Новый аналог инсулина и его применение

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению аналогов инсулина длительного действия, и может быть использовано в медицине для лечения диабета. Получен аналог инсулина, в котором аминокислота инсулина модифицирована путем замены 14-й аминокислоты А цепи на глутаминовую кислоту или аспарагин, и где аминокислотные последовательности В цепи и А цепи инсулина состоят из SEQ ID NO: 38 и 37 соответственно. На основе указанного аналога инсулина получен конъюгат с биосовместимым веществом в качестве носителя, способного к пролонгированию периода полувыведения аналога инсулина in vivo. Изобретение позволяет получить аналог инсулина, имеющий сниженное сродство связывания с рецептором инсулина по сравнению с нативной формой. 4 н. и 17 з.п. ф-лы, 6 ил., 5 табл., 11 пр.

 

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к аналогу инсулина, имеющему сниженный титр инсулина и сниженное сродство связывания с рецептором инсулина по сравнению с нативной формой, предназначенному для увеличения периода полувыведения инсулина из крови, к конъюгату, полученному путем сшивания аналога инсулина и носителя, к препарату длительного действия, включающему этот конъюгат, и к способу получения этого конъюгата.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Известно, что in vivo белки удаляются из организма посредством различных путей, таких как расщепление протеолитическими ферментами в крови, выведение через почки или клиренс, опосредованный рецепторами. Поэтому приложены значительные усилия к повышению терапевтической эффективности за счет механизмов избегания клиренса белков и увеличения периода полувыведения физиологически активных белков.

С другой стороны, инсулин представляет собой гормон, секретируемый поджелудочной железой организма человека, который регулирует уровни глюкозы в крови и играет роль в поддержании нормальных уровней глюкозы в крови, перенося при этом излишки глюкозы из крови в клетки для обеспечения клеток энергией. Тем не менее, у пациентов с диабетом инсулин не функционирует надлежащим образом вследствие недостатка инсулина, резистентности к инсулину и утраты функции бета-клеток, следовательно, глюкоза в крови не может утилизироваться в качестве источника энергии, и уровень глюкозы в крови повышается, что приводит к гипергликемии. В конечном счете, происходит ее выведение с мочой, в результате чего развиваются различные осложнения. Таким образом, инсулинотерапия необходима пациентам с аномальной секрецией инсулина (при диабете типа I) или с резистентностью к инсулину (при диабете типа II), и уровни глюкозы в крови можно нормально регулировать путем введения инсулина. Тем не менее, подобно другим белковым и пептидным гормонам, инсулин имеет очень короткий период полувыведения in vivo, и, следовательно, его недостаток состоит в многократном введении. Такое частое введение вызывает сильную боль и дискомфорт для пациентов. В связи с этим в целях повышения качества жизни за счет увеличения периода полувыведения этого белка in vivo и уменьшения частоты введения проведены многочисленные исследования по включению белка в препарат и химической конъюгации (конъюгат с жирной кислотой, конъюгат с полиэтиленовым полимером). Имеющийся в продаже инсулин длительного действия включает инсулин гларгин, выпускаемый фирмой Sanofi Aventis (лантус, продолжительность действия приблизительно 20-22 часа), и инсулины детемир (левемир, продолжительность действия приблизительно 18-22 часа) и тресиба (деглюдек, продолжительность действия приблизительно 40 часов), выпускаемые фирмой Novo Nordisk. Эти препараты инсулина длительного действия не образуют пик концентрации инсулина в крови, и, следовательно, подходят в качестве базального инсулина. Тем не менее, в связи с тем, что данные препараты не обладают достаточно длительным периодом полувыведения, все еще остается недостаток, состоящий в необходимости одной или двух инъекций в сутки. Соответственно, в достижении предназначенной цели существует ограничение, состоящее в том, что для повышения удобства для пациентов с диабетом, нуждающихся в долгосрочном введении, частота введения должна быть значительно снижена.

В предшествующем исследовании описан специфичный процесс клиренса инсулина in vivo; 50% или более инсулина удаляется через почки, а остальное удаляется посредством процесса рецептор-опосредованного клиренса (RMC; receptor mediated clearance) в сайтах-мишенях, таких как мышцы, жировая ткань, печень и т.д.

В этом отношении в многочисленных исследованиях, включающих работы, описанные в публикациях: J Pharmacol Exp Ther (1998) 286: 959, Diabetes Care (1990) 13: 923, Diabetes (1990) 39: 1033, сообщают, что, чтобы избежать RMC инсулина, его активность in vitro снижается, в результате чего повышается его уровень в крови. Тем не менее, эти аналоги инсулина, имеющие сниженное сродство связывания с рецептором, не могут избежать почечного клиренса, являющегося основным механизмом клиренса, хотя RMC снижается. Соответственно, существует ограничение, состоящее в значительном увеличении периода полувыведения из крови.

Исходя из этого, авторы настоящего изобретения приложили множество усилий к увеличению периода полувыведения инсулина из крови. В результате они обнаружили, что новый аналог инсулина, не имеющий нативной последовательности инсулина, но имеющий не нативную последовательность инсулина, показал сниженный титр in vitro и сниженное сродство связывания с рецептором, и, следовательно, его почечный клиренс может быть уменьшен. Они также обнаружили, что период полувыведения инсулина из крови может быть дополнительно увеличен за счет сшивания аналога инсулина с фрагментом Fc иммуноглобулина в качестве репрезентативного носителя, эффективного для увеличения периода полувыведения, в результате чего было выполнено настоящее изобретение.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Техническая задача

Целью настоящего изобретения является разработка аналога инсулина, полученного таким образом, что он имеет сниженный титр in vitro для пролонгирования периода полувыведения инсулина in vivo, и конъюгата, полученного путем сшивания этого аналога инсулина с носителем.

В частности, одним объектом настоящего изобретения является разработка аналога инсулина, имеющего сниженный титр инсулина по сравнению с нативной формой.

Другим объектом настоящего изобретения является разработка конъюгата аналога инсулина, полученного путем сшивания аналога инсулина с носителем.

Еще одним объектом настоящего изобретения является разработка препарата инсулина длительного действия, включающего конъюгат аналога инсулина.

Еще одним объектом настоящего изобретения является разработка способа получения конъюгата аналога инсулина.

Еще одним объектом настоящего изобретения является разработка способа увеличения периода полувыведения in vivo с использованием аналога инсулина или конъюгата аналога инсулина, полученного путем сшивания аналога инсулина с носителем.

Еще одним объектом настоящего изобретения является разработка способа лечения заболеваний, связанных с инсулином, включающего стадию введения аналога инсулина или конъюгата аналога инсулина субъекту, нуждающемуся в этом.

Техническое решение

В одном аспекте для достижения указанных выше целей в настоящем изобретении предложен аналог инсулина, имеющий сниженный титр инсулина по сравнению с нативной формой, в которой аминокислота цепи В или цепи А модифицирована.

В одном конкретном воплощении в настоящем изобретении предложен аналог инсулина, имеющий сниженное сродство связывания с рецептором инсулина.

В другом конкретном воплощении в настоящем изобретении предложен ненативный аналог инсулина, в котором одна аминокислота, выбранная из группы, состоящей из 8-й аминокислоты, 23-й аминокислоты, 24-й аминокислоты и 25-й аминокислоты цепи В и 1-й аминокислоты, 2-й аминокислоты и 14-й аминокислоты цепи А, в аналоге инсулина согласно настоящему изобретению заменена аланином.

Еще в одном другом конкретном воплощении в настоящем изобретении предложен аналог инсулина, в котором аналог инсулина согласно настоящему изобретению выбран из группы, состоящей из SEQ ID NO: 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34 и 36.

В другом аспекте в настоящем изобретении предложен конъюгат аналога инсулина, который получают путем сшивания описанного выше аналога инсулина с носителем, способным к пролонгированию периода полувыведения.

В одном конкретном воплощении в настоящем изобретении предложен конъюгат аналога инсулина, полученный путем сшивания (1) описанного выше аналога инсулина и (2) Fc участка иммуноглобулина посредством (3) пептидного линкера или непептидильного линкера, выбранного из группы, состоящей из полиэтиленгликоля (ПЭГ), полипропиленгликоля, сополимеров этиленгликоля и пропиленгликоля, полиоксиэтилированных полиолов, поливиниловых спиртов, полисахаридов, декстрана, поливинилэтилового эфира, биоразлагаемых полимеров, липидных полимеров, хитинов, гиалуроновой кислоты и их комбинации.

Еще в одном другом аспекте в настоящем изобретении предложен препарат инсулина длительного действия, включающий описанный выше конъюгат аналога инсулина, в котором продолжительность действия и стабильность in vivo увеличены.

В одном конкретном воплощении в настоящем изобретении предложен препарат длительного действия, применяемый для лечения диабета.

В другом воплощении в настоящем изобретении предложен способ получения описанного выше конъюгата аналога инсулина.

Еще в одном другом конкретном воплощении в настоящем изобретении предложен способ увеличения периода полувыведения in vivo с применением аналога инсулина или конъюгата аналога инсулина, полученного путем сшивания аналога инсулина и носителя.

Еще в одном другом конкретном воплощении в настоящем изобретении предложен способ лечения инсулинозависимых заболеваний, включающий стадию введения аналога инсулина или конъюгата аналога инсулина субъекту, нуждающемуся в этом.

ПОЛЕЗНЫЕ ЭФФЕКТЫ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Ненативный аналог инсулина по настоящему изобретению имеет сниженный титр инсулина и сниженное сродство связывания с рецептором инсулина по сравнению с нативной формой, и, таким образом, избегает механизмов клиренса in vivo. Следовательно, аналог инсулина имеет повышенный период полувыведения из крови in vivo, и конъюгат аналога инсулина с Fc участком иммуноглобулина, полученный с использованием данного аналога, проявляет значительно увеличенный период полувыведения из крови, что, таким образом, повышает удобство для пациентов, нуждающихся во введении инсулина.

ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

На фиг. 1 представлен результат анализа чистоты аналога инсулина с помощью электрофореза белка, представляющий собой результат для репрезентативного аналога инсулина, Аналога №7 (дорожка 1: маркер размера, дорожка 2: нативный инсулин, дорожка 3: аналог инсулина (№7);

На фиг. 2 представлен результат анализа чистоты аналога инсулина с помощью хроматографии высокого давления, представляющий собой результат для репрезентативного аналога инсулина, Аналога №7 ((А) обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография (ОФ-ВЭЖХ), (Б) эксклюзионная ВЭЖХ);

На фиг. 3 представлен результат пептидного картирования аналога инсулина, представляющий собой результат для репрезентативного аналога инсулина, Аналога №7 ((А) нативный инсулин, (Б) аналог инсулина (№7));

На фиг. 4 представлен результат анализа чистоты конъюгата аналога инсулина с Fc иммуноглобулина с помощью белкового электрофореза, представляющий собой результат для репрезентативного аналога инсулина, Аналога №7 (дорожка 1: маркер размера, дорожка 2: конъюгат аналога инсулина (№7) с Fc иммуноглобулина);

На фиг. 5 представлен результат анализа чистоты конъюгата аналога инсулина с Fc иммуноглобулина с помощью хроматографии высокого давления, представляющий собой результат для репрезентативного аналога инсулина, Аналога №7 ((А) обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография (ОФ-ВЭЖХ), (Б) эксклюзионная ВЭЖХ, (В) ионообменная ВЭЖХ); и

На фиг. 6 представлен результат анализа фармакокинетики конъюгата нативного инсулина с Fc иммуноглобулина и аналога инсулина с Fc иммуноглобулина у нормальных крыс, представляющий собой результат для репрезентативного аналога инсулина, Аналога №7 (о: конъюгат нативного инсулина с Fc иммуноглобулина (21,7 нмоль/кг); ·: конъюгат нативного инсулина с Fc иммуноглобулина (65,1 нмоль/кг); □: конъюгат аналога инсулина с Fc иммуноглобулина (21,7 нмоль/кг); ■: конъюгат аналога инсулина с Fc иммуноглобулина (65,1 нмоль/кг). (А) конъюгат нативного инсулина с Fc иммуноглобулина и конъюгат аналога инсулина (№7) с Fc иммуноглобулина, (Б) конъюгат нативного инсулина с Fc иммуноглобулина и конъюгат аналога инсулина (№8) с Fc иммуноглобулина, (В) конъюгат нативного инсулина с Fc иммуноглобулина и конъюгат аналога инсулина (№9) с Fc иммуноглобулина).

ЛУЧШИЙ СПОСОБ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к аналогу инсулина, имеющему сниженный титр in vitro. Данный аналог инсулина отличается тем, что имеет ненативную последовательность инсулина и, следовательно, имеет сниженное сродство связывания с рецептором инсулина по сравнению с нативным инсулином, вследствие чего его рецептор-опосредованный клиренс значительно снижен за счет повышенной константы диссоциации, что приводит в результате к увеличению периода его полувыведения из крови.

При использовании в настоящем документе термин "аналог инсулина" включает различные аналоги, имеющие сниженный титр инсулина, по сравнению с нативной формой.

Аналог инсулина может представлять собой аналог инсулина, имеющий сниженный титр инсулина по сравнению с нативной формой, в котором аминокислота В цепи или А цепи инсулина модифицирована. Аминокислотные последовательности нативного инсулина приведены ниже.

-А цепь:

-В цепь:

Аналог инсулина, используемый в примерах настоящего изобретения, представляет собой аналог инсулина, полученный методом генетической рекомбинации. Тем не менее, настоящее изобретение не ограничено им, а включает все инсулины, имеющие сниженный титр in vitro. Предпочтительно аналог инсулина может включать инвертированные инсулины, варианты инсулина, фрагменты инсулина или тому подобное, и способ их получения может включать как твердофазный способ, так и метод генетической рекомбинации, но не ограничен ими.

Аналог инсулина представляет собой пептид, сохраняющий функцию контроля глюкозы в крови в организме, идентичного контролю под действием инсулина, и данный пептид включает агонисты инсулина, его производные, фрагменты, варианты или тому подобное.

Агонист инсулина по настоящему изобретению относится к веществу, связывающемуся с рецептором инсулина in vivo, в результате чего он проявляет такие же биологические активности, как и инсулин, независимо от структуры инсулина.

Аналог инсулина по настоящему изобретению означает пептид, проявляющий гомологию последовательности по меньшей мере 80% в аминокислотной последовательности по сравнению с А цепью или В цепью нативного инсулина, имеющий несколько групп аминокислотных остатков, измененных в форме химического замещения (например, альфа-метилирования, альфа-гидроксилирования), удаления (например, деаминирования) или модификации (например, N-метилирования) и осуществляющий функцию контроля глюкозы в крови в организме. В отношении целей настоящего изобретения аналог инсулина представляет собой аналог инсулина, имеющий сниженное сродство связывания с рецептором инсулина по сравнению с нативной формой, и аналоги инсулина, имеющие сниженный титр инсулина по сравнению с нативной формой, включены без ограничения.

При условии, что аналог инсулина способен проявлять низкую рецептор-опосредованную интернализацию или низкий рецептор-опосредованный клиренс, его тип и размер конкретно не ограничены. Аналог инсулина, для которого основным механизмом клиренса in vivo является рецептор-опосредованная интернализация или рецептор-опосредованный клиренс, подходит для целей настоящего изобретения.

Фрагмент инсулина по настоящему изобретению означает тип инсулина, в котором одна или более аминокислот добавлено или делетировано, и добавленные аминокислоты могут представлять собой ненативные аминокислоты (например, аминокислоту D-типа). Такие фрагменты инсулина сохраняют функцию контроля глюкозы в крови в организме.

Вариант инсулина по настоящему изобретению означает пептид, отличающийся от инсулина одной или более аминокислотных последовательностей, и сохраняющий функцию контроля глюкозы в крови в организме.

Соответствующие способы получения агонистов, производных, фрагментов и вариантов инсулина по настоящему изобретению можно использовать независимо или в комбинации. Например, в настоящее изобретение включены пептиды, одна или более аминокислотных последовательностей которых отличается от последовательностей инсулина, и в которых остаток амино-концевой аминокислоты деаминирован, а также осуществляющие функцию контроля глюкозы в крови в организме.

В частности, аналог инсулина может представлять собой аналог инсулина, в котором одна или более аминокислот, выбранных из группы, состоящей из 8-й аминокислоты, 23-й аминокислоты, 24-й аминокислоты и 25-й аминокислоты В цепи и 1-й аминокислоты, 2-й аминокислоты и 14-й аминокислоты А цепи, замещено другой аминокислотой, предпочтительно аланином. Кроме того, аналог инсулина может быть выбран из группы, состоящей из SEQ ID NO: 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34 и 36, но может включать без ограничения любой аналог инсулина, имеющий сниженное сродство связывания с рецептором инсулина.

Согласно одному воплощению настоящего изобретения было обнаружено, что аналоги инсулина SEQ ID NO: 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34 и 36, в частности, репрезентативные аналоги инсулина 7, 8 и 9 (SEQ ID NO: 32, 34 и 36), имеют сниженное сродство связывания с рецептором инсулина in vitro по сравнению с нативной формой (таблица 4).

В другом аспекте в настоящем изобретении предложен конъюгат аналога инсулина, полученный путем сшивания аналога инсулина и носителя.

При использовании в настоящем документе термин "носитель" означает вещество, способное к увеличению периода полувыведения сшитого с ним аналога инсулина in vivo. Аналог инсулина согласно настоящему изобретению отличается тем, что имеет значительно сниженное сродство связывания с рецептором инсулина по сравнению с нативной формой и избегает рецептор-опосредованного клиренса или почечного клиренса. Таким образом, если известно, что носитель увеличивает период полувыведения in vivo при сшивании его с различными известными физиологически активными полипептидами, очевидно, что при сшивании его с аналогом инсулина его период полувыведения in vivo может быть увеличен, и полученный в результате конъюгат можно применять в качестве препарата длительного действия.

Например, поскольку увеличение периода полувыведения является первоочередной задачей, носитель, сшитый с новым инсулином, имеющим сниженный титр, не ограничен Fc участком иммуноглобулина. Носитель включает биосовместимое вещество, которое способно к пролонгированию периода полувыведения in vivo за счет сшивания его с любым биосовместимым веществом, способным к снижению почечного клиренса, выбранное без ограничения из группы, состоящей из различных полимеров (например, полиэтиленгликоля и жирной кислоты, альбумина и его фрагментов, конкретной аминокислотной последовательности и т.д.), альбумина и его фрагментов, веществ, связывающих альбумин, и полимеров, состоящих из повторяющихся звеньев конкретной аминокислотной последовательности, антитела, фрагментов антитела, веществ, связывающих FcRn (неонатальный Fc-рецептор), соединительной ткани in vivo или ее производных, нуклеотида, фибронектина, трансферрина, сахарида и полимеров. Кроме того, способ сшивания биосовместимого вещества, обладающего способностью к пролонгированию периода полувыведения in vivo, с аналогом инсулина, имеющим сниженный титр, включает генетическую рекомбинацию, конъюгацию in vitro или тому подобное. Примеры биосовместимого вещества могут включать FcRn-связывающее вещество, жирную кислоту, полиэтиленгликоль, аминокислотный фрагмент или альбумин. FcRn-связывающее вещество может представлять собой Fc участок иммуноглобулина.

Аналог инсулина и биосовместимое вещество в качестве носителя могут быть сшиты друг с другом посредством пептидного или непептидильного линкера в качестве линкера.

Конъюгат инсулина может представлять собой конъюгат аналога инсулина, полученный путем сшивания (1) аналога инсулина и (2) Fc участка иммуноглобулина посредством (3) пептидного линкера или непептидильного линкера, выбранного из группы, состоящей из полиэтиленгликоля, полипропиленгликоля, сополимеров этиленгликоля и пропиленгликоля, полиоксиэтилированных полиолов, поливиниловых спиртов, полисахаридов, декстрана, поливинилэтилового эфира, биоразлагаемых полимеров, липидных полимеров, хитинов, гиалуроновой кислоты и их комбинации.

В одном конкретном воплощении конъюгата аналога инсулина по настоящему изобретению непептидильный полимер в качестве линкера сшит с амино-концом В цепи аналога инсулина. В другом конкретном воплощении конъюгата аналога инсулина по настоящему изобретению непептидильный полимер в качестве линкера сшит с остатком В цепи аналога инсулина. Модификация в А цепи инсулина приводит к снижению активности и безопасности. Таким образом, в данных воплощениях изобретения непептидильный линкер в качестве линкера сшит с В цепью инсулина, в результате чего сохраняется активность инсулина, и повышается безопасность.

При использовании в настоящем документе термин "активность" означает способность инсулина к связыванию с рецептором инсулина, и означает, что инсулин связывается с его рецептором, в результате чего осуществляет свое действие. Такое сшивание непептидильного полимера с амино-концом В цепи инсулина по настоящему изобретению может быть достигнуто путем контроля рН, и предпочтительный диапазон рН составляет от 4,5 до 7,5.

При использовании в настоящем документе термин "N-конец" можно использовать взаимозаменяемо с термином "N-концевой участок".

В одном конкретном примере авторы настоящего изобретения получили конъюгат аналог инсулина-ПЭГ-Fc иммуноглобулина путем сшивания ПЭГ с N-концом Fc участка иммуноглобулина и селективного сочетания с ним N-конца В цепи инсулина. Период полувыведения данного конъюгата аналог инсулина-ПЭГ-Fc иммуноглобулина был увеличен по сравнению с неконъюгированной формой, и данный конъюгат проявлял гипогликемическое действие в модели заболевания на животных. Таким образом, очевидно, что может быть получен новый препарат инсулина длительного действия, сохраняющий активность in vivo.

Fc участок иммуноглобулина безопасен для применения в качестве носителя лекарственного средства, поскольку он представляет собой биоразлагаемый полипептид, который метаболизируется in vivo. Кроме того, Fc участок иммуноглобулина имеет относительно низкую молекулярную массу по сравнению с полноразмерными молекулами иммуноглобулина, и, следовательно, обладает преимуществом в отношении получения, очистки и выхода конъюгата. Fc участок иммуноглобулина не содержит Fab фрагмент, являющийся в высокой степени неоднородным за счет различающихся аминокислотных последовательностей в зависимости от подкласса антител, и поэтому можно ожидать, что Fc участок иммуноглобулина может значительно увеличить гомогенность веществ и обладает меньшими антигенными свойствами в крови.

При использовании в настоящем документе термин "Fc участок иммуноглобулина" относится к белку, содержащему константную область 2 тяжелой цепи (СН2) и константную область 3 тяжелой цепи (СН3) иммуноглобулина за исключением вариабельных участков тяжелой цепи и легкой цепи, константную область 1 тяжелой цепи (СН1) и константную область 1 легкой цепи (CL1) иммуноглобулина. Он может дополнительно включать шарнирную область при константной области тяжелой цепи. Fc участок иммуноглобулина по настоящему изобретению может также частично или полностью содержать Fc участок, включающий константную область 1 тяжелой цепи (СН1) и/или константную область 1 легкой цепи (CL1) за исключением вариабельных участков тяжелой цепи и легкой цепи иммуноглобулина, при условии, что его действие по существу аналогично или улучшено по сравнению с нативной формой. Кроме того, он может представлять собой фрагмент, имеющий делецию в относительно длинном участке аминокислотной последовательности, соответствующей СН2 и/или СН3.

Таким образом, Fc участок иммуноглобулина по настоящему изобретению может включать 1) домен СН1, домен СН2, домен СН3 и домен СН4, 2) домен СН1 и домен СН2, 3) домен СН1 и домен СН3, 4) домен СН2 и домен СН3, 5) комбинацию одного или более доменов и шарнирной области иммуноглобулина (или части шарнирной области), и 6) димер каждого домена константных областей тяжелой цепи и константной области легкой цепи.

Кроме того, Fc участок иммуноглобулина по настоящему изобретению включает как производное (мутант) его последовательности, так и его нативную аминокислотную последовательность. Производное аминокислотной последовательности имеет последовательность, отличающуюся от нативной аминокислотной последовательности вследствие делеции, инсерции, неконсервативной или консервативной замены одного или более аминокислотных остатков, либо их комбинации. Например, в случае Fc IgG, аминокислотные остатки в положениях 214-238, 297-299, 318-322 или 327-331, известные как важные для связывания, можно использовать в качестве подходящей мишени для модификации.

Кроме того, возможны другие различные производные, включая производные, имеющие делецию участка, способного к образованию дисульфидной связи, делецию нескольких аминокислотных остатков на N-конце нативной формы Fc или добавление остатка метионина на N-конце нативной формы Fc. Кроме того, чтобы удалить эффекторные функции, делеция может происходить в сайте связывания комплемента, таком как C1q-связывающий сайт, и в сайте антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (ADCC). Методики получения таких производных последовательности Fc участка иммуноглобулина раскрыты в документах WO 97/34631 и WO 96/32478.

Аминокислотные замены в белках и пептидах, в целом не изменяющие активность молекул, известны в данной области техники (Н. Neurath, R.L. Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). Чаще всего встречающимися заменами являются замены Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly в обоих направлениях.

При желании Fc участок может быть модифицирован путем фосфорилирования, сульфатирования, акрилирования, гликозилирования, метилирования, фарнезилирования, ацетилирования, амидирования и тому подобного.

Описанные выше производные Fc представляют собой производные, обладающие биологической активностью, идентичной активности Fc участка по настоящему изобретению, или обладают повышенной структурной стабильностью по отношению к нагреванию, рН или тому подобному.

Кроме того, эти Fc участки могут быть получены из нативных форм, выделенных у людей и других животных, включая коров, коз, свиней, мышей, кроликов, хомяков, крыс и морских свинок, либо могут представлять собой их рекомбинанты или производные, полученные из трансформированных клеток животных или микроорганизмов. В данном случае они могут быть получены из нативного иммуноглобулина путем выделения полноразмерных иммуноглобулинов из организма человека или животного и их обработки протеолитическим ферментом. Папаин расщепляет нативный иммуноглобулин на участки Fab и Fc, а обработка пепсином приводит в результате к получению pF'c и F(ab)₂. Эти фрагменты можно подвергать эксклюзионной хроматографии для выделения Fc или pF'c.

Предпочтительно Fc участок человеческого происхождения представляет собой рекомбинантный Fc участок иммуноглобулина, полученный из микроорганизма.

Кроме того, Fc участок иммуноглобулина может находиться в форме, имеющей нативные сахарные цепи, увеличенные сахарные цепи по сравнению с нативной формой или уменьшенные сахарные цепи по сравнению с нативной формой, либо может находиться в дегликозилированной форме. Увеличение, уменьшение или удаление сахарных цепей Fc участка иммуноглобулина может быть достигнуто способами, общеизвестными в данной области техники, такими как химический способ, ферментативный способ и генно-инженерный способ с использованием микроорганизма. В данном случае удаление сахарных цепей из Fc участка приводит к резкому снижению сродства связывания с комплементом (C1q) и к снижению или утрате антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичности или комплементзависимой цитотоксичности, в результате чего не индуцирует нежелательные иммунные ответы in vivo. В этом отношении Fc участок иммуноглобулина в дегликозилированной или агликозилированной форме может быть более подходящим для целей настоящего изобретения в качестве носителя лекарственного средства.

Термин "дегликозилирование" при использовании в настоящем документе означает ферментативное удаление сахарных группировок из Fc участка, а термин "агликозилирование" означает, что Fc участок продуцируется в негликозилированной форме прокариотом, предпочтительно Е. coli.

С другой стороны, Fc участок иммуноглобулина может быть выделен у людей или других животных, включая коров, коз, свиней, мышей, кроликов, хомяков, крыс и морских свинок, и предпочтительно у людей. Кроме того, Fc участок иммуноглобулина может представлять собой Fc участок, полученный из IgG, IgA, IgD, IgE и IgM, или полученный из их комбинаций или гибридов. Предпочтительно его получают из IgG или IgM, находящихся среди самых распространенных белков в крови человека, и наиболее предпочтительно из IgG, о котором известно, что он увеличивает периоды полувыведения лиганд-связывающих белков.

С другой стороны, термин "комбинация" при использовании в настоящем документе означает, что полипептиды, кодирующие одноцепочечные участки Fc иммуноглобулинов одинакового происхождения, сшиты с одноцепочечным полипептидом другого происхождения с образованием димера или мультимера. Таким образом, димер или мультимер может быть образован из двух или более фрагментов, выбранных из группы, состоящей из фрагментов Fc IgG, Fc IgA, Fc IgM, Fc IgD и Fc IgE.

Термин "гибрид" при использовании в настоящем документе означает, что в одноцепочечном Fc участке иммуноглобулина присутствуют последовательности, кодирующие два или более Fc участка иммуноглобулина различного происхождения. В настоящем изобретении возможны различные типы гибридов. Таким образом, доменные гибриды могут состоять из доменов в количестве от одного до четырех, выбранных из группы, состоящей из СН1, СН2, СН3 и СН4 Fc IgG, Fc IgM, Fc IgA, Fc IgE и Fc IgD, и могут включать шарнирную область.

С другой стороны, IgG разделен на подклассы lgG1, lgG2, lgG3 и lgG4, и настоящее изобретение включает их комбинации и гибриды. Предпочтительными подклассами являются подклассы lgG2 и lgG4, и наиболее предпочтителен Fc участок lgG4, редко осуществляющий эффекторные функции, такие как CDC (комплементзависимая цитотоксичность). Таким образом, в качестве носителя лекарственного средства по настоящему изобретению наиболее предпочтительным Fc участком иммуноглобулина является негликозилированный Fc участок, полученный из lgG4 человека. Fc участок человеческого происхождения более предпочтителен, чем Fc участок происхождения, отличающегося от человеческого, который может действовать в качестве антигена в организме человека и вызывать нежелательные иммунные ответы, такие как продуцирование нового антитела против антигена.

В конкретном воплощении конъюгата аналога инсулина оба конца непептидильного полимера могут быть сшиты с N-концом Fc участка иммуноглобулина и с аминогруппой N-конца В цепи аналога инсулина, либо с ε-аминогруппой или тиольной группой внутреннего остатка лизина В цепи, соответственно.

Fc участок - линкер - аналог инсулина по настоящему изобретению получают при различных молярных отношениях. Таким образом, число фрагментов Fc и/или линкеров, сшитых с одним аналогом инсулина, не ограничено.

Кроме того, сшивание Fc участка, определенного линкера и аналога инсулина по настоящему изобретению может включать все типы ковалентных связей и все типы нековалентных связей, таких как водородные связи, ионные взаимодействия, ван-дер-ваальсовы силы и гидрофобные взаимодействия, когда Fc участок и аналог инсулина экспрессируются в виде слитого белка путем генетической рекомбинации. Тем не менее, что касается физиологической активности аналога инсулина, сшивание предпочтительно осуществляют посредством ковалентных связей, но без ограничения.

С другой стороны, Fc участок по настоящему изобретению, определенный линкер и аналог инсулина могут быть сшиты друг с другом на N-конце или на С-конце, и предпочтительно по свободной группе, и, в частности, ковалентная связь может быть образована на амино-конце, остатке аминокислоты лизина, остатке аминокислоты гистидина или на свободном остатке цистеина.

Кроме того, сшивание Fc участка по настоящему изобретению, определенного линкера и аналога инсулина можно осуществлять в определенном направлении. Так, линкер может быть сшит с N-концом, С-концом или свободной группой Fc участка иммуноглобулина, и может быть также сшит с N-концом, С-концом или свободной группой аналога инсулина.

Непептидильный линкер может быть сшит с N-концевой аминогруппой фрагмента иммуноглобулина и не ограничен каким-либо остатком лизина или цистеина последовательности фрагмента иммуноглобулина.

Кроме того, в конкретном воплощении конъюгата аналога инсулина конец непептидильного полимера может быть сшит с внутренним аминокислотным остатком или свободной функциональной группой, способной к связыванию функциональной группы на конце непептидильного полимера, в дополнение к N-концу Fc участка иммуноглобулина, но без ограничений.

В настоящем изобретении непептидильный полимер означает биосовместимый полимер, включающий два или более повторяющихся звеньев, связанных друг с другом, в котором эти повторяющиеся звенья связаны друг с другом любой ковалентной связью за исключением пептидной связи. Такой непептидильный полимер может иметь два конца или три конца.

Непептидильный полимер, который можно использовать в настоящем изобретении, может быть выбран из группы, состоящей из полиэтиленгликоля, полипропиленгликоля, сополимеров этиленгликоля и пропиленгликоля, полиоксиэтилированных полиолов, поливинилового спирта, полисахаридов, декстрана, поливинилэтилового эфира, биоразлагаемых полимеров, таких как PLA (полилактид) и PLGA (полилактид-гликолевая кислота), липидных полимеров, хитинов, гиалуроновой кислоты и их комбинаций, и предпочтительно полиэтиленгликоля. Его производные, известные в данной области техники, и производные, которые могут быть легко получены с использованием навыков, известных в данной области техники, также находятся в пределах объема настоящего изобретения.

Пептидный линкер, используемый в слитом белке, полученном традиционным способом слияния в рамке считывания, имеет недостатки, состоящие в том, что он легко расщепляется in vivo протеолитическим ферментом, и, следовательно, ожидаемый достаточный эффект увеличения периода полувыведения активного лекарственного средства из крови за счет носителя не может быть получен. В настоящем изобретении, тем не менее, конъюгат может быть получен как с использованием непептидильного линкера, так и пептидного линкера. В непептидильном линкере можно использовать полимер, обладающий устойчивостью к протеолитическому ферменту, чтобы поддерживать период полувыведения пептида из крови на уровне, подобном уровню носителя. Таким образом, можно использовать любой непептидильный полимер без ограничения при условии, что он представляет собой полимер, обладающий упомянутой выше функцией, то есть полимер, обладающий устойчивостью к протеолитическому ферменту in vivo. Непептидильный полимер имеет молекулярную массу в диапазоне от 1 до 100 кДа, и предпочтительно от 1 до 20 кДа.

Непептидильный полимер по настоящему изобретению, связанный с Fc участком иммуноглобулина, может представлять собой один тип полимера или комбинацию различных типов полимеров.

Непептидильный полимер, используемый в настоящем изобретении, имеет функциональную группу, способную к связыванию с Fc участком иммуноглобулина и белковым лекарственным средством.

Непептидильный полимер имеет на обоих концах функциональную группу, предпочтительно выбранную из группы, состоящей из функциональной альдегидной группы, пропиональдегидной группы, бутиральдегидной группы, малеимидной группы и производного сукцинимида. Производное сукцинимида может представлять собой сукцинимидилпропионат, гидроксисукцинимидил, сукцинимидилкарбоксиметил или сукцинимидилкарбонат.В частности, когда непептидильный полимер имеет функциональную альдегидную группу на его обоих концах, ее связывание на обоих концах с физиологически активным полипептидом и с иммуноглобулином происходит эффективно при минимальных неспецифических взаимодействиях. Конечный продукт, образованный путем восстановительного алкилирования альдегидной связью, значительно более стабилен, чем связанный амидной связью. Альдегидная функциональная группа селективно связывается с N-концом при низком рН, и связывается с остатком лизина с образованием ковалентной связи при высоком рН, таком как рН 9,0.

Функциональные группы на обоих концах непептидильного полимера могут быть одинаковыми или отличаться друг от друга. Например, непептидильный полимер может содержать на одном конце малеимидную группу, а на другом конце альдегидную группу, пропиональдегидную группу или бутиральдегидную группу. Для получения одноцепочечного конъюгата аналога инсулина по настоящему изобретению при использовании в качестве непептидильного полимера полиэтиленгликоля, содержащего функциональную гидроксигруппу на его обоих концах, эта гидроксигруппа может быть активирована с образованием различных функциональных групп с помощью известных химических реакций, либо можно использовать полиэтиленгликоль, содержащий имеющуюся в продаже модифицированную функциональную группу.

Конъюгат аналога инсулина по настоящему изобретению сохраняет in vivo активности традиционного инсулина, такие как энергетический метаболизм и метаболизм Сахаров, а также увеличивает период полувыведения аналога инсулина из крови и значительно увеличивает продолжительность эффективности пептида in vivo, и, следовательно, данный конъюгат полезен при лечении диабета.

В одном примере настоящего изобретения было подтверждено, что аналог инсулина, имеющий сниженное сродство связывания с рецептором инсулина, проявляет значительно более длительный период полувыведения in vivo, чем конъюгат нативного инсулина, при сшивании с носителем, способным к пролонгированию периода полувыведения in vivo (фиг. 6).

В другом аспекте в настоящем изобретении предложен препарат инсулина длительного действия, включающий конъюгат аналога инсулина. Этот препарат инсулина длительного действия может представлять собой препарат инсулина длительного действия, обладающий увеличенной продолжительностью действия и повышенной стабильностью in vivo. Препарат инсулина длительного действия может представлять собой фармацевтическую композицию для лечения диабета.

Фармацевтическая композиция, включающая конъюгат по настоящему изобретению, может содержать фармацевтически приемлемые носители. Для перорального введения фармацевтически приемлемый носитель может включать связующее вещество, смазывающее вещество, разрыхлитель, эксципиент, солюбилизатор, диспергирующий агент, стабилизатор, суспендирующий агент, краситель, ароматизатор или тому подобное. Для инъекционных препаратов фармацевтически приемлемый носитель может включать буферный агент, консервант, анальгетик, солюбилизатор, изотонический агент и стабилизатор. Для препаратов для местного введения фармацевтически приемлемый носитель может включать основу, эксципиент, смазывающее вещество, консервант или тому подобное. Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно включать в различные дозируемые формы в комбинации с упомянутыми выше фармацевтически приемлемыми носителями. Например, для перорального введения фармацевтическую композицию можно включать в таблетки, пастилки, капсулы, эликсиры, суспензии, сиропы или облатки. Для инъекционных препаратов фармацевтическая композиция может быть представлена в виде ампулы, содержащей стандартную дозу, или контейнера, содержащего множественные дозы. Фармацевтическую композицию можно также включать в растворы, суспензии, таблетки, пилюли, капсулы и препараты пролонгированного высвобождения.

С другой стороны, примеры носителей, эксципиентов и разбавителей, подходящих для приготовления препарата, включают лактозу, декстрозу, сахарозу, сорбит, маннит, ксилит, эритрит, мальтит, крахмал, аравийскую камедь, альгинат, желатин, фосфат кальция, силикат кальция, целлюлозу, метилцеллюлозу, микрокристаллическую целлюлозу, поливинилпирролидон, воду, метилгидроксибензоат, пропилгидроксибензоат, тальк, стеарат магния, минеральные масла или тому подобное.

Кроме того, в фармацевтические препараты можно дополнительно включать наполнители, антикоагулянты, смазывающие вещества, увлажняющие агенты, ароматизаторы, антисептики или тому подобное.

Еще в одном другом аспекте в настоящем изобретении предложен способ лечения инсулинозависимых заболеваний, включающий введение аналога инсулина или конъюгата аналога инсулина субъекту, нуждающемуся в этом.

Конъюгат согласно настоящему изобретению полезен при лечении диабета, и, следовательно, данное заболевание можно лечить путем введения фармацевтической композиции, содержащей этот конъюгат.

Термин "введение" при использовании в данном документе означает введение пациенту предопределенного вещества определенным подходящим способом. Конъюгат по настоящему изобретению можно вводить посредством любого из традиционных путей при условии, что этот путь подходит для достижения желаемой ткани. Можно осуществлять интраперитонеальное, внутривенное, внутримышечное, подкожное, внутрикожное, пероральное, местное, интраназальное, внутрилегочное и интраректальное введение, но настоящее изобретение не ограничено ими. Тем не менее, поскольку пептиды расщепляются при пероральном введении, активные ингредиенты композиции для перорального введения должны иметь покрытие или должны быть включены в препарат для защиты против разрушения в желудке. Предпочтительно настоящую композицию можно вводить в инъекционной форме. Кроме того, фармацевтическую композицию можно вводить с использованием определенного устройства, способного к переносу активных ингредиентов в клетку-мишень.

Кроме того, фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может быть определена несколькими соответствующими факторами, включающими типы заболеваний, подлежащих лечению, пути введения, возраст пациента, пол, массу и тяжесть заболевания, а также типами лекарственного средства в качестве активного ингредиента. Поскольку фармацевтическая композиция по настоящему изобретению обладает превосходной продолжительностью действия и титром in vivo, она обладает преимуществом, состоящим в значительном снижении частоты введения фармацевтического препарата по настоящему изобретению.

Еще в одном другом аспекте в настоящем изобретении предложен способ получения конъюгата аналога инсулина, включающий получение аналога инсулина; получение носителя и сшивание аналога инсулина и носителя.

Еще в одном другом аспекте в настоящем изобретении предложен способ увеличения периода полувыведения in vivo с использованием аналога инсулина или конъюгата аналога инсулина, полученного путем сшивания аналога инсулина и носителя.

СПОСОБ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Далее настоящее изобретение описано более подробно со ссылкой на Примеры. Тем не менее, эти Примеры предназначены лишь для иллюстративных целей, и изобретение не должно быть ограничено этими Примерами.

Пример 1: Получение вектора, экспрессирующего одноцепочечный аналог инсулина

Для получения аналогов инсулина, каждый из которых имеет модифицированную аминокислоту в А цепи или в В цепи, с использованием в качестве матрицы вектора, экспрессирующего нативный инсулин, были синтезированы прямой и обратный олигонуклеотиды (таблица 2), а затем проведена полимеразная цепная реакция (ПЦР) для амплификации гена каждого аналога.

В приведенной ниже таблице 1 представлены аминокислотные последовательности, модифицированные в А цепи или в В цепи, и названия аналогов. Так, Аналог 1 представляет собой аналог, где 1-й глицин А цепи заменен аланином, а Аналог 4 представляет собой аналог, где 8-й глицин В цепи заменен аланином.

Праймеры для амплификации аналога инсулина представлены в следующей таблице 2.

ПЦР для амплификации аналогов инсулина проводили в следующих условиях: 18 циклов 95°С в течение 30 секунд, 55°С в течение 30 секунд, 68°С в течение 6 минут. Фрагменты, содержащие аналоги инсулина, полученные в этих условиях, встраивали в вектор рЕТ22b для экспрессии в виде внутриклеточных телец включения, и полученные в результате экспрессионные векторы обозначили как рЕТ22b-аналоги инсулина 1-9. Эти экспрессионные векторы содержали нуклеиновые кислоты, кодирующие аминокислотные последовательности аналогов инсулина 1-9 под контролем промотора Т7, и белки, представляющие собой аналоги инсулина, экспрессировали в виде телец включения в клетках-хозяевах.

Последовательности ДНК и последовательности белка аналогов инсулина 1-9 представлены в следующей таблице 3.

Пример 2: Экспрессия рекомбинантного слитого пептида аналога инсулина

Экспрессии рекомбинантных аналогов инсулина осуществляли под контролем промотора Т7. Штамм Е. coli BL21-DE3 (Е. coli В F-dcm ompT hsdS(rB-mB-) gal λDE3); Novagen) трансформировали каждым из рекомбинантных векторов, экспрессирующих аналоги инсулина. Трансформацию проводили в соответствии с рекомендуемым протоколом (Novagen). Отдельные колонии, трансформированные каждым рекомбинантным экспрессионным вектором, собирали и инокулировали в 2х среду Лурия-Бертани (LB), содержащий ампициллин (50 мкг/мл) и культивировали при 37°С в течение 15 часов. Культуральную среду рекомбинантного штамма и 2х среду LB, содержащую 30% глицерин, смешивали в соотношении 1:1 (об/об). Каждый 1 мл распределяли в криопробирки, замораживали при -140°С и использовали в качестве концентрированной суспензии клеток для продуцирования рекомбинантного слитого белка.

Для экспрессии рекомбинантных аналогов инсулина 1 флакон каждой концентрированной суспензии клеток оттаивали и инокулировали в 500 мл 2Х бульона Лурия-Бертани и культивировали при перемешивании при 37°С в течение 14-16 часов. Культивирование останавливали, когда оптическая плотность (OD600) достигала 5,0 или выше. Культуральную среду использовали в качестве затравочной культуры. Эту затравочную культуру инокулировали в ферментер на 50 л (MSJ-U2, B.E.MARUBISHI, Япония), содержащий 17 л ферментационной среды, и запускали начальную периодическую ферментацию. Условия культивирования поддерживали при температуре 37°С, скорости тока воздуха 20 л/мин (1 об/об/мин), скорости перемешивания 500 об/мин и при рН 6,70 с использованием 30% раствора аммиака. Ферментацию проводили в режиме периодической культуры с подпиткой путем добавления питательного раствора при истощении питательных веществ в культуральной среде. Мониторинг роста штамма проводили по значению OD. Изопропилтиогалактозид (ИПТГ) вводили при конечной концентрации 500 мкМ, когда значение OD было выше 100. После введения ИПТГ культивирование продолжали в течение приблизительно 23-25 часов. После остановки культивирования рекомбинантные штаммы собирали центрифугированием и хранили при -80°С до использования.

Пример 3: Выделение и рефолдинг рекомбинантного аналога инсулина

С целью изменения рекомбинантных аналогов инсулина, экспрессированных в Примере 2, с получением растворимых форм клетки разрушали, после чего подвергали рефолдингу. 100 г (сырая масса) осадка клеток ресуспендировали в 1 л буфера для лизиса (50 мМ Трис-HCI (рН 9,0), 1 мМ этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) (рН 8,0), 0,2 M NaCl и 0,5% Тритон Х-100). Клетки разрушали с использованием микрофлюидизатора М-110ЕН (АС Technology Corp., модель М1475С) при рабочем давлении 15000 psi (103421,36 кПа). Разрушенный таким путем лизат клеток центрифугировали при 7000 об/мин и 4°С в течение 20 минут. Супернатант отбрасывали, и осадок ресуспендировали в 3 л буфера для отмывки (0,5% Тритон Х-100 и 50 мМ Трис-HCl (рН 8,0), 0,2 M NaCl, 1 мМ ЭДТА). После центрифугирования при 7000 об/мин и 4°С в течение 20 минут, осадок клеток ресуспендировали в дистиллированной воде с последующим центрифугированием таким же путем. Осадок, полученный таким путем, ресуспендировали в 400 мл буфера (1 M глицин, 3,78 г цистеин-HCl, рН 10,6) и перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. Для выделения ресуспендированного таким путем рекомбинантного аналога инсулина добавляли 400 мл 8 M мочевины и перемешивали при 40°С в течение 1 часа. Для рефолдинга солюбилизированных рекомбинантных аналогов инсулина центрифугирование проводили при 7000 об/мин и 4°С в течение 30 мин с получением супернатанта. К нему добавляли 2 л дистиллированной воды с использованием перистальтического насоса при скорости тока 1000 мл/ч при перемешивании при 4°С в течение 16 часов.

Пример 4: Очистка с помощью катион-связывающей хроматографии

После рефолдинга образец наносили на колонку Source S (GE Healthcare), уравновешенную 20 мМ натрийцитратным буфером (рН 2,0), содержащим 45% этанол, а затем белки, представляющие собой аналоги инсулина, элюировали в 10 объемах колонки линейным градиентом от 0% до 100% 20 мМ натрийцитратного буфера (рН 2,0), содержащего 0,5 M хлорида калия и 45% этанол.

Пример 5: Обработка трипсином и карбоксипептидазой В

Соли удаляли из элюированных образцов с использованием обессоливающей колонки, и буфер заменяли буфером (10 мМ Трис-HCl, рН 8,0). Добавляли трипсин, соответствующий 1000 молярной доле, и карбоксипептидазу В, соответствующую 2000 молярной доле по отношению к образцу белка, а затем перемешивали при 16°С в течение 16 часов. Для остановки реакции использовали 1 M цитрат натрия (рН 2,0), чтобы снизить рН до 3,5.

Пример 6: Очистка катион-связывающей хроматографией

После этой обработки образец наносили на колонку Source S (GE Healthcare), уравновешенную 20 мМ натрийцитратным буфером (рН 2,0), содержащим 45% этанол, а затем белки, представляющие собой аналоги инсулина, элюировали в 10 объемах колонки линейным градиентом от 0% до 100% 20 мМ натрийцитратного буфера (рН 2,0), содержащего 0,5 M хлорид калия и 45% этанол.

Пример 7: Очистка анион-связывающей хроматографией

Соли удаляли из элюированных образцов с использованием обессоливающей колонки, и буфер заменяли буфером (10 мМ Трис-HCI, рН 7,5). Для выделения чистого аналога инсулина из образца, полученного в Примере 6, образец наносили на анионообменную колонку (Source Q: GE Healthcare), уравновешенную буфером 10 мМ Трис (рН 7,5), и белок, представляющий собой аналог инсулина, элюировали в 10 объемах колонки линейным градиентом от 0% до 100% буфера 10 мМ Трис (рН 7,5), содержащего 0,5 M хлорид натрия.

Чистоту аналога инсулина, очищенного таким путем, анализировали с помощью белкового электрофореза (электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (ДСН-ПААГ), фиг. 1) и хроматографии высокого давления (высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ)) (фиг. 2), и модификации аминокислот были идентифицированы с помощью пептидного картирования (фиг. 3) и анализа молекулярной массы каждого пика.

В результате было обнаружено, что каждый аналог инсулина имеет желаемую модификацию в его аминокислотной последовательности.

Пример 8: Очистка конъюгата аналог инсулина (№7)-Fc иммуноглобулина

Для пегилирования N-конца бета-цепи аналога инсулина с использованием 3.4К ALD2 ПЭГ (NOF, Япония) аналог инсулина и ПЭГ подвергали взаимодействию при молярном отношении 1:4 с аналогом инсулина в концентрации 5 мг/мл при 4°С в течение приблизительно 2 часов. В это время реакцию проводили в 50 мМ цитрате натрия при рН 6,0 и 45% изопропаноле, добавляли 3,0 мМ цианоборгидрид натрия в качестве восстанавливающего агента и давали возможность взаимодействия. Реакционную смесь очищали на колонке SP-HP (GE Healthcare, США) с использованием буфера, содержащего цитрат натрия (рН 3,0) и 45% этанол, и градиента концентрации KCl.

Для получения конъюгата аналог инсулина - Fc фрагмент иммуноглобулина очищенный моно-пегилированный аналог инсулина и фрагмент Fc иммуноглобулина подвергали взаимодействию при молярном отношении от 1:1 до 1:2 и при 25°С в течение 13 ч, где суммарная концентрация белка составляла приблизительно 20 мг/мл. В это время условия реакции представляли собой буфер 100 мМ N-2-гидроксиэтилпиперазин-N-2-этансульфоновая кислота (ГЭПЭС) при рН 8,2, и к нему добавляли 20 мМ цианоборгидрид натрия в качестве восстанавливающего агента. Таким образом, ПЭГ был связан с N-концом фрагмента Fc.

После остановки реакции реакционный раствор наносили на колонку Q HP (GE Healthcare, США) с буфером Трис-HCl (рН 7,5) и градиентом концентрации NaCl для отделения и очистки непрореагировавшего фрагмента Fc иммуноглобулина и моно-пегилированного аналога инсулина.

Затем колонку Source 15ISO (GE Healthcare, США) использовали в качестве вторичной колонки, чтобы удалить остаточный фрагмент Fc иммуноглобулина и конъюгат, в котором два или более аналогов инсулина было сшито с Fc фрагментом иммуноглобулина, с получением в результате конъюгата аналог инсулина - Fc фрагмент иммуноглобулина. В это время элюирование проводили с использованием градиента концентрации Трис-HCl (рН 7,5), содержащего сульфат аммония, и конъюгат аналог инсулина - Fc иммуноглобулина, элюированный таким путем, анализировали с помощью электрофореза белка (ДСН-ПААГ, фиг. 4) и хроматографии высокого давления (ВЭЖХ) (фиг. 5). В результате было обнаружено, что чистота конъюгата составляет почти 99%.

Пример 9: Сравнение сродства связывания с рецептором инсулина между нативным инсулином, аналогом инсулина, конъюгатом нативный инсулин - Fc иммуноглобулина и конъюгатом аналог инсулина - Fc иммуноглобулина

Для измерения сродства связывания конъюгата аналог инсулина - Fc иммуноглобулина с рецептором инсулина для анализа использовали поверхностный плазмонный резонанс (SPR, BIACORE 3000, GE Healthcare). Рецепторы инсулина иммобилизовали на чипе СМ5 путем аминного сочетания, и на него независимо наносили 5 разведений или более нативного инсулина, аналога инсулина, конъюгата нативный инсулин - иммуноглобулин Fc и конъюгата аналог инсулина - Fc иммуноглобулина. Затем исследовали сродство связывания каждого вещества с рецептором инсулина. Сродство связывания каждого вещества вычисляли с использованием программного обеспечения BIAevaluation. Используемая при этом модель представляла собой связывание по Лангмюру 1:1 со смещением нулевой линии.

В результате по сравнению с инсулином человека аналог инсулина (№6) проявлял сродство связывания с рецептором 14,8%, аналог инсулина (№7) проявлял сродство связывания с рецептором 9,9%, аналог инсулина (№8) проявлял сродство связывания с рецептором 57,1%, аналог инсулина (№9) проявлял сродство связывания с рецептором 78,8%, конъюгат нативный инсулин - Fc иммуноглобулина проявлял сродство связывания с рецептором 3,7-5,9% в зависимости от постановки эксперимента, конъюгат аналог инсулина (№6) - Fc иммуноглобулина проявлял сродство связывания с рецептором 0,9% или менее, конъюгат аналог инсулина (№7) - Fc иммуноглобулина проявлял сродство связывания с рецептором 1,9%, конъюгат аналог инсулина (№8) - Fc иммуноглобулина проявлял сродство связывания с рецептором 1,8%, и конъюгат аналог инсулина (№9) - Fc иммуноглобулина проявлял сродство связывания с рецептором 3,3% (таблица 4). Соответственно, наблюдали, что аналоги инсулина по настоящему изобретению имеют сниженное сродство связывания с рецептором инсулина по сравнению с нативным инсулином, и конъюгаты аналог инсулина - Fc иммуноглобулина также имеют значительно сниженное сродство связывания с рецептором инсулина.

Пример 10: Сравнение эффективности in vitro между конъюгатом нативный инсулин - Fc иммуноглобулина и аналог инсулина - Fc иммуноглобулина

Для оценки эффективности in vitro конъюгата аналог инсулина - Fc иммуноглобулина для тестирования захвата глюкозы или синтеза липидов использовали дифференцированные адипоциты мышиного происхождения 3T3-L1. Клетки 3T3-L1 субкультивировали в среде DMEM (модифицированной Дульбекко среде Игла, Gibco, № по каталогу 12430), содержащей 10% ФСТ (фетальную сыворотку теленка), два или три раза в неделю и поддерживали. Клетки 3T3-L1 суспендировали в среде для дифференцировки (среде DMEM, содержащей 10% ФСТ), а затем засевали при плотности 5×10⁴ на лунку в 48-луночную чашку Петри и культивировали в течение 48 часов. Для дифференцировки адипоцитов 1 мкг/мл инсулина человека (Sigma, № по каталогу 19278), 0,5 мМ IBMX (3-изобутил-1-метилксантин, Sigma, № по каталогу 15879) и 1 мкМ дексаметазона (Sigma, № по каталогу D4902) смешивали со средой для дифференцировки, и в каждую лунку добавляли 250 мкл этой смеси после удаления предшествующей среды. Через 48 часов среду заменяли средой для дифференцировки с добавлением только 1 мкг/мл инсулина человека. Затем по мере замены среды средой для дифференцировки с добавлением 1 мкг/мл инсулина человека каждые 48 часов индукцию дифференцировки адипоцитов исследовали в течение 7-9 дней. Для тестирования поглощения глюкозы дифференцированные клетки промывали один раз средой DMEM без сыворотки, а затем 250 мкл добавляли для индукции истощения сыворотки в течение 4 часов. Среду DMEM без сыворотки использовали для перенесения 10-кратных серийных разведений инсулина человека от 2 мкМ до 0,01 мкМ, конъюгата нативный инсулин - Fc иммуноглобулина и конъюгатов аналог инсулина - Fc иммуноглобулина от 20 мкМ до 0,02 мкМ. Каждые 250 мкл образцов, полученных таким образом, добавляли к клеткам и культивировали в термостате с 5% СО₂ при 37°С в течение 24 часов. С целью измерения достаточного количества глюкозы в среде после инокуляции отбирали 200 мкл среды и разводили в 5 раз фосфатно-солевым буфером Дульбекко (Д-ФСБ), а затем GOPOD (аналитический набор GOPOD, Megazyme, № по каталогу K-GLUC). На основании поглощения стандартного раствора глюкозы преобразовывали концентрацию глюкозы в среде и вычисляли значения ЕС₅₀ для поглощения глюкозы конъюгатом нативный инсулин - Fc иммуноглобулина и конъюгатами аналог инсулина - Fc иммуноглобулина соответственно.

В результате по сравнению с инсулином человека конъюгат нативный инсулин - Fc иммуноглобулина показал поглощение глюкозы 11,6%, конъюгат аналог инсулина (№6) - Fc иммуноглобулина показал поглощение глюкозы 0,43%, конъюгат аналог инсулина (№7) - Fc иммуноглобулина показал поглощение глюкозы 1,84%, конъюгат аналог инсулина (№8) - Fc иммуноглобулина показал поглощение глюкозы 16,0%, конъюгат аналог инсулина (№9) - Fc иммуноглобулина показал поглощение глюкозы 15,1% (таблица 5). Соответственно, наблюдали, что конъюгат аналог инсулина (№6) - Fc иммуноглобулина и аналог инсулина (№7) - Fc иммуноглобулина по настоящему изобретению имеют значительно сниженный титр in vitro по сравнению с конъюгатом нативный инсулин - Fc иммуноглобулина, а конъюгат аналог инсулина (№8) - Fc иммуноглобулина и конъюгат аналог инсулина (№9) - Fc иммуноглобулина имеют титр in vitro, подобный титру конъюгата нативный инсулин - Fc иммуноглобулина.

Пример 11: Фармакокинетика конъюгата аналог инсулина - Fc иммуноглобулина

Для оценки фармакокинетики конъюгатов аналог инсулина - Fc иммуноглобулина сравнивали их концентрацию в крови по времени у нормальных крыс (крысы SD, самцы, возраст 6 недель), адаптированных в течение 5 дней к условиям лаборатории. Инъецировали соответственно 21,7 нмоль/кг конъюгата нативный инсулин - Fc иммуноглобулина и 65,1 нмоль/кг конъюгата аналог инсулина - Fc иммуноглобулина подкожно. Кровь собирали через 0, 1, 4, 8, 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168, 192 и 216 часов. В каждый момент времени концентрации в крови конъюгата нативный инсулин - Fc иммуноглобулина и 65,1 нмоль/кг конъюгата аналог инсулина - Fc иммуноглобулина измеряли с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) и использовали в качестве набора инсулин ELISA (ALPCO, США). Тем не менее, в качестве идентифицирующего антитела использовали конъюгат lgG4 мыши против человека с HRP (Alpha Diagnostic Intl, Inc, США).

Результаты исследования фармакокинетики конъюгата нативный инсулин - Fc иммуноглобулина и аналог инсулина - Fc иммуноглобулина показали, что их концентрации в крови возрастают пропорционально концентрациям их введения, и конъюгаты аналог инсулина - Fc иммуноглобулина, имеющие низкое сродство связывания с рецептором инсулина, показали значительно увеличенное время полувыведения по сравнению с конъюгатом нативный инсулин - Fc (фиг. 6).

Эти результаты позволяют предположить, что при сшивании аналогов инсулина по настоящему изобретению, модифицированных с получением сниженного сродства связывания с рецептором инсулина, с Fc участком иммуноглобулина с получением конъюгатов, эти конъюгаты могут быть предложены в качестве стабильных препаратов инсулина вследствие значительно увеличенного периода полувыведения in vivo, и, следовательно, можно эффективно применять их в качестве терапевтических средств для лечения диабета. Кроме того, поскольку сами аналоги инсулина согласно настоящему изобретению также имеют сниженное сродство связывания с рецептором инсулина и сниженный титр, эти аналоги инсулина также проявляют такой же эффект при сшивании с различными другими носителями.

На основании приведенного выше описания специалистам в данной области техники очевидно, что могут быть произведены различные модификации и изменения без отклонения от объема и сущности изобретения. Таким образом, понятно, что описанные выше воплощения изобретения не являются ограничивающими, а иллюстративными во всех аспектах. Объем изобретения вероятнее определен прилагаемой формулой изобретения, чем предшествующим ей описанием, и поэтому все изменения и модификации, входящие в пределы и границы формулы изобретения или эквиваленты таких пределов и границ, таких образом, подразумевают как включенные в формулу изобретения.

1. Аналог инсулина, имеющий сниженное сродство связывания с рецептором инсулина по сравнению с нативной формой, где аминокислота инсулина модифицирована путем замены 14-й аминокислоты А цепи на глутаминовую кислоту или аспарагин и где аминокислотные последовательности В цепи и А цепи инсулина состоят из SEQ ID NO: 38 и 37 соответственно.

2. Аналог инсулина по п. 1, состоящий из SEQ ID NO: 34 или 36.

3. Конъюгат аналога инсулина, обладающий увеличенной продолжительностью действия in vivo, в котором (1) аналог инсулина по п. 1 или 2 сшит с (2) одним биосовместимым веществом, выбранным из группы, состоящей из полиэтиленгликоля, жирной кислоты, холестерина, альбумина и его фрагментов, веществ, связывающих альбумин, полимеров, состоящих из повторяющихся звеньев конкретной аминокислотной последовательности, антитела, фрагментов антитела, FcRn (неонатальный рецептор кристаллизующегося фрагмента иммуноглобулина)-связывающих веществ, нуклеотида, фибронектина, трансферрина, сахарида и полимеров, в качестве носителя, способного к пролонгированию периода полувыведения аналога инсулина in vivo,

где аналог инсулина и биосовместимое вещество связаны друг с другом посредством пептида или непептидильного полимера в качестве линкера.

4. Конъюгат аналога инсулина по п. 3, где FcRn-связывающее вещество представляет собой Fc участок иммуноглобулина.

5. Конъюгат аналога инсулина по п. 3, где (1) аналог инсулина по п. 1 или 2 сшит с (2) Fc участком иммуноглобулина посредством (3) пептидного линкера или непептидильного линкера, выбранного из группы, состоящей из полиэтиленгликоля, полипропиленгликоля, сополимеров этиленгликоля-пропиленгликоля, полиоксиэтилированных полиолов, поливинилового спирта, полисахаридов, декстрана, поливинилэтилового эфира, биоразлагаемых полимеров, липидных полимеров, хитинов, гиалуроновой кислоты и их комбинации.

6. Конъюгат аналога инсулина по п. 5, где непептидильный линкер сшит с N-концом В цепи аналога инсулина.

7. Конъюгат аналога инсулина по п. 5, где оба конца непептидильного полимера сшиты с N-концом Fc участка иммуноглобулина и с N-концевой аминогруппой аналога инсулина либо ε-аминогруппой или тиольной группой внутреннего остатка лизина В цепи соответственно.

8. Конъюгат аналога инсулина по п. 5, где Fc участок иммуноглобулина является агликозилированным.

9. Конъюгат аналога инсулина по п. 5, где Fc участок иммуноглобулина состоит из доменов в количестве от 1 до 4, выбранных из группы, состоящей из доменов СН1 (тяжелой цепи 1), СН2, СН3 и СН4.

10. Конъюгат аналога инсулина по п. 5, где Fc участок иммуноглобулина представляет собой Fc участок, полученный из IgG, IgA, IgD, IgE или IgM.

11. Конъюгат аналога инсулина по п. 10, где каждый домен Fc участка иммуноглобулина представляет собой гибрид, состоящий из доменов, имеющих различное происхождение и полученных из иммуноглобулина, выбранного из группы, состоящей из IgG, IgA, IgD, IgE и IgM.

12. Конъюгат аналога инсулина по п. 5, где Fc участок иммуноглобулина дополнительно включает шарнирную область.

13. Конъюгат аналога инсулина по п. 10, где Fc участок иммуноглобулина представляет собой димер или мультимер, состоящий из одноцепочечных иммуноглобулинов, состоящих из доменов одного происхождения.

14. Конъюгат аналога инсулина по п. 10, где Fc участок иммуноглобулина представляет собой Fc участок IgG4.

15. Конъюгат аналога инсулина по п. 14, где Fc участок иммуноглобулина представляет собой агликозилированный Fc участок, полученный из IgG4 человека.

16. Конъюгат аналога инсулина по п. 5, где активная группа непептидильного линкера выбрана из группы, состоящей из альдегидной группы, пропиональдегидной группы, бутиральдегидной группы, малеимидной группы и производного сукцинимида.

17. Конъюгат аналога инсулина по п. 16, где производное сукцинимида представляет собой сукцинимидилпропионат, сукцинимидилкарбоксиметил, гидроксисукцинимидил или сукцинимидилкарбонат.

18. Конъюгат аналога инсулина по п. 5, где непептидильный линкер имеет активные альдегидные группы на его обоих концах.

19. Фармацевтическая композиция длительного действия для лечения диабета, содержащая конъюгат аналога инсулина по п. 3 в эффективном количестве.

20. Фармацевтическая композиция длительного действия по п. 19, которая представляет собой терапевтическое средство для лечения диабета.

21. Способ получения конъюгата аналога инсулина по п. 3, включающий: сшивание аналога инсулина по п. 1 или 2 с биосовместимым веществом,

выбранным из группы, состоящей из полиэтиленгликоля, жирной кислоты, холестерина, альбумина и его фрагментов, веществ, связывающих альбумин, полимеров, состоящих из повторяющихся звеньев конкретной аминокислотной последовательности, антитела, фрагментов антитела, FcRn-связывающих веществ, нуклеотида, фибронектина, трансферрина, сахарида и полимеров, посредством пептида или непептидильного полимера в качестве линкера.