Миметик кальцитонина для лечения болезней и нарушений

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к миметику кальцитонина, и может быть использовано в медицине. Миметик кальцитонина представляет собой полипептид с SEQ ID NO:44, ацетилированный на N-конце и амидированный на C-конце, и может быть использован в составе фармацевтических композиций для эффективного лечения сахарного диабета, избытка массы тела, неалкогольной жировой дистрофии, остеопороза или остеоартрита. 5 н. и 15 з.п. ф-лы, 17 ил., 5 табл., 7 пр.

 

Настоящее изобретение имеет отношение к миметикам кальцитонина и их применению в качестве медикаментов при лечении различных болезней и расстройств, включая, без ограничения, диабет (I и II типа), избыточный вес тела, чрезмерное потребление пищи и метаболический синдром, регуляцию уровня глюкозы в крови, регуляцию ответа на глюкозотолерантный тест, регулирование потребления пищи, лечение остеопороза и лечение остеоартрита.

В мире насчитывается около 250 миллионов больных диабетом, при этом предполагается, что это количество удвоится в течение следующих двух десятилетий. Более 90% этой популяции страдает от сахарного диабета 2 (T2DM). По оценкам в настоящее время диагноз поставлен только 50-60% человек, которые болеют T2DM или находятся на стадии, предшествующей клиническому проявлению T2DM.

T2DM представляет собой гетерогенное заболевание, которое характеризуется нарушениями в метаболизме углеводов и жиров. Причины возникновения T2DM являются многофакторными и включают как генетические, так и связанные с окружающей средой факторы, оказывающие воздействие на функцию β-клеток и чувствительность к инсулину в тканях, таких как мышцы, печень, поджелудочная железа и жировая ткань. В результате этого наблюдается пониженная секреция инсулина, которая происходит параллельно с прогрессирующим снижением функции β-клеток и развитием хронической резистентности к инсулину. Неспособность эндокринной части поджелудочной железы компенсировать периферическую резистентность к инсулину приводит к гипергликемии и началу развития клинических проявлений диабета. Резистентность тканей к опосредованному инсулином поглощению глюкозы в настоящее время считается основным патофизиологическим фактором развития T2DM. Критерием оптимальной коррекции T2DM является снижение уровней глюкозы в крови, которое может представлять собой как хроническое снижение уровней глюкозы в крови, так и повышение способности переносить высокие уровни глюкозы после приема пищи, что характеризуется снижением пиковых уровней глюкозы и более быстрым клиренсом. Обе эти ситуации обеспечивают меньшую нагрузку на β-клетки в отношении выработки инсулина и их функционирования.

Диабет I типа характеризуется потерей способности вырабатывать инсулин в ответ на потребление пищи и, следовательно, неспособностью регулировать уровень глюкозы в крови до нормального физиологического уровня.

Физическая структура кости может быть нарушена в результате воздействия целого ряда факторов, включая болезнь и повреждение. Одной из самых распространенных болезней костей является остеопороз, который характеризуется низкой костной массой и структурной деградацией костной ткани, приводящей к ломкости костей и повышенной чувствительности к переломам, в частности шейки бедренной кости, позвоночника и запястья. Остеопороз развивается в случае нарушения равновесия, например, когда скорость резорбции кости превышает скорость формирования кости. Показано, что введение эффективного количества противорезорбтивного средства, такого как кальцитонин, предотвращает резорбцию кости.

Воспалительные или дегенеративные заболевания, включая болезни суставов, например, остеоартрит (OA), ревматоидный артрит (RA) или ювенильный ревматоидный артрит (JRA), а также включая воспаления, являющиеся результатом аутоиммунного ответа, например, волчанку, анкилозирующий спондилоартрит (AS) или рассеянный склероз (MS), могут приводить к существенной потере подвижности из-за боли и разрушения сустава. Хрящ, покрывающий кость в суставах и обеспечивающий амортизацию, может деградировать с течением времени, таким образом, допуская нежелательное прямое соприкосновение двух костей, которое может ограничить движение одной кости относительно другой и/или вызвать повреждение одной кости другой во время движения сустава. Субхондральная кость, подлежащая под хрящом, также может деградировать. Введение эффективного количества противорезорбтивного средства, такого как кальцитонин, может предотвратить резорбцию кости.

WO 2013/067357 раскрывает искусственные варианты природных кальцитонинов, имеющие модифицированные аминокислотные последовательности, предназначающиеся для обеспечения улучшенных свойств.

Кальцитонины являются высококонсервативными у большого числа видов. Полноразмерный природный кальцитонин состоит из 32 аминокислот. Последовательности примеров природных кальцитонинов приведены ниже (в каждом случае последовательность имеет С-концевое амидирование - не показано):

Сравнение аминокислотных последовательностей разных природных кальцитонинов и UGP302 из WO 2013/067357 выглядит следующим образом:

Пептид UGP302 из WO 2013/067357 в дальнейшем называется КВР-042. Таким образом, имеется текущая необходимость разработки аналогов кальцитонина, обладающих улучшенными свойствами, или, по меньшей мере, обеспечивающих альтернативные искусственные последовательности, улучшающие свойства кальцитонинов природного происхождения, в частности в отношении агонизма к рецепторам амилина и кальцитонина, при этом, исключая CGRP-рецепторный агонизм, и тем самым обеспечивая оптимальную эффективность in vivo и безопасность.

Имеющие значение пептидные последовательности включают

Другие, представляющие интерес последовательности, показаны в следующих таблицах:

Таким образом, настоящее изобретение в данном документе предоставляет пептид, имеющий какую-либо одну из аминокислотных последовательностей, представленных в таблице 2а или таблице 4а, каждая из которых может быть карбоксилирована на N-конце или иным образом модифицирована с целью уменьшения положительного заряда первой аминокислоты и независимо от этого может быть амидирована на своем С-конце и в каждой из которых остатки цистеина в 1 и 7 положении могут одновременно замещаться α-аминосубериновой кислотой (Asu).

Изобретение включает пептид, имеющий какую-либо одну из аминокислотных последовательностей, представленных в таблице 3.

Изобретение также включает пептид, имеющий какую-либо одну из аминокислотных последовательностей, представленных в таблице 2b или таблице 4b, каждая из которых может быть карбоксилирована на N-конце или иным образом модифицирована с целью уменьшения положительного заряда первой аминокислоты и независимо от этого может быть амидирована на своем С-конце и в каждой из которых остатки цистеина в 1 и 7 положении могут одновременно замещаться α-аминосубериновой кислотой (Asu).

Исследовав активность 32 аминокислотных аналогов природных кальцитонинов, в частности, изучив, для каких аминокислот требуется сильная активация рецептор-опосредованных ответов, мы обнаружили, что аминокислоты под номерами 11, 15, 18, 22, 24, 30 и 31 являются более строгими в терминах типа аминокислоты, при этом предпочтительными значениями для 11 является К или R, для 15 - D или Е, для 18 - К или R, для 22 - Y или F, для 24 предпочтительно К, хотя R работает, для 30 - N и для 31 - А.

Данный пептид может быть заключен в состав фармацевтического препарата, предназначенного для энтерального или парентерального введения. Предпочтительными являются инъекционные композиции, предпочтительно для подкожных инъекций, однако, пептид может быть заключен в предназначенный для перорального введения состав с носителем, при этом необязательно носитель увеличивает биодоступность пептида при пероральном введении. Подходящие носители включают носители, содержащие 5-CNAC, SNAD и SNAC.

Необязательно, пептид заключается в состав фармацевтической композиции для перорального введения, содержащей покрытые лимонной кислотой частицы, причем покрытые лимонной кислотой частицы увеличивают биодоступность пептида при пероральном введении.

Изобретение включает пептид изобретения, предназначенный для использования в качестве медикамента. Пептид может использоваться при лечении диабета (I и/или II типа), избыточного веса тела, чрезмерного потребления пищи, метаболического синдрома, ревматоидного артрита, неалкогольной жировой дистрофии печени, остеопороза или остеоартрита, плохо регулируемых уровней глюкозы в крови, плохо регулируемого ответа на глюкозотолерантный тест или плохо регулируемого потребления пищи. В частности, пептиды могут использоваться для понижения нежелательно высокого уровня глюкозы в крови натощак или для понижения нежелательно высокого HbA1c или для понижения нежелательно высокого ответа на глюкозотолерантный тест.

В некоторых вариантах осуществления N-концевой участок миметиков кальцитонина, обсужденных выше, модифицируется с целью уменьшения положительного заряда первой аминокислоты. Например, ацетильная, пропионильная или сукцинильная группа может быть замещена на цистеин-1. В таблице 3, "Ас" относится к модификации ацетильной группы. Каждая 'Ас' в таблице 3 может быть заменена на "Pr" в отношении модификации пропионильной группы, или на "Succ" в отношении модификации сукцинильной группы. "NH2" относится к амидированной С-концевой карбоксильной группе. Альтернативные пути уменьшения положительного заряда включают, но не ограничиваются этим, пегилирование, основанное на полиэтиленгликоле, или добавление другой аминокислоты, такой как глутаминовая кислота или аспарагиновая кислота на N-конце. Альтернативно, другие аминокислоты могут быть добавлены к N-концу пептидов, обсужденных выше, включая, но не ограничиваясь этим, лизин, глицин, формилглицин, лейцин, аланин, ацетил-аланин и диаланин. Специалистам в данной области техники будет понятно, что пептиды, имеющие некоторое количество остатков цистеина, часто образуют дисульфидный мостик между двумя такими остатками цистеина. Все описанные в данном документе пептиды определяются как необязательно включающие один или более таких дисульфидных мостиков, в частности в местоположениях Cys1-Cys7. В подражание этому, цистеины в положениях 1 и 7 могут быть вместе заменены на α-аминосубериновую кислоту. Все раскрытые в описании пептиды, обозначенные номерами КВР-0##, имеют такой дисульфидный мостик.

Наряду с тем, что миметики кальцитонина настоящего раскрытия могут существовать в форме свободной кислоты, предпочтительно, что С-концевая аминокислота может быть амидирована. Заявители предполагают, что такое амидирование может способствовать эффективности и/или биодоступности пептида. Предпочтительный метод производства амидированных вариантов миметиков кальцитонина настоящего раскрытия состоит в том, чтобы воздействовать на предшественники (имеющие глицин вместо С-концевой аминогруппы желательного амидированного продукта) в присутствии пептидилглицин альфа-амидирующей монооксигеназы в соответствии с известными методами, при этом предшественники превращаются в амидированные продукты в реакциях, описанных, например, в US 4708934 и ЕР 0308067 и ЕР 0382403.

Предпочтительным является рекомбинантный способ получения предшественника и фермента, катализирующего превращение предшественника в кальцитонин лосося. Такое рекомбинантное получение обсуждается в Biotechnology, Vol. 11 (1993) pp. 64-70, by Ray MV, Van Duyne P, Bertelsen AH, Jackson-Matthews DE, Stunner AM, Merkler DJ, Consalvo AP, Young SD, Gilligan JP, Shields PP., где кроме того описывается превращение предшественника в амидированный продукт. Рекомбинантный продукт, представленный в данном документе, аналогичен природному кальцитонину лосося и кальцитонину лосося, полученному с использованием синтеза в растворе и твердофазного химического синтеза пептидов.

Получение амидированных продуктов также может осуществляться с помощью амидирующего фермента и процесса, представленного Consalvo, et al в US 7445911; Miller et al, US 2006/0292672; Ray et al, 2002, Protein Expression and Purification, 26:249-259; and Mehta, 2004, Biopharm. International, July, pp. 44-46.

Получение предпочтительных амидированных пептидов может происходить, например, путем получения удлиненного глицином предшественника в Е. coli в виде растворимого гибридного белка в присутствии глутатион-8-трансферазы или путем прямой экспрессии предшественника в соответствии с методикой, описанной в US6103495. Такой удлиненный глицином предшественник имеет молекулярную структуру, идентичную желательному амидированному продукту за исключением фрагмента на С-конце (где продукт заканчивается фрагментом --X--NH₂, тогда как предшественник заканчивается --X-gly, X является С-концевым аминокислотным остатком продукта). Альфа-амидированный фермент, описанный в вышеуказанных публикациях, катализирует превращение предшественников в продукт.Такой фермент предпочтительно получают рекомбинантным методом, например, в клетках яичника китайского хомячка (СНО)), как описано в цитированных выше статьях, опубликованных в Biotechnology and Biopharm.

Пептидные активные агенты настоящего раскрытия в форме свободных кислот могут быть получены подобным образом, за исключением отсутствия включения С-концевого глицина в "предшественник", при этом предшественник является альтернативой окончательного пептидного продукта и не требует стадии амидирования.

За исключением случаев, когда оговорено особо, предпочтительная дозировка миметиков кальцитонина настоящего изобретения полностью аналогична, как для терапевтической, так и для профилактической цели. Желательные дозировки более подробно обсуждаются ниже и различаются в зависимости от способа введения.

За исключением тех случаев, когда указано иначе или когда очевидно из контекста, дозировки в описании относятся к весу активных соединений, не изменяющихся под действием или без учета фармацевтических эксципиентов, разбавителей, носителей или других ингредиентов, несмотря на то, что такие дополнительные ингредиенты при желании входят в состав. Любые лекарственные формы (капсула, таблетка, инъекционная форма или тому подобное), обычно используемые в фармацевтическом производстве для доставки пептидных активных агентов, подходят для использования в данном случае, при этом термины "эксципиент", "разбавитель" или "носитель" включают такие неактивные ингредиенты, которые, как правило, входят в состав вместе с активными ингредиентами в подобных лекарственных формах при производстве. Предпочтительная пероральная лекарственная форма обсуждается более подробно ниже, однако, она не должна рассматриваться как исключительный способ введения активных агентов настоящего раскрытия.

Миметики кальцитонина настоящего раскрытия могут применяться для лечения целого ряда болезней и нарушений у пациента. Использованный в описании термин "пациент" означает организм, принадлежащий к царству животных. В одном варианте осуществления термин "пациент" относится к позвоночным, конкретнее к млекопитающим, включая человека.

Соответственно, настоящее раскрытие включает применение пептидов при лечении диабета I типа, диабета II типа или метаболического синдрома, ожирения или подавления аппетита, или для снижения резистентности к инсулину, для уменьшения нежелательно высокого уровня глюкозы в сыворотке крови натощак, или для уменьшения нежелательно высокого уровня глюкозы в сыворотке крови, или для уменьшения нежелательно высокого уровня инсулина в сыворотке, или для уменьшения нежелательно сильного ответа на глюкозотолерантный тест, или для лечения остеопороза, или для лечения остеоартрита.

В данной области существует ряд принятых в данной области систем измерений диапазона нормальных значений веса тела с учетом целого ряда факторов, таких как пол, возраст и рост. Пациент, нуждающийся в режимах лечения или профилактики, изложенных в данном документе, включает пациентов, вес тела которых превышает признанные нормы, или у которых, вследствие наследственности, факторов окружающей среды или другого общепризнанного фактора риска, имеется более высокий риск приобретения избыточного веса тела или ожирения, чем у всей популяции. В соответствии с настоящим раскрытием предполагается, что миметики кальцитонина могут использоваться для лечения диабета, в том случае, когда контроль за весом тела является вопросом осуществления лечения.

В одном варианте осуществления способ включает энтеральное введение пациенту, нуждающемуся в таком введении, для лечения указанного состояния фармацевтически эффективного количества какого-либо одного из описанных в данном документе пептидов.

В одном варианте осуществления способ включает парентеральное введение пациенту, нуждающемуся в таком введении, для лечения указанного состояния фармацевтически эффективного количества какого-либо одного из описанных в данном документе пептидов. Для парентерального введения (включая внутрибрюшинное, подкожное, внутривенное, внутрикожное или внутримышечное введение с помощью инъекции) могут использоваться, например, растворы пептида настоящего раскрытия в кунжутном или арахисовом масле или в водном пропиленгликоле. Водные растворы должны быть соответствующим образом забуферены (предпочтительным является значение рН выше 8), если необходимо, а жидкий разбавитель сначала приводят в изотоническое состояние. Эти водные растворы являются подходящими для внутривенных инъекций. Масляные растворы пригодны для внутрисуставных, внутримышечных и подкожных инъекций. Приготовление подобных растворов в стерильных условиях легко осуществляется с помощью общепринятых фармацевтических методов, хорошо известных специалисту в данной области. Примеры подходящих для парентерального применения препаратов включают растворы, предпочтительно масляные или водные растворы, а также суспензии, эмульсии или имплантаты, включая суппозитории. Пептиды могут входить в состав стерильной формы, содержащей несколько доз или однократную дозу, например, будучи диспергированными в жидком носителе, таком как стерильный физиологический раствор или 5% солевые растворы с декстрозой, обычно используемые в сочетании с инъекционными лекарственными средствами.

Указанный способ может включать предварительную стадию установления, страдает ли пациент от указанного состояния, и/или следующую стадию определения насколько указанное лечение является эффективным для облегчения состояния у указанного пациента, например, в каждом случае проведение перорального теста на толерантность к глюкозе или теста на уровень сахара в крови в покое.

Для осуществления улучшенного контроля над весом пациента, чтобы вызвать потерю веса или избежать прибавки веса, активное соединение предпочтительно вводится один раз или более в день, например, по меньшей мере, два раза в день, например, от 2 до 4 раз в день. Композиции активного соединения могут содержать лекарственную форму, подходящую для такого режима введения. Активные соединения могут вводиться в целях контролирования веса пациента, подвергающегося лечению диабета или метаболического синдрома.

Пероральные энтеральные композиции предназначаются для потребления путем проглатывания с целью последующего высвобождения в кишечнике, ниже желудка, и следовательно доставки через воротную вену в печень, в противоположность композициям, которые должны находиться во рту, чтобы попасть в кровоток после подъязычного или щечного рассасывания.

Подходящие для использования в настоящем раскрытии лекарственные формы включают таблетки, мини-таблетки, капсулы, гранулы, шарики, шипучие твердые и жевательные твердые композиции. Такие композиции могут включать желатин, который предпочтительно является гидролизованным желатином или желатином с низким молекулярным весом. Такие композиции могут быть получены в результате сушки замораживанием гомогенного водного раствора, содержащего кальцитонин или его фрагмент или конъюгат и гидролизованный желатин или низкомолекулярный желатин, и последующей обработки получающегося в результате твердого вещества до получения указанной фармацевтической композиции для перорального приема, при этом желатин может иметь средний молекулярный вес от 1000 до 15000 Дальтон. Такие композиции могут включать протективное соединение-носитель, такое как 5-CNAC или другие, как раскрывается в описании.

В то время как пероральные композиции, такие как таблетки и капсулы, являются предпочтительными, композиции, предназначенные для применения в настоящем раскрытии, могут также иметь форму сиропов, эликсиров или тому подобного и суппозиториев или тому подобного. Пероральная доставка в большинстве случаев является предпочтительным способом доставки, поскольку этот способ является удобным, относительно легким и в большинстве случаев безболезненным, что дает в результате лучшее соблюдение режима лечения пациентами по сравнению с другими способами доставки. Однако, биологический, химический и физический барьеры, такие как изменение значения рН в желудочно-кишечном тракте, сильные пищеварительные ферменты и непроницаемые для активных агентов гастроинтестинальные оболочки, делают проблематичной пероральную доставку кальцитонин-подобных пептидов млекопитающим, например, подтверждено, что пероральная доставка кальцитонинов, которые являются полипептидными гормонами с длинной цепью, секретируемыми парафолликулярными клетками щитовидной железы у млекопитающих и ультимобранхиальной железой у птиц и рыб, исходно затруднена, по меньшей мере отчасти, вследствие недостаточной стабильности кальцитонина в желудочно-кишечном тракте, а также неспособности кальцитонина легко транспортироваться через кишечные стенки в кровоток.

Композиции, подходящие для перорального приема, описываются ниже.

Лечение пациентов

В одном варианте осуществления миметик кальцитонина настоящего раскрытия вводится в соответствующей дозировке для сохранения уровней миметика в сыворотке пациентов в пределах от 5 пикограмм до 500 нанограмм на миллилитр, предпочтительно в пределах от 50 пикограмм до 250 нанограмм, например, от 1 до 100 нанограмм на миллилитр. Уровни в сыворотке можно измерить с помощью радиоиммунологического метода, известного в данной области. При этом лечащий врач может контролировать ответ пациента и затем изменять дозировку, чтобы обеспечить метаболизм и ответ у отдельного пациента. Практически одновременное высвобождение лучше всего достигается путем введения всех компонентов настоящего раскрытия в виде одной пилюли или капсулы. Однако, раскрытие также включает, например, разделение необходимого количества миметика кальцитонина между двумя или более таблетками или капсулами, которые могут вводиться вместе, так что они совместно обеспечивают необходимое количество ингредиентов. "Фармацевтическая композиция" при использовании в описании включает, но не ограничивается этим, полную дозировку, подходящую для конкретного введения пациенту, независимо от того, одна или более таблеток или капсул (или других лекарственных форм) рекомендуются при данном введении.

Миметик кальцитонина настоящего раскрытия может быть заключен в состав для перорального введения с применением методов, использованных в продуктах Unigene Enteripep®. Включаются способы, описанные в патенте США №5912014, патенте США №6086918, патенте США №6673 574, патенте США №7316819, патенте США №8093207 и публикации США №2009/0317462. В частности, возможно использование конъюгации соединения с мембранным транслокатором (переносчиком), таким как домен белковой трансдукции HIV ТАТ белка, заключение в состав вместе с одним или более ингибиторами протеазы и/или с агентом, понижающим значение рН, на который может быть нанесено покрытие из защитного кислотоустойчивого носителя и/или усилителя абсорбции, который может представлять собой поверхностно-активное вещество.

В одном варианте осуществления миметик кальцитонина настоящего раскрытия создается предпочтительно для пероральной доставки известным способом, как в патентной публикации США №2009/0317462. Одна предпочтительная пероральная лекарственная форма в соответствии с настоящим раскрытием представлена в таблице 5, ниже:

В одном варианте осуществления миметик кальцитонина настоящего раскрытия может предназначаться для энтерального, в частности перорального, введения смеси с подходящим соединением-носителем. Подходящие соединения-носители включают соединения, описанные в патенте США №5773647 и патенте США №5 866536, в частности из их числа эффективной является 5-CNAC (N-(5-хлорсалицилоил)-8-аминокаприловая кислота, обычно в виде динатриевой соли). Другими предпочтительными носителями или средствами доставки являются SNAD (натриевая соль 10-(2-гидроксибензамидо)декановой кислоты) и SNAC (натриевая соль N-(8-[2-гидроксибензоил]амино)каприловой кислоты). В одном варианте осуществления фармацевтическая композиция настоящего раскрытия включает доставку эффективного количества носителя, такого как 5-CNAC, т.е. количества, эффективного для доставки соединения, необходимого для достижения желательного эффекта. Обычно, такой носитель, как 5-CNAC присутствует в количестве от 2,5% до 99,4% по весу, более предпочтительно от 25% до 50% по весу от всей композиции.

В дополнение к этому WO 00/059863 раскрывает динатриевые соли формулы I

в которой

R¹, R², R³ и R⁴ независимо представляют собой водород, -ОН, -NR⁶R⁷, галоген, С₁-С₄алкил или С₁-С₄алкокси;

R⁵ представляет собой замещенный или незамещенный С₂-С₁₆ алкилен, замещенный или незамещенный С₂-С₁₆ алкенилен, замещенный или незамещенный С₁-С₁₂ алкил(арилен) или замещенный или незамещенный арил(С₁-С₁₂ алкилен); a R⁶ и R⁷ являются независимо водородом, кислородом или С₁-С₄ алкилом; и их гидраты и сольваты как особенно эффективные для пероральной доставки активных агентов, таких как кальцитонины, например, кальцитонин лосося, эти соединения могут использоваться в настоящем раскрытии.

Предпочтительные энтеральные композиции, необязательно использующие микронизированный 5-CNAC, могут быть в основном такими, как описано в WO 2005/014031.

Соединение может быть заключено в композицию для перорального введения с помощью методов, использованных в продукте Capsitonin от компании Bone Medical Limited. Могут использоваться методы, как в композициях Axcess. Конкретнее, активный ингредиент может быть заключен в капсулу с энтеросолюбильным покрытием, способным выдерживать прохождение через желудок. Капсула может содержать активное соединение вместе с веществом, усиливающим абсорбцию гидрофильного ароматического спирта, например, как описано в WO 02/028436. Известно, что энтеросолюбильное покрытие может становиться проницаемым в зависимости от значения рН, например, при значении рН от 3 до 7. WO 2004/091584 также описывает подходящие способы создания композиций с использованием ароматического спирта-усилителя абсорбции.

Соединение может быть создано с помощью методов, используемых в продуктах Oramed, которые могут включать композицию с омега-3 жирной кислотой, как показано в WO 2007/029238 или как описано в US 5102666.

В общем, могут использоваться фармацевтически приемлемые соли (в частности моно- или динатриевые соли), сольваты (например, спиртовые сольваты) и гидраты этих носителей или могут использоваться средства доставки.

Пероральное введение фармацевтических композиций согласно раскрытию может осуществляться регулярно, например, один или более раз в день или в неделю; периодически, например, нерегулярно в течение дня или недели; или циклически, например, регулярно в течение нескольких дней или недель, с последующим периодом без введения. Лекарственная форма фармацевтических композиций, раскрываемых в настоящее время вариантов осуществления, может быть любой известной формой, например, жидкой или твердой лекарственной формой. Жидкие лекарственные формы включают растворы, эмульсии, суспензии, сиропы и эликсиры. Кроме активного соединения и носителя, такого как 5-CNAC, жидкие композиции также могут включать инертные эксципиенты, обычно используемые в данной области техники, например, солюбилизирующие вещества, такие как этанол; масла, такие как хлопковое масло, касторовое масло и кунжутное масло; смачивающие вещества; эмульгирующие вещества; суспендирующие вещества; подсластители; ароматизирующие вещества и растворители, такие как вода. Твердые лекарственные формы включают капсулы, мягкие желатиновые капсулы, таблетки, капсуловидные таблетки, порошки, гранулы или другие твердые лекарственные формы для перорального приема, гранулы или другие твердые лекарственные формы, которые могут быть изготовлены с помощью хорошо известных в данной области техники методов. Кроме того, фармацевтические композиции могут содержать вспомогательные вещества в обычно используемых количествах включая, но не ограничиваясь этим, вещество, регулирующее значение рН, консервирующее вещество, вещество, придающее вкус, вещество, исправляющее вкус, ароматизирующее вещество, увлажняющее вещество, вспомогательное вещество, красящее вещество, поверхностно-активное вещество, смягчающее вещество, смазывающее вещество, такое как стеарат магния, вещество для повышения текучести, добавку для прессования, солюбилизатор, эксципиент, разбавитель, такой как микрокристаллическая целлюлоза, например, Avicel РНак 102, поставляемый корпорацией FMC, или любую их комбинацию. Другие добавки могут включать фосфатно-буферные соли, лимонную кислоту, гликоли и другие диспергирующие средства. Такая композиция также может включать один или более ингибиторов ферментов, таких как актинонин или эпиактинонин и их производные; апротинин, трасилол и ингибитор Бовмана-Бирка. Кроме того, ингибитор транспорта, т.е. [rho]-гликопротеин, такой как кетопрофин, может присутствовать в композициях настоящего раскрытия. Твердые фармацевтические композиции текущего раскрытия могут быть изготовлены с помощью общеизвестных методов, например, путем составления смеси активного соединения, носителя, такого как 5-CNAC, и любых других ингредиентов, перемешивания и заполнения в капсулы или, вместо наполнения в капсулы, формования с последующим таблетированием или прессования в форме с получением таблеток. В дополнение к этому с помощью известных методов может быть получена твердая дисперсия, с последующей дополнительной обработкой с целью получения таблетки или капсулы. Предпочтительно, ингредиенты в фармацевтических композициях текущего раскрытия являются равномерно или однородно смешанными по всей твердой лекарственной форме.

Альтернативно, активное соединение может создаваться в виде конъюгата с указанным носителем, который может быть олигомером, как описано в US 2003/0069170, например,

Такие конъюгаты могут вводиться в комбинации с жирной кислотой и солью желчной кислоты, как описано в этом документе.

Могут применяться конъюгаты с полиэтиленгликолем (PEG), как описано, например, в работе Mansoor et al.

Альтернативно, активные соединения могут быть смешаны с нитрозо-N-ацетил-D,L-пеницилламином (SNAP) и раствором карбопола или с таурохолатом и раствором карбопола для получения мукоадгезивной эмульсии.

Активное соединение может быть «загружено» в нанокапсулы из хитозана, как раскрывается в работе Prego et al (необязательно, модифицированные PEG, как в работе Prego Prego С, Torres D, Fernandez-Megia E, Novoa-Carballal R, , Alonso MJ.) или покрытые хитозаном или PEG липидные наночастицы, как раскрывается в работе Garcia-Fuentes et al. Нанокапсулы из хитозана для этой цели могут быть модифицированы иминотиоланом, как описано в работе Guggi et al. Они могут входить в состав эмульсий вода/масло/вода, как описано в работе Dogru et al. Биодоступность активных соединений может быть увеличена использованием тауродезоксихолата или лауроилкарнитина, как описано в работе Sinko et al или в работе Song et al. В целом, пригодные в качестве носителей наночастицы обсуждаются в работе de la Fuente et al и могут использоваться в настоящем изобретении.

Другие подходящие стратегии для композиций, предназначенных для перорального применения, включают использование системы временного усилителя проницаемости (ТРЕ), описанной в WO 2005/094785 от компании Chiasma Ltd. ТРЕ использует масляную суспензию твердых гидрофильных частиц в гидрофобной среде для защиты лекарственной молекулы от инактивирования агрессивной окружающей средой желудочно-кишечного (GI) тракта и в то же самое время оказывает воздействие на стенку GI, индуцируя проникновение доставляемых лекарственных молекул.

Кроме того, включается использование глутатиона или соединений, содержащих многочисленные тиоловые группы, как описано в US 2008/0200563, для ингибирования работы выкачивающих насосов в мембранах клеток слизистой оболочки. Примеры практического осуществления таких способов также описаны в Caliceti, P. Salmaso, S., Walker, G. and , A. (2004) 'Development and in vivo evaluation of an oral insulin-PEG delivery system.' Eur. J. Pharm. Sci., 22, 315-323, in Guggi, D., Krauland, A.H., and , A. (2003) 'Systemic peptide delivery via the stomach: in vivo evaluation of an oral dosage form for salmon calcitonin'. J. Control. Rel. 92, 125-135, and in , A., Pinter, Y., Guggi, D., Kahlbacher, H., , G., Schuh, M., Schmerold, I., Del Curto, M.D., D'Antonio, M., Esposito, P. and Huck, Ch. (2005) 'The use of thiolated polymers as carrier matrix in oral peptide delivery' - Proof of concept. J. Control. Release, 106, 26-33.

Активное соединение может быть заключено в бесшовные микросферы, как описано в WO 2004/084870, где активный фармацевтический ингредиент солюбилизируется в виде эмульсии, микроэмульсии или суспензии, помещается внутрь мини-сфер и покрывается разными способами либо с помощью общепринятых, либо новых технологий нанесения покрытий. В результате получается инкапсулированное лекарственное средство в "заранее солюбилизированной" форме, что при пероральном введении обеспечивает заранее заданное немедленное или длительное высвобождение активного лекарственного средства в точно определенных местоположениях и в строго определенных величинах на всем протяжении желудочно-кишечного тракта. В сущности, предварительная солюбилизация лекарственного средства увеличивает предсказуемость его кинетического профиля, одновременно увеличивая проницаемость и стабильность лекарственного средства.

Можно использовать покрытые хитозаном нанокапсулы, как описано в US 2009/0074824. Введенная с помощью этой технологии активная молекула является защищенной, находясь внутри нанокапсул, поскольку они являются устойчивыми к действию желудочного сока. В дополнение к этому мукоадгезивные свойства системы увеличивают время адгезии к стенкам кишечника (было установлено, что существует задержка при транзите по желудочно-кишечному тракту этих систем), способствуя более эффективной абсорбции активной молекулы.

Также могут использоваться методы, разработанные компанией TSR1 Inc. Эти способы включают технологию гидрофильной солюбилизации (Hydrophilic Solubilization Technology, HST), в которой желатин, природный экстракт коллагена, несущий как положительные, так и отрицательные заряды, покрывает частицы активного ингредиента, содержащегося в лецитиновых мицеллах, и предотвращает их агрегацию или слипание. Это дает в результате улучшенную смачиваемость частиц гидрофобного лекарства за счет полярных взаимодействий. Кроме того, амфифильный лецитин снижает поверхностное натяжение между растворяющей жидкостью и поверхностью частиц.

Активный ингредиент может быть приготовлен в виде композиции с кукурбитурилами в качестве наполнителей.

Альтернативно, может применяться технология GIPET компании Merrion Pharmaceuticals для получения таблеток, покрытых кишечнорастворимой оболочкой, содержащих активный ингредиент с усилителем всасывания, который может представлять собой жирную кислоту со средней длиной цепи, производное жирной кислоты со средней длиной цепи, как описано в US 2007/0238707, или транслоцируемый через мембрану пептид, как описано в US 7268214.

Можно применять технологию GIRES™, которая состоит из лекарственной формы с контролируемым высвобождением внутри надуваемого мешка, который помещается в лекарственную капсулу для перорального введения. После растворения капсулы генерирующая газ система надувает мешок в желудке. В клинических испытаниях было показано, что мешок остается в желудке в течение 16-24 часов.

Альтернативно, активное соединение может быть конъюгировано с защитным модификатором, что позволяет ему избежать ферментативной деградации в желудке и облегчает его всасывание. Активное соединение может быть ковалентно конъюгировано с монодисперсным производным короткоцепочечных метокси-полиэтиленгликоль-гликолипидов, которое кристаллизуется и лиофилизируется в сухой активный фармацевтический ингредиент после очистки. Такие способы описаны в US 5438040 и на сайте www.biocon.com.

Для доставки активного соединения также может применяться везикула, нацеленная на печень (hepatic-directed vesicle, HDV). HDV может состоять из липосом (диаметр ≤150 нм), содержащих активное соединение, которые также содержат в своем липидном бислое молекулу, нацеленную на гепатоциты. Нацеливающая молекула направляет доставку инкапсулированного активного соединения в клетки печени, вследствие чего для обеспечения эффекта требуется относительно малое количество активного соединения. Такая технология описана в US 2009/0087479 и дополнительно на сайте www.diasome.com.

Активное соединение может быть включено в композицию, дополнительно содержащую в основном неводную гидрофильную среду, включающую спирт и сорастворитель в сочетании с неполным глицеридом со средней длиной цепи, необязательно в смеси с длинноцепочечными видами ПЭГ, как описано в US 2002/0115592 в отношении инсулина.

Альтернативно этому, можно применять интестинальные пластыри, как описано в работе Shen Z, Mitragotri S, Pharm Res. 2002 Apr; 19 (4): 391-5 'Intestinal patches for oral drug delivery'.

Активное соединение может быть заключено в размываемую матрицу, сделанную из гидрогеля, смешанного с гидрофобным полимером, как описано в US 7189414.

Подходящие дозировки для перорального приема при лечении взрослых людей могут находиться в пределах от 0,05 до 5 мг, предпочтительно примерно от 0.1 до 2.5 мг.

Частота приема дозировки пациентами может составлять от одного до шести раз в день, например, от двух до четырех раз в день. Желательно, лечение должно проводиться в течение длительного периода времени, по меньшей мере, 6 недель, предпочтительно, по меньшей мере, 6 месяцев, предпочтительно, по меньшей мере, года, и необязательно в течение жизни.

Комбинированное лечение при соответствующих состояниях может проводиться с применением композиции согласно настоящему изобретению и с отдельным введением одного или более других терапевтических средств. Альтернативно этому, композиция согласно настоящему изобретению может включать одно или более других терапевтических средств для совместного введения.

Комбинированное лечение согласно настоящему изобретению включает комбинации активного соединения, как описано, с инсулином, GLP-2, GLP-1, GIP или амилином или вообще с другими антидиабетическими препаратами. Таким образом, комбинированное лечение, включая применение совместных композиций, может проводиться с применением агентов, увеличивающих чувствительность к инсулину, включая бигуаниды, такие как метформин, буформин и фенформин, тиазолидинедионы (TZD's) (PPAR), такие как балаглитазон, пиоглитазон, ривоглитазон, росиглитазон и троглитазон, двойные агонисты PPAR, такие как алеглитазар, мураглитазар и тезаглитазар, или стимуляторы секреции, включая препараты сульфонилмочевины, такие как карбутамид, хлорпропамид, гликлазид, толбутамид, толазамид, глипизид, глибенкламид, глибурид, гликвидон, гликлопирамид и глимепририд, меглитиниды/глиниды (К+), такие как натеглинид, репаглинид и митиглинид, аналоги GLP-1, такие как эксенатид, лираглутид и албиглутид, ингибиторы DPP-4, такие как алоглиптин, линаглиптин, саксаглиптин, ситаглиптин и вилдаглиптин, аналоги инсулина или специальные композиции, такие как (быстрого действия) инсулин лиспро, инсулин аспарт, инсулин глулизин, (длительного действия) инсулин гларгин, инсулин детемир), вдыхаемый инсулин - эксубра и NPH инсулин, и другие, включая ингибиторы альфа-глюкозидазы, такие как акарбоза, миглитол и воглибоза, аналоги амилина, такие как прамлинтид, ингибиторы SGLT2, такие как дапаглиф лозин, ремоглиф лозин и серглифлозин, а также прочие агенты, включая бенфлуорекс и толрестат.

Дополнительные комбинации включают совместное введение или совместное заключение в состав с лептинами. Резистентность к лептину является точно установленным компонентом диабета 2 типа, однако, инъекции лептина до настоящего времени оказывались неспособными улучшить это состояние. В противоположность этому, существуют доказательства, подтверждающие, что амилин и, следовательно, молекулы с амилин-подобными свойствами, такие как миметики кальцитонина лосося, способны улучшать чувствительность к лептину. Комбинация амилин/лептин оказывает синергическое действие на вес тела и потребление пищи, а также резистентность к инсулину [Kusakabe Т et al].

Раскрываемые в этом документе варианты осуществления описываются в следующих примерах, которые предоставлены для понимания раскрытия и не должны истолковываться, как ограничивающие каким бы то ни было образом границы раскрытия, установленные в формуле изобретения, предоставленной в дальнейшем. Следующие далее примеры приводятся для того, чтобы предоставить специалистам в данной области полное раскрытие и описание того, как выполнить и применить описанные варианты осуществления, и не предназначаются для ограничения рамок настоящего раскрытия, а также не предназначаются для утверждения, что эксперименты, предоставленные ниже, -это все или единственные проведенные эксперименты. Были предприняты усилия по обеспечению точности в отношении используемых количественных показателей (например, количества, температуры и т.д.), однако некоторые экспериментальные ошибки и отклонения следует принимать во внимание. Если не указано иное, части являются частями по весу, молекулярный вес является средневесовым молекулярным весом, температура предоставляется в градусах по Цельсию, а давление является атмосферным или близким к атмосферному.

Результаты показаны на прилагаемых чертежах, как указано далее:

фигура 1 - исходные данные, показьшающие активность КВР (из таблицы 3) на CTR при воздействии sCT и UGP302/KBP-042 в разных временных точках;

фигура 2 - активация CTR в зависимости от времени фиксированными концентрациями различных лигандов;

фигура 3 - дозозависимая активация AMY-R при добавлении различных лигандов к линии клеток, экспрессирующих AMY-R;

фигура 4 - конкурентное связывание тестируемых соединений на клетках, экспрессирующих CTR (левая панель) и AMY-R (правая панель), р1С50 даны в таблице;

фигура 5 - дозозависимая активация CGRP-R для различных лигандов;

фигура 6 - эффект однократной дозы КВР-056 на потребление пищи, вес тела и PPG;

фигура 7 - результат воздействия в течение трех недель UGP302/KBP-042, КВР-023, КВР-056 и КВР.088 на FPG и HbA1c;

фигура 8 - действие КВР соединений на резорбцию коллагена I типа, верхняя панель, и резорбцию коллагена II типа, нижняя панель;

фигура 9 - показывает полученные в примере 7 результаты сравнения между эффектами соединений КВР-088 и КВР-089 на потребление пищи у мышей с ожирением, фигура 10 показывает количественное определение краткосрочного потребления пищи, полученного в примере 7, при сравнении пептида КВР-089 изобретения и известного пептида КВР-042;

фигура 11 - показывает количественное определение краткосрочного потребления пищи (верхняя панель) и изменение веса тела (нижняя панель) для этих пептидов;

фигуры 12A-12F - дополнительно показывают результаты, полученные в примере 1, в отношении индукции цАМФ путем воздействия на рецептор кальцитонина (фигуры 12А, В и Е) и на рецептор амилина (фигуры D и Е) и кроме того, показывает результаты, полученные в примере 7, в виде количественного определения потребления пищи (фигура 12F).

Примеры

В предоставленных далее примерах были использованы следующие материалы и методы.

Клетки и клеточные линии

Были куплены линии клеток, экспрессирующие рецепторы кальцитонина, амилина и CGRP, которые культивировали в соответствии с инструкциями производителя.

Рецептор кальцитонина (CTR): U2OS-CALCR от компании DiscoveRx (Cat. No.: 93-0566С3).

Рецептор амилина (AMY-R): СНО-К1 CALCR + RAMP3 от компании DiscoveRx (Cat. No.: 93-0268C2).

Рецептор CGRP (CGRP-R): CHO-K1 CALCRL + RAMP1 от компании DiscoveRx (Cat. No.: 93-0269C2).

В независимых биоанализах CTR, AMY-R и CGRP-R клетки в указанные моменты времени были обработаны увеличивающимися дозами sCT, UGP-302/KBP-042 или KBPs, показанных в таблице 3 (0, 0.001, 0.01, 0.1, 1, 10 и 100 nM).

Пример 1. Исследование β-аррестина

GPCR-анализы с использованием β-Arrestin PathHunter являются функциональными клеточными методами исследований, которые непосредственно измеряют способность лиганда активировать GPCR путем обнаружения взаимодействия β-аррестина с активированным GPCR. Поскольку вовлечение аррестина является независимым от сигнального пути G-белка, эти анализы предоставляют эффективную и универсальную платформу для скрининга и профилирования, которая может быть использована практически для любого Gi-, Gs или Gq-связанного рецептора.

В этой системе GPCR «вставляется» в рамку с небольшим фрагментом фермента ProLink™ и коэкспрессируется в клетках, устойчиво экспрессирующих гибридный белок β-аррестина и более крупный, N-концевой делеционный мутант β-gal (называемый акцептором фермента или ЕА). Активация GPCR стимулирует связывание β-аррестина с ProLink-меченым GPCR и обеспечивает комплементацию двух фрагментов фермента, приводя к образованию активного β-gal фермента. Это взаимодействие приводит к увеличению ферментативной активности, которая может быть измерена с использованием хемилюминесцентных проявляющих реагентов PathHunter® Detection Reagents.

Исследование проводили в прозрачных 384-луночных планшетах (Greiner Bio-One, 784080). За день до проведения эксперимента высевали 2500 клеток на лунку в 10 мкл специальной для данного клеточного типа среды. Для количественного определения GPCR-опосредованного вовлечения β-аррестина использовали набор Pathhunter™ Detection Kit (93-0001, DiscoverX) и проводили исследование согласно инструкциям производителя.

Результаты показаны на фигурах 1, 2 и 3. Как можно видеть на фигуре 1, пептиды являются весьма близкими по активности; однако, с увеличением времени КВР-056 показывает превосходящую способность активировать и поддерживать активацию CTR. Это даже лучше видно на фигуре 2, где отдельные лиганды нанесены на график при одной заданной концентрации и в зависимости от времени. Явно видно, что КВР-056 превосходит другие пептиды по активации рецептора кальцитонина.

Другим важным признаком молекул этого класса является способность активировать рецептор амилина AMY-R, и как видно на фигуре 3, KBPs способны полностью активировать этот рецептор, причем КВР-088 является более эффективным, чем классический AMY-R агонист sCT.

Как можно видеть на целой группе фигур, анализ бета-аррестина был использован для оценки длительной активации рецептора. Это было сделано при использовании рецептора кальцитонина (CTR): клеточная линия U2OS-CALCR от компании DiscoveRx (кат. №: 93-0566С3), причем в противоположность классическому 3-часовому «выходу», накопление бета-аррестина проводили в течение 24,48 и 72 часов, а затем анализировали.

Пептиды, подходящие для использования в изобретении были классифицированы по их способности активировать CTR и AMY-R in vitro в порядке убывания, как указано далее.

Пример 2. Конкурентное связывание с лигандом

В этом примере мы продемонстрировали относительную способность тестируемых соединений связываться с рецепторами кальцитонина и амилина. В соответствии с экспериментами по индукции бета-аррестина, мы провели эксперименты по конкурентному связыванию лигандов с использованием клеток, экспрессирующих CTR и AMY-R. При исследовании связывания лигандов на клетках 15.000 CTR или AMY-R клеток высевали в 96-луночные планшеты, затем клетки обрабатывали 0.1 nM ¹²⁵I-конъюгированным sCT в присутствии или в отсутствие немеченого КВР в увеличивающихся дозах в течение 60 минут при 37°С. После инкубации супернатант удаляли и клетки промывали дважды в 200 мкл PBS. Клетки лизировали, используя буфер (30 мМ М NaCl, 50 мМ Трис-HCl, 5 мМ EDTA, 1% дезоксихолевую кислоту, 10% SDS, мини-таблетку ингибитора протеазы (1 таблетка : 10 мл), лизаты собирали для измерения на γ-счетчике.

Результаты показаны на фигуре 4. Во-первых, мы обнаружили, что все лиганды эффективно связываются с обоими рецепторами; однако, что касается аффинности, то аффинность КВР-088 была лучше, чем других лигандов, особенно у AMY-R.

Пример 3. Проверка вовлечения β-аррестина на CGRP-рецепторе

Учитывая тот факт, что показано, что TAs пептиды со способностью активировать рецептор амилина активируют CGRP-R, действие которого может оказывать неблагоприятное влияние на суммарный эффект соединений, мы оценили, активируют ли KBPs CGRP-рецептор. Как видно на фигуре 5, в отличие от кальцитонина лосося, ни одно из соединений КВР не активировало CGRP-R.

Пример 4. Тест на активность в отношении веса тела in vivo

Чтобы подтвердить in vivo активность этого класса пептидов, был проведен острый тест на способность КВР-056 уменьшать потребление пищи, вес тела и возникающий после приема пищи уровень глюкозы по сравнению с UGP302/KBP-042. Самцов крыс Sprague-Dawley содержали на рационе с высоким содержанием жира в течение 8 недель, чтобы вызвать ожирение, а затем подвергали воздействию однократной подкожной дозы 5 мкг/кг КВР-056, UGP302/KBP-042 или разбавителя (физиологический раствор) (5 крыс на группу), оценивали действие на потребление пищи, вес тела и уровень глюкозы. Кровь отбирали из хвостовой вены через 18 часов после введения дозы. Уровни глюкозы в цельной крови определяли с помощью глюкометра ACCU-CHEK® Aviva (Roche Diagnostics, Роткройц, Швейцария).

Как видно на фигуре 6, КВР-056 сильно уменьшал потребление пищи в течение 18-часового периода, что также проявляется в значительной потере веса. Интересно то, что потеря веса превышает потерю веса, вызванную UGP302/KBP-042. И наконец, наблюдалось значительное уменьшение уровней глюкозы после приема пищи, что свидетельствует о том, что этот новый класс пептидов демонстрирует значительную активность in vivo.

Пример 5. Тест на активность in vivo в отношении уровня глюкозы натощак и HbA1c

Для оценки эффектов пептидов в отношении регуляции уровней глюкозы в крови, самцов крыс ZDF, являющихся «золотым стандартом» модели диабета 2 типа, лечили в течение 3 недель тремя наиболее многообещающими KBPs (023, 056 и 088) и активным препаратом сравнения (UGP302/KBP-042). Самцы крыс ZDF были получены в возрасте 7 недель из лаборатории Charles River Laboratories (Kisslegg, Германия). Всех животных содержали в виварии Nordic Bioscience в условиях постоянной температуры (21-23°С) и относительной влажности (55-65%) при 12 часовом цикле день/ночь со свободным доступом к корму для крыс Purina 5008 (Brogaarden, Lynge, Дания) и водопроводной воде. В возрасте 8 недель всех животных разделили на пять групп по 8 мышей в каждой, исходя из уровня глюкозы в крови натощак и веса тела (разбавитель (физиологический раствор), UGP302/KBP-042 5 мкг/кг/день, КВР-023 5 мкг/кг/день, КВР-056 5 мкг/кг/день и КВР-088 5 мкг/кг/день), дозы вводили подкожно один раз в день. Животных лечили в течение 3 недель, чтобы оценить воздействие пептидов на уровень глюкозы в крови натощак. Уровень глюкозы в крови контролировали с помощью системы мониторинга Accu-Check® Aviva (Roche Diagnostics, Роткройц, Швейцария) и уровни HbA1c контролировали с помощью DCA Vantage™ Analyzer (Siemens Healthcare Diagnostics, Дирфилд, Иллинойс).

Уровень глюкозы натощак и HbA1c оценивали через три недели, и как видно на фигуре 7, и КВР-056 и КВР-088 были высоко активными в отношении уменьшения FPG и HbA1c, и что интересно, они превосходят UGP302/KBP-042, показывая, что замены аминокислот улучшают эффективность, что также видно по данным, полученным in vitro.

Пример 6. Действие КВР-056 на резорбцию кости и деградацию хряща

Принимая во внимание взаимоотношение между KBPs и разными кальцитонинами, общеизвестные защитные эффекты кальцитонина лосося в отношении кости и хряща, эффекты КВР-056 на резорбцию кости (измеренную посредством CTX-I) и деградацию хряща (оцененную посредством СТХ-II) исследовали на самцах крыс, которых содержали на диете с высоким содержанием жира (HFD). Как видно на фигуре 8, КВР-056 зависимым от дозы и времени образом уменьшал как CTX-I, так и СТХ-II, при этом максимальное ингибирование наблюдалось через три часа после введения дозировки и при дозах, превышающих 1 мкг/кг/день. Это подтверждает то, что KBPs сохраняют свои благоприятные эффекты на кость и хрящ, несмотря на замены аминокислот. Кроме того, основываясь на их превосходстве в других тестах, мы ожидали, что эти эффекты тоже будут лучшими.

Пример 7. Сравнение действия КВР 088 и КВР 089 на потребление пищи у крыс с ожирением.

Крыс содержали на диете с высоким содержанием жира в течение 14 недель до эксперимента, чтобы вызвать ожирение. Затем крыс разделили случайным образом на 7 групп (разбавитель (0.9% NaCl), КВР-089 (дозы: 1,25, 2,5, 5 мкг/кг) и КВР-088 (дозы: 1.25, 2,5, 5 мкг/кг). Животных не кормили в течение ночи, затем утром подкожно вводили однократную дозу пептида или разбавителя. Потребление пищи контролировали в пределах следующих интервалов (0-4 часов, 4-24 часов и 24-48 часов). Как видно на фигуре 9, и КВР-088 и КВР-089 приводят к уменьшению потребления пиши в пределах 4-часового интервала, причем действие сохранялось до 24 часов. В интервале от 24 до 48 часов только КВР-089 приводил к уменьшению потребления пищи, показывая, что эта молекула превосходит КВР-088.

На фигуре 12F показаны результаты аналогичного теста в отношении более широкого диапазона пептидов согласно изобретению.

Далее были предприняты подобные исследования в течение разных периодов времени и с разными пептидами, результаты показаны на фигуре 10 и фигуре 11. Способность КВР089 подавлять потребление пищи в течение 72 часов сравнивали со способностью КВР042 в качестве контроля, результаты показаны на фигуре 10.

Чтобы дополнительно исследовать эффективность КВР-089 в сравнении с КВР-042, крысам с ожирением вводили путем подкожной инъекции 2.5 мкг/кг/день или КВР-089 или КВР-042, и были взяты две контрольные группы, группа с введением разбавителя и группа с ограничением калорийности, в которой потребление пищи соответствовало потреблению пищи в группе КВР-089, для того, чтобы понять, будут ли наблюдаться эффекты независимо от потребления пищи.

На фигуре 11 действие пептидов на потребление пищи и вес тела в течение восьминедельного периода лечения показано на верхней и нижней панелях, соответственно. Можно видеть, что оба пептида существенно уменьшают потребление пиши в начале, как и предполагалось, после чего эффект уменьшается и потребление пищи постепенно нормализуется. Воздействие на вес тела продемонстрировано на фигуре И, нижняя панель, где явно видно, что оба пептида вызывают существенную потерю веса; однако, потеря веса, вызванная, больше, чем вызванная КВР-042, что демонстрирует превосходство КВР-089. Кроме того, при сравнении КВР-089 с контрольной группой с ограничением калорийности (получающие одинаковое кормление), которая получила точно такое же количество пищи как группа КВР-089 в течение периода исследования, стало очевидно, что уменьшение веса опосредуется не только ограничением потребления пищи, но также другими эффектами.

В этом подробном описании, если точно не указано иное, слово 'или' используется в качестве термина, который возвращает истинное значение, когда любое или оба из установленных условий встречается, в отличие от термина 'исключительно или', который предусматривает, что только одно из условий встречается. Термин 'содержащий' используется в смысле 'включающий', а не в смысле 'состоящий из'. Все предыдущие идеи, приведенные выше, включаются в описание путем отсылки. Признание в данном описании какого-либо ранее опубликованного документа не должно считаться допущением или утверждением, что его идея была общедоступной в Австралии или где-нибудь в другом месте до даты приоритета изобретения.

1. Миметик кальцитонина, представляющий собой пептид c аминокислотной последовательностью AcCSNLSTCMLGRLSQDLHRLQTYPKTDVGANAP-NH2, представленной в SEQ ID NO:44.

2. Фармацевтическая композиция для лечения сахарного диабета, включающая эффективное количество миметика кальцитонина по п. 1 и фармацевтически приемлемый носитель.

3. Фармацевтическая композиция по п. 2, составленная для энтерального введения.

4. Фармацевтическая композиция по п. 2, составленная для парентерального введения.

5. Фармацевтическая композиция по п. 2, составленная для введения в форме инъекции.

6. Фармацевтическая композиция по п. 2, составленная с носителем для перорального введения.

7. Фармацевтическая композиция по п. 6, где носитель включает 5-CNAC, SNAD или SNAC.

8. Фармацевтическая композиция по п. 2, отличающаяся тем, что пептид включается в состав фармацевтической композиции для перорального введения, содержащей покрытые лимонной кислотой частицы, которые увеличивают биодоступность пептида при пероральном введении.

9. Фармацевтическая композиция для лечения избытка массы тела или избыточного потребления пищи, включающая эффективное количество миметика кальцитонина по п. 1 и фармацевтически приемлемый носитель.

10. Фармацевтическая композиция по п. 9, составленная для энтерального или парентерального введения.

11. Фармацевтическая композиция по п. 9, составленная с носителем для перорального введения.

12. Фармацевтическая композиция по п. 11, где носитель включает 5-CNAC, SNAD или SNAC.

13. Фармацевтическая композиция для лечения неалкогольной жировой дистрофии печени, включающая эффективное количество миметика кальцитонина по п. 1 и фармацевтически приемлемый носитель.

14. Фармацевтическая композиция по п. 13, составленная для энтерального или парентерального введения.

15. Фармацевтическая композиция по п. 13, составленная с носителем для перорального введения.

16. Фармацевтическая композиция по п. 15, где носитель включает 5-CNAC, SNAD или SNAC.

17. Фармацевтическая композиция для лечения остеопороза или остеоартрита, включающая эффективное количество миметика кальцитонина по п. 1 и фармацевтически приемлемый носитель.

18. Фармацевтическая композиция по п. 17, составленная для энтерального или парентерального введения.

19. Фармацевтическая композиция по п. 17, составленная с носителем для перорального введения.

20. Фармацевтическая композиция по п. 19, где носитель включает 5-CNAC, SNAD или SNAC.