Способ количественного определения суммы флавоноидов в плодах боярышника мягковатого
Владельцы патента RU 2695760:
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Самарский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации (RU)
Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности, в частности к способу количественного определения суммы флавоноидов в плодах боярышника мягковатого (Crataegus submollis Sarg). Способ количественного определения суммы флавоноидов в плодах боярышника мягковатого с предварительным получением водно-спиртового извлечения путем экстракции измельченных плодов боярышника мягковатого этиловым спиртом в пересчете на вещество флавоноидной природы методом прямой спектрофотомерии, включает экстракцию сырья с использованием в качестве экстрагента этилового спирта с концентрацией 70%, количественное определение суммы флавоноидов в плодах боярышника мягковатого проводят при длине волны 282 нм в пересчете на катехин; содержание суммы флавоноидов (X в процентах) в пересчете на катехин и абсолютно сухое сырье рассчитывают по формуле:
где: D - оптическая плотность испытуемого раствора; Do - оптическая плотность раствора стандартного образца катехина; m - масса сырья, г; mo - масса стандартного образца катехина, г;
W - потеря в массе при высушивании в процентах. В случае отсутствия стандартного образца катехина содержание суммы флавоноидов (X в процентах) в пересчете на катехин и абсолютно сухое сырье целесообразно использовать теоретическое значение его удельного показателя поглощения, равное 144:
где: D - оптическая плотность испытуемого раствора; m - масса сырья, г; 144 - удельный показатель поглощения стандартного образца катехина при 282 нм; W - потеря в массе при высушивании в процентах. Техническим результатом является создание способа количественного определения суммы флавоноидов в плодах боярышника мягковатого в пересчете на катехин. 3 табл., 3 ил.
Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и может быть использовано в центрах контроля качества лекарственных средств и контрольно-аналитических лабораториях при проведении количественного определения суммы флавоноидов в плодах боярышника мягковатого (полумягкого) (Crataegus submollis Sarg.).
Действующая система контроля качества лекарственных препаратов требует постоянного усовершенствования подходов к стандартизации биологически активных соединений (БАС) с использованием современных методов анализа и актуальных данных об их физико-химических, спектральных и фармакологических свойствах, позволяющих объективно и селективно определять содержание целевых веществ (1).
Сырье различных видов рода Боярышник (плоды, листья, цветки, побеги) широко используются в отечественной и зарубежной медицине (2). Боярышник мягковатый является перспективным видом лекарственного растения для получения лекарственного растительного сырья. Кроме того, плоды боярышника мягковатого широко используют в Российской Федерации как пищевой продукт (3). Плоды боярышника мягковатого содержат много различных флавоноидов (катехины, антоцианы, флавонолы и др.), среди которых по нашим данным доминируют катехины.
Описан способ количественного определения суммы антоцианов (подгруппы флавоноидов) в высушенных плодах боярышника мягковатого с использованием прямой спектрофотометрии. Данная методика включает такие стадии, как измельчение сырья, термическая экстракция сырья этиловым спиртом 95%, подкисленным кислотой хлористоводородной в соотношении «сырье-экстрагент» - 1:10, измерение оптической плотности электронного спектра испытуемого раствора при аналитической длине волны 543 нм. Содержание суммы антоцианов в плодах боярышника полумягкого, определенное с использованием данной методики, составляет 0,023% (4).
Данный метод взят нами в качестве прототипа. Недостатками этого метода являются высокая погрешность при определении суммы антоцианов и невозможность определения в анализируемом сырье суммы флавоноидов в пересчете на вещества, специфические для плодов боярышника мягковатого.
Таким образом, целью изобретения является разработка способа количественного определения суммы флавоноидов в плодах боярышника мягковатого.
Техническим результатом является создание способа количественного определения суммы флавоноидов в плодах боярышника мягковатого в пересчете на катехин.
Технический результат достигается тем, что экстракцию сырья осуществляют однократно, в качестве экстрагента используют этиловый спирт в концентрации 70%, количественное определение суммы флавоноидов в плодах боярышника мягковатого проводят при длине волны 282 нм в пересчете на катехин; содержание суммы флавоноидов (X в процентах) в пересчете на катехин и абсолютно сухое сырье вычисляют по формуле:
где:
D - оптическая плотность испытуемого раствора;
Do - оптическая плотность раствора стандартного образца катехина;
m - масса сырья, г;
mo - масса стандартного образца катехина, г;
W - потеря в массе при высушивании в процентах.
В случае отсутствия стандартного образца катехина для расчета содержание суммы флавоноидов (X в процентах) в пересчете на катехин и абсолютно сухое сырье целесообразно использовать теоретическое значение его удельного показателя поглощения, равное 144:
где:
D - оптическая плотность испытуемого раствора;
m - масса сырья, г;
144 - удельный показатель поглощения 
стандартного образца катехина при 282 нм;
W - потеря в массе при высушивании в процентах.
С использованием УФ-спектроскопии установлено, что катехины является доминирующими и специфическими веществами для плодов боярышника мягковатого, химическая формула катехина представлена на фигуре 1.
При изучении спектральных характеристик было выявлено, что именно катехин определяет характер кривой поглощения водно-спиртового извлечения из плодов боярышника мягковатого. Данный факт проиллюстрирован на фигурах 2 и 3, где кривая поглощения 1 - показывает электронный спектр раствора водно-спиртового извлечения из плодов боярышника полумягкого, а кривая поглощения 2 - электронный спектр раствора катехина. На графике видно, что кривая поглощения раствора водно-спиртового извлечения плодов боярышника коррелирует с кривой поглощения раствора катехина.
Также нами было изучено влияние экстрагента на процесс экстракции. В таблице 1 представлена зависимость выхода флавоноидов из плодов боярышника мягковатого от концентрации экстрагента. В результате эксперимента в качестве оптимального экстрагента нами был выбран 70% этиловый спирт, так как выход действующих веществ из сырья при его использовании максимален.
Кроме того, в таблице 2 представлена зависимость выхода флавоноидов плодов боярышника мягковатого от времени экстракции на кипящей водяной бане, что позволило выбрать время экстракции 60 минут.
В таблице 3 представлена зависимость выхода флавоноидов плодов боярышника мягковатого от соотношения «сырье-экстрагент». Из таблицы видно, что максимальный выход действующих веществ наблюдается при соотношении «сырье-экстрагент» - 1:100, поэтому данное соотношение было выбрано нами в качестве оптимального.
Таким образом, было определено, что оптимальными параметрами экстракции являются: однократное извлечение 70% этиловым спиртом на кипящей водяной бане в течение 60 минут в соотношении «сырье-экстрагент» - 1:100.
Принимая по внимание тот факт, что доминирующими и специфическим для плодов боярышника мягковатого являются катехины, а максимумы поглощения раствора катехина и водно-спиртового извлечения плодов боярышника мягковатого находятся в области 282 нм, целесообразным является определение содержания суммы флавоноидов в пересчете на катехин при длине волны 282 нм.
Способ реализуется следующим образом.
Аналитическую пробу высушенных плодов боярышника мягковатого измельчают до размера частиц 3 мм. Около 1 г (точная навеска) измельченного сырья помещают в колбу со шлифом вместимостью 200 мл, прибавляют 100 мл 70% этилового спирта. Колбу закрывают пробкой и взвешивают на тарирных весах с точностью до ±0,01. Колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане (умеренное кипение) в течение 60 минут. Затем колбу закрывают той же пробкой, снова взвешивают и восполняют недостающий экстрагент до первоначальной массы. Извлечение фильтруют через бумажный фильтр с красной полосой и остужают в течение 30 минут (извлечение из плодов).
Испытуемый раствор для анализа суммы флавоноидов готовят следующим образом: 2 мл полученного извлечения помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят объем раствора до метки 70% этиловым спиртом (испытуемый раствор).
Раствором сравнения является 70% этиловым спиртом.
Оптическую плотность измеряют при аналитической длине волны 282 нм и определенное значение оптической плотности используют в формуле расчета.
Для расчета содержания суммы флавоноидов готовят раствор стандартного образца катехина, измеряют его оптическую плотность при аналитической длине волны 282 нм и определенное значение оптической плотности используют в формуле расчета.
Приготовление раствора стандартного образца катехина
Около 0,003 г (точная навеска) катехина помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, растворяют в 96% этиловом спирте. Затем содержимое колбы доводят 96% этиловым спиртом до метки (раствор А катехина). После чего 5 мл раствора А катехина помещают в мерную колбу на 25 мл и доводят раствор до метки 70% этиловым спиртом. Раствором сравнения является 70% этиловый спирт. Измерение оптической плотности проводят при длине волны 282 нм сразу после приготовления все растворов.
Содержание суммы флавоноидов (X в процентах) в пересчете на катехин и абсолютно сухое сырье вычисляют по формуле:
где:
D - оптическая плотность испытуемого раствора;
Do - оптическая плотность раствора стандартного образца катехина;
m - масса сырья, г;
mo - масса стандартного образца катехина, г;
W - потеря в массе при высушивании в процентах.
В случае отсутствия стандартного образца катехина содержание суммы флавоноидов (X в процентах) в пересчете на катехин и абсолютно сухое сырье для расчета целесообразно использовать теоретическое значение его удельного показателя поглощения, равное 144:
где:
D - оптическая плотность испытуемого раствора;
m - масса сырья, г;
144 - удельный показатель поглощения 
стандартного образца катехина при 282 нм;
W - потеря в массе при высушивании в процентах.
Предлагаемый способ поясняется следующими примерами.
Пример 1.
Аналитическую пробу сырья боярышника кроваво-красного измельчают до размера частиц 3 мм (заготовлено в г. Самаре, Ботанический сад, сентябрь 2018 г.). 1,0241 г измельченного сырья помещают в колбу со шлифом вместимостью 200 мл, прибавляют 100 мл 70% этилового спирта. Колбу закрывают пробкой и взвешивают на тарирных весах с точностью до ± 0,01. Колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане (умеренное кипение) в течение 60 минут. Затем колбу закрывают той же пробкой, снова взвешивают и восполняют недостающий экстрагент до первоначальной массы. Извлечение фильтруют через бумажный фильтр с красной полосой и остужают в течение 30 минут (извлечения из плодов).
Испытуемый раствор для анализа суммы флавоноидов готовят следующим образом: 2 мл полученного извлечения помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят объем раствора до метки 70% этиловым спиртом (испытуемый раствор). Раствором сравнения является 70% этиловым спиртом.
Для расчета содержания суммы флавоноидов готовят раствор стандартного образца катехина, измеряют его оптическую плотность при аналитической длине волны 282 нм и определенное значение оптической плотности используют в формуле расчета.
Приготовление раствора стандартного образца катехина
Около 0,003 г (точная навеска) катехина помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, растворяют в 96% этиловом спирте. Затем содержимое колбы доводят 96% этиловым спиртом до метки (раствор А катехина). После чего 5 мл раствора А катехина помещают в мерную колбу на 25 мл, и доводят раствор до метки 70% этиловым спиртом. Раствором сравнения является 70% этиловый спирт. Измерение оптической плотности проводят при длине волны 282 нм сразу после приготовления все растворов.
Содержание суммы флавоноидов (X в процентах) в пересчете на катехин и абсолютно сухое сырье вычисляют по формуле:
где:
0,4488 - оптическая плотность испытуемого раствора;
0,3529 - оптическая плотность раствора стандартного образца катехина;
1,0241 - масса сырья, г;
0,0031 - масса стандартного образца катехина, г;
6,95 - потеря в массе при высушивании в процентах.
Измерение оптической плотности проводят при длине волны 282 нм.
Содержание суммы флавоноидов в пересчете на катехин составило 4,14%.
Пример 2.
При необходимости определения суммы флавоноидов в плодах боярышника мягковатого в отсутствии стандартного образца катехина, необходимо провести все действия из примера 1 до приготовления раствора стандартного образца катехина.
где:
0,4488 - оптическая плотность испытуемого раствора;
144 - удельный показатель поглощения 
стандартного образца катехина при 282 нм;
1,0241 - масса сырья, г;
6,95 - потеря в массе при высушивании в процентах.
Содержание суммы флавоноидов в пересчете на катехин = 4,09%.
Все результаты были статистически обработаны. Ошибка единичного количественного определения составила ±4,44%.
Таким образом, предлагаемый способ количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на катехин в плодах боярышника мягковатого с использованием прямой спектрофотометрии разработан впервые для данного вида сырья и обладает следующими преимуществами:
1. Разработанный метод является более специфичным и селективным, так как в качестве экстрагента используется 70% этиловый спирт, позволяющий исчерпывающе извлекать целевые вещества (флавоноиды).
2. Пересчет суммы флавоноидов осуществляется на доминирующее и специфическое для плодов боярышника мягковатого - катехин.
3. Ошибка единичного определения предлагаемого способа составляет ±4,44%, тогда как в случае прототипа, по результатам наших исследований она может достигать 7%.
Этот способ целесообразно применять в центрах контроля качества лекарственных средств, на фармацевтических предприятиях и контрольно-аналитических лабораториях при проведении количественного анализа плодов боярышника мягковатого (Crataegus submollis Sarg.).
ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ
1. Куркин В.А. Фармакогнозия. Учебник для студентов фармацевтических вузов (факультетов). - 3-е изд., перераб. и доп. - Самара: ООО «Офорт»; ФГБОУ ВО СамГМУ Минздрава России, 2016. - 1279 с.
2. Куркина А.В. Флавоноиды фармакопейных растений: монография. - Самара: ООО «Офорт», ГБОУ ВПО СамГМУ Минздравсоцразвития России, 2012. - 290 с.
3. Деревья и кустарники СССР // Т. 3, Издание Академии наук СССР Москва-Ленинград, 1954. 872 с.
4. Еникеева К.Е., Хасанова С.Р., Кудашкина Н.В., Андерсова П.А., Асадуллина Д.Д., Ярочкина А.Р. Выбор оптимальных условий извлечения антоциановых соединений из плодов боярышника мягковатого // Вестник Башкирского государственного медицинского университета (сетевое издание), №4, 2018. - С. 130-133.
Способ количественного определения суммы флавоноидов в плодах боярышника мягковатого с предварительным получением водно-спиртового извлечения путем экстракции измельченных плодов боярышника мягковатого этиловым спиртом в пересчете на вещество флавоноидной природы методом прямой спектрофотометрии, отличающийся тем, что экстракцию сырья осуществляют в качестве экстрагента используют этиловый спирт в концентрации 70%, количественное определение суммы флавоноидов в плодах боярышника мягковатого проводят при длине волны 282 нм в пересчете на катехин; содержание суммы флавоноидов (X в процентах) в пересчете на катехин и абсолютно сухое сырье рассчитывают по формуле
где:
D - оптическая плотность испытуемого раствора;
Do - оптическая плотность раствора стандартного образца катехина;
m - масса сырья, г;
mo - масса стандартного образца катехина, г;
W - потеря в массе при высушивании в процентах;
в случае отсутствия стандартного образца катехина содержание суммы флавоноидов (X в процентах) в пересчете на катехин и абсолютно сухое сырье целесообразно использовать теоретическое значение его удельного показателя поглощения, равное 144:
где:
D - оптическая плотность испытуемого раствора;
m - масса сырья, г;
144 - удельный показатель поглощения 
стандартного образца катехина при 282 нм;
W - потеря в массе при высушивании в процентах.
