гелевой карты, представляющей собой пластиковый планшет с микропробирками, наполненными гелевыми колонками. Каждая микропробирка состоит из дозирующей/инкубационной камеры и колонки, содержащей полимеризованные микросферы декстрана в буферном растворе низкой ионной силы (LISS).

В дозирующую/инкубационную камеру микропробирки вносят по 50 мкл полученной по примеру 8 0,8% суспензии обработанных папаином стандартных эритроцитов человека группы крови A₁(II) (первый ряд) или 0,8% суспензии обработанных папаином эритроцитов человека группы крови В(III) (второй ряд) и по 25,0 мкл соответствующей пробы с компонентами заявляемого стандартного образца. Пробы центрифугируют на специальной центрифуге (для гелевых карт) в стандартных условиях (запрограммированный режим) и оценивают агглютинацию.

Содержание гемагглютининов определяют как максимальное разведение пробы компонента заявляемого стандартного образца, при котором наблюдают распределение агглютинированных эритроцитов в толще гелевой колонки или в ее верхней части. Неагглютинированные эритроциты оседают на дно микропробирки.

Результаты определения содержания анти-А и анти-В гемагглютининов методом непрямой гемагглютинации в стандартном образце представлены в Табл. 4.

Из данных, представленных в Табл. 2, следует, что отсутствует необходимость растворения стандартного образца. Получение разведения до содержания белка 25 г/л проводится без предварительного подтверждения содержания белка с учетом данных, указанных в паспорте, при этом наблюдается положительный момент - упрощение пробоподготовки.

Из данных, представленных в Табл. 4, следует, что аттестуемое значение содержания анти-А и анти-В антител в компонентах стандартного образца содержания анти-А и анти-В гемагглютининов, соответствует заявленным требованиям: положительный компонент А содержит анти-А гемагглютинины количестве, соответствующем разведению 1:16 (Me) с размахом варьирования от 1:16 до 1:32; положительный компонент В содержит анти-В гемагглютинины в количестве, соответствующем разведению 1:16 (Me) с размахом варьирования от 1:16 до 1:16; отрицательный компонент содержит анти-А и анти-В гемагглютинины в количестве, соответствующем разведению менее 1:2; компонент лимит содержания анти-А гемагглютининов с содержанием анти-А гемагглютининов количестве, соответствующем разведению 1:64 (Me) с размахом варьирования от 1:32 до 1:64; компонент лимит содержания анти-В гемагглютининов с содержанием анти-В гемагглютининов 1:64 (Me) с размахом варьирования от 1:32 до 1:64.

Пример 12. Изучение стабильности стандартного образца содержания анти-А и анти-В гемагглютининов.

Для изучения стабильности образцы полученного стандартного образца содержания анти-А и анти-В гемагглютининов хранят при температуре (5±3)°C и определяют контролируемые параметры в момент закладки на хранение, далее каждый месяц в течение первых трех месяцев, далее с интервалом в 3 мес. до 15 мес. Контролируемые параметры: содержание анти-А и анти-В гемагглютининов и содержание белка. Результаты изучения стабильности представлены в Табл. 5. Для установления окончательного срока хранения наблюдения продолжаются.

Пример 13. Набор, содержащий стандартный образец содержания анти-А и анти-В гемагглютининов.

Набор содержит:

1) положительный компонент А (ампула 3,0 мл), представляющий собой раствор иммуноглобулина человека, полученный из плазмы крови доноров I(0) группы крови;

2) положительный компонент В (ампула 3,0 мл), представляющий собой раствор иммуноглобулина человека, полученный из плазмы крови доноров I(0) группы крови;

3) отрицательный компонент стандартного образца (ампула 3,0 мл), представляющий собой раствор иммуноглобулина человека, полученный из плазмы крови доноров IV(AB) группы крови;

4) компонент лимит содержания анти-А гемагглютининов (ампула 3,0 мл), представляющий собой раствор иммуноглобулина человека, полученный из плазмы крови доноров I(0) группы крови;

5) компонент лимит содержания анти-В гемагглютининов (ампула 3,0 мл), представляющий собой раствор иммуноглобулина человека, полученный из плазмы крови доноров I(0) группы крови.

Все компоненты аттестованы по методикам, изложенным в примерах 3, 4, 5, 10, 11. Набор упаковывают в пачку картонную и прикладывают инструкцию по применению и паспорт на стандартный образец.

Пример 14. Хранение и транспортирование стандартного образца.

Упакованные наборы стандартного образца хранят при температуре (5±3)°C в защищенном от света месте. Транспортирование осуществляют всеми видами крытого транспорта согласно санитарно-эпидемиологическим правилам СП 3.3.2.3332-16 «Условия транспортирования и хранения иммунобиологических лекарственных препаратов» при температуре (5±3)°C.

Аналогичным образом, с учетом раскрытия изобретения в описании, специалистом в данной области могут быть получены, выполнены другие варианты изобретения, которые охватываются формулой изобретения.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Padmore R. Possible mechanisms for intravenous immunoglobulin-assotiated hemolysis: clues obtained from review of clinical case reports. Transfusion. 2015; 55 (Suppl 2): S 59-64. doi: 10.1111/trf. 13090.

2. Darnige L., Puget S. Haemolysis and IVIG: Why this side effect increases and how to prewents it in dysimmune neuropathies? Journal of the Peripheral Nervous System. 2015; 20 (2): 123.

3. Berard R., Wittemore В., Scuccimarri R. Hemilytic anemia following intravenous immunoglobulin therapy in patients treated for Kawasaki disease: a report of 4 cases. Pediatric Rheumatology Online Journal. 2012; 10 (1): 10. doi: 10.1186/1546-0096-10-10.

4. 07/2011:20620 «Anti-А and anti-B haemagglutinins» European Pharmacopoeia EDQM. 8^th Ed. Доступ по подписке [Электронный ресурс]. URL: http://online6.edqm.eu/ep801/# (дата обращения: 24.04.2017).

5. ОФС 1.8.2.0005.15 «Определение анти-А и анти-В гемагглютининов в лекарственных препаратах иммуноглобулинов человека» Государственная фармакопея Российской Федерации. XIII издание. Том III [Электронный ресурс]. URL: http://pharmacopoeia.ru/ofs-1-8-2-0005-15-opredelenie-anti-a-i-anti-v-gemagglyutininov-v-lekarstvennyh-preparatah-immunoglobulinov/ (дата обращения: 24.04.2017).

6. Лист-вкладыш к Международному референс-реагенту анти-А и анти-В антител в препаратах иммуноглобулинов для внутривенного введения: положительный и отрицательный контроли для метода гемагглютинации, NIBSC 07/306 и 07/308 [Электронный ресурс]. URL: http://www.nibsc.org/documents/ifu/07-306.pdf (дата обращения: 24.04.2017).

7. Лист-вкладыш к Международному референс-реагенту анти-А и анти-В антител в препаратах иммуноглобулинов для внутривенного введения: лимит содержания, NIBSC 07/310 [Электронный ресурс]. URL: http://www.nibsc.org/documents/ifu/07-310.pdf (дата обращения: 24.04.2017).

8. Лист-вкладыш к Референс-стандарту Европейской фармакопеи, Иммуноглобулин (содержание анти-А, анти-В антител) положительный контроль, биологический референс-препарат, серия 1, Y0001688 [Электронный ресурс]. URL: https://crs.edqm.eu/db/4DCGI/db/4DCGI/leaflet?leaflet=Y0001688_1 (дата обращения: 24.04.2017).

9. Лист-вкладыш к Референс-стандарту Европейской фармакопеи, Иммуноглобулин (содержание анти-А, анти-В антител) отрицательный контроль, биологический референс-препарат, серия 1, Y0001689 [Электронный ресурс]. URL: https://crs.edqm.eu/db/4DCGI/db/4DCGI/leaflet?leaflet=Y0001689_1 (дата обращения: 24.04.2017).

10. Лист-вкладыш к Референс-стандарту Европейской фармакопеи, Иммуноглобулин для анти-А, анти-В антител лимит содержания, биологический референс-препарат, серия 1, Y0001153 [Электронный ресурс]. URL: https://crs.edqm.eu/db/4DCGI/db/4DCGI/leaflet?leaflet=Y0001153_1 (дата обращения: 24.04.2017).

Набор для определения содержания анти-А и анти-В гемагглютининов в препаратах крови человека в реакции прямой гемагглютинации и реакции непрямой гемагглютинации, содержащий пять компонентов, представляющих собой растворы иммуноглобулинов человека: положительный компонент А с аттестованным содержанием анти-А гемагглютининов в диапазоне от 1:16 до 1:64 и аттестованным содержанием белка не менее 30 мг/мл, полученный из плазмы крови доноров I(0) группы крови; положительный компонент В с аттестованным содержанием анти-В гемагглютининов в диапазоне от 1:16 до 1:64 и аттестованным содержанием белка не менее 30 мг/мл, полученный из плазмы крови доноров I(0) группы крови; отрицательный компонент с аттестованным содержанием анти-А и анти-В гемагглютининов в количестве, соответствующем разведению не более 1:2, и аттестованным содержанием белка не менее 30 мг/мл, полученный из плазмы крови доноров IV(АВ) группы крови; компонент с лимитом содержания анти-А гемагглютининов с аттестованным содержанием анти-А гемагглютининов в количестве, соответствующем разведению 1:64, и аттестованным содержанием белка не менее 30 мг/мл, полученный из плазмы крови доноров I(0) группы крови; компонент с лимитом содержания анти-В гемагглютининов с аттестованным содержанием анти-В гемагглютининов в количестве, соответствующем разведению 1:64, и аттестованным содержанием белка не менее 30 мг/мл, полученный из плазмы крови доноров I(0) группы крови.