Эффективный синтез конъюгатов этилендицистеина-сахара для визуализации и терапии

Изобретение относится к области химического синтеза, в частности к способу синтеза конъюгата для молекулярной визуализации и терапии. Способ получения конъюгата этилендицистеина-сахара включает смешивание в органическом растворителе незащищенной тиазолидин-карбоновой кислоты со связывающим агентом, выбранным из сульфо-NHS, DMAP, DBU, EDAC или DCC, добавление аминосахара с образованием посредством этого конъюгата тиазолидина-сахара и восстановление конъюгата тиазолидина-сахара восстанавливающим агентом, содержащим щелочной металл и источник электронов, с получением посредством этого конъюгата этилендицистеина-сахара. Изобретение обеспечивает эффективное получение конъюгата с высокой степенью чистоты. 20 з.п. ф-лы, 19 ил., 6 пр.

 

[0001] В настоящей заявке заявляется приоритет по предварительной заявке на патент США № 61/615684, поданной 26 марта 2012 года, которая в полном объеме включена в настоящий документ путем ссылки.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

1.Область техники, к которой относится изобретение

[0002] Настоящее изобретение относится, в основном, к области химического синтеза, визуализации, радиотерапии, мечения, химиотерапии, медицинской терапии, лечения сердечно-сосудистых заболеваний и лечения рака. Более конкретно, настоящее изобретение относится к новым способам синтеза конъюгатов для молекулярной визуализации и терапии.

2.Описание предшествующего уровня техники

[0003] Рассматривая синтетические препараты молекулярных агентов для мечения металлами, при получении таких агентов в водных (влажных) условиях, иногда очистка этих агентов может представлять собой некоторую сложность. Очистка в водных условиях может быть выполнена, например, с использованием эксклюзионной хроматографии или диализа с мембранами с определенным отсечением по молекулярной массе; например, диализ, как правило, наиболее эффективен при разделении частиц с молекулярной массой 1000 г/моль или более. Однако этот способ очистки зачастую позволяет выделять не только заданный агент, но и любые другие частицы, которые могут проходить через такую мембрану. Внедрение примесей в визуализирующие агенты может быть проблематичным в последующих применениях визуализирующих агентов, особенно в отношении визуализации и/или терапевтического применения. Например, если визуализирующий агент, содержащий радионуклид ("реальный" визуализирующий агент), считается чистым, но на самом деле содержит примеси, которые также включают радионуклид, то качественное измерение или обнаружение "реального" визуализирующего агента может быть скрыто или ошибочно из-за наличия такой примеси.

[0004] Способы синтеза органических соединений в органических растворителях и использование защитных групп, как правило, обеспечивают улучшение очистки соединений, по сравнению с очисткой водных сред. Введение защитных групп позволяет обеспечивать защиту различных функциональных групп промежуточных соединений во время синтеза, а также облегчает очистку этих промежуточных соединений. Различные способы очистки с использованием органических растворителей позволяют разделять и выделять заданные соединения, такие как визуализирующие агенты, с очень небольшим содержанием примесей. Кроме того, частицы с молекулярной массой менее 1000 г/моль зачастую можно легко очистить с помощью способов очистки, известных в органической химии. Учитывая преимущества, обеспечиваемые органическим синтезом и очисткой, по сравнению с очисткой водных сред, способы органического синтеза и очистки визуализирующих агентов более вероятно дают агенты с более высокой степенью чистоты, чем агенты, полученные путем очистки водных сред. Однако добавление и удаление защитных групп может внести дополнительные затраты и снизить эффективность и чистоту конечных продуктов.

[0005] Следовательно, существует необходимость в получении этих и других агентов с использованием синтетических приемов, позволяющих получать агенты с более высокой степенью чистоты более эффективным способом.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0006] В аспектах настоящего изобретения представлены новые способы получения конъюгата тиазолидина-сахара и конъюгата этилендицистеина-сахара. Для получения конъюгата тиазолидина-сахара указанный способ может включать смешивание аминосахара с тиазолидин-карбоновой кислотой с образованием посредством этого конъюгата тиазолидина-сахара. Для получения конъюгата этилендицистеина-сахара указанный способ может дополнительно включать восстановление конъюгата тиазолидина-сахара восстанавливающим агентом, содержащим щелочной металл и источник электронов.

[0007] Например, аминосахар представляет собой аминогексозу или аминопентозу. Неограничивающие примеры аминогексозы включают аминопроизводные глюкозы, галактозы, маннозы, идозы, талозы, альтрозы, аллозы, гулозы или фруктозы. Конкретный пример аминогексозы представляет собой глюкозамин. Неограничивающие примеры аминопентозы включают аминопроизводные рибозы, ксилозы, арабинозы или ликсозы. Аминосахар представляет собой сахар, имеющий аминогруппу, расположенную в 2’, 3’, 4’ или 5’ положении сахара. В конкретном аспекте аминосахар имеет аминогруппу, расположенную в 2’ положении сахарного кольца.

[0008] Способ смешивания может быть осуществлен в органическом растворителе, таком как диметилформамид, диметилсульфоксид, диоксан, метанол, этанол, гексан, метиленхлорид, ацетонитрил, тетрагидрофуран или их смесь. В других аспектах способ смешивания может быть выполнен в водном растворителе.

[0009] Одна, две, три, четыре, пять или все гидроксильные группы аминосахара могут быть защищены, например, ацетильной или бензоильной группой, или могут быть незащищенными. В конкретном примере аминосахар представляет собой глюкозамин, защищенный ацетильными группами, такой как 1,3,4,6-тетра-О-ацетил-2-амино-α-D-глюкопиранозы гидрохлорид. Защитные группы представляют собой группы, обычно используемые в органическом синтезе, но не в синтезе в водных средах.

[0010] Способы настоящего изобретения могут дополнительно включать по меньшей мере одну стадию очистки. Любое соединение настоящего изобретения может быть очищено любым способом, известным специалистам в данной области. Специалистам в данной области известны такие способы, а также случаи, когда эти способы могут быть использованы. Например, в многостадийном синтезе, направленном на получение конкретного соединения, стадия очистки может быть выполнена после каждой стадии синтеза, после каждых нескольких стадий, в различное время в ходе синтеза и/или в самом конце синтеза. В некоторых способах одна или более стадий очистки включают методики, выбранные из группы, состоящей из силикагелевой колоночной хроматографии, ВЭЖХ (высокоэффективной жидкостной хроматографии) и ЖХ (жидкостной хроматографии). В некоторых вариантах реализации способы очистки специально включают эксклюзионную хроматографию и/или диализ. Способы очистки подробнее описаны ниже. В конкретном аспекте указанный способ может включать очистку конъюгата тиазолидина-сахара до его восстановления.

[0011] Для получения конъюгата этилендицистеина-сахара, конъюгат тиазолидина-сахара может быть восстановлен щелочным металлом и источником электронов. Щелочной металл может быть литием, натрием или калием. Источник электронов может быть жидким аммиаком, метиламином, этиламином или этилендиамином. В конкретном аспекте восстановление может быть восстановлением по Берчу.

[0012] Для создания конъюгата этилендицистеина(ЭЦ)-сахара, меченого металлическим ионом, указанный способ может дополнительно включать хелатирование металлического иона с конъюгатом этилендицистеина-сахара. Например, металлический ион выбран из группы металлических ионов, состоящей из иона технеция, иона олова (II), иона меди, иона индия, иона таллия, иона галлия, иона мышьяка, иона рения, иона гольмия, иона иттрия, иона самария, иона селена, иона стронция, иона гадолиния, иона висмута, иона железа, иона марганца, иона лютеция, иона кобальта, иона платины, иона кальция и иона родия. В некоторых аспектах металлический ион представляет собой радионуклид, и любой радионуклид, известный специалистам в данной области. Неограничивающие примеры радионуклидов включают ^99mTc, ^117mSn, ¹⁷⁷Lu, ¹⁸⁸Re, ¹⁸⁶Re, ¹⁵³Sm, ¹⁶⁶HO, ⁹⁰Y, ⁸⁹Sr, ⁶⁷Ga, ⁶⁸Ga, ¹¹¹In, ¹⁸³Gd, ⁵⁹Fe, ²²⁵Ac, ²¹²Bi, ²¹¹At, ⁴⁵Ti, ⁶⁰Cu, ⁶¹Cu, ⁶⁷Cu, ⁶⁴Cu и ⁶²Cu. В других аспектах металлический ион представляет собой не радиоактивный металл, такой как ¹⁸⁷Re.

[0013] Дополнительные варианты реализации настоящего изобретения относятся к способам визуализации очага, диагностики заболевания или лечения заболевания в организме субъекта. Указанный способ может включать получение конъюгата этилендицистеина(ЭЦ)-сахара, меченого металлическим ионом, полученного так, как описано в настоящем документе, и введение субъекту фармацевтически или диагностически эффективного количества конъюгата этилендицистеина(ЭЦ)-сахара, меченого металлическим ионом, и при этом происходит визуализация очага, диагностика заболевания или лечение заболевания.

[0014] Очаг, подлежащий визуализации, может быть опухолью. Способ может также включать лечение субъекта, страдающего раком. В конкретных аспектах рак представляет собой рак молочной железы, рак легких, рак предстательной железы, рак яичников, рак головного мозга, рак печени, рак шейки матки, рак ободочной кишки, рак почек, рак кожи, рак головы и шеи, рак костей, рак пищевода, рак мочевого пузыря, рак матки, лимфатический рак, рак желудка, рак поджелудочной железы, рак яичек, лимфому или лейкоз.

[0015] В дополнительных аспектах указанный способ визуализации очага в организме субъекта также включает обнаружение сигнала от конъюгата этилендицистеина(ЭЦ)-сахара, меченого металлическим ионом, который локализован в указанном очаге. Указанный сигнал может быть обнаружен с помощью приема, выбранного из группы, состоящей из позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ), ПЭТ/КТ, компьютерной томографии (КТ), однофотонной эмиссионной компьютерной томографии (ОФЭКТ), ОФЭКТ/КТ, магнитно-резонансной томографии (МРТ), ПЭТ/МРТ, ОФЭКТ/МРТ, оптической визуализации и ультразвука.

[0016] Очаг, подлежащий визуализации, может быть опухолью сердца. Указанный способ визуализации, диагностики или лечения относится к субъекту, страдающему сердечно-сосудистым заболеванием. Сердечно-сосудистое заболевание может быть инфарктом миокарда, застойной сердечной недостаточностью, кардиомиопатией, пороком клапана сердца, аритмией, врожденным пороком сердца, грудной жабой, экстракардиальным застоем по большому кругу кровообращения, систолической сердечной недостаточностью, сердечной недостаточностью с нормальной систолической функцией или правосторонней сердечной недостаточностью.

[0017] В дополнительном варианте реализации представлена композиция конъюгата или набор, содержащий конъюгат этилендицистеина-сахара в соответствии с указанными вариантами реализации и неомицин. В некоторых аспектах указанная композиция содержит от около 0,1 мг до около 1,0 мг неомицина на 1 мг конъюгата этилендицистеина-сахара (например, около 0,2-0,8, 0,3-0,7, 0,4-0,6 или около 0,5 мг на 1 мг конъюгата этилендицистеина-сахара). В дополнительных аспектах указанная композиция может дополнительно содержать антиоксиданты, стабилизирующие агенты, консерванты или соли. Например, композиция может дополнительно содержать аскорбиновую кислоту, цистеин и/или хлорид олова (II). В некоторых конкретных аспектах композиция содержит (а) от около 0,5 до 2,0 мг аскорбиновой кислоты на 1 мг конъюгата этилендицистеина-сахара; (b) от около 0,1 до 1,0 мг цистеина на 1 мг конъюгата этилендицистеина-сахара; и/или (с) от около 0,05 до 0,5 мг хлорида олова (II) на 1 мг конъюгата этилендицистеина-сахара. В некоторых аспектах композиция представляет собой водный раствор или раствор, который был заморожен и/или лиофилизирован.

[0018] В родственном варианте реализации представлен способ получения композиции конъюгата, включающий (а) растворение конъюгата этилендицистеина-сахара и неомицина в водном растворе (например, в растворе хлорида олова (II); и (b) лиофилизацию или замораживание указанного раствора с получением композиции конъюгата этилендицистеина-сахара. Точно так же представлен способ получения металлохелата конъюгата этилендицистеина-сахара, включающий смешивание раствора, содержащего конъюгат этилендицистеина-сахара и неомицин, с металлическим ионом (например, радиоактивным металлическим ионом) в соответствующих условиях с образованием хелата.

[0019] В дополнительном варианте реализации представлен способ визуализации очага, диагностики заболевания или лечения заболевания в организме субъекта, включающий введение конъюгата этилендицистеина(ЭЦ)-сахара, меченого металлическим ионом, пациенту, в сочетании с неомицином. Например, указанный способ может включать (а) получение композиции, содержащей конъюгат этилендицистеина(ЭЦ)-сахара, меченого металлическим ионом, и неомицин; и (b) введение субъекту фармацевтически или диагностически эффективного количества указанной композиции, и при этом происходит визуализация очага, диагностика заболевания или лечение заболевания.

[0020] В дополнительном варианте реализации представлена композиция, содержащая конъюгат этилендицистеина-сахара, меченого металлическим ионом, и неомицин (например, от около 0,1 мг до около 1,0 мг неомицина на 1 мг конъюгата этилендицистеина-сахара). Например, в некоторых аспектах указанная композиция предназначена для визуализации очага, диагностики заболевания или лечения заболевания в организме субъекта.

[0021] Варианты реализации, рассмотренные в контексте способов и/или композиций настоящего изобретения, могут быть использованы в отношении любого другого способа или композиции, описанной в настоящем документе. Следовательно, вариант реализации, относящийся к одному способу или композиции, может быть использован также в отношении других способов и композиций настоящего изобретения.

[0022] При использовании в описании, термины в единственном числе означают один или более. При использовании в формуле изобретения в сочетании со словом "включая", слова в единственном числе означают один или более одного.

[0023] Использование термина "или" в формуле изобретения означает "и/или", если явно не указано, что он относится только к альтернативам или если эти альтернативы являются взаимоисключающими, хотя настоящее описание поддерживает такое определение, которое относится только к альтернативам и к "и/или". Используемый в настоящем документе термин "другой" означает по меньшей мере второй или более.

[0024] В настоящей заявке термин "около" используется для указания того, что указанное значение включает неотъемлемые отклонения погрешности для указанного устройства, способа, используемого для определения указанного значения, или отклонений, которые существуют между исследуемыми объектами.

[0025] Другие задачи, особенности и преимущества настоящего изобретения станут понятны из следующего подробного описания. Тем не менее, следует иметь в виду, что подробное описание и конкретные примеры, указывая предпочтительные варианты реализации настоящего изобретения, представленные только для иллюстрации, поскольку возможны различные изменения и модификации в пределах общей идеи и рамок настоящего изобретения, которые станут понятны специалистам в данной области техники из подробного описания.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[0026] Следующие фигуры образуют часть настоящего описания и включены для дополнительной иллюстрации некоторых аспектов настоящего изобретения. Настоящее изобретение может быть лучше понятно со ссылкой на один или более из этих чертежей в сочетании с подробным описанием конкретных вариантов реализации, представленных в настоящем документе.

[0027] ФИГ. 1. Эффективный синтез ECG.

[0028] ФИГ. 2. ТСХ анализ ⁶⁸Ga-ECG с использованием солевого раствора в качестве элюента. Радио-ТСХ анализ чистоты ⁶⁸Ga-ECG составил >96%.

[0029] ФИГ. 3. ВЭЖХ анализ ^68/69Ga-ECG и ECG (подвижная фаза: H₂O/ацетонитрил, 9:1 об./об., скорость потока: 0,5 мл/мин., колонка: C18 - Extend (Agilent), УФ АБС 210 нм). ВЭЖХ анализ чистоты ⁶⁸Ga-ECG составил >96%.

[0030] ФИГ. 4. Анализ мгновенной ТСХ (верхний а, в солевом растворе) и ВЭЖХ (нижний b, детектор NaI) ^99mTc-ECG (подвижная фаза: H₂O/ацетонитрил, 9:1 об./об., скорость потока: 0,5 мл/мин., колонка: C18 - Extend (Agilent), УФ АБС: 210 нм). Радио-ТСХ и ВЭЖХ анализ чистоты ^99mTc-ECG составил >96%.

[0031] ФИГ. 5. ПЭТ-визуализация ¹⁸F-FDG и ⁶⁸Ga-ECG у крыс с мезотелиомой (400 мкКи/крыса, IV, за 45 минут). Для создания динамического графика использовали выделенные компьютером области исследования (ROI) (импульсы на пиксель) для опухоли и мышцы с соответствующим интервалом времени. Динамический график построили от 0 до 45 минут.

[0032] ФИГ. 6. ПЭТ-изображения ⁶⁸Ga-ECG у крыс с мезотелиомой (400 мкКи/крыса, IV, нижняя часть тела), до и после обработки через 45 минут. Верхний: исходное значение при размере опухоли 1,5 см, нижний: обработано паклитакселом (20 мг/кг, IV, одна доза на 7 день). T: опухоль.

[0033] ФИГ. 7. Плоскостная сцинтиграфия ^99mTc-EC (левый) и ^99mTc-ECG (300 мкКи/крыса, IV, получено 500000 импульсов) (средний и правый) у крыс с мезотелиомой. Значения представляют собой соотношения плотности импульсов в опухоли/мышце через 1 час (верхний график) и 2 часа (нижний график). T: опухоль.

[0034] ФИГ. 8. ¹H ЯМР для G-Ac-T

[0035] ФИГ. 9. ¹³C ЯМР для T-G-(Ac)4

[0036] ФИГ. 10. МС для T-G-(Ac)4

[0037] ФИГ. 11. ¹H ЯМР для EC-G

[0038] ФИГ. 12. ¹³C ЯМР для EC-G

[0039] ФИГ. 13. Масс-спектр для EC-G

[0040] ФИГ. 14. ВЭЖХ для EC-G

[0041] ФИГ. 15. ^99mTcEC-G (мгновенная ТСХ, с использованием солевого раствора в качестве элюента)

[0042] ФИГ. 16. Анализ мгновенной тонкослойной хроматографии ^99mTc-EC-G с использованием солевого раствора в качестве подвижной фазы. Бумага: Waterman № 1; № по каталогу: 3030614. Левый график представляет собой продукт, полученный с использованием набора, описанного в настоящем документе; правый график представляет собой стандартный ^99mTc-EC-G.

[0043] ФИГ. 17. Анализ ВЭЖХ 99mTc-EC-G, полученного с использованием набора, описанного в настоящем документе, с помощью H₂O/MeCN (9:1) в качестве элюента со скоростью потока 0,50 мл/мин. Колонка: Extend C18; серийный номер: USFK004129, Agilent).

[0044] ФИГ. 18. Анализ ВЭЖХ стандартного 99mTc-EC-G, с помощью H₂O/MeCN (9:1) в качестве элюента со скоростью потока 0,50 мл/мин. Колонка: Extend C18; серийный номер: USFK004129, Agilent).

[0045] ФИГ. 19. Поглощение 99mTc-EC-G, полученного из набора, и стандартного 99mTc-EC-G в клетках опухоли молочной железы крыс 13762. Левые графики представляют собой продукт из набора, а правые графики - стандартный продукт.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ РЕАЛИЗАЦИИ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0046] Настоящее изобретение относится к новым синтетическим способам получения конъюгата тиазолидина-сахара в качестве предшественников для получения конъюгата этилендицистеина-сахара. В настоящем изобретении дополнительно представлены способы синтеза конъюгата этилендицистеина-сахара. В некоторых аспектах эти синтетические способы могут исключать необходимость добавления защитных групп к этилендицистеину (ЭЦ) и повышать эффективность процесса и чистоту конечных продуктов, по сравнению с другими способами, описанными в публикации патента США № 20100055035 (включенной в настоящий документ путем ссылки).

[0047] В некоторых аспектах по меньшей мере часть способов настоящего изобретения осуществляется в органическом растворителе. Выбор растворителя для способов настоящего изобретения известен специалистам в данной области техники. Выбор растворителя может зависеть, например, от того, какой(-ие) из них облегчает солюбилизацию всех реагентов или, например, какой(-ие) из них лучше всего способствует заданной реакции (особенно, если известен механизм реакции). Растворители могут включать, например, полярные растворители и/или неполярные растворители. Растворитель может быть полярным апротонным растворителем, таким как диметилсульфоксид. Возможные растворители включают, но не ограничиваются этим, диметилформамид, диметилсульфоксид, диоксан, метанол, этанол, гексан, метиленхлорид, тетрагидрофуран и/или ацетонитрил. В некоторых вариантах реализации растворители включают этанол, диметилформамид и/или диоксан. Для любой конкретной реакции или процедуры очистки может быть выбрано более одного растворителя. С любым выбранным растворителем также может быть смешана вода; это может быть сделано, например, для улучшения растворимости одного или более реагентов. Представлены также способы на основе мокрой (водной) химии.

[0048] Как описано в настоящем документе, некоторые аспекты настоящего изобретения включают использование защитных групп для защиты аминосахара в его реакции с тиазолидином или его производными. Однако аспекты настоящего изобретения могут исключать необходимость в добавлении защитных групп к этилендицистеину (ЭЦ), как описано в публикации патента США № 20100055035.

[0049] Если необходимо селективно выполнить химическую реакцию в одном реакционноспособном сайте многофункционального соединения, то другие реакционноспособные сайты должны быть временно заблокированы. "Защитная группа" или "защищенная нуклеофильная группа", при использовании в настоящем документе, описывается как группа, используемая с целью такого временного блокирования. Во время синтеза макромолекул настоящего изобретения должны быть защищены различные функциональные группы с использованием защитных групп (или защитных агентов) на различных стадиях синтеза. Существует множество способов, хорошо известных специалистам в данной области техники, для осуществления такой стадии. Описание защитных агентов, их реакционноспособность, установка и применение представлено, например, в публикации Greene и Wuts (1999), которая включена путем ссылки в полном объеме. Функция защитной группы заключается в защите одной или более функциональностей (например, −NH2, −SH, −COOH) во время последующих реакций, ход которых может быть нарушен либо из-за того, что свободная (другими словами, незащищенная) функциональная группа подвергается реакции и функционализации таким образом, что она более не пригодна для последующих реакций, как если бы она была свободной, либо из-за того, что такая свободная функциональная группа мешает реакции. Одна и та же защитная группа может быть использована для защиты одной или более одинаковых или различных функциональных групп. Также могут быть использованы различные защитные группы для многостадийной защиты одного и того же типа функциональной группы в макромолекуле настоящего изобретения.

[0050] В конкретных аспектах могут быть защищены гидроксильные группы аминосахара в качестве исходного материала. Гидроксильные (или спиртовые) защитные группы хорошо известны специалистам в данной области техники. См., например, Greene и Wuts (1999), Глава 2. Эти защитные группы могут быть введены с помощью защитных агентов, хорошо известных специалистам в данной области техники. Снятие этих групп также хорошо известно специалистам в данной области техники.

[0051] Подходящая гидрокси-защитная группа может быть выбрана из группы, состоящей из сложных или простых эфиров. Сложные эфиры, такие как ацетатные, бензоильные, трет-бутилкарбонильные и трифторацетильные группы, могут быть удалены в кислотных или щелочных условиях. Простые эфиры, такие как метокси, этокси и три-бензилметил, могут быть удалены в более сильных кислотных или щелочных условиях. Предпочтительная защитная группа представляет собой ацетатный эфир.

[0052] Настоящее изобретение предусматривает способы смешивания аминосахара с тиазолидин-карбоновой кислотой. Условия для смешивания могут включать любые условия, подходящие для образования пептидной связи между аминосахаром и тиазолидин-карбоновой кислотой, такие как наличие одного или более связывающих агентов или катализаторов. Связывающие агенты, при использовании в настоящем документе, представляют собой реагенты, используемые для облегчения связывания аминогруппы и карбоксильной группы с образованием пептидной связи. Такие агенты хорошо известны специалистам в данной области техники и могут быть использованы в некоторых вариантах реализации способов настоящего изобретения. Примеры связывающих агентов включают, но не ограничиваясь этим, сульфо-N-гидроксисукцинимид (сульфо-NHS), диметиламинопиридин (DMAP), диазабицикло[5.4.0]ундец-7-ен (DBU), 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид (EDAC) и дициклогексилкарбодиимид (DCC). Предполагаются также другие карбодиимиды в качестве связывающих агентов. Связывающие агенты рассмотрены, например, в публикациях Bodansky, 1993 и Grant, 1992. Эти связывающие агенты могут быть использованы отдельно или в комбинации друг с другом или с другими агентами для облегчения сопряжения. Сопряженный продукт затем может быть очищен, например, силикагелевой колоночной хроматографией или ВЭЖХ.

[0053] В некоторых аспектах настоящего изобретения отсутствует необходимость в выполнении отдельной реакции снятия защиты. В реакции восстановления могут быть сняты защитные группы с одновременным превращением конъюгата тиазолидина-сахара в конъюгат этилендицистеина-сахара. Реакция восстановления включает использование восстанавливающего агента, содержащего щелочной металл и источник электронов, например, основание Льюиса. Щелочной металл может быть литием, натрием или калием. Источник электронов может быть основанием Льюиса, таким как жидкий аммиак, метиламин, этиламин или этилендиамин. В конкретном аспекте восстановление может быть восстановлением по Берчу. Например, восстанавливающий агент для восстановления по Берчу содержит металлический литий или натрий и жидкий аммиак. В альтернативных вариантах реализации восстанавливающий агент содержит металлический литий, металлический натрий, металлический калий или металлический кальций и метиламин или этиламин. Реакционная смесь для восстановления по Берчу может содержать смесь растворителей. Эта смесь растворителей может содержать изопропиловый спирт (IPA), трет-бутиловый спирт, тетрагидрофуран (ТГФ), аммиак или их комбинации. В зависимости от используемых реагентов восстановление по Берчу может происходить при температуре от около −80°C до около 55°C. При использовании в качестве реагента жидкого аммиака, восстановление может происходить при температуре от около −80°C до около −35°C. При использовании в качестве реагента метиламина или этиламина, восстановление может происходить при температуре от около −10°C до около 10°C. Реакционную смесь для восстановления по Берчу поддерживают при указанных выше температурах в течение от около 10 минут до около 4 часов.

[0054] Как указано выше, специалистам в данной области техники хорошо знакомы способы очистки соединений настоящего изобретения. Используемый в настоящем документе термин "очистка" относится к любому измеримому увеличению чистоты, по сравнению с чистотой материала до очистки. Как правило, возможна очистка каждого соединения настоящего изобретения, включая очистку промежуточных соединений, а также очистку конечных продуктов. Стадия очистки не всегда включена в общие методики, описанные ниже, но специалистам в данной области понятно, что эти соединения могут быть, как правило, очищены на любой стадии. Примеры способов очистки включают гель-фильтрацию, эксклюзионную хроматографию (называемую также гель-фильтрационной хроматографией, гель-проникающей хроматографией или молекулярной эксклюзией), диализ, перегонку, перекристаллизацию, сублимацию, дериватизацию, электрофорез, силикагелевую колоночную хроматографию и высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ), включая нормально-фазовую ВЭЖХ и обращенно-фазовую ВЭЖХ. В некоторых вариантах реализации эксклюзионная хроматография и/или диализ специально исключены как формы очистки соединений настоящего изобретения. Очистка соединений силикагелевой колоночной хроматографией или ВЭЖХ, например, обеспечивает преимущество получения заданных соединений с очень высокой степенью чистоты, зачастую более высокой, чем при очистке соединений другими способами. Также может быть определена радиохимическая чистота соединений настоящего изобретения. Способы определения радиохимической чистоты хорошо известны в данной области техники и включают хроматографические способы в сочетании со способами обнаружения радиоактивности (например, анализ авторадиографии). Ниже представлены также примеры сравнения чистоты соединений, полученных органическим и мокрым способами и очищенных различными способами.

[0055] Способы определения чистоты соединений хорошо известны специалистам в данной области техники и включают, в неограничивающих примерах, авторадиографию, масс-спектроскопию, определение температуры плавления, ультрафиолетовый анализ, калориметрический анализ, (ВЭЖХ), тонкослойную хроматографию и анализ ядерного магнитного резонанса (ЯМР) (включая, но не ограничиваясь этим, ¹H и ¹³C ЯМР). В некоторых вариантах реализации может быть использован калориметрический способ для титрования чистоты промежуточных соединений или конечных продуктов. В одном варианте реализации чистота неизвестного соединения может быть определена ее сравнением с соединением известной чистоты: это сравнение может быть в форме соотношения, измерение которого описывает чистоту неизвестного соединения. Программное обеспечение, имеющееся в различных приборах (например, спектрофотометрах, ВЭЖХ, ЯМР), а также другие средства, известные специалистам в данной области, могут облегчать выполнение этих определений специалистами в данной области.

[0056] Настоящее изобретение дополнительно предусматривает способы хелатирования (также называемого координацией) одного или более металлических ионов с конъюгатом этилендицистеина-сахара с образованием конъюгата этилендицистеина(ЭЦ)-сахара, меченого металлическим ионом. Такие стадии хелатирования могут иметь место в органическом растворителе. В других вариантах реализации хелатирование имеет место в водной среде. В некоторых вариантах реализации хелатирующий агент ЭЦ и сахар могут способствовать хелатированию металлического иона. В предпочтительных вариантах реализации металлический ион образует хелат только с хелатирующим агентом ЭЦ. Хелатированный металлический ион может быть связан, например, ионной связью, ковалентной связью или координационной ковалентной связью (также называемой донорно-акцепторной связью). Способы такой координации хорошо известны специалистам в данной области техники. В одном варианте реализации координация может происходить за счет примешивания металлического иона в раствор, содержащий конъюгат этилендицистеина-сахара. В другом варианте реализации координация может происходить за счет примешивания металлического иона в раствор, содержащий конъюгат ЭЦ-сахара.

[0057] В некоторых неограничивающих примерах металлический ион может представлять собой технеций, индий, рений, галлий, медь, гольмий, платину, гадолиний, лютеций, иттрий, кобальт, кальций, мышьяк или любой их изотоп. Любой металлический ион, описанный в настоящем документе, может быть хелатирован с соединением настоящего изобретения.

[0058] Некоторые аспекты настоящего изобретения относятся к композициям, в которых терапевтический фрагмент сопряжен с конъюгатом хелатирующего агента настоящего изобретения, таким как конъюгат этилендицистеина-сахара. Композиция настоящего изобретения, в некоторых вариантах реализации, может быть пригодна одновременно при визуализации и терапии. В некоторых конкретных вариантах реализации терапевтический фрагмент представляет собой фрагмент, который является агентом, обладающий известным или предполагаемым преимуществом при лечении или предупреждении гиперпролиферативного заболевания у субъекта. Субъект может быть животным, таким как млекопитающее. В некоторых конкретных вариантах реализации субъект представляет собой человека.

[0059] В других вариантах реализации настоящего изобретения терапевтический фрагмент представляет собой терапевтический металлический ион (например, Re-188, Re-187, Re-186, Ho-166, Y-90, Sr-89 и Sm-153), а конъюгат этилендицистеина-сахара, хелатированный с металлом, представляет собой агент, являющийся терапевтическим агентом (а не агентом визуализации), который может быть использован при лечении или предупреждении гиперпролиферативного заболевания.

[0060] Гиперпролиферативное заболевание в настоящем документе описывается как заболевание, связанное с патологическим клеточным ростом или патологической скоростью обновления клеточной популяции. Например, гиперпролиферативное заболевание может быть раком. Термин "рак", используемый в настоящем документе, описывается как неконтролируемый и прогрессирующий рост клеток в ткани. Специалистам в данной области техники знакомы другие существующие синонимичные термины, такие как неоплазма или злокачественное образование, или опухоль. Для лечения по способам настоящего изобретения предполагаются любые типы рака. Например, рак может представлять собой рак молочной железы, рак легких, рак яичников, рак головного мозга, рак печени, рак шейки матки, рак ободочной кишки, рак почек, рак кожи, рак головы и шеи, рак костей, рак пищевода, рак мочевого пузыря, рак матки, рак желудка, рак поджелудочной железы, рак яичек, лимфому или лейкоз. В других вариантах реализации настоящего изобретения рак представляет собой метастатический рак.

[0061] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения композиции настоящего изобретения пригодны для дуальной химиотерапии и радиационной терапии (радиохимиотерапии). Например, конъюгат хелатирующего ЭЦ-сахара, представленный в настоящем документе, может быть хелатирован с металлическим ионом, который представляет собой терапевтический металлический ион, а также с терапевтическим фрагментом (таким как противораковый фрагмент). В качестве другого примера, терапевтический металлический ион может быть хелатирован одновременно с ЭЦ и сахарным фрагментом в конъюгате ЭЦ-сахара.

[0062] Например, металлический ион может быть бета-эмиттером. При использовании в настоящем документе, бета-эмиттер представляет собой любой агент, который испускает энергию бета-излучения в любом диапазоне. Примеры бета-эмиттеров включают Re-188, Re-187, Re-186, Ho-166, Y-90 и Sn-153. Специалистам в данной области техники хорошо известны эти агенты для применения при лечении гиперпролиферативных заболеваний, таких как рак.

[0063] Специалистам в данной области техники знакомы дизайны химиотерапевтических протоколов и протоколов радиационной терапии, которые могут быть использованы при введении соединений настоящего изобретения. Как описано ниже, эти агенты могут быть использованы в комбинации с другими терапевтическими способами, направленными на лечение гиперпролиферативных заболеваний, таких как рак. Более того, специалистам в данной области техники известны способы выбора подходящей дозы для введения субъекту. Протокол может включать однократную дозу или многократные дозы. Пациент может наблюдаться на токсичность и реакцию на лечение по протоколам, известным специалистам в данной области техники.

[0064] Фармацевтические композиции настоящего изобретения содержат терапевтически или диагностически эффективное количество композиции настоящего изобретения. Выражения "фармацевтически или фармакологически приемлемые" или "терапевтически эффективные" или "диагностически эффективные" относятся к молекулярным фрагментам и композициям, которые не вызывают неблагоприятную, аллергическую или другую нежелательную реакцию при введении животному, такому как, например, человек, в зависимости от конкретного случая. Получение терапевтически эффективных или диагностически эффективных композиций известно специалистам в данной области техники в свете настоящего описания, как показано на примерах в публикации Remington, Pharmaceutical Sciences, 18ое изд. Mack Printing Company, 1990, включенной в настоящий документ путем ссылки. Кроме того, для введения животному (например, человеку) следует понимать, что препараты должны соответствовать стандартам стерильности, пирогенности, общей безопасности и чистоты, в соответствии с требованиями отдела биологических стандартов FDA.

[0065] Используемое в настоящем документе выражение "композиция, содержащая терапевтически эффективное количество" или "композиция, содержащая диагностически эффективное количество" включает любой и все растворители, дисперсионные среды, покрытия, поверхностно-активные вещества, антиоксиданты, консерванты (например, антибактериальные агенты, противогрибковые агенты), изотонические агенты, агенты для замедления абсорбции, соли, консерванты, лекарства, стабилизаторы для лекарств, гели, связующие вещества, вспомогательные вещества, агенты для улучшения распадаемости таблеток, смазывающие вещества, подсластители, ароматизаторы, красители, подобные материалы и их комбинации, известные специалистам в данной области техники. За исключением случаев, когда какой-либо стандартный носитель является несовместимым с активным агентом, подразумевается его применения в представленных композициях.

[0066] Композиции настоящего изобретения могут содержать различные типы носителей, в зависимости от того, будут ли они введены в твердой, жидкой или аэрозольной форме, а также от необходимости их стерильности для таких способов введения, как инъекция. Композиции настоящего изобретения могут быть введены внутривенно, внутрикожно, внутриартериально, внутрибрюшинно, внутриочагово, интракраниально, внутрисуставно, внутрипростатически, внутриплеврально, интратрахеально, интраназально, интравитреально, внутривагинально, интраректально, локально, внутритуморально, внутримышечно, внутрибрюшинно, подкожно, субконъюнктивально, внутрисосудисто, мукозально, внутриперикардиально, внутрипупочно, интраокулярно, перорально, местно, локально, инъекцией, инфузией, непрерывной инфузией, локализованной перфузией, омывающей непосредственно целевые клетки, через катетер, через лаваж, в липидных композициях (например, липосомах) или другим способом или любой комбинацией из вышеописанных, как известно специалистам в данной области техники.

[0067] Фактическое необходимое количество композиции настоящего изобретения, вводимой пациенту, может быть определено физическими и физиологическими факторами, такими как масса тела, тяжесть состояния, ткань, подлежащая визуализации, тип заболевания, подлежащего лечению, предшествующие или параллельные визуализирующие или терапевтические вмешательства, индивидуальные особенности пациента и способ введения. Лечащий врач, ответственный за введение, в любом случае должен определить концентрацию активного ингредиента(-ов) в композиции и соответствующую дозу(-ы) для конкретного субъекта.

[0068] В некоторых вариантах реализации фармацевтические композиции могут содержать, например, по меньшей мере около 0,1% хелата хелатирующего агента и металлического иона. В других вариантах реализации активное соединение может содержать от около 2% до около 75% от массы единицы дозирования или, например, от около 25% до около 60%, а также любые диапазоны, которые могут быть получены в их пределах. В других не ограничивающих примерах доза может содержать также от около 0,1 мг/кг/массы тела до около 1000 мг/кг/массы тела или любое количество в пределах этого диапазона, или любое количество, превышающее 1000 мг/кг/массы тела на одно введение.

[0069] В любом случае композиция может содержать различные антиоксиданты для замедления окисления одного или более компонентов. Кроме того, предотвращение действия микроорганизмов может быть осуществлено за счет консервантов, таких как различные антибактериальные и противогрибковые агенты, включая, но не ограничиваясь этим, парабены (например, метилпарабены, пропилпарабены), хлорбутанол, фенол, сорбиновая кислота, тимеросал или их комбинации.

[0070] Композиции настоящего изобретения могут быть составлены в форме свободного основания, в нейтральной или солевой форме. Фармацевтически приемлемые соли включают соли, образованные со свободными карбоксильными группами, полученные из неорганических оснований, таких как, например, гидроксиды натрия, калия, аммония, кальция или железа; или таких органических оснований как изопропиламин, триметиламин, гистидин или прокаин.

[0071] В тех вариантах реализации, в которых композиция представлена в жидкой форме, носитель может быть растворителем или дисперсионной средой, включая, но не ограничиваясь этим, воду, этанол, многоатомный спирт (например, глицерин, пропиленгликоль, жидкий полиэтиленгликоль и так далее), липиды (например, триглицериды, растительные масла, липосомы) и их комбинации. Надлежащая текучесть может поддерживаться, например, за счет использования покрытий, таких как лецитин; за счет поддержания заданного размера частиц путем их диспергирования в носителях, таких как, например, жидкий полиол или липиды; за счет использования поверхностно-активных веществ, таких как, например, гидроксипропилцеллюлоза; или комбинацией таких способов. Во многих случаях предпочтительно включать изотонические агенты, такие как, например, сахара, хлорид натрия или их комбинации.

[0072] Стерильные растворы для инъекций могут быть приготовлены с использованием таких приемов как стерилизующая фильтрация. Как правило, дисперсии получают путем введения различных стерилизованных активных ингредиентов в стерильный жидкий носитель, который содержит базовую дисперсионную среду и/или другие ингредиенты. В случае стерильных порошков для приготовления стерильных растворов, суспензий или эмульсий для инъекций, предпочтительные способы приготовления представляют собой приемы высушивания в вакууме или высушивания замораживанием, в результате которых получают порошок активного ингредиента плюс любой дополнительный заданный ингредиент из предварительно стерильно отфильтрованной жидкой среды. Жидкая среда должна быть при необходимости забуферена надлежащим образом, а жидкому разбавителю перед инъекцией сначала необходимо сообщить свойства изотоничности с помощью достаточного количества солевого раствора или глюкозы. Предполагается также получение высококонцентрированных композиций для непосредственной инъекции, в которых предусмотрено использование ДМСО (диметилсульфоксида) в качестве растворителя для обеспечения чрезвычайно быстрого проникновения, доставки высоких концентраций активных агентов в небольшую зону.

[0073] Композиция должна быть стабильной в условиях производства и хранения и должна быть защищена от заражающего действия микроорганизмов, таких как бактерии и грибки. Следует понимать, что заражение эндотоксинами должно быть по меньшей мере на безопасном уровне, например, менее 0,5 нг/мг белка.

[0074] В конкретных вариантах реализации пролонгированная абсорбция инъецируемой композиции может быть обеспечена за счет применения в композициях агентов, замедляющих абсорбцию, таких как, например, моностеарат алюминия, желатин или их комбинации.

[0075] Композиции настоящего изобретения могут быть использованы в различных радиологических медицинских приемах визуализации, известных специалистам в данной области техники. Например, подразумевается сцинтиграфическое исследование как способ визуализации, который может быть использован для измерения сигнала, полученного от металлического иона, хелатированного с конъюгатом ЭЦ-сахара. Специалистам в данной области техники известны приемы применения сцинтиграфического исследования (см., например, Kundra et al., 2002, специально включенный в настоящий документ путем ссылки).

[0076] Радионуклидные способы визуализации (позитрон-эмиссионная томография (ПЭТ); однофотонная эмиссионная компьютерная томография (ОФЭКТ)) представляют собой диагностические приемы визуализации в поперечном разрезе, которые определяют распределение и концентрацию радиоактивных индикаторов с радионуклидной меткой. Хотя КТ и МРТ обеспечивают значительную анатомическую информацию о расположении и распространенности опухолей, эти средства визуализации не обеспечивают надлежащее различие инвазивных очагов от опухоли, радиационного некроза, дифференцирования или глиоза. ПЭТ и ОФЭКТ могут быть использованы для локализации и характеристики опухолей за счет измерения метаболической активности.

[0077] ПЭТ и ОФЭКТ дают информацию, касающуюся информации на клеточном уровне, такой как клеточная жизнеспособность. В случае ПЭТ пациент проглатывает или получает инъекцию слабо радиоактивного вещества, испускающего позитроны, которое можно наблюдать как вещество, движущееся через организм. Например, в одном общепринятом применении пациентам вводят глюкозу с присоединенными эмиттерами позитронов и наблюдают головной мозг пациентов при выполнении различных заданий. Поскольку при работе головного мозга используется глюкоза, изображение ПЭТ демонстрирует области с высокой активностью головного мозга.

[0078] С ПЭТ тесно связана однофотонная эмиссионная компьютерная томография или ОФЭКТ. Основное различие между ними заключается в том, что вместо позитрон-испускающего вещества в ОФЭКТ используют радиоактивный индикатор, который испускает фотоны низкой энергии. ОФЭКТ представляет собой ценность для диагностики заболеваний коронарной артерии, и в Соединенных штатах Америки ежегодно выполняется уже около 2,5 миллионов ОФЭКТ исследований сердца.

[0079] ПЭТ радиофармацевтические средства для визуализации обычно метят эмиттерами позитронов, такими как ¹¹C, ¹³N, ¹⁵О, ¹⁸F, ⁸²Rb, ⁶²Cu и ⁶⁸Ga. ОФЭКТ радиофармацевтические средства обычно метят эмиттерами позитронов, такими как ^99mTc, ²⁰¹Tl и ⁶⁷Ga. В отношении визуализации головного мозга, ПЭТ и ОФЭКТ радиофармацевтические средства классифицируют по проницаемости гематоэнцефалического барьера (ГЭБ), перфузии головного мозга и связыванию рецептора метаболизма, а также по связыванию антигена-антитела (Saha et al., 1994). ОФЭКТ агенты гематоэнцефалического барьера, такие как ^99mTcO4-DTPA, ²⁰¹Tl и [⁶⁷Ga]цитрат исключаются нормальными клетками головного мозга, но входят в опухолевые клетки из-за измененного ГЭБ. ОФЭКТ перфузионные агенты, такие как [¹²³I]IMP, [^99mTc]HMPAO, [^99mTc]ECD, представляют собой липофильные агенты и поэтому диффундируют в нормальный головной мозг. Важные рецептор-связывающие ОФЭКТ радиофармацевтические средства включают [¹²³I]QNE, [¹²³I]IBZM и [¹²³I]иомазенил. Эти индикаторы связываются с определенными рецепторами и важны для оценки заболеваний, связанных с рецепторами.

[0080] Компьютерная томография (КТ) предполагается как способ визуализации в контексте настоящего изобретения. Снимая под различными углами группы рентгеновских лучей, количество которых иногда составляет более тысячи, с последующим их объединением с помощью компьютера, КТ обеспечивает возможность построения трехмерного изображения любой части тела. Компьютер запрограммирован для отображения двухмерных срезов под любым углом и на любой глубине.

[0081] В случае КТ внутривенная инъекция рентгеноконтрастного агента может способствовать идентификации и выявлению масс мягкой ткани, если первоначальные КТ изображения не являются диагностическими. Точно так же, контрастные агенты способствуют оценке васкулярности очага в мягкой ткани или кости. Например, использование контрастных агентов может способствовать выявлению взаимосвязи опухоли с соседних сосудистых структур.

[0082] КТ контрастные агенты включают, например, йодированные контрастные среды. Примеры этих агентов включают йоталамат, йогексол, диатризоат, йопамидол, этиодол и йопаноат. В качестве КТ контрастного агента описано также применение гадолиниевых агентов (см., например, Henson et al., 2004). Например, в качестве КТ контрастного агента были использованы гадопентатные агенты (рассмотренные в публикации Strunk и Schild, 2004).

[0083] Магнитно-резонансная томография (МРТ) представляет собой более новый способ визуализации, чем КТ, в котором для получения изображений используются мощные магнитные и радиочастотные сигналы. Наиболее распространенные молекулярные частицы в биологических тканях представляют собой воду. Квантово-механический "спин" протонных ядер воды в конечном итоге обусловливает появление сигнала в экспериментах по визуализации. В МРТ образец, подлежащий визуализации, помещают в мощное статическое магнитное поле (1-12 Тесла) и возбуждают спины импульсом радиочастотного (RF) излучения с получением результирующей намагниченности в образце. Затем различные градиенты магнитного поля и другие радиочастотные импульсы действуют на спины, кодируя пространственную информацию в записываемые сигналы. Собирая и анализируя эти сигналы, можно составить трехмерное изображение, которое, как и КТ изображение, обычно отображается в двухмерных срезах.

[0084] Контрастные агенты, используемые в МР визуализации, отличаются от агентов, используемых в других способах визуализации. Они предназначены для облегчения различия компонентов тканей с идентичными характеристиками сигнала и для сокращения времени релаксации (что дает более сильный сигнал на Т1-взвешенных спин-эховых МР изображениях и менее интенсивныый сигнал на Т2-взвешенных изображениях). Примеры МРТ контрастных агентов включают хелаты гадолиния, хелаты марганца, хелаты хрома и частицы железа.

[0085] КТ и МРТ дают анатомическую информацию, которая помогает определить границы ткани и сосудистой структуры. По сравнению с КТ, недостатки МРТ включают слабую переносимость пациентов, противопоказания для электрокардиостимуляторов и некоторых других имплантированных металлических устройств, а также помехи, связанные со многими причинами, не последней из которых является движение (Alberico et al., 2004). С другой стороны, КТ представляет собой быстрый, хорошо переносимый пациентами и легкодоступный способ, но он обладает меньшим контрастным разрешением, чем МРТ и требует использования йодированного контраста и ионизирующего излучения (Alberico et al., 2004). Недостаток обоих КТ и МРТ заключается в том, что ни один из этих способов не дает функциональную информацию на клеточном уровне. Например, ни один из этих способов не дает информацию о клеточной жизнеспособности.

[0086] Оптическая визуализация представляет собой другой способ визуализации, получивший широкое распространение в определенных областях медицины. Примеры включают оптическое мечение клеточных компонентов и ангиографию, такую как ангиография с флуоресцеином и ангиография с индоцианином зеленым. Примеры агентов оптической визуализации включают, например, флуоресцеин, производные флуоресцеина, индоцианин зеленый, орегоновый зеленый, производные орегонового зеленого, родамин зеленый, производные родамина зеленого, эозин, эритрозин, техасский красный, производные техасского красного, малахитовый зеленый, сульфосукцинимидиловый эфир нанозолота, каскадный синий, производные кумарина, нафталин, производные пиридилоксазола, краситель каскадный желтый или краситель дапоксил.

[0087] Другой способ биомедицинской визуализации, получивший широкое распространение, представляет собой ультразвук. Ультразвуковая визуализация используется неинвазивно для обеспечения изображений в поперечном разрезе и даже трехмерных изображений в реальном времени структур мягких тканей и информации о кровообращении в организме. Высокочастотные звуковые волны и компьютер создают изображения кровеносных сосудов, тканей и органов.

[0088] Ультразвуковая визуализация кровотока может быть ограничена рядом факторов, таких как размер и глубина кровеносного сосуда. Ультразвуковые контрастные агенты, относительно недавняя разработка, включают перфлюорин и аналоги перфлюорина, которые предназначены для преодоления этих ограничений за счет улучшения черно-белых изображений и сигналов Доплера.

[0089] Некоторые варианты реализации настоящего изобретения относятся к способам визуализации определенного участка в организме субъекта с использованием двух способов визуализации, которые включают измерение первого сигнала и второго сигнала от комплекса визуализирующего фрагмента и хелатирующего металла. Первый сигнал получают от иона металла, а второй сигнал получают от визуализирующего фрагмента. Как показано выше, любой способ визуализации, известный специалистам в данной области техники, может быть использован в этих вариантах реализации представленных способов визуализации.

[0090] Способы визуализации осуществляют в любое время во время или после введения композиции, содержащей диагностически эффективное количество композиции настоящего изобретения. Например, визуализирующие исследования могут быть выполнены во время введения дуальной визуализирующей композиции настоящего изобретения или в любое время впоследствии. В некоторых вариантах реализации первый способ визуализации выполняют, начиная одновременно с введением дуального агента визуализации или примерно через 1 секунду, 1 час, 1 день или любой более продолжительный период времени после введения дуального агента визуализации, или в любое время между любыми из указанных точек времени.

[0091] Второй способ визуализации может быть выполнен одновременно с первым способом визуализации или в любое время после первого способа визуализации. Например, второй способ визуализации может быть выполнен примерно через 1 секунду, примерно через 1 час, примерно через 1 день или через любой более продолжительный период времени после завершения первого способа визуализации, или в любое время между любыми из указанных точек времени. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения первый и второй способ визуализации выполняют параллельно, так что они начинаются одновременно после введения агента. Специалистам в данной области известно выполнение различных способов визуализации, предусмотренных настоящим изобретением.

[0092] В некоторых вариантах реализации представленных способов двойной визуализации, одно и то же устройство визуализации используют для выполнения первого способа визуализации и второго способа визуализации. В других вариантах реализации используют другое устройство визуализации для выполнения второго способа визуализации. Специалистам в данной области техники известны устройства визуализации, доступные для выполнения первого способа визуализации и второго способа визуализации, и специалистам в данной области техники известно применение этих устройств для создания изображений. Дополнительные подробности диагностических и терапевтических способов представлены в публикации US 2008/0107198 (включенной в настоящий документ путем ссылки).

[0093] Следующие примеры включены для иллюстрации предпочтительных вариантов реализации настоящего изобретения. Специалистам в данной области техники понятно, что способы, описанные в следующих примерах, представляют собой способы, которые, как было обнаружено авторами изобретения, хорошо работают при практическом осуществлении настоящего изобретения и, следовательно, могут считаться предпочтительными способами его практического осуществления. Однако специалистам в данной области техники, в свете настоящего описания, понятно, что могут быть сделаны многочисленные изменения в конкретных вариантах реализации, описанных в настоящем документе, которые приводят к получению таких же или аналогичных результатов, без отклонения от общей идеи и рамок настоящего изобретения.

ПРИМЕРЫ

Пример 1 - Синтез N,N-этилендицистеин-глюкозамина (EC-G). См. ФИГ. 1.

[0094] Общая информация

[0095] Все химические реактивы и растворители приобрели у компании Sigma-Aldrich (Сент-Луис, штат Миссури). Ядерный магнитный резонанс (ЯМР) выполнили на спектрометре Bruker 300 МГц, а масс-спектры выполнили на масс-спектрометре Waters Q-TOF Ultima (Милфорд, штат Массачусетс) в главном центре Онкологического центра им. М.Д. Андерсона при Техасском университете (UTMDACC; Хьюстон, штат Техас). Химические сдвиги записали в δ (м.д.), а значения J - в Герцах. FDG приобрели в отделе ядерной медицины UTMDACC.

[0096] Синтез ECG

[0097] Стадия 1. Синтез T-G-(Ac)₄

[0098] К раствору тиазолидин-4-карбоновой кислоты (Т) (2,6 г, 0,02 моль) в ДМФ (20 мл) и 5,0 мл триметиламина добавляли 1-гидроксибензотриазола гидрат, 2,7 г (0,02 моль). Через 30 минут к смеси добавляли 1,3,4,6-тетра-О-ацетил-2-амино-α-D-глюкопиранозы гидрохлорид (G-(Ac)₄) (7,7 г, 0,02 моль), N,N′-дициклогексилкарбодиимид (DCC; 4,2 г, 0,02 моль) и 4-диметиламинопиридин (DMAP; 1,2 г, 0,01 моль) и перемешивали в течение ночи при комнатной температуре. Раствор упаривали до сухости под высоким вакуумом. К остатку добавляли дихлорметан (CH₂Cl₂) (50 мл) и выдерживали при 4°C в течение ночи, затем отфильтровали. Продукт очищали силикагелем, элюируя CH₂Cl₂/MeOH(95/5, об./об.) с получением белого продукта, T-G-(Ac)₄, 4,08 г (44,2%). ЯМР и масс-спектрометрию использовали для подтверждения структуры T-G-(Ac)₄.

[0099] Стадия 2. Реакция восстановления

[0100] По кусочкам добавляли натрий к раствору T-G-(Ac)₄ (4,08 г, 8,8 ммоль) в жидком аммиаке (170 г). Цвет раствора медленно изменился на темно-синий. Через 30 минут добавляли небольшое количество хлорида аммония. Жидкий аммиак удаляли под пониженным давлением. Остаточное твердое вещество растирали с метанолом (100 мл). Затем твердое вещество отфильтровали и промывали дополнительным количеством метанола (50 мл) с получением неочищенного продукта, 4,16 г. Для получения ECG аналитической чистоты, неочищенный продукт (0,1 г) растворяли в 1,0 мл HCl (0,1 н.) и очищали на колонке Sephadex, элюируя H₂O. Водные фракции объединяли и лиофилизировали с получением EC-G, 0,029 г (46,7%). ЯМР, масс-спектрометрию и ВЭЖХ использовали для подтверждения структуры ECG.

[0101] Результаты

[0102] Схема синтеза показана на ФИГ. 1. ECG синтезировали по реакциям в две стадии. На первой стадии тиазолидин-4-карбоновая кислота (Т) взаимодействовала с 1,3,4,6-тетра-О-ацетил-2-амино-α-D-глюкопиранозы гидрохлоридом (G-(Ac)₄) в присутствии 1-гидроксибензотриазола гидрата, DCC и DMAP. После очистки выход продукта T-G-(Ac)₄ составил 44,2%. ¹H ЯМР (D₂O, δ): 1,97-2,14 (м, 12H), 3,88 (т, 1H), 3,93 (с, 2H), 4,05-4,10 (м, 6H), 4,22-4,30 (м, 2H), 5,09 (т, 1H), 5,34 (т, 1H), 5,80 (д, 1H), 6,93 (д, 1H). ¹³C ЯМР (D₂O, δ): 171,19, 171,00, 170,65, 169,35, 166,35, 141,76, 92,05, 82,45, 72,79, 72,02, 68,02, 61,73, 60,39, 53,21, 42,32, 20,84, 20,68, 20,58, 20,55. FAB МС m/z: 462,5.

[0103] На второй стадии T-G-(Ac)₄ восстанавливали натрием в жидком аммиаке (восстановление по Берчу). Неочищенный продукт очистили на колонке Sephadex с получением ECG (46,7%). ВЭЖХ показала чистоту более 82%. ¹H ЯМР (D₂O, δ): 3,15-3,20 (м, 4H), 3,78-4,05 (м, 6H), 4,08-4,15 (м, 8H), 4,2-4,3 (д, 2H), 4,68-4,73 (д, 2H), 5,19-5,21 (д, 2H)., ¹³C ЯМР (D₂O, δ): 174,81, 174,56, 94,95, 90,87, 90,84, 75,96, 73,91, 73,85, 71,59, 70,71, 70,66, 70,10, 69,88, 60,72, 60,62, 56,72, 54,11, 23,33, 22,23, 21,96. FAB МС m/z: 591.

Пример 2 - Синтез холодного Ga-ECG

[0104] ⁶⁹GaCl₃ (20 мг, 0,11 ммоль) в 0,2 мл H₂O добавляли к раствору ECG (60 мг, 0,1 ммоль) в 0,5 мл H₂O. Значение рН довели до 4-5 с помощью 0,1 н. NaOH (50 мкл). Раствор нагревали в течение 30 минут при 60°C. Продукт очищали на колонке Sephadex, элюируя H₂O, с получением Ga-ECG. После лиофилизации получали Ga-ECG в виде белого твердого вещества (52 мг, 78,1%). ЯМР, масс-спектрометрию и ВЭЖХ использовали для подтверждения структуры ⁶⁹Ga-ECG.

[0105] ЯМР холодного ⁶⁹Ga-ECG: ¹H ЯМР (D₂O, δ): 2,94-3,38 (м, 8H), 3,43-3,65 (м, 4H), 3,50-3,80 (м, 10H), 3,92-4,02 (т, 2H), 4,23-4,34 (д, 2H), 5,15-5,34 (д, 2H). ¹³C ЯМР (D₂O, δ): 175,51, 175,16, 95,55, 90,85, 90,67, 75,76, 74,90, 73,55, 71,59, 70,71, 70,66, 70,10, 69,88, 60,72, 60,62, 56,72, 54,11, 23,53, 22,83, 22,16. Радио-ТСХ и ВЭЖХ анализ чистоты ⁶⁸Ga-ECG и ^99mTc-ECG составил >96% (ФИГ. 2-4). ВЭЖХ холодного ⁶⁹Ga-ECG использовали для подтверждения структуры ⁶⁸Ga-ECG (ФИГ. 3).

Пример 3 - Радиосинтез ⁶⁸Ga-ECG и ^99mTc-ECG

[0106] ⁶⁸GaCl₃ получали из ⁶⁸Ge/⁶⁸Ga-генератора (Eckert Ziegler, Валенсия, штат Калифорния), элюируя 0,1 н. HCl. ⁶⁸GaCl₃ (120 мкл, 300 мкКи) добавляли к раствору ECG (1,2 мг) в 0,1 мл H₂O, а значение рН доводили до 4-5 с помощью NaHCO₃ (40 мкл, 0,1 н.). Раствор нагревали при 60°C в течение 15 минут. Пертехнетат натрия (Na^99mTcO₄) получали из ⁹⁹MO/^99mTc-генератора, приобретенного у Covidien (Хьюстон, штат Техас). Радиосинтез ^99mTc-ECG выполняли добавлением ^99mTc-пертехнетата (40-50 мкКи) в лиофилизированный остаток ECG (5 мг) и хлорид олова (II) (SnCl₂, 100 мкг). Комплесообразование ECG с ^99mTc выполняли при рН 6,5. Радиохимическую чистоту определяли по ТСХ (Waterman №1, Aldrich-Sigma, Сент-Луис, штат Миссури), элюируя солевым раствором. Высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ), оснащенную NaI детектором и УФ-детектором (210 нм), выполняли на обращенно-фазовой колонке C-18 (C18-extend, Agilent, Санта-Клара, штат Калифорния), элюируя ацетонитрилом/водой (1:9, об./об.) со скоростью потока 0,5 мл/мин. ВЭЖХ холодного ⁶⁹Ga-ECG использовали для подтверждения структуры ⁶⁸Ga-ECG.

Пример 4 - Биораспределение радиометок в организме крыс с мезотелиомой

[0107] Самок крыс Fischer 344 (150±25 г) (Harlan Sprague-Dawley, Индианаполис, штат Индиана (n=3 крысы/точку времени) инокулировали клетками злокачественной плевральной мезотелиомы, полученных из клеточной линии IL-45. Опухолевые клетки (10⁶ клеток/крысу) вводили инъекцией (внутримышечно) в задние конечности. Исследования выполняли через 14-17 дней после инокуляции, когда опухоли достигали размера около 1 см в диаметре. В исследованиях распределения в тканях каждому животному вводили инъекции (внутривенно, 10 мкКи/крысу, 10 мкг/крысу) с ^99mTc-ECG, ⁶⁸Ga-ECG и ¹⁸F-FDG. Крыс умертвляли через 0,5-4 часа. Выбранные ткани вырезали, взвешивали и выполняли подсчет радиоактивности с помощью гамма-счетчика (Packard Instruments, Доунерс Гроув, штат Иллинойс). Биораспределение метки в каждом образце рассчитывали как процент от инъецированной дозы на грамм сырой массы ткани (% ИД/г).

[0108] Поглощение опухолью и тканью (% ИД/г) для ⁶⁸Ga-ECG, ^99mTc-ECG и ¹⁸F-FDG показано в Таблицах 1-3. Наивысшее поглощение опухолью ^99mTc-ECG составило 0,47 через 30 минут после инъекции, и оно уменьшилось до 0,08 через 240 минут после инъекции. Поглощение опухолью (% ИД/г), соотношения плотности импульсов в опухоли/легких, опухоли/крови и опухоли/мышце для ^99mTc-ECG (30-240 мин.) составили от 0,47±0,06 до 0,08±0,01; от 0,71±0,07 до 0,85±0,04; от 0,47±0,03 до 0,51±0,01 и от 3,49±0,24 до 5,06±0,25; для ⁶⁸Ga-ECG (15-60 мин.) составили от 0,70±0,06 до 0,92±0,08; от 0,64±0,05 до 1,15±0,08; от 0,42±0,03 до 0,67±0,07 и от 3,84±0,52 до 7,00±1,42; для FDG (30-180 мин.) составили от 1,86±0,22 до 1,38±0,35; от 3,18±0,44 до 2,92±0,34, от 4,19±0,44 до 19,41±2,05 и от 5,75±2,55 до 3,33±0,65, соответственно. Более высокое поглощение в почках наблюдали для ⁶⁸Ga-ECG и ^99mTc-ECG групп, предположительно из-за того, что ЭЦ и конъюгаты ЭЦ могут взаимодействовать с почечными канальцами в почках (Yang et al., 2003).

Пример 5 - Исследования сцинтиграфической визуализации

[0109] Для исследований визуализации использовали самок крыс Fischer 344 (150±25 г) со злокачественной плевральной мезотелиомой (в задних конечностях), полученной из клеточной линии IL-45. Исследования выполняли через 14-17 дней после инокуляции, когда опухоли достигли размера около 1 см в диаметре. Сцинтиграфические изображения получали либо с помощью микро-ПЭТ (Inveon), вставленного в координату гантри ПЭТ/КТ системы сбора данных, либо из М-гамма камеры (Siemens Medical Systems, Inc., Хофман Истейтс, штат Иллинойс), оснащенной коллиматором для низких энергий с параллельными отверстиями. Каждому животному вводили ^99mTc-ECG (300 мкКи/крысу), ⁶⁸Ga-ECG и 18F-FDG (400 мкКи/крысу, IV), и получали изображения через 0,5-4 часа. Для демонстрации того, что ⁶⁸Ga-ECG может быть использован для терапии с визуальным контролем, некоторых крыс с мезотелиомой (n=3) с объемом опухоли 1,5 см обрабатывали паклитакселом (20 мг/кг, IV, однократная инъекция). Перед обработкой и на 7 день после обработки паклитакселом крыс с опухолью визуализировали с помощью ⁶⁸Ga-ECG. Выделенные компьютером области исследования (ROI) (импульсы на пиксель) использовали для определения соотношений плотности импульсов в опухоли к фоновому значению для ^99mTc-ECG. Для создания динамического графика для 68Ga-ECG и 18F-FDG использовали выделенные компьютером области исследования (ROI) (импульсы на пиксель) для опухоли и мышцы с соответствующим интервалом времени. Динамический график построили от 0 до 45 минут. Использовали паклитаксел, поскольку он вызывает антипролиферативный эффект за счет ингибирования транспортеров глюкозы (Glut-1) в исследованиях на клеточных линиях (Rastogi et al., 2007). Также было описано, что мезотелиома реагирует на обработку паклитакселом в животной модели (Schulz et al., 2011).

[0110] Сцинтиграфические изображения крыс, которым ввели ⁶⁸Ga-ECG, ^99mTc-ECG и ¹⁸F-FDG, показали, что опухоли могут быть четко визуализированы через 0,5-4 часа (ФИГ. 5-7). Динамический график поглощения ⁶⁸Ga-ECG и ¹⁸F-FDG опухолью показал аналогичный тип транспорта (ФИГ. 5). ⁶⁸Ga-ECG был способен контролировать реакцию на обработку паклитакселом у тех же крыс с мезотелиомой (ФИГ. 6). Двух крыс, получивших ^99mTc-ECG (среднее и правое изображение) случайным образом выбрали для сравнения с крысами, получившими ^99mTc-EC (левое изображение) в том же ряду изображений. Опухоль в группе ^99mTc-ECG продемонстрировала более высокое поглощение, чем группа ^99mTc-EC (контроль) через 1 и 2 часа (ФИГ. 7).

[0111] В результате был достигнут эффективный синтез ECG с высоким выходом. ⁶⁸Ga-ECG и ^99mTc-ECG получили с высокой степенью радиохимической чистоты. Исследования биораспределения и плоскостной визуализации продемонстрировали фармакокинетическое распределение и возможность применения ⁶⁸Ga-ECG и ^99mTc-ECG для визуализации мезотелиомы. ⁶⁸Ga-ECG и ^99mTc-ECG показали повышенное поглощение в мезотелиоме в исследованной модели, что указывает на возможность их применения для оценки объема опухоли. ⁶⁸Ga-ECG и ^99mTc-ECG могут быть пригодны для скрининга, диагностики, классификации и оценки эффективности лечения в отношении всех типов рака.

Пример 6 - Изготовление набора EC-G

[0112] Изготовляли один набор EC-G путем растворения 1,0 мг EC-G в 0,1 мл воды. К нему добавили 1 мг L-аскорбиновой кислоты в 0,1 мл воды, 0,5 мг неомицина в 0,1 мл, 0,5 мг L-цистеина и 0,1 мл раствора хлорида олова (II) с концентрацией 1 мг/мл. Продукт лиофилизировали до единичного холодного набора. ^99mTc-EC-G, полученный с помощью этого набора, анализировали мгновенной тонкослойной хроматографией, используя солевой раствор в качестве подвижной фазы. Результаты показали одинаковое удерживание для продукта из набора и для стандартного продукта ^99mTc-EC-G (ФИГ. 16). Продукт из набора и стандартный продукт анализировали также с помощью ВЭЖХ, используя H₂O/MeCN (9:1) в качестве элюента со скоростью потока 0,50 мл/мин. (ФИГ. 17 и 18). Поглощение продукта из набора и стандартного продукта анализировали на поглощение в клетках опухоли молочной железы крыс 13762. Было обнаружено, что продукт из набора имеет более чем в 5 раз более высокое поглощение, чем стандартный продукт (ФИГ. 19).

ССЫЛКИ НА ПУБЛИКАЦИИ

Следующие ссылки на публикации, в той степени, в которой они обеспечивают иллюстративные, процедурные или другие подробности, дополняющие то, что описано в настоящем документе, специально включены в настоящий документ путем ссылки.

Публикация США 2008/0107198

Alberico et al., Surg. Oncol. Clin. N. Am., 13(1):13-35, 2004.

Bodansky, в: Peptide Chemistry, 2^ое изд., Springer-Verlag, Нью-Йорк, 1993.

Grant, в: Synthetic Peptides, Freeman & Co., Нью-Йорк, 1992.

Green и Wuts, Protective Groups in organic Synthesis, 3^е изд. Wiley, Нью-Йорк, 1999.

Henson et al., Am. J. Neuroradiol., 25(6):969-972, 2004.

Kundra et al., J. Nucl. Med., 43(3):406-412, 2002.

Rastogi et al., Cancer Lett., 257(2):244-251, 2007.

Remington, Pharmaceutical Sciences, 18ое изд. Mack Printing Company, 1289-1329, 1990.

Saha et al., Semin. Nucl. Med., 24(4):324-349, 1994.

Schulz et al., Ann. Thorac. Surg., 92(6):2007-2013, 2011.

Strunk и Schild, Eur. Radiol., 14(6):1055-1062, 2004.

Yang et al., Radiology, 226:465-473, 2003.

1. Способ получения конъюгата этилендицистеина-сахара, включающий

(А) смешивание в органическом растворителе незащищенной тиазолидин-карбоновой кислоты со связывающим агентом, выбранным из сульфо-NHS, DMAP, DBU, EDAC или DCC, добавление аминосахара с образованием посредством этого конъюгата тиазолидина-сахара; и

(В) восстановление конъюгата тиазолидина-сахара восстанавливающим агентом, содержащим щелочной металл и источник электронов, с получением посредством этого конъюгата этилендицистеина-сахара.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что аминосахар представляет собой аминогексозу или аминопентозу.

3. Способ по п.2, отличающийся тем, что аминогексоза представляет собой аминопроизводное глюкозы, галактозы, маннозы, идозы, талозы, альтрозы, аллозы, гулозы или фруктозы.

4. Способ по п.3, отличающийся тем, что аминогексоза представляет собой глюкозамин.

5. Способ по п.2, отличающийся тем, что аминопентоза представляет собой аминопроизводное рибозы, ксилозы, арабинозы или ликсозы.

6. Способ по п.1, отличающийся тем, что аминосахар представляет собой сахар, имеющий аминогруппу, расположенную в 2’ положении сахара.

7. Способ по п.1, отличающийся тем, что гидроксильные группы аминосахара являются защищенными.

8. Способ по п.7, отличающийся тем, что аминосахар представляет собой 1,3,4,6-тетра-O-ацетил-2-амино-α-D-глюкопиранозы гидрохлорид.

9. Способ по п.1, отличающийся тем, что органический растворитель представляет собой диметилформамид, диметилсульфоксид, диоксан, метанол, этанол, гексан, метиленхлорид, ацетонитрил, тетрагидрофуран или их смесь.

10. Способ по п.1, дополнительно включающий очистку конъюгата тиазолидина-сахара перед восстановлением.

11. Способ по п.10, отличающийся тем, что конъюгат тиазолидина-сахара очищают силикагелевой колоночной хроматографией, ВЭЖХ или их комбинацией.

12. Способ по п.1, отличающийся тем, что щелочной металл представляет собой литий, натрий или калий.

13. Способ по п.1, отличающийся тем, что источник электронов представляет собой жидкий аммиак, метиламин, этиламин, этилендиамин или их комбинации.

14. Способ по п.1, дополнительно включающий хелатирование металлического иона с конъюгатом этилендицистеина-сахара с образованием конъюгата этилендицистеина(ЭЦ)-сахара, помеченного металлическим ионом.

15. Способ по п.14, отличающийся тем, что металлический ион выбран из группы металлических ионов, состоящей из иона технеция, иона олова (II), иона меди, иона индия, иона таллия, иона галлия, иона мышьяка, иона рения, иона гольмия, иона иттрия, иона самария, иона селена, иона стронция, иона гадолиния, иона висмута, иона железа, иона марганца, иона лютеция, иона кобальта, иона платины, иона кальция и иона родия.

16. Способ по п.14, отличающийся тем, что металлический ион представляет собой радионуклид.

17. Способ по п.16, отличающийся тем, что радионуклид выбран из группы, состоящей из ^99mTc, ^117mSn, ¹⁷⁷Lu, ¹⁸⁸Re, ¹⁸⁶Re, ¹⁵³Sm, ¹⁶⁶Ho, ⁹⁰Y, ⁸⁹Sr, ⁶⁷Ga, ⁶⁸Ga, ¹¹¹In, ¹⁸³Gd, ⁵⁹Fe, ²²⁵Ac, ²¹²Bi, ²¹¹At, ⁴⁵Ti, ⁶⁰Cu, ⁶¹Cu, ⁶⁷Cu, ⁶⁴Cu и ⁶²Cu.

18. Способ по п.14, отличающийся тем, что металлический ион представляет собой нерадиоактивный металл.

19. Способ по п.18, отличающийся тем, что нерадиоактивный металл представляет собой ¹⁸⁷Re.

20. Способ по п.1, отличающийся тем, что смешивание дополнительно включает гидрат 1-гидроксибензотриазола.

21. Способ по п.1, отличающийся тем, что связывающий агент представляет собой DCC.